DE1185335B

DE1185335B - Verfahren zur Herstellung von neuen Staphylococcen-Antigenen

Info

Publication number: DE1185335B
Application number: DEP29409A
Authority: DE
Inventors: Henry Blessing Devlin; Myron Wolf Fisher; Theodore Herbert Haskell
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1961-05-15
Filing date: 1962-05-14
Publication date: 1965-01-14
Also published as: FR2679M; FI40107C; GB992132A; FI40107B; DK105490C; CH417852A

Description

Verfahren zur Herstellung von neuen Staphylococcen-Antigenen Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Polysaccharid-Verbindungen, die imstande sind, gegen Staphylococceninfektionen zu immunisieren.
Gemäß der Erfindung kann das Antigen gewonnen werden, indem man immunogenes Protoplasma von gewissen Stämmen von Staphylococcus aureus mit einer wäßrigen Säure bei einem pH-Wert von etwa 4 oder niedriger extrahiert und die Feststoffe von der Lösung abtrennt, wodurch man eine wäßrige Lösung erhält, die das Polysaccharid enthält.
Die besonderen Stämme von Staphylococcus aureus, die verwendet werden können, sind solche, die die morphologische Eigenschaft aufweisen, daß sie lose zusammenhängende, diffuse, halbopake Kolonien bilden, wenn man sie in einem halbfesten oder weichen Agar-Kulturmedium züchtet, das Plasma, Serum und deren Proteinkomponenten enthält. Dies ist eine hochcharakteristische Eigenschaft, da die große Mehrzahl von Stämmen von Staphylococcus aureus unter den gleichenWachstumsbedingungen dichte, kompakte, opake, zusammenhängende Kolonien bildet und als Quelle für das Verfahren nach der Erfindung ungeeignet sind. Einige Beispiele von einzelnen Stämmen von Staphylococcus aureus, die verwendet werden können, sind UC 76, Smith, S193N4, H & D, Castellani, MCD 138, SK 4473, K 6, K 93 und K 93 M.

Von diesen Stämmen werden die Stämme K 93 M, MCD 138, S193N4 und UC 76 bevorzugt. Alle diese Stämme von Staphylococcus aureus wurden niedergelegt in der Kultursammlung von Parke, Davis & Company in Detroit, Michigan, und in der Kultursammlung des Fermentation Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, U. S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, unter den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Nummern.

Parke, Northern Utilization

Stamm Davis & Co. Research Laboratory

Sammlung Nr. Sammlung Nr.

UC 76 05068 NRRL B-2467

Smith 05067 NRRL B-2468

S 193 N 4 05089 NRRL B-2469

H & D 05087 NRRL B-2471

Castellani 05088 NRRL B-2472

MCD 138 05085 NRRL B-2473

SK 4473 05086 NRRL B-2474

K 6 05090 NRRL B-2475

K93 05091 NRRLB-2476

K 93 M 05092 NRRL B-2477

Das als Ausgangsmaterial beim Verfahren der Erfindung verwendete immunogene Protoplasmamaterial kann aus intakten Zellen des speziellen Organismus oder aus Zellbruchstückenbestandteilen oder einem Abwandlungsprodukt mit immunogenen Eigenschaften bestehen. Wenn das immunogene Protoplasmamaterial aus intakten Zellen besteht, können diese entweder lebend, d. h. imstande sein, sich zu vermehren, oder abgetötet sein, d. h. nicht imstande sein, sich zu vermehren, oder ein Gemisch von beiden. Das genaue Verfahren, wie es zur Erzeugung von abgetöteten oder partiell abgetöteten Staphylococcen angewendet wird, ist nicht kritisch.

Einige Arbeitsweisen, die verwendet werden können, sind eine Behandlung mit Wärme von etwa 600 C für 1 bis 1/2 Stunde, mit p-Propiolacton (0,1 bis 0,2 0/o bei 37"C 2 Stunden) und mit Phenol (1 0/o bei 25"C für etwa 18 Stunden).
Weitere Beispiele von immunogenem Protoplasmamaterial, wie es als Ausgangsmaterial beim Verfahren nach der Erfindung Verwendung findet, sind immonugene Massen, die aus Zellen der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus durch eine physikalische oder chemische Behandlung erhalten werden, durch die die Zelle zerrissen wird, ohne daß die immunogenen Eigenschaften in wesentlichem Ausmaß verlorengehen.
Einige Beispiele von solchen zusätzlichen immunogenen Plasmamaterialien, wie sie als Ausgangsmateria beim Verfahren nach der Erfindung geeignet sind, sind Zellenbruchteile, wie sie durch mechanisches Zerreißen von intakten Zellen entsteben, das phenolunlösliche, wasserunlösliche, feste Material, wie es bei der Extraktion von intakten Zellen mit Phenol oder einem wäßrigen Lösungsmittel anfällt, und die wasserunlösliche Fraktion, wie sie durch Extraktion von intakten Zellen mit Phenol und einem wäßrigen Lösungsmittel erhalten wird.
Bei der Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung wird die Behandlung des immunogenen Protoplasmamaterials mit einer wäßrigen Säure bei einem pH-Wert von etwa 4 oder weniger durchgeführt mit einer beliebigen Säure aus einer Vielzahl von organischen oder anorganischen Säuren. Einige Beispiele der zahlreichen verwendbaren Säuren sind wäßrige Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Monochloressigsäure, Trichloressigsäure und Salzsäure. Jedoch werden die Zeit und die Temperatur der Behandlung mit den wäßrigen Säuren im Hinblick auf die spezielle Stärke der verwendeten Säure eingestellt, so daß das Ausgangsmaterial in das gewünschte Polysaccharid umgewandelt wird, ohne übermäßige Hydrolyse zu einzelnen Sacchariden. Im allgemeinen wird bei einer Arbeitsweise bei einem pH-Wert von 2 bis 4 die Suspension oder Lösung des Ausgangsmaterials erhitzt, während, wenn man bei einem pH-Wert unter 2, insbesondere in Gegenwart von Mineralsäuren und anderen starken Säuren, wie Trichloressigsäure, arbeitet, die Behandlung vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Obgleich eine kurze Behandlung bei pH-Werten unter O angewendet werden kann, sind solche Bedingungen nicht zu empfehlen, da sie weitergehende Hydrolyse des gewünschten Produktes verursachen. Ein Beispiel einer bevorzugten Säure ist eine verdünnte Essigsäure.
Zum Beispiel arbeitet man bei Bedingungen unter Verwendung dieser Säure, indem man die Suspension und die Lösung des Ausgangsmaterials in O,ln-Essigsäure 5 bis 60 Minuten unter Druck auf etwa 121"C erhitzt, obgleich eine beträchtliche Abweichung von diesen speziellen Reaktionsbedingungen ebenfalls befriedigende Ergebnisse liefert.
Nach der Behandlung mit wäßriger Säure bei einem pH-Wert von etwa 4 oder niedriger liegt das gewünschte Produkt in der wäßrigen Lösung vor. Die wäßrige Lösung wird abgekühlt, falls notwendig, und von etwaigen unlöslichen Resten abgetrennt, was durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren und ähnliche Arbeitsweisen geschehen kann.
Die auf diese Weise erhaltene wäßrige Lösung enthält das Polysaccharid und kann als Impfprodukt oder zur Isolierung des gereinigten Polysaccharids verwendet werden. Für die Verwendung als Impflösung wird der pH-Wert eingestellt, um die Lösung für die Injektion brauchbar zu machen. Normalerweise wird der pH-Wert auf etwa 6 bis 8, vorzugsweise auf etwa 7,2, eingestellt. Wenn die Impflösung nicht isotonisch ist, ist es vorzuziehen, sie durch Zugabe von Natriumchlorid isotonisch zu machen.
Das fertige Impfprodukt kann nach zahlreichen Arbeitsmethoden steril gemacht werden. Zum Beispiel kann es durch Wärme, Ultraviolettbestrahlung oder durch Zugabe von chemischen Schutzstoffen sterilisiert werden. Es ist vorzuziehen, der fertigen Vaccine einen chemischen Schutzstoff zuzusetzen. Einige geeignete Schutzstoffe sind Thimerosal (1:10000), Benzethoniumchlorid (1: 20 000) oder Phenol (0,2°/o).
Eine Klärung durch eine Filtration durch ein Seitz-Filter kann ebenfalls angewendet werden.
Impflösungen, die das Polysaccharid enthalten und wie oben ausgeführt hergestellt sind, erzeugen bei parenteraler Verabreichung eine hohe Immunität nicht nur gegen eine Infektion durch den Stamm von Staphylococcus aureus, der bei ihrer Herstellung verwendet wurde, sondern auch durch eine Infektion durch andere Stämme von Staphylococcus aureus.
Weiter werden gemäß der Erfindung das Polysaccharid und seine Salze aus der beschriebenen wäßrigen Lösung, wie sie bei der wäßrigen Säurehydrolyse anfällt, sowie aus der oben beschriebenen Impflösung durch Isolierung und Reinigung erhalten.
Das Polysaccharidprodukt wird durch Entfernung des Wassers aus der wäßrigen Lösung oder der Impflösung als rohe feste Substanz erhalten. Vorzugsweise werden die wäßrigen Lösungen oder die Impflösung nach einer Dialyse gefroren und dann in gefrorenem Zustand getrocknet, wodurch man ein festes Rohprodukt mit einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 250 bis 261 Millimikron erhält auf Grund des Vorhandenseins von Nucleinsäuren als Verunreinigung. Das Polysaccharidprodukt wird gereinigt durch Chromatographie, durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes, durch Ausfällen der Verunreinigung mit einem Alkohol, insbesondere einem niederen Alkohol, z. B. Äthanol, in Gegenwart von Salzen, wie Natriumacetat oder Natriumsulfat, oder durch Kombination dieser Arbeitsweisen.
Für eine chromatographische Reinigung wird die wäßrige Lösung des Polysaccharids durch eine Säule aus aktiver Kohle geleitet und das erhaltene aktive Produkt durch Eindampfen oder Lyophilisierung des Ablaufes gewonnen.
Zur Reinigung durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes wird eine wäßrige Lösung des Polysaccharids mit einem langkettigen quaternären Ammoniumsalz, z. B. Cetylpyridiniumchlorid oder Cetyltrimethylammoniumbromid, umgesetzt. Bei richtiger Kontrolle des pH-Wertes und der Ionenstärke scheidet sich ein unlöslicher quarternärer Ammonium-Polysaccharid-Komplex ab (vgl. G Ii c »Methods of biochemical Analysis«, Bd. 8, S. 145 bis 197). Der unlösliche Komplex wird dann in Calciumchloridlösung gelöst, und das Polysaccharid wird durch Zugabe von Äthanol ausgefällt. Das Produkt kann dann erneut gefällt werden, sooft man will, durch Wiederauflösung in Wasser und Zugabe von Äthanol. Bei Durchführung der Reinigung durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammonium-Polysaccharid-Komplexes ist es ratsam, zunächst Nucleinsäuren zu entfernen, da diese Verbindungen unter bestimmten Bedingungen mit den angesäuerten Polysacchariden gemeinsam ausfallen. Die Entfernung der Nucleinsäuren kann erreicht werden, indem man die Polysaccharidlösung mit neutralisierter Diatomeenerde oder aktiver Kohle vorbehandelt, bis das zurückbleibende Bodenprodukt nur eine geringe oder keine Absorption in Ultraviolett zeigt.
Zur Reinigung durch Ausfällung von Verunreinigungen mit einem Alkohol wird ein Alkohol in ausreichender Menge zugefügt, um die Hauptmenge der Verunreinigungen ohne Ausfällung einer wesentlichen Menge des gewünschten Polysaccharids zu bewirken.
Für optimale Ergebnisse müssen die Konzentrationen des Polysaccharids der zugefügten Salze und des Alkohols sorgsam geregelt werden. Befriedigende Ergebnisse erhält man durch die Zugabe von 5 bis 10 Volumen absolutem Äthanol zu der 0,l5molaren Natriumsulfatlösung mit nicht mehr als etwa 5 mg/ccm Polysaccharid. Die ausgefällten Verunreinigungen werden dann z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt.
Im Anschluß an die Reinigung durch Chromatographie, durch quaternäre Ammoniumkomplexbildung oder durch Ausfällung von Verunreinigungen mit einem Alkohol liegt das Polysaccharid normalerweise in Salzform in wäßriger - Lösung vor und wird als gereinigte weiße feste Masse durch Dialyse der Lösung und Eindampfen oder Lyophilisierung isoliert.
Die durch Lyophilisierung erhaltenen Produkte sind teilweise wasserhaltig und werden normalerweise in dieser Form für physikalische, chemische und biologische Messungen und Anwendungen verwendet.
Ein gründlich getrocknetes Produkt erhält man durch Trocknen bei 50"C, und dieses wird normalerweise für Mikroelementaranalysen und gelegentlich für weitere Untersuchungen verwendet. Und wenn nichts anderes angegeben ist, beziehen sich diese Daten der Beschreibung auf lyophilisierte, nicht aber anderweitig getrocknete Proben.
Bevorzugte Ausgangsstoffe für die immunogenen Protoplasmastoffe sind intakte Zellen der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus und das phenolunlösliche, wasserunlösliche feste Material, wie es durch Extraktion der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus mit Phenolen und wäßrigen Lösungsmitteln erhalten wird. Diese Ausgangsstoffe ergeben bei einer hohen Reproduzierbarkeit eine hohe Ausbeute des gewünschten Polysaccharids von ausreichender Reinheit.
Intakte Zellen, die als Ausgangsmaterial verwendet werden, können entweder lebende, abgetötete oder partiell abgetötete Zellen sein. Wenn abgetötete oder partiell abgetötete Zellen verwendet werden, können sie, wie oben angegeben, mit Hilfe einer Behandlung mittels Wärme, B-Propiolacton oder Phenol hergestellt sein.
Das phenolunlösliche, wasserunlösliche, feste Material, wie es als Ausgangsmaterial verwendet wird, kann durch Extraktion von lebenden oder abgetöteten Zellen der speziellen Stämme von Staphylococcus aureus mit Phenol und Verwendung des unlöslichen Rückstands erhalten werden. Gewöhnlich werden die speziellen Stämme von Staphylococcus aureus mit einem wäßrigen Lösungsmittel sowie mit Phenol extrahiert, und es wird in beiden Lösungsmitteln die feste, unlösliche Fraktion verwendet.
Die beiden Extraktionen können entweder gleichzeitig oder, was vorzuziehen ist, getrennt durchgeführt werden, indem man zunächst die Phenolextraktion vor der Extraktion mit einem wäßrigen Lösungsmittel vornimmt.
Das für die Extraktion verwendete wäßrige Lösungsmittel ist vorzugsweise Wasser, obgleich auch physiologisch verträgliche wäßrige Salzlösungen, wie physiologische Salzlösungen, Hanksche ausgeglichene Salzlösung u. ä. verwendet werden können. Wenn beide Extraktionen gleichzeitig durchgeführt werden, muß ausreichend Phenol verwendet werden, um eine Phenol- phase zu bilden, aber unzureichend, um alles vorhandene wäßrige Lösungsmittel zu lösen. Wenn die Phenolextraktion vor der Extraktion mit einemwäßrigen Lösungsmittel durchgeführt wird, muß die Phenolphase hinreichend Wasser enthalten, um das Phenol flüssig zu halten, aber auch unzureichend Wasser, um die Abtrennung einer besonderen wäßrigen Phase zu bewirken, d. h. zwischen etwa 5 und 30°/e Wasser aufweisen. Da die intakten Zellen von Staphylococcen, die als Ausgangsmaterial verwendet werden, feucht sind und Wasser enthalten, ist es im allgemeinen nicht notwendig, sehr viel Wasser zum Phenol zuzugeben, um es zu verflüssigen. Die normale und bevorzugte Arbeitsweise besteht darin, Phenol zu verwenden, das am Ende nicht mehr als etwa 150/o Wasser enthält. Nach der Extraktion mit Phenol und einem wäßrigen Lösungsmittel enthalten die Zellenbruchstücke, die in Phenol und in Wasser unlöslich sind, das Polysaccharid.
Die Polysaccharidverbindung, die nach dem Verfahren nach der Erfindung hergestellt wird, ist eine hochmolekulare Substanz, die viele einzelne Saccharideinheiten enthält. Das Polysaccharid enthält Carboxylgruppen und kann daher als freie Säure vorliegen sowie in Form zahlreicher Salze, z. B. als Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Ammonium- und Aminsalz oder als deren Gemisch. Die Form der freien Säure und die einfachen Salzbildungen haben ähnliche chemische, physikalische und biologische Eigenschaften und sind bei geeigneten pH-Bedingungen leicht ineinander umwandelbar und werden daher für die Zwecke dieser Erfindung als äquivalent angesehen; falls nicht anderweitig bemerkt, wird kein Unterschied zwischen dem Polysaccharid als Säure und der Form seines einfachen Salzes gemacht.
Allgemeine Charakterisierung Das Polysaccharid ist weiß, wasserlöslich, wärmebeständig und nicht dialysierbar. Es enthält Carboxylgruppen und enthält als freie Säure nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff.
In Form der freien Säure und einfacher Salze ist es stark linksdrehend. Die spezifische Drehung entsprechend der freien Säure, getrocknet auf konstantes Gewicht bei 50° C, beträgt [a] 203 = 79,40 in wäßriger Lösung. Durch Mikro analyse von getrockneten Proben und Äquivalentgewichtsmessungen ergibt sich die empirische Formel der freien Säure zu C,9H33N3O13.
Das Polysaccharid ist polymerer Natur und besitzt ein sehr hohes Molekulargewicht.
Spektroskopische Charakterisierung Die Zeichnungzeigtdas Infrarotabsorptionsspektrum des Polysaccharids als freie Säure in- einer Kaliumbromidscheibe. Infrarotabsorptionsmaxima erscheinen bei 2,95, 3,22, 3,33, 3,37, 5,73, 6,00, 6,43, 6,96, 7,24, 7,61,8,04,8,77,9,49, 10,83, 11,13 und 11,52 Mikron.
Die Salzformen haben ebenfalls charakteristische Absorptionsspektra, wie beschrieben ist in dem Experimentalabschnitt.
Das Polysaccharid besitzt keine selektive Absorption in Ultraviolett. Jedoch sind Messungen der Ultraviolettabsorption nützlich, um das Vorhandensein von Verunreinigungen, wie Nucleinsäuren, zu bestimmen, die in Ultraviolett eine charakteristische Absorption aufweisen.
Chemisches Verhalten Das Polysaccharid gibt negative Molisch- und Anthrontests, was anzeigt, daß die üblichen Hexosen und Pentosen nicht vorhanden sind. Tests auf Sialin-und einfache Uronsäuren sind negativ. Nach einer Hydrolyse wird ein positiver Elson-Morgan-Test erhalten, was anzeigt, daß das Hydrolyseprodukt ein oder mehrere Aminosaccharide enthält. Durch Erhitzen mit Diphenylamin und Essigsäure-Schwefelsäure-Gemischen (Dischs Test) erhält man ein Produkt mit einer blauen Farbe mit einem Absorptionsmaximum bei 575 Millimikron. Die Empfindlichkeit dieses Tests ist verhältnismäßig gering, und Verunreinigungen können stören. Durch Erhitzen in 79 0/0iger Schwefelsäure 15 Minuten bei 1100 C wird eine Lösung mit einem einzelnen Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 290 Millimikron erzielt.
Das Polysaccharid zeigte keine merkliche Aufnahme von Perjodat unter Standardbedingungen, was eine hochsubstituierte Struktur anzeigt.
Durch Reaktion mit verdünnter methanolischer Salzsäure oder Diazomethan wird das Polysaccharid in einen Methylester umgewandelt. Die Methylestergruppierung wird in einen Alkohol durch Reduktion mit Natriumborhydrid in Natriumbicarbonatlösung umgewandelt.
Quantitative O-Acetyl-Bestimmungen zeigen die Anwesenheit von 5,5 bis 7,0 0/o Acetylgruppen, gebunden an Sauerstoff. Die Acetoxylgruppen werden mit 0,1 n-Natronlauge bei Raumtemperatur hydrolysiert.
Eingehende Strukturbestimmungen sind gegründet auf die Untersuchung der Hydrolyseprodukte des Polysaccharids und seine Derivate und haben gezeigt, daß das Polysaccharid chemisch als ein Polymer von D-Glucosaminuronsäure beschrieben werden kann, das ein amidgebundenes L-Alanin (wahrscheinlich N-acetyliertes, da freie Aminogruppen nicht vorhanden sind) enthält und 5,5 bis 7,0 0/o Acetylgruppen, gebunden an Sauerstoff, aufweist. Produkte, die nach der Hydrolyse des Polysaccharids mit Mineralsäure identifizierbar sind, sind Alanin, Ammoniumchlorid und D-Glucosaminuronsäure. Vorhandensein von D-Glucosaminuronsäureeinheiten ist ein hochcharakteristisches Strukturmerkmal des Polysaccharids. D-Glucosaminuronsäure gehört nicht zu der Gruppe der gewöhnlichen Uronsäuren, die mit den kolorimetrischen Standard-Versuchsmethoden auf Uronsäure positive Tests ergeben.
Kolorimetrische Untersuchung Das Polysaccharid entwickelt eine gelbe Farbe in Essigsäure-Schwefelsäure-Lösung, die für quantitative Bestimmungen dienen kann. 2 ccm wäßrige Polysaccharidlösung werden zu 4 ccm Eisessig, der 100/o Schwefelsäure enthält, gegeben, und man erhitzt das Gemisch 30 Minuten in siedendem Wasser. Nach dem Abkühlen zeigt die Lösung ein Absorptionsmaximum bei 283, 410 und 470 Millimikron. Die meisten einfachen Zucker stören bei den Lösungen in dem Gebiet von 283 Millimikron, aber die Absorptionsspitzen bei 410 und 470 Millimikron sind sehr spezifisch. Durch Vergleich der Ablesung der optischen Dichte bei 410 und 470 Millimikron kann die Reinheit einer unbekannten Polysaccharidprobe miteiner gereinigten oder einer standardisierten Probe verglichen werden. Dieses Verfahren kann als Mittel einer quantitativen Analyse angewendet werden.
Elektrophoretisches Verhalten Das Polysaccharid kann nachgewiesen werden, und seine elektrophoretische Beweglichkeit kann auf Glasfaserstreifen untersucht werden. Wenn 50 bis 100 mg Polysaccharid auf solche Streifen aufgebracht und einer Elektrophorese unterworfen werden, kann das Polysaccharid durch Besprühen der Streifen mit einer Lösung, die 10/o p-Anisidin in feuchtem Butanol mit 201o konzentrierter Schwefelsäure enthält, und Erhitzen auf 100"C während 10 bis 15 Minuten nachgewiesen werden. Das Polysaccharid erscheint als rosa Fleck gegen einen farblosen Hintergrund. Das Polysaccharid bewegt sich als Anion gegen die Anode oder den positiven Pol bei pH-Werten von 4 und mehr. Eine gute Auflösung wird mit einem 0,05molaren Phosphatpuffer bei pH 6,0 und 0,05molarem Boratpuffer bei pH-Wert 8,6 bei hoher Spannung von 300 Volt und niedriger Stromstärke (weniger als 20 Milliampere) erhalten. Bei pH-Werten zwischen 3 und 4 bewegt sich das Polysaccharid durch Endosmose als ungeladenes Teilchen.
Das elektrophoretische Verhalten des Polysaccharids als gemischtes Calcium-Natrium-Salz wurde in einem Tiselius-Elektrophoreseapparat bestimmt, und die nachstehenden Elektrophorese- Beweglichkeitskonstanten wurden bestimmt: Bei einem pH-Wert von 4,4 6,3 10-5 cm2 sec-l Volt-l; bei einem pH-Wert von 6,0 5,87 10-5 cm2 sec-l Volt-l; bei einem pH-Wert von 7,5 5,83 10-5 cm2 . sec-l . Volt-'.
Spezielle physikochemische Charakterisierung Bei physikochemischen Bestimmungen wurde gefunden, daß das Polysaccharid ein sehr hohes Molekulargewicht besitzt. Das Polysaccharid kann auch durch übliche Viskositätsmessungen charakterisiert werden. Bei 23"C wurde die Viskosität des Polysaccharids als freie Säure bestimmt zu 0,0151 Poise (0,30/0 in Wasser). Der entsprechende Wert für die Viskosität von reinem Wasser bei 230 C ist 0,0938 Poise.
Biologische Versuche Es wurde eine immunologische Wirkungseinheit bestimmt, die von Wert ist bei Laboratoriumsversuchen von rohen und gereinigten Polysaccharidpräparaten sowie von wäßrigen Lösungen, aus denen diese stammen. Die Wirkungseinheit, bestimmt als Mäuseschutzeinheit, ist die Menge Material, die imstande ist, 50 0/o einer Gruppe von Mäusen gegen eine Infektion durch das 10 OOOfache der Menge an Staphylococcen zu schützen, die 500/o einer Gruppe von normalen Kontrollmäusen abzutöten vermag. Die immunogene Substanz wird subkutan 7 Tage vor der Beimpfung verabreicht, und die Beimpfung erfolgt durch intraperitoneale Verabreichung von Staphylococcen in Mucin. Bei dem Standardversuch wird der Stamm UC 76 von Staphylococcus aureus für die Beimpfung verwendet. Die Wirksamkeit eines Präparates kann ausgedrückt werden als Zahl der Mäuseschutzeinheit je Milligramm oder je Kubikzentimeter Lösung oder als die Zahl von PD50 (500/,ige Schutzdosis) je Milligramm oder je Kubikzentimeter Lösung gegen den LD50-Wert bei 10 000facher Beimpfung (500/die Lethaldosis). Gereinigte Präparate des Polysaccharids enthalten, wie -gefunden wurde, etwa 300 000 Mäuseschutzeinheiten (oder PD50) je Milligramm oder 300 je Mikrogramm. Bei der Beurteilung der Reinheit aus immunologischen Versuchen muß die übliche Toleranz für Experimentalfehler bei bioIogischen Messungen beachtet werden.
Das Polysaccharid und seine Salze sowie die Impflösungen, die diese enthalten, vermögen die Bildung eines positiven Schutzkörpers zu stimulieren, und bei einer parenteralen Verabreichung erzeugen sie ein hohes Ausmaß einer Immunität nicht nur gegen die Infektionen durch den Stamm von Staphylococcus aureus, der bei ihrer Herstellung verwendet wurde, sondern auch durch eine Infektion mit anderen Stämmen von Staphylococcus aureus. Da das Polysaccharid und seine Salze gereinigt und genau charakterisiert und standardisiert werden können, besitzen sie eine hohe Reproduzierbarkeit in ihrer chemischen Zusammensetzung und in ihrem klinischen Effekt.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 Eine Stammlösung des Stammes UC76 von Staphylococcus aureus wird in einem Kulturmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung gehalten: Bestandteil Menge Pepton aus Casein durch Pankreasverdauung (Trypticase) .............. 17,0 g Papain-Verdauungsprodukt von Sojabohnen (Phyton) 3,0 g Natriumchlorid ....................... 5,0 g Dikaliumphosphat ................... . 2,5 g Dextrose ............................. 2,5 g Destilliertes Wasser 1000,0 ccm Für die Verwendung wird dieses Medium durch Autoklavieren bei 118 bis 121°C für 15 Minuten sterilisiert. Der Organismus wird 18 bis 24 Stunden bei 35 bis 37"C entwickelt und in einem gleichen Medium durch einmalige Übertragung in jeder Woche gehalten.
Saatkulturen wurden durch Beimpfung von großen Testrohren mit 30 ccm obengenannten Kulturmedien, enthaltend etwa 0,3 ccm Stammkultur, und Entwicklung bei 35 bis 37"C während 6 bis 24 Stunden -hergestellt. Für jeden Kolben der Endproduktion wird ein Rohr der Saatkultur hergestellt. Es wird eine Reihe von Endproduktionskolben hergestellt, wobei jeder 1000 ccm sterilisiertes Medium, wie angegeben, enthält. Jeder Kolben wird mit 30 ccm der 6- bis 24-Stunden-Kultur beimpft und 24 Stunden bei 35 bis 37° C entwickelt. Man gibt reines Phenol hinzu in einer Konzentration von 1 Gewichtsprozent je Volumen, und nach einem Durchmischen läßt man die Kultur für die Inaktivierung bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Die Zellsuspension wird dann in einer Sharples Laboratoriumsluftturbine bei Raumtemperatur bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 250 ccm/ Min. zentrifugiert. Die dichtgepackten Zellen werden herausgenommen, wieder in einem Zehntel des Orginalkulturvolumens 0,85 0/0iger Salzlösung in einem Waring-Mischer aufgeschwemmt und wieder durch Zentrifugieren gesammelt. Die Anzahl der erhaltenen Zellen wird auf den Umwandlungsfaktor berechnet, wobei 2,4 g nasser, durch Zentrifugieren erhaltener dicht- gepackter Zellen angenähert 1 1012 Organismen entsprache. Das Gewicht der trockenen Zellen beträgt ungefähr 280/o des Naßzellengewichtes.
Es wird Phenol mit einer kleinen Menge Wasser, um es flüssig zu machen, zu der Zellmasse gegeben unter Verwendung von 9 ccm Phenol, für je 1 1012 Zellen. Die feste Masse wird suspendiert, und durch weitere Zugabe von Phenol oder Wasser wird die Suspension auf ein Volumen von 10,58 ccm für je 1.1012 Zellen gebracht und rechnerisch auf eine Phenolkonzentration von 85 i 1 0/o Volumen eingestellt. Die Zellenphenolsuspension wird auf eine Temperatur von 24 i 2"C gebracht und in einem Waring-Mischer 8 bis 10 Minuten durchgemischt und bei einer Temperatur unter etwa 50"C gehalten. Die hierbei erhaltene Emulsion wird 30 bis 60 Minuten in Teilmengen bei 2500 Umdr./Min. bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die klare überstehende Flüssigkeit wird verworfen, und die festen Tabletten werden wieder suspendiert in 85%igem Phenol durch Vermischen während 1 bis 2 Minuten in einem Waring-Mischer unter Verwendung von 10 ccm 85%igem Phenol für je 1 .1012 Originalzellen. Die Zellenmasse wird wieder durch Zentrifugieren gesammelt, und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die Zellenmasse wird wieder in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 5,0 bis 5,5 ccm je 1 10l2 1.1012 Originalzellen suspendiert, und die Suspension wird 24 bis 28 Stunden gegen kaltes, laufendes Leitungswasser und dann über Nacht gegen destilliertes Wasser bei angenähert 4"C dialysiert. Falls nötig, wird die Dialyse wiederholt, bei der Ferricchloridtest auf Phenol negativ ist. Die Suspension wird auf pH 7,4 i 0,2 mit 0,1 n-Natronlauge eingestellt und bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die wäßrigen und festen Phasen werden voneinander getrennt, und beide werden aufbewahrt. Die feste Pastille wird wieder mit destilliertem Wasser zu einem Volumen von 0,25 bis 0,30 ccm für je 1 1012 Originalzellen suspendiert, und nach gründlichem Durchmischen wird die Suspension zentrifugiert. Die festen Pastillen werden zur Herstellung des Polysaccharids durch Umsetzung mit Essigsäure verwendet.
Das Polysaccharid wird auf folgende Weise hergestellt: Das gewaschene feste Produkt aus der Phenol-Wasser-Extraktion des Stammes UC 76 von Staphylococcusaureus,wie oben beschrieben, wird in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 5,0 ccm für je 1 1.1012 Originalzellen suspendiert. Man gibt hinreichend 10n-Essigsäure hinzu, um eine endgültige KonzentrationvonO,ln-Essigsäure zu erzielen; der pH-Wert beträgt an diesem Punkt etwa 3,4 i 0,3. Die Suspension wird gründlich durchgemischt und 5 Minuten bei 121"C im Autoklav behandelt. Die Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt und zentrifugiert.
Das gewünschte Produkt erscheint an dieser Stelle in der wäßrigen überstehenden Flüssigkeit. Die feste Ausfällung wird wieder in 0,1n-Essigsäure zu einem Volumen von 0,5 ccm für je 1.10¹² Originalzellen suspendiert. Diese Suspension wird zentrifugiert, die wäßrige überstehende Flüssigkeit vereinigt man mit der, wie sie bei der vorhergehenden erhalten wurde, und die Ausfällung wird verworfen. Die wäßrige Lösung wird mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,4 L 0,2 eingestellt. Wenn das Produkt in dieser Form verwendet werden soll, wird ein Schutzstoff, wie Thimerosal (1:10000) oder Benzethoniumchlorid (1: 20 000), hinzugegeben, und die Lösung wird sterilisiert und filtriert. Um das feste Polysaccharid zu isolieren, wird die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 i 0,2 eingestellt, 3 Tage gegen laufendes Leitungswasser und dann 1 Tag gegen das 10fach seines Volumens von destilliertem Wasser dialysiert.
Die Lösung wird gefroren und in gefrorenem Zustand getrocknet, wobei man eine weiße, flockige, feste Masse erhält, die rohes Polysaccharid mit94500Mäuseschutzeinheiten je Milligramm enthält.
Eine Reinigung des Polysaccharids kann durch Kohlechromatographie erfolgen. Eine Suspension von 497 mg rohem Polysaccharid mit 94 500 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm, wie beschrieben, wird in 10 ccm Wasser suspendiert, und das unlösliche Material wird abzentrifugiert. Der Niederschlag wird zweimal mit 5 ccm Wasser gewaschen, und alle wäßrigen Lösungen werden vereinigt und mit verdünnter Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt.
Die wäßrige Lösung wird auf 40 ccm mit Wasser verdünnt und durch eine Kohlechromatographiesäule, hergestellt aus 650 mg aktivierter Holzkohle und 650 mg Diatomeenerde, geleitet. Stoffe, wie Norit und Celite 545, können hierzu verwendet werden. Die Säule wird mit etwas Wasser gewaschen, und eine Gesamtmenge Ablauf von insgesamt etwa 43 ccm wird aufgefangen. Der Ablauf, der im Ultraviolett kein Absorptionsmaximum zeigt, wird dann über Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert und in dem gefrorenen Zustand getrocknet, wobei man 176 mg weißes Pulver erhält, das partiell gereinigtes Polysaccharid ist, das im Versuch 163 000 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm aufweist. Für eine weitere Reinigung wird eine zweite Kohlechromatographiesäule aus 1,0 g aktivierter Holzkohle und 1,0 g Diatomeenerde hergestellt.
Die Säule wird 100 ccm einer 0,20/0eigen Lösung von Tetranatriumäthylendiamintetraessigsäure und dann mit Wasser gewaschen, bei die Lösung neutral ist.
Das partiell gereinigte Polysaccharid wird in 15 ccm Wasser gelöst, und der pH-Wert wird auf 4,1 mit Tetraessigsäure eingestellt. Die Lösung wird dann durch die Kohlesäule geleitet, diese Säule wird mit etwas Wasser gewaschen. Der Gesamtablauf wird aufgefangen, auf einen pH-Wert von 5,8 bis 6,0 mit Alkali eingestellt und über Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die restliche Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5 wird durch Diatomeenerde filtriert und aus gefrorenem Zustand getrocknet, wobei man gereinigtes Polysaccharid mit etwa 300 000 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm erhält. Das erhaltene Produkt ist ein gemischtes Calcium-Natrium-Salz.
Das Produkt zeigt im Ultraviolett keine selektive Absorption und enthält kein Protein, wie sich durch einen negativen Biuret-Test und quantitative Proteinbestimmung ergibt. Die spezifische Drehung ist [acl 72,30(0,5260/0 in Wasser) oder [osl 2D = 830, berechnet für wasserfreies Produkt nach einem Abtreiben von 13,2 0/o flüchtigen Anteilen bei 50"C. Das Produkt ergibt bei der Analyse 39,8 0/o Kohlenstoff, 6,29°/o Wasserstoff, 7,47 und 7,30 0/o Stickstoff, 2,0 0/o Calcium, 0,470/0 Natrium, eine Spur Phosphor und 5,55 °lo Asche.
Eine Reinigung des Polysaccharids kann auch durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes durchgeführt werden. 100 mg rohes Polysaccharid mit einem Wert von 94 500 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm, wie beschrieben, werden in 5 com Wasser gelöst, und die Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt. Die Lösung wird auf ein Volumen von 11 ccm und einen pH-Wert von 4,4 mit Essigsäure eingestellt und wird mit 52 mg Aktivkohle 10 Minuten gerührt und dann filtriert.
Das Filtrat wird durch Ultraviolettspektroskopie untersucht, um die Vollständigkeit der Entfernung von Nucleinsäuren zu bestimmen, und es werden weitere Behandlungen mit aktivierter Kohle durchgeführt, bis das Filtrat praktisch keine selektive Absorption im Ultraviolett zeigt. Zum Beispiel werden zwei weitere Behandlungen mit 50 und 30 mg aktivierter Kohle erforderlich. Das Endresultat nach einer Lyophilisierung ergibt 63 mg partiell gereinigtes Polysaccharid mit 126000 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm. Zu einer Lösung von 60 mg dieses Pulvers in 5 ccm Wasser und 0,9 ccm ln-Natriumchloridlösung gibt man 8 ccm 1 0/0ige Cetylpyridiniumchloridlösung. Es scheidet sich ein viskoses öliges Produkt ab. Das Gemisch läßt man bei Raumtemperatur über Nacht stehen und zentrifugiert. Das aufgenommene Produkt wird zweimal durch Zentrifugieren in 1 ccm Wasser gewaschen und in 1 com 0,5molarer Calciumchloridlösung gelöst.
Man fügt 4 bis 10 Volumina Äthanol hinzu, fängt das ausfallende Calciumsalz auf und wäscht es dreimal mit Äthanol. Das Produkt wird in 1 ccm 0,05molarer Calciumchloridlösung gelöst, wieder mit Äthanol ausgefällt und dreimal mit Äthanol gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist Polysaccharid-Calciumsalz mit 239 000 Mäuseschutzeinheitenje Milligramm. Etwas phosphorylierte saure Polysaccharide verbleiben in dieser Probe.
Eine Reinigung des Polysaccharids kann auch durch Ausfällung der Verunreinigung durch einen Alkohol erfolgen. 590 mg rohes Polysaccharid mit 520/0 Reinheit, kolorimetrisch bestimmt, werden in 55 ccm 15molarer Natriumsulfatlösung gelöst. Man gibt 165 ccm absoluten Äthanol tropfenweise unter Rühren hinzu, und der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 5 bis 10 ccm 950/0im Äthanol gewaschen und verworfen. Die überstehende Flüssigkeit einschließlich Waschäthanolwasser wird mit weiteren 110 ccm Äthanol verdünnt und zentrifugiert. Es wird eine kleine Menge ungelöster Verunreinigungen entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 15 bis 20 ccm eingeengt, auf 50 ccm mit Wasser verdünnt und über Nacht mit entionisiertem Wasser dialysiert. Die restliche Lösung wird durch Diatomeenerde filtriert und lyophilisiert, wobei man 307 mg Polysaccharid als gemischtes Calcium-Natrium-Salz als weißes Pulver erhält, das nach der kolorimetrischen Bestimmung eine 1000/,ige Reinheit aufweist.
Bei den Arbeitsweisen dieses Beispiels kann man auch an Stelle des Stammes UC76 von Staphylococcus aureus einen beliebigen der nachstehenden Stämme verwenden: Smith, S 193 N 4, H & D, Castellani, MCD 138, SK 4473, K 6, K 93 und K 93 M.
Beispiel 2 300 mg phenolunlösliches, wasserunlösliches festes Material, wie es bei der Extraktion von UC 76 von Staphylococcus aureus mit Phenol und Wasser anfällt, werden mit 10 ccm 5°/"igerTrichloressigsäure 24Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die ausfallende Suspension klärt man durch Zentrifugieren und Filtrieren durch Diatomeenerde und neutralisiert das Filtrat mit Alkali, dialysiert, filtriert und lyophilisiert zweimal und erhält rohes immunogenes Polysaccharid als weißes Pulver mit einer Reinheit von 200/o, kolorimetrisch und biologisch bestimmt. Das Produkt wird gereinigt, wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
Als Ausgangsmaterial kann man auch den phenolunlöslichen Rückstand aus der Extraktion des Stammes UC 76 von Staphylococcus aureus mit Phenol verwenden.
Beispiel 3 316 mg phenolunlösliches, wasserunlösliches festes Material, wie es bei der Extraktion des Stammes von UC76 von Staphylococcus aureus mit Phenol und Wasser anfällt, werden in 20ccm 1 n-Essigsäure suspendiert, und man erhitzt das Gemisch 30 Minuten unter Rückfluß unter Rühren. Die anfallende Suspension wird durch Zentrifugieren und Filtrieren durch Diatomeenerde geklärt, und man neutralisiert mit Alkali, dialysiert, filtriert und lyophilisiert, wobei man rohes Polysaccharid erhält, das eine 260/0ige Reinheit, kolorimetrisch bestimmt, ergibt. Das Produkt wird gereinigt, wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
Bei der vorstehenden Arbeitsweise ist es auch befriedigend, wenn man die Suspension in 1 n-Essigsäure 45 Minuten auf 90 bis 95° C erhitzt.
Beispiel 4 Eine nasse Paste von abgetöteten Zellen, hergestellt durch Behandlung einer Kultur des Stammes UC 76 von Staphylococcus aureus mit 101o Phenol (Gewicht/ Volumen) bei 18 Stunden bei Raumtemperatur, suspendiert man in destilliertem Wasser, wobei man eine Suspension miteiner Zellenzahlvon 200 109 Zellen je Kubikzentimeter erhält. Die Suspension teilt man in drei Teile, die je ein Volumen von 170 ccm auf weisen.
Den ersten Teil behandelt man mit Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,1 n-Essigsäure (pH-Wert etwa 4,0 bis 4,2) und erhitzt 30 Minuten unter Druck auf 121 cd. Man kühlt die Suspension ab und zentrifugiert bei 800 Umdr./Min. Die klare überstehende Flüssigkeit enthält Polysaccharid und ergibt kolorimetrisch 1,53 mg/ccm.
Den zweiten Teil behandelt man mit Essigsäure (pH-Wert etwa 3,3) und erhitzt 30 Minuten unter Druck auf 121"C. Die Suspension kühlt man ab und zentrifugiert bei 800 Umdr./Min. Die klare überstehende Suspension enthält Polysaccharid und ergibt kolorimetrisch 1,66 mg/ccm.
Den dritten Teil behandelt man mit Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 1 n-Trichloressigsäure (pH-Wert etwa 0,6) und rührt 16 Stunden bei 23"C. Die Suspension wird dann zentrifugiert bei 8000 Umdr./Min. Die klare überstehende Flüssigkeit enthält immunogenes Polysaccharid und ergibt 1,28 mg/ccm, kolorimetrisch bestimmt.
Das Polysaccharid, erhalten in wäßriger Lösung nach einer der vorstehenden Arbeitsweisen, wird gereinigt, wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
Beispiel 5 Ein wäßriger Extrakt in einer Menge von 1280 ccm, erhalten durch Phenol-Wasser-Extraktion der Stämme UC 76 und K 93 M von Staphylococcus aureus, wird mit 12,8 ccm 10 n-Essigsäure zu einem pH-Wert von etwa 3,3 angesäuert. Die Lösung wird 5 Minuten bei 121"C in einem Autoklav behandelt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Den pH-Wert stellt man äuf etwa 7,0 durch Zugabe von 7,3 ccm 500/0iger Natriumhydroxydlösung ein. Die Lösung, die nun das Polysaccharid enthält, ergibt 10500 Mäuseschutzeinheiten je Kubikzentimeter. Sie wird im Vakuum auf ein Volumen von 250 ccm konzentriert und über Nacht dialysiert. Die zurückbleibende Lösung wird filtriert und lyophilisiert, wobei man das Polysaccharid mit einer Reinheit von 12kl, (kolorimetrisch) erhält.
374 mg dieses Produktes löst man in 16 ccm 0,45molarer Natriumsulfatlösung. Man gibt 16 ccm Wasser und dann eine Lösung von 278 mg Cetylpyridiniumchlorid in 16 ccm Wasser hinzu. Das ausfallende Produkt wird abfiltriert, und das Filtrat wird lyophilisiert. Die bei der Lyophilisierung erhaltenen Feststoffe löst man in 6,2 ccm Wasser und gibt 31 ccm absoluten Äthanol tropfenweise unter Rühren hinzu. Das ausgefällte Produkt wird abzentrifugiert, und der Rückstand wird mit 25 ccm 950/0im Athanol in drei Teilen gewaschen.
Die Äthanollösungen werden vereinigt und im Vakuum auf einen hellbraunen Sirup eingedampft. Man gibt absolutes Äthanol hinzu, wobei das feste Polysaccharid ausfällt, das durch Zentrifugieren gesammelt, mit absolutem Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet wird. Ausbeute: 82 mg mit 480/o Reinheit (kolorimetrisch).
80 mg dieses Produktes löst man in 1 mg lmolarem Natriumsulfatpuffer bei einem pH-Wert von 5,6 und gibt 9 ccm absoluten Äthanol langsam unter Rühren hinzu. Das unlösliche Produkt wir durch Zentrifugieren aufgefangen und dann dreimal mit 950/,im Äthanol gewaschen. Das Produkt löst man in Wasser, dialysiert über Nacht und lyophilisiert. Es wird dann wieder in 8 ccm Wasser gelöst, und der pH-Wert wird auf 4,0 eingestellt. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren aufgefangen und durch eine Säule, hergestellt aus 0,5 g aktivierter Kohle und 0,5 g Diatomeenerde, geleitet. Die Säule wird mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen, und die vereinigte wäßrige Lösung, die etwa 7 ccm beträgt, wird mit 0,6 ccm 1 n-Natriumchloridlösung und anschließend mit einer Lösung von 45 mg Cetylpyridiniumchlorid in 1 com Wasser gewaschen. Der sich abscheidende harzartige Niederschlag wird abzentrifugiert, einmal mit Wasser gewaschen und in 0,8 ccm lmolarer Calciumchloridlösung gelöst. Man fügt 10 Volumina absoluten Äthanol hinzu und sammelt das sich abscheidende unlösliche Produkt durch Zentrifugieren, wäscht dreimal mit Äthanol, löst wieder in 1 ccm Wasser auf und fällt erneut durch Zugabe von Äthanol. Das Produkt wird in Wasser gelöst, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, wobei man 22 mg Polysaccharid als Calciumsalz erhält, das kolorimetrisch eine Einheit von 92 0/o zeigt. Das Produkt wird in die freie Säure umgewandelt, indem man es in einer kleinen Menge destilliertem Wasser löst und durch eine Säule mit 2,5 ccm Kationenaustauscherharz in freier Säureform leitet. Die wäßrige Lösung wird lyophilisiert, wobei man das Polysaccharid als freie Säure erhält, die kolorimetrisch eine 1000/,ige Reinheit zeigt und eine Viskosität von 0,0159 (0,316 0/o in Wasser) hat.
Beispiel 6 Gereinigtes Polysaccharid, isoliert aus der Kohlechromatographie wie im Beispiel 1, wird als gemischtes Calcium-Natrium-Salz erhalten und durch die nachstehende Arbeitsweise in das Calciumsalz umgewandelt.
177 mg Polysaccharid werden in 8 ccm Wasser gelöst, und der pH-Wert wird auf 7,0 mit einer Base eingestellt. Zu dieser Lösung gibt man 1,8 ccm 1molare Natriumchloridlösung und dann 260 mg Cetylpyridiniumchlorid in 8 ccm Wasser. Das Gemisch wird mit 30ccm Wasser verdünnt und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf man das gebildete harzartige Präzipitat durch Zentrifugieren sammelt und einmal mit 4 ccm Wasser wäscht. Den Niederschlag läßt man abtropfen und löst ihn dann durch Rühren mit 5 ccm 0,5molarer Calciumchloridlösung.
Man gibt 40ccm Äthanol hinzu und sammelt das ausfallende Polysaccharid-Calciumsalz durch Zentrifugieren und wäscht dreimal mit Äthanol. Um ein höhergereinigtes Calciumsalz zu gewinnen, löst man das Produkt in 5 ccm Wasser mit 0,1 ccm 0,5molarer Calciumchloridlösung und fällt erneut durch Zugabe von 40 ccm Äthanol. Das Produkt sammelt man durch Zentrifugieren, wäscht zweimal mit Äthanol, löst wieder in Wasser und dialysiert die Lösung 16 Stunden gegen entionisiertes Wasser. Die Lösung mit dem Polysaccharid-Calciumsalz filtriert man durch eine Schicht Diatomeenerde und lyophilisiert das Filtrat, wobei man das gereinigte Polysaccharid-Calciumsalz als Filtrat erhält; [a3b = -80,8 0C (0,6 0/o in Wasser) oder [d;]2D3 = ~ 90,6°C, berechnet als wasserfreies Salz nach einem Abtreiben von 10,92°/o flüchtigen Stoffen bei 50"C. Das getrocknete Produkt ergibt 40,8 °/o Kohlenstoff, 6,0 °/0 Wasserstoff, 7,77 0/o Calcium (nach der Flamme) und 6,2 0/o Asche. Durch potentiometrische Titration in Wasser ergibt sich der pKa'-Wert zu 3,35 entsprechend einem Äquivalentgewicht von etwa 600; umgerechnet auf den Gehalt an Calcium und flüchtige Bestandteile ist das Äquivalentgewicht des Polysaccharids als freie Säure etwa 510. In einer Calciumbromidscheibe zeigt das Calciumsalz Infrarotmaxima bei etwa 2,93, 3,23, 3,41, 5,78, 6,06, 6,42, 7,06, 7,27, 7,65, 8,02, 8,78, 9,50, 10,70, 11,20 und 11,55 Mikron.
Beispiel 7 Gereinigtes Polysaccharid, isoliert aus der Kohlechromatographie wie im Beispiel 1, wird als gemischtes Calcium-Natrium-Salz erhalten und durch die nachstehende Arbeitsweise in das Natriumsalz umgewandelt. 100 mg Polysaccharid löst man in 10 ccm Wasser und 1,8 ccm lmolarer Natriumchloridlösung und gibt dann 150 ccm Cetylpyridiniumchlorid in 10 ccm Wasser unter Rühren hinzu. Nach 2 Stunden Stehen bei Raumtemperatur sammelt man das ausgefallene Produkt durch Zentrifugieren und wäscht mit 3 ccm Wasser. Das Produkt löst man in 2 ccm Imolarem Natriumacetatpuffer (pH-Wert 5,6). Die Lösung verdünnt man mit 1 ccm Wasser und gibt unter Rühren und Erwärmen tropfenweise 30 ccm absoluten Äthanol hinzu, um das Polysaccharid-Natriumsalz auszufällen. Das Gemisch kühlt man auf Raumtemperatur ab, sammelt das Produkt durch Zentrifugieren und wäscht dreimal mit Äthanol. Um ein höhergereinigtes Natriumsalz zu gewinnen, löst man das Produkt wieder in 3 ccm Wasser mit 0,5 ccm Natriumacetatpuffer und fällt erneut durch Zugabe von 30 bis 35 ccm Äthanol wie zuvor. Das unlösliche Salz fängt man in einer Zentrifuge auf, wäscht mit Äthanol, löst wieder in Wasser und dialysiert die Lösung 16 Stunden gegen entionisiertes Wasser. Die nach der Dialyse zurückbleibende Lösung filtriert man durch ein Filter aus Diatomeenerde und lyo- philisiert das Salz, wobei man das Polysaccharid-Natrium-Salz erhält; [a]'03 -80,4" (0,69 0/o in Wasser) oder [ol]O = -86,5", berechnet als wasserfreies Produkt nach Abtreiben von 7,35 0/o flüchtigen Bestandteilen bei 50"C. Das getrocknete Produkt ergibt 42,37 0/o Kohlenstoff, 5,86 0/o Wasserstoff, 8,32 0/o Stickstoff 3,5 0/o Natrium (nach der Flamme), 0,35 0/o Calcium (eine Spur von Verunreinigungen durch die Flamme nachgewiesen) und 7,93 0/o Asche.
In einer Kaliumbromidscheibe zeigt das Natriumsalz Infrarotabsorptionsmaxima bei etwa 2,93, 3,24, 3,41, 5,78, 6,05, 6,43, 6,70, 7,10, 7,27, 7,65, 8,02, 8,85, 9,53, 10,70, 11,20 und 11,57 Mikron.
Beispiel 8 Das Polysaccharid kann man als freie Säure erhalten, indem man ein Salz davon einem Ionenaustausch unterwirft. Eine Lösung von 35 mg Polysaccharid-Calciumsalz, wie im Beispiel 6 erhalten, gibt man in 5 ccm destilliertem Wasser durch eine Säule, die 2,5 ccm Kationenaustauscherharz (50 bis 100 Maschen) in Form der freien Säure enthält. Die Säule wird mit einer kleinen Menge destilliertem Wasser gespült, und die vereinigten Abläufe und Waschwässer werden lyophilisiert, wo beim an dasPolysaccharid als freie Säure als weißes Pulver erhält; []2D = -79,4" (0,63 0/o in Wasser), trockene Probe.
Das Produkt ergibt nach dem Trocknen auf konstantes Gewicht bei 50° C 44,89 0/o Kohlenstoff, 6,48 O/o Wasserstoff, 8,34 0/o Stickstoff und 40,3 0/o Sauerstoff als Differenz. Die angegebene empirische Formel ist C,9H33N3O13.
Eine weitere Probe des Polysaccharids als freie Säure, entstehend aus dem gemischten Calcium-Natrium-Salz, hatte eine spezifische Drehung von [O;]2D = 77,20(0,5 °/0 in Wasser). Nach dem Trocknen auf konstantes Gewicht- bei 500 C ergab dieses Produkt 44,64 0/o Kohlenstoff, 6,27 O/o Wasserstoff, 8,15 0/o Stickstoff und 40,9 40,9°/0 Sauerstoff als Differenz. Die biologische Untersuchung zeigte 313 000 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm.
Das Polysaccharid als freie Säure zeigt die nachstehenden Infrarotabsorptionsmaxima in einer Kaliumbromidscheibe: 2,95, 3,22, 3,33, 3,37, 5,37, 6,00, 6,43, 6,96, 7,24, 7,61, 8,04, 8,77, 9,49, 10,83, 11 13 und 11,52 Mikron.
Das Polysaccharid als freie Säure wird in ein beliebiges gewünschtes Salz durch Titrieren mit der ausgewählten Base, wie Natriumhydroxyd, Kaliumcarbonat oder Calciumhydroxyd, umgewandelt.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Staphylococcen-Antigens, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t, daß man immunogenes Protoplasmamaterial aus einem Stamm von Staphylococcus aureus, der bei der Entwicklung in einem halbfesten oder weichen Agar-Kultur-Medium, das Plasma, Serum oder deren Proteinkomponenten enthält, lose zusammenhängende, diffuse, halbopake Kolonien bildet, mit einer wäßrigen Lösung einer Säure bei einem pH-Wert von etwa 4 oder weniger behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als immunogenes Protoplasmamaterial intakte Zellen von UC 76, Smith, S 193 N 4, H & D, Castellani, MCD 138, SK 4473, K 6, K 93 oder K 93 M-Stämme von Staphylococcus aureus verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die intakten Zellen des Stammes UC 76 von Staphylococcus aureus mit 0,1 n-Essigsäure erwärmt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das immunogene Polysaccharid, wie es in der wäßrigen Lösung vorliegt, durch Chromatographie, Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes, Ausfällung der Verunreinigungen mit Alkohol oder einer Kombination dieser Verfahren reinigt.