DE19930607C2 - Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Vielzahl von Proben und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Vielzahl von Proben und Vorrichtung zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Abstract
Zur Gewinnung von Daten über die Reaktionskinematik wird der Ablauf von Reaktionen in einer oder mehreren Proben von Zusammensetzungen an einer Vielzahl diskreter Meßorte optisch überwacht. Erfindungsgemäß werden zur Registrierung der Lichtsignale aufeinanderfolgende Einzelbilder jeweils der Gesamtheit der Meßorte während der zu erwartenden Dauer der ablaufenden Reaktionen aufgenommen. Die Auswertung der Lichtsignale erfolgt durch Analyse der die Meßorte wiedergebenden Bildausschnitte der aufgenommenen Einzelbilder.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben über die
Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Vielzahl von
Proben und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens,
gemäß dem Oberbegriff
des Patentanspruchs 1 bzw. des Patentanspruchs 6. Ein Verfah
ren bzw. eine Vorrichtung dieser Gattung ist aus
DE 197 45 373 A1 bekannt.
Die Kinetik chemischer Reaktionen wird üblicherweise anhand
meßbarer physikalischer Eigenschaften verfolgt, die sich abhän
gig von der Konzentration bestimmter Reaktanten oder des End
produktes der Reaktion in der jeweils beobachteten Zusammen
setzung ändern. Gebräuchlich sind insbesondere photometrische
Messungen im Bereich sichtbaren oder ultravioletten Lichtes zur
Erfassung von Fluoreszenz, Lumineszenz und optischer Eigen
schaften wie z. B. des Lichtabsorptionsvermögens in ausgewählten
Spektralbereichen, häufig unter Verwendung von Indikatorfarb
stoffen. Um das jeweils zu messende Licht hervorzurufen, kann
die beobachtete Probe der Zusammensetzung mit anregender Strah
lung (z. B. UV-Licht zur Anregung von Fluoreszenz oder Lumines
zenz) oder mit dem erforderlichen Einfallslicht (zur Messung
der Absorption) bestrahlt werden. Das zu messende Licht kann
aber auch Licht sein, das in der Zusammensetzung originär er
zeugt wird und dessen Intensität sich in charakteristischer
Weise während des Reaktionsablaufs ändert, wie dies als Chemo
lumineszenz bekannt ist.
Wird die Reaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß untersucht,
kann das der Reaktion entsprechende physikalische Signal in
einfacher Weise unter ununterbrochener Beobachtung durch ein
Photometer unmittelbar registriert werden. Soll die Reaktion im
Sinne eines großen Durchsatzes, wie es im Rahmen von Suchtests
(Screening) notwendig ist, mehrfach mit unterschiedlicher Zu
sammensetzung untersucht werden, bedient man sich üblicherweise
sequentieller Verfahren unter Verwendung mehrerer Reaktions
gefäße mit entsprechend unterschiedlich zusammengesetzten Pro
ben. Als Reaktionsgefäße werden üblicherweise handelsübliche
Küvetten, Mikrotiterplatten aber auch verschiedene Trägermate
rialien genutzt, die sowohl einer kinetischen Signalregistrie
rung zugänglich als auch zur Durchführung der chemischen Reak
tion geeignet sind.
Bei einer ersten Variante sequentieller Verfahren läßt man die
chemische Reaktion nacheinander in den verschiedenen Reaktions
gefäßen ablaufen, und das zur Lichtmessung verwendete Photome
ter wird nacheinander an den einzelnen Gefäßen eingesetzt. Die
zur Bewertung einer chemischen Reaktion der Probe in einem
Reaktionsgefäß notwendige Registrierdauer wird also vollständig
für die Registrierung nur dieser Reaktion aufgewendet. Nach
Beendigung dieser Registrierung wird der Vorgang separat mit
dem nächsten Reaktionsgefäß durchlaufen. Dies wird wiederholt,
bis die Reaktion in allen Proben registriert wurde. Die Gesamt
meßzeit dieser Verfahren setzt sich hier hauptsächlich zusammen
aus der Summe aller einzelnen Registrierdauern. Die Anzahl der
Meßpunkte je Zeiteinheit, die zur Auswertung der kinetischen
Reaktion zur Verfügung stehen, wird ausschließlich durch das
Meßgerät bestimmt und liegt bei gebräuchlichen Photometern im
Bereich von 10 bis 100 Meßpunkten je Sekunde. Nachteil dieses
Verfahrens ist die notwendige lange Meßzeit für eine große An
zahl von Proben.
Bei anderen sequentiellen Verfahren wird, zur Verkürzung der
Gesamtmeßzeit, die zu beobachtende Reaktion in allen Reaktions
gefäßen so zeitversetzt gestartet, daß während Reaktionsablau
fes in einem Reaktionsgefäß bereits die Reaktion im jeweils
nächsten Reaktionsgefäß beginnt. Die Reaktionsabläufe werden
hierbei beobachtet, indem die jeweiligen Meßorte, also die
einzelnen Proben, nacheinander, entsprechend dem Maß der Start
zeitversetzung, vom Photometer zur Meßwertnahme anvisiert wer
den und diese Folge zyklisch wiederholt wird, bis zum Ende der
zuletzt gestarteten Reaktion. Die Gesamtmeßzeit dieser Verfah
ren setzt sich hauptsächlich zusammen aus der Zeitdifferenz
zwischen dem Meßbeginn an der ersten Probe und dem Meßbeginn an
der letzten Probe (Summe der Startzeitversetzungen) und der
Meßdauer für eine einzelne Reaktion.
Bei allen sequentiellen Verfahren ist die zeitliche Auflösung
der Messungen begrenzt durch die Geschwindigkeit, mit welcher
von Probe zu Probe geschritten werden kann. Die Schrittfolge
wird üblicherweise realisiert durch mechanische Relativbewegung
zwischen der Probenanordnung und der Lichtmeßeinrichtung, wie
es z. B. aus DE 38 36 716 A1 oder EP 0 841 557 A2 be
kannt ist. Dies läßt keine sehr hohen Geschwindigkeiten zu und
bedeutet zudem einen relativ großen apparativen Aufwand. Ge
bräuchliche Systeme erreichen bei der Registrierung von Kinetiken
in Titerplatten mit 96 Kavitäten Geschwindigkeiten von bis zu zwei
Meßpunkten je Sekunde. Hinzu kommt, daß der zeitliche Abstand
zwischen aufeinanderfolgenden Meßwertnahmen an jeweils der
selben Probe von der Anzahl der Proben abhängt. Die Anzahl der
Meßwertnahmen je Zeiteinheit bestimmt aber bei vorgegebenem
Meßsignal im wesentlichen die Qualität der Beurteilung der
registrierten chemischen Reaktion.
Die vorstehend genannten Nachteile lassen sich reduzieren oder
ausräumen, indem man zur Detektion der Lichtsignale Strahlung
aus den verschiedenen, gleichzeitig bereitgestellten Proben
mittels eines geeigneten optischen Systems an unterschiedliche
Orte der Bildaufnahmefläche einer Bildaufnahmeeinrichtung über
trägt, die während der zu erwartenden Dauer der Reaktionen
zyklisch abgetastet wird, um für die verschiedenen Orte der
Bildaufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender
Lichtmeßwerte zu erhalten, die ausgewertet werden. Die Abta
stung einer Bildaufnahmefläche kann viel schneller erfolgen als
eine Abtastung der Proben durch mechanische Relativbewegung
zwischen der Gesamtanordnung der Proben und einem Lichtmeß
system. Somit lassen sich die Lichtsignale aus den verschie
denen Proben immer nahezu gleichzeitig (quasi-parallel) detek
tieren.
Eine Technik zur derartigen quasi-parallelen Detektion ist in
der eingangs erwähnten DE 197 45 373 A1 beschrieben. Dort wird
als Bildaufnahmeeinrichtung eine mit Video-Norm betriebene
Kamera verwendet, deren Bildaufnahmefläche ein CCD-Array ist.
Die Übertragung der Lichtstrahlung aus den Proben erfolgt mit
tels eines hochauflösenden Lichtleiterbündels, das trichter
förmig als sogenannter "Taper" ausgebildet ist, dessen groß
flächige Stirnfläche die Probenvielzahl abdeckt und dessen
kleinflächige Stirnfläche der Bildaufnahmefläche entspricht.
Dieses recht aufwendige optische System soll Parallaxen-Effekte
vermeiden, die sich ergeben können, wenn man für das Abbilden
ein konventionelles Linsensystem verwendet. Bei konventioneller
Linsenabbildung, also beim Abbilden der Gesamtansicht der Pro
benvielzahl mittels des üblichen Objektivs einer CCD-Kamera,
werden nämlich verschiedene Proben wegen ihrer unterschiedlich
weiten Versetzung gegenüber der optischen Achse naturgemäß aus
unterschiedlichen Betrachtungswinkeln vom Objektiv "gesehen".
Diese Parallaxe beeinflußt zwangsläufig die an der Bildaufnah
mefläche empfangene Lichtmenge und bewirkt somit, daß die
Absolutwerte der detektierten Lichtsignale aus Proben an den
Rändern des Gesichtsfeldes einem anderen Maßstabsfaktor unter
liegen als die Lichtsignale aus zentral gelegenen Proben. Die
für die einzelnen Proben erhaltenen Meßwertreihen sind bei
herkömmlicher Linsenabbildung demnach nicht nur abhängig vom
Reaktionsverlauf in der Probe, sondern unterliegen wegen der
Parallaxe auch einem ungleichmäßigen, vom Ort der Probe abhän
gigen Maßstab. Die Verwendung des parallaxenfrei abbildenden
Lichtleiterbündels anstelle eines Objektivs soll dies verhin
dern.
Bei einer anderen, aus DE 197 48 211 A1 bekannten Technik
paralleler Detektion wird jeder Probe ein eigenes Linsensystem
zugeordnet, bestehend aus einer dicht an der betreffenden Probe
angeordneten Minilinse, welche ein Bild eines Ausschnittes der
Probe in einer Zwischenebene erzeugt, und jedes dieser Zwi
schenbilder wird dann auf ein jeweils zugeordnetes CCD-Element
abgebildet, mittels einer gemeinsamen Feldlinse. Durch ein
solches "gesplittetes" Linsensystem erfolgt eine Projektion
einzelner verschiedener, jeweils parallaxenfrei erzeugter Zwi
schenbilder von diskreten Ausschnitten der Gegenstandsebene auf
die CCD-Elemente. Insoweit ist die Wirkung eher vergleichbar
derjenigen eines Lichtleiterbündels.
Beide vorstehend genannten Verfahren einer parallelen bzw.
quasi-parallelen Detektion haben den Nachteil, daß relativ
komplizierte Mittel erforderlich sind, um die verschiedenen
Lichtsignale den einzelnen Proben eindeutig zuzuordnen. Ein
gesplittetes Linsensystem oder ein hochauflösendes Lichtleiter
bündel zur parallaxenfreien Abbildung ist aufwändig und teuer,
und zwar umso mehr, je größer die Anzahl der Proben ist. Hinzu
kommt, daß die gesplittete Optik oder das Lichtleiterbündel an
die spezielle Ausbildung und Geometrie der Probenanordnung an
gepaßt sein muß. Dies bedingt, daß für die räumliche Anordnung
der Reaktionsgefäße bzw. Proben ein bestimmtes Format vorgege
ben wird, was aber von Nachteil ist, wenn die Anordnung von
Reaktionsgefäßen verändert werden soll oder wenn die Proben von
Fall zu Fall in nicht vorhersehbarer Weise unterschiedliche
Anordnung und/oder Geometrie haben. Dies kann z. B. bei Verwen
dung von Trägermaterialien wie Zellulosematrizen, bei denen
einzelne Spots als Reaktionsgefäße bzw. Proben benutzt werden,
durch die Einwirkung wäßriger Medien auf diese Trägermateria
lien in unerwünschter Weise vorkommen.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Technik vorzuse
hen, die es erlaubt, Daten über die Reaktionskinetik in einer
Vielzahl von Proben mit hoher zeitlicher Auflösung unter Ver
wendung optischer Abbildung zu gewinnen, wobei weder die Auflö
sung noch die Gesamtmeßzeit noch der Aufwand für die Abbil
dungsoptik nennenswert von der Anzahl der Proben abhängt. Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das im Patentanspruch 1
beschriebene Verfahren und durch die im Patentanspruch 6 be
schriebene Vorrichtung gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen
und Ausgestaltungen der Erfindung sind in Unteransprüchen
gekennzeichnet.
Das Prinzip der Erfindung besteht darin, die Verwendung einer
zyklisch abtastenden Bildaufnahmeeinrichtung zu kombinieren mit
(a) der Verwendung nur eines einzigen Objektivs zur Gesamt
abbildung aller Proben, (b) der Überlagerung einer virtuellen
Maske zur Abgrenzung der Proben in der Gesamtabbildung und (c)
einer Bestimmung der kinetischen Konstante der Reaktion nach
dem Zeitgesetz erster Ordnung in jeder Probe. Werden Reaktionen
nach dem Zeitgesetz erster Ordnung beobachtet, dann folgen die
diesbezüglichen Lichtmeßwerte zeitlich einer Exponentialfunk
tion, deren Zeitkonstante die kinetische Konstante dieser
Reaktion darstellt und unabhängig von irgendwelchen Maßstabs
faktoren der Funktion ist. Somit bleibt die Bestimmung der
kinetischen Konstante unberührt von den oben beschriebenen
Parallaxen-Effekten. Dies wiederum erlaubt die Verwendung nur
eines einzigen Objektivs, auch unter Inkaufnahme etwaiger
Parallaxen-Effekte. Der bisher notwendige Aufwand zur paral
laxenfreien Abbildung kann daher entfallen.
Ebenso entfallen auch die bisherigen Probleme hinsichtlich der
Kompatibilität zwischen der räumlichen Anordnung des Abbil
dungssystems und den jeweiligen Geometrien der Probenanordnung.
Änderungen oder Unterschiede in der räumlichen Anordnung der
Proben, z. B. unterschiedliche Formate der Anordnung der Reak
tionsgefäße oder unterschiedliche Formen bzw. Größen in der
Ausdehnung eines zu beobachteten Probenbereiches, können leicht
verkraftet werden. Für die Registrierung der Signale, also die
Bildaufnahme, muß lediglich sichergestellt sein, daß alle ge
wünschten Meßorte gleichzeitig von der Bildaufnahmeeinrichtung
"sichtbar" sind. Nur für die Auswertung der aufgenommenen Si
gnale bedarf es einer besonderen Berücksichtigung des Formates,
um die Bildbestandteile bzw. Pixel jeder einzelnen Probenabbil
dung gegenüber den anderen Probenabbildungen und gegenüber den
übrigen Bildbereichen abzugrenzen. Diese Abgrenzung erfolgt
einfach mittels Überlagerung einer virtuellen Maske, deren
Gestalt dem jeweiligen Format der Gefäßanordnung leicht ange
paßt werden kann. Eine solche Maske kann aus einem Vorrat vor
gespeicherter Masken abgerufen werden; sie kann aber auch von
Fall zu Fall neu definiert werden, unter Beobachtung des auf
genommenen Gesamtbildes der Gefäßeinrichtung. Bei Realzeit-
Auswertung muß die Maske natürlich vor dem Start der Reaktionen
definiert werden.
In vielen Fällen ist es jedoch vorteilhafter, die Maske erst
nach erfolgter Aufzeichnung der Bildsignale zu definieren,
unter Beobachtung eines Standbildes aus der Aufzeichnung, um
die Maske optimal auf die Gegebenheiten des tatsächlich statt
gefunden Reaktionsablaufes abzustimmen. Die Ableitung der Meß
werte mittels der Maske und die Auswertung geschieht dann an
schließend anhand der wiederabgespielten Aufzeichnung. Hierbei
kann die Abspielung mit verlangsamter Geschwindigkeit erfolgen,
zur Anpassung an die Leistungsfähigkeit der verwendeten Verar
beitungsmittel.
Die nachträgliche Definition der virtuellen Maske ist auch dann
von besonderem Vorteil, wenn die Proben jeweils Zellkulturen
sind und sich etwa beim Ausplattieren einer Zellkultur auf ein
festes Kulturmedium die Lage der anwachsenden Kulturen in zu
fälliger, nicht vorhersagbarer Weise ausbildet.
Allgemein gilt, daß die Abgrenzung der auszuwertenden Bildberei
che mittels einer virtuellen Maske zu einer wesentlichen
Verminderung der zu verarbeitenden Datenmenge führt. Die Daten
gewinnung kann jeweils auf das Wesentliche konzentriert werden,
so daß trotz möglicher hoher räumlicher und zeitlicher Auflö
sung die Datenflut in vertretbaren Grenzen gehalten werden
kann.
Eine Verringerung der Datenmenge kann man ohne Nachteil in
allen Fällen auch erreichen, indem man die zur Auswertung her
angezogenen Meßwerte für jeden Meßort zeitlich nicht äquidi
stant sondern derart ableitet, daß der Abstand aufeinan
derfolgender Meßwerte in zeitlich hochaufzulösenden Abschnitten
des Reaktionsverlaufes größer ist als in Abschnitten, wo eine
geringere zeitliche Auflösung tolerierbar ist. So kann man den
zeitlichen Abstand der zur Auswertung herangezogenen aufeinan
derfolgenden Meßwerte in Abschnitten schnellerer Lichtsignal
änderungen kleiner wählen als in Abschnitten langsamerer Licht
signaländerungen. Diese Möglichkeit gab es bei den vorbekannten
Verfahren nicht, bei denen sich die Bewertungsverfahren an ei
nem konstanten Signal/Zeit-Quotienten orientierten, so daß die
Auswertung stets anhand zeitlich äquidistanter Meßpunkte erfol
gen mußte.
Durch die erfindungsgemäße Bildaufnahme können Lichtsignale von
einer Vielzahl verschiedener Meßorte nahezu gleichzeitig und in
schneller Folge registriert werden. Die Lichtsignale lassen
sich als Bildsignale mittels üblicher Aufzeichnung auf üblichen
Datenträgern sichern.
Als Bildaufnahmeeinrichtung kann im Grunde jede Einrichtung
verwendet werden, die in der Lage ist, aufeinanderfolgende Ein
zelbilder der Gefäßeinrichtung so aufzunehmen, daß sich hieraus
verarbeitbare Bildsignale ableiten lassen. Vorzugsweise wird
eine Videokamera verwendet, die während der zu erwartenden Re
aktionsdauer in der üblichen Weise zur periodischen Abtastung
ihres Bildrasters betrieben wird, um die auszuwertenden Bild
signale direkt als Videosignale zu erzeugen. Brauchbar ist aber
auch eine elektronische Kamera, die aufeinanderfolgende Einzel
bilder jeweils als Standbild nach jeweiliger Einzel-Auslösung
aufnimmt und entsprechende elektrische Bildsignale liefert. Die
zur Auswertung heranzuziehenden Meßwerte können in diesen bei
den Fällen in Realzeit "live" aus Bildsignalen schon während
des Betriebs der Kamera abgeleitet werden; die Meßwerte können
aber auch, was in vielen Fällen vorzuziehen ist, aus einer Auf
zeichnung der elektrischen Bildsignale abgeleitet werden. Im
Rahmen der Erfindung ist es auch möglich, die Einzelbilder mit
tels einer Laufbild- oder Einzelbildkamera auf ein photoemp
findliches Medium wie z. B. einen Film aufzuzeichnen, das dann
(nach Entwicklung und Fixierung) zur Erzeugung verarbeitbarer
elektrischer Signale mittels eines Scanners abgetastet wird.
Die Anzahl der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beobacht
baren Meßorte wird durch das Auflösungsvermögen der verwendeten
Bildaufnahme- bzw. Abtasteinrichtung bestimmt. Bereits das Auf
lösungsvermögen relativ billiger Videokameras von einigen hun
derttausend Pixeln pro Vollbild kann gut ausreichen, die Reak
tionen an mehr als hundert verschiedenen Proben gleichzeitig
photometrisch zu registrieren. Die Vielzahl der Proben können
sich in einer entsprechenden Vielzahl von Reaktionsgefäßen
befinden, sie können aber auch verschiedene Orte in einem Reak
tionsgefäß einnehmen.
Die Signale etwa einer Videoaufnahme, wie sie vorzugsweise
genutzt wird, besitzen eine weitgehend lineare Abhängigkeit
zwischen Konzentration eines Indikatorfarbstoffes in einer
Probe und dem Farbwert des Videosignals der betreffenden Pro
benabbildung. In den meisten Fällen können also Pixelwerte des
Videosignals in linearem Maßstab die Farbstoffkonzentration
anzeigen, was die Auswertung sehr vereinfacht. In davon abwei
chenden Fällen kann man eine nichtlineare Abhängigkeit durch
Mitführen geeigneter Konzentrationsreihen berücksichtigen:
Durch Anpassen nichtlinearer Kurven mittels geeigneter Verfah ren, wie z. B. mittels einer Spline-Funktion, kann diese Abhän gigkeit mathematisch definiert werden. Diese Funktion kann dann weiterhin genutzt werden um die unmittelbar durch das Bild signal registrierten Farbwerte in entsprechender Weise zu kor rigieren, d. h. auf die tatsächliche Konzentration zu kalibrieren.
Durch Anpassen nichtlinearer Kurven mittels geeigneter Verfah ren, wie z. B. mittels einer Spline-Funktion, kann diese Abhän gigkeit mathematisch definiert werden. Diese Funktion kann dann weiterhin genutzt werden um die unmittelbar durch das Bild signal registrierten Farbwerte in entsprechender Weise zu kor rigieren, d. h. auf die tatsächliche Konzentration zu kalibrieren.
Um die zu registrierenden Lichtsignale von störenden Signalen
zu trennen, kann es von Vorteil sein, Filter einzusetzen. Im
Falle einer Anregung der Lichtsignale durch UV-Bestrahlung kann
z. B. ein Schwerpunktfilter mit einer Durchlässigkeit zwischen
280 und 360 nm verwendet werden, um das UV-Anregungssignal der
Lichtquelle zu filtern, und des weiteren ein Schwerpunktfilter
unmittelbar vor der Kameralinse, um das Signallicht zu filtern.
Letzeres ist von Vorteil, wenn eine monochromatische Bildauf
nahmeeinrichtung verwendet wird; im Falle einer farbtauglichen
Bildaufnahmeeinrichtung können auszuwertende Farbanteile des
Signallichtes gewünschtenfalls durch "elektronische Filterung"
selektiert werden, d. h. durch Einstellung des Anteilsverhält
nisses der Primärfarbkomponenten des Farbbildsignals.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der beigefügten Zeichnun
gen und anhand einiger Ausführungsbeispiele erläutert.
Fig. 1 zeigt schematisch, teilweise in Blockform, ein Beispiel
für den Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens;
Fig. 2 zeigt schematisch die Draufsicht auf die Kavitäten
einer Titerplatte als Beispiel für eine typische
Anordnung einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen;
Fig. 3 zeigt die Gestalt einer virtuellen Maske für die
Abbildung der Gefäßanordnung nach Fig. 2;
Fig. 4 zeigt ein Beispiel für eine nicht-äquidistante
Meßwertnahme;
Fig. 5 und 6 zeigen ein Beispiel für die Ausbildung von
Zellkulturen in einem Reaktionsgefäß und die Anordnung
geeigneter Maskenöffnungen zu deren Beobachtung.
Die in der Fig. 1 gezeigte Vorrichtung enthält eine insgesamt
mit 10 bezeichnete Gefäßeinrichtung, im dargestellten Fall mit
einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen 11 (in Schnittansicht ge
zeigt). Die Reaktionsgefäße 11 enthalten Proben 12 von Zusam
mensetzungen, in denen Reaktionen ablaufen, die photometrisch
überwacht werden sollen, um Lichtsignale zu registrieren, die
charakteristisch für die Reaktionsabläufe sind. Die Gefäßein
richtung 10 kann, wie als Beispiel schematisch gezeigt, eine
Titerplatte sein, deren Kavitäten die Reaktionsgefäße 11 bil
den. Es kann auch eine beliebige Anordnung anderer Reaktions
gefäße verwendet werden, z. B. eine Anordnung einzelner Küvet
ten oder ein Trägermaterial wie etwa eine Zellulosematrix, in
der einzelne Spots die Reaktionsgefäße bilden. Jedes der Ge
fäße bzw. jeder Spot bildet einen gesonderten diskreten Meßort
für eine durchzuführende photometrische Messung. Jedes Gefäß
kann aber selbst wiederum einer Summe diskreter Meßorte beein
halten, die sich selektiv mit einer virtuellen Maske in einem
aufgenommenen Bild abgrenzen und bewerten lassen. Die Gefäß
einrichtung 10 kann aber auch ein einziges Gefäß
sein, in welchem an unterschiedlichen Stellen
Reaktionen mit unterschiedlicher Kinetik ablaufen können. In
diesem Fall bilden die jeweils zu überwachenden Stellen der
Probe diskrete Meßorte.
Oberhalb der Gefäßeinrichtung 10 ist eine Bildaufnahmeeinrich
tung 20, die mononochromatisch oder farbtauglich sein kann, so
angeordnet, daß sie von oben alle Meßorte gleichzeitig über
blickt. Das heißt, das Objektiv 21 der Bildaufnahmeeinrichtung
20 bildet die Draufsicht der Gefäßeinrichtung 10 auf einer
lichtempfindlichen Bildaufnahmefläche (z. B einem CCD-Bildsen
sor im Falle einer elektronischen Kamera) ab. Jeder Meßort ist
also anhand der Bildkoordinaten seiner Abbildung eindeutig
identifizierbar. Die Bildaufnahmeeinrichtung 20 sei im darge
stellten Beispielsfall eine Videokamera und kann gewünschten
falls so ausgelegt sein, daß die Bildwiederholfrequenz
(Rasterabtastrate bzw. Vollbildfrequenz) veränderbar ist.
Die in der Zeichnung dargestellte Vorrichtung enthält ferner
eine aus Lampen 31, 32 bestehende Beleuchtungseinrichtung, um die Meßorte in der
Gefäßeinrichtung 10 derart zu bestrahlen, daß die Reaktions
abläufe anhand von Lichtsignalen beobachtet werden können. Die
Art der Beleuchtung wird abhängig davon gewählt, welche Art
von Lichterscheinung oder optischer Eigenschaft als Indikation
für das Fortschreiten der ablaufenden Reaktionen genutzt wer
den soll. Beim dargestellten Beispiel sind seitlich der Bildaufnahmeeinrichtung
20 vier um 90° winkelversetzte Lampen 31 vorgesehen (von denen
nur die beiden vorderen zu sehen sind), welche die Proben 12
von oben bestrahlen, und eine unter der (transparenten) Gefäß
einrichtung 10 angeordnete Lampe 32, welche die Proben 12 von
unten bestrahlt. Für die Anordnung der Lampen
kann aber auch eine andere, für die Lichtmessung geeignete
Geometrie gewählt werden.
Soll z. B. Fluoreszenz oder Lumineszenz als reaktionsindizie
rende Größe beobachtet werden, wird für die Beleuchtung eine
entsprechende anregende Strahlung verwendet, z. B. UV-Licht,
vorzugsweise aus allen Lampen 31 und 32. Um Nutzlicht von
Störlicht zu trennen, können Filter benutzt werden, vorzugs
weise Schwerpunktfilter (z. B. Durchlässigkeitsbereich zwischen
280 und 360 nm) an den UV-Lampen (nicht dargestellt) und ein
Schwerpunktfilter 22 (z. B. 430 ± 10 nm) zum Durchlassen des
Luminenzlichtes vor dem Objektiv 21.
Werden Indikatorfarbstoffe in den Proben verwendet, können die
Proben durch sichtbares Licht beleuchtet werden. Hierbei kann
mit Auflicht unter Verwendung der Lampen 31 und/oder mit
Durchlicht unter Verwendung der Lampe 32 gearbeitet werden.
Zur Beobachtung von Lichtabsorption verwendet man vorzugsweise
nur die Lampe 32 als Durchlicht-Beleuchtungsquelle. Um Nutz
licht von Störlicht zu trennen oder bestimmte Farbeffekte in
den Proben selektiv zu registrieren, können auch hier Filter,
gegebenenfalls dem jeweiligen Farbstoff angepaßt, an den
Lampen 31, 32 bzw. vor dem Objektiv 21 benutzt werden. Ist die Bildaufnahme
einrichtung 20 eine Farbkamera, kann eine eventuell erwünschte Farbselektion
auch elektronisch bei der Signalverarbeitung erfolgen, durch
entsprechende relative Gewichtung der Primärfarbkomponenten
des Farbbildsignals (z. B. der Rot-, Grün- und Blau-Komponente
bei einem RGB-Videosignal).
Soll Chemolumineszenz als reaktionsindizierende Größe beobach
tet werden, bleiben die Lampen 31, 32 vorzugs
weise ausgeschaltet.
Die in der Zeichnung gezeigte Vorrichtung enthält ferner Verarbeitungsmittel 40 in
Form eines Computers, einen Monitor 50 und eine Aufzeichnungs- und
Abspieleinrichtung 60 für Videosignale. Der Videosignalausgang der Bild
aufnahmeeinrichtung 20 führt zur Einrichtung 60 und von dort zu Videosignal
eingängen des Monitors 50 und der Verarbeitungsmittel 40. Es sind (nicht
dargestellte) Schaltmittel vorgesehen, um die Videosignale von
der Bildaufnahmeeinrichtung 20 wahlweise mit oder ohne gleichzeitige Aufzeich
nung in der Einrichtung 60 auf den Monitor 50 und/oder auf die Verarbeitungsmittel 40
koppeln zu können und um aufgezeichnete Videosignale aus
der Einrichtung 60 zum Monitor 50 und/oder zu den Verarbeitungsmitteln 40 koppeln
zu können.
Die Verarbeitungsmittel 40 enthalten Prozessoren 41 und Speichereinrichtun
gen 42 zur programmgesteuerten Verarbeitung und Auswertung der
Videosignale. Eine allgemein als Block 70 dargestellte Einga
bevorrichtung enthält Mittel für Nutzereingaben (Tastatur,
Maus) an den Verarbeitungsmitteln 40. Weitere Peripheriegeräte, stellvertre
tend durch den Block 80 dargestellt, können Ausgabeeinrichtun
gen wie z. B einen Drucker oder zusätzliche Datenträger enthal
ten. Zwischen den Verarbeitungsmitteln 40 und dem Monitor 50 ist die übliche
Datenkommunikationsverbindung vorgesehen, um von den Verarbeitungsmitteln
verarbeitete Bildsignale, Graphiken als Ergebnisse der Auswer
tung von Videosignalen und von den Verarbeitungsmitteln generierte Ikons,
Befehls- und Anzeigefelder, Masken, Fenster, Mitteilungen,
Menüs u. dergl. wiederzugeben.
Zur Durchführung des Verfahrens wird die
Gefäßeinrichtung 10 mit der oder den zu beobachtenden Probe(n)
gefüllt und in das Gesichtsfeld der Bildaufnahmeeinrichtung 20 gebracht,
und gewünschtenfalls werden die Lampe 31 und/oder die Lampe 32 und
die Bildaufnahmeeinrichtung 20 eingeschaltet. Das von der Bildaufnahmeeinrichtung 20 nach
deren Einschaltung gesehene Bild wird auf dem Bildschirm des
Monitors 50 wiedergegeben. Mit Hilfe der Verarbeitungsmittel 40 kann als
Schablone oder Maske ein frei definiertes virtuelles Netz
erzeugt und so auf dem Bildschirm positioniert werden, daß die
Innenseiten der Netzöffnungen bzw. die "Maschen" des Netzes
Bildausschnitte einrahmen, welche jeweils einen Meßort als
Fläche auf dem Bildschirm definieren. Die Art der Geometrie
dieser Flächen kann beliebig sein, z. B. kreisförmig oder
rechteckig.
Die Fig. 2 zeigt als Beispiel eine Gefäßeinrichtung 10 mit
einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen 11 in einer Ansicht, wie
sie von der Bildaufnahmeeinrichtung 20 gesehen wird und auf dem Bildschirm des Monitors 50
abgebildet werden kann. Diese Gefäßeinrichtung 10 kann eine
Titerplatte sein, deren Kavitäten die Reaktionsgefäße 11 bilden. Der
Einfachheit halber sind nur 24 Kavitäten dargestellt, angeord
net in einer Matrix aus vier Reihen und sechs Spalten; in der
Praxis kann die Titerplatte weit mehr Kavitäten aufweisen, in
handelsüblichen Ausführungsformen z. B. 8 × 12 = 96 oder 16 × 24 = 384
Kavitäten. Die Reaktionsgefäße können auch einzelne Küvetten
sein oder Spots einer Spotmatrix von Proben (z. B. 20 × 20
Spots) auf einem geeigneten Trägermaterial.
Die Fig. 3 zeigt als Beispiel ein virtuelles Netz 90 in Form
einer Maske mit 24 quadratischen Teilflächen 91, welche ein
zelne Maskenöffnungen darstellen. Dieses Netz 90 ist dazu
konzipiert, der Abbildung der Gefäßeinrichtung 10 nach Fig. 2
überlagert zu werden. Jede Teilfläche 91 entspricht einem
"Meßort", d. h. sie definiert einen Bildbereich, der einem
auszuwertenden Bereich der in den Reaktionsgefäßen 11 enthaltenen
Proben entspricht.
Nach Festlegen der Datensammelrate (d. h. Meßwertnahme je Zeit
einheit) und nach dem Start der Reaktionen in den Reaktions
gefäßen können die Werte jeweils mehrerer oder aller Pixel der
einzelnen Teilflächen 91 jeweils mittels üblicher Algorithmen
integriert werden. Da jede Teilfläche einem Meßort entspricht,
repräsentieren die integrierten Daten aus jeder einzelnen Flä
che pro Rasterabtastperiode (Videovollbild) einen Lichtmeßwert
vom betreffenden Meßort. Es können auch Daten über jeweils
mehrere Vollbildperioden integriert werden, um jeweils einen
Lichtmeßwert zu bilden. Durch schrittweises Auswerten der
Videobilder können also zeitlich geordnete Meßwertreihen
erhalten werden, mit denen die Kinetik der chemischen
Reaktion, die in allen Reaktionsgefäßen abläuft, beschrieben
werden kann.
Diese Meßdaten können
für weitere
Bewertungen zugänglich abgespeichert oder graphisch dargestellt
werden. Eine solche graphische Darstellung kann auch
auf den Bildschirm des Monitors 50 wiedergegeben werden.
Beispielsweise können die berechneten Meßwertkurven in jeweils
einem eigenen kleinen Feld des Schirmbildes wiedergegeben
werden, wobei diese Graphikbildchen vorzugsweise in gleicher
räumlicher Anordnung zueinander angelegt werden, wie es der
Anordnung der Meßorte entspricht. Die Menge der Graphikbild
chen kann entweder bildschirmfüllend oder in einem gesonderten
Abschnitt des Schirms neben der Meßortabbildung wiedergegeben
werden.
Mittels bekannter Rechenverfahren werden aus den Meßdaten die kinetischen
Konstanten der Reaktionen nach dem Zeitgesetz erster Ordnung berechnet.
Die Gewinnung der einzelnen Meßwerte (Datenpunkte) kann gewünschten
falls nicht äquidistant erfolgen, angepaßt an die Nichtlineari
tät entsprechend dem Zeitgesetz erster Ordnung.
Ein Beispiel für eine nicht äquidistante Meßwertnahme ist
qualitativ in der Fig. 4 veranschaulicht. Diese Figur zeigt
den zeitlichen Verlauf der an einer Probe beobachtbaren
Lichtintensität L im Falle einer Reaktion erster Ordnung. Die
Meßgröße steigt nach dem Start der Reaktion steil an und wird
dann zunehmend flacher. Zur genauen Auswertung genügt eine
hohe zeitliche Auflösung der Meßwertnahme nur in den Bereichen
steilen Anstiegs, während man sich in anderen Bereichen mit
geringerer Auflösung begnügen kann, um die Datenmenge zu
reduzieren. Diesem Prinzip folgt das in der Fig. 4 gezeigte
Schema, indem die zeitlichen Abstände der Meßwertnahme zu
Beginn der Reaktion sehr klein und dann zunehmend größer
gewählt werden, wie es die diskreten Punkte in der Fig. 4 rein
qualitativ veranschaulichen. Als praktisches Beispiel für eine
Reaktion erster Ordnung mit einer Reaktionsdauer von 900
Sekunden kann zu Beginn ein Zeitabstand von 0,4 Sekunden
gewählt werden, der bis zum Ende der Reaktion allmählich auf
etwa 80 Sekunden vergrößert wird, um insgesamt nur etwa 500
Meßwerte zu erhalten (statt 2250 Meßwerte im Falle einer
durchgehenden unveränderten Zeitauflösung von 0,4 Sekunden).
Im folgenden werden vier spezielle Beispiele für die Durchfüh
rung des Verfahrens beschrieben.
Bei diesem Beispiel wird zur Bildung der Reaktionsgefäße ein
96 mal 140 mm großes Trägermaterial (Zellulose, Whatman 540)
verwendet, auf welches eine Peptidbibliothek der Sequenz QUE-
XaaXaaF-FLU-Z, in der QUE als Fluoreszenzquencher, Xaa als
eine mögliche natürliche Aminosäure und FLU als ein Fluorogen
dienen, in einer Spotmatrix von 400 (20 × 20 Spots) aufsyntheti
siert wird. Unter dem Trägermaterial befindet sich eine Wanne,
und darüber sind im Abstand von 30 cm eine handelsübliche
Farb-Videokamera als Bildaufnahmeeinrichtung 20 und seitlich davon vier UV-Lampen 31 (wie
in der Zeichnung gezeigt) angebracht. Unmittelbar vor dem
Objektiv 21 ist ein Schwerpunktfilter 22 (430 ± 15 nm)
angebracht. Die Wanne ist gefüllt mit 10 ml einer gepufferten
Chymotrypsinlösung (0,1 mg/ml Chymotrypsin; 0,1 M Phosphatpuf
fer pH 7.8).
Durch Eintauchen der Spotmatrix in die Chymotrypsinlösung wird
die Reaktion gestartet. Die Zunahme der Fluoreszenz durch
chymotryptische Hydrolyse wird mittels der als Bildaufnahmeeinrichtung 20 verwendeten Videokamera bei
einer Bildwiederholfrequenz von 20 Vollbildern je Sekunde für
eine Dauer von 15 min nach Start der Reaktion vom Gerät 60
aufgezeichnet.
Zur Auswertung wird, während des Abspielens der aufgezeichne
ten Videosequenzen, auf dem Bildschirm des Monitors 50 ein
virtuelles Netz von 20 mal 20 Einzelflächen so angeordnet, daß
repräsentative kreisrunde Flächen der 400 Spots abgegrenzt
werden. Durch Integration von 16 Pixeln je Einzelfläche über
jeweils 10 Vollbilder, was einer Meßwertrate von jeweils einem
Meßwert je 10 Vollbilder bzw. von 2 Meßwerten pro Sekunde für
jeden Spot entspricht, werden alle 400 Spots kinetisch ausge
wertet, und mittels linearer Regression werden die Anfangs
anstiege berechnet. Der Vergleich der synthetisierten Peptid
sequenzen mit den berechneten kinetischen Konstanten läßt
Rückschlüsse über die Substratspezifität der verwendeten
Protease zu.
Als Anordnung von Reaktionsgefäßen wird hier eine Titerplatte
mit 96 Kavitäten verwendet. In die Kavitäten werden je 137 µl
einer Lösung aus 7 µl Serum, 50 µl Substratlösung (123 mg/L
Succinyl-Phe-Pro-Phe-4-nitroanilid in 35 mmol/L HEPES Puffer,
pH 7,8) und 80 µl Chymotrypsin-Lösung (1 g/L Chymotrypsin in
35 mmol/L HEPES Puffer, pH 7,8) pipettiert.
Die Reaktion wird jeweils durch die Zugabe der 50-µl-Substrat
lösung gleichzeitig zu allen Kavitäten mittels eines handels
üblichen Pipettiersystems gestartet. Während der Reaktion wird
die Titerplatte von unten mittels weißem Licht (z. B. durch die
Lampe 32 bei der in der Zeichnung dargestellten Apparatur)
gleichmäßig angestrahlt. Die Änderung der Lichtabsorption wird
mittels der als Bildaufnahmeeinrichtung 20 verwendeten Videokamera bei einer Bildwiederholfrequenz von
20 Vollbildern je Sekunde für 20 min nach Start der Reaktion
aufgezeichnet. Das geeignete Lichtsignal wird durch Vorschal
ten eines Schwerpunktfilters 22 (390 ± 5 nm) vor das Objektiv 21
der Bildaufnahmeeinrichtung 20 erhalten.
Zur Auswertung wird, vor dem Abspielen der aufgezeichneten
Videosequenzen, auf dem Bildschirm des Monitors 50 ein stehen
des Bild der 96 Kavitäten erzeugt, und ein virtuelles Netz von
8 mal 12 Einzelflächen wird so auf dem Bildschirm angeordnet,
daß repräsentative Flächen der 96 Spots einzeln abgegrenzt
werden. Während des Vorlaufs der Videosequenzen mit einer
Bildwiederholfrequenz von 10 Vollbildern je Sekunde wird durch
Integration von 3 mal 3 Pixeln je Einzelfläche die Änderung
der Lichtabsorption aller 96 Kavitäten erfaßt.
Die Reaktion wird gemäß einem Konzentrations-Zeitgesetz ers
ter Ordnung ausgewertet. Die Reaktionsgeschwindig
keits-Konstanten befinden sich im Bereich zwischen 4.10-3 und
3.10-2 je Sekunde. Zur Berechnung der Reaktionskonstanten
werden Datensammelraten verwendet, die folgendem Zeitgesetz
entsprechen:
Dsz = ln(1 - A)/k, mit A = [1 - exp(- k.gZ)]/Dp.
Es bedeuten:
Dsz = Zeit, zu der ein Meßpunkt zur Berechnung herangezogen wird;
k = kinetische Konstante einer Reaktion erster Ordnung
gZ = gesamte Reaktionszeit, über die die Reaktion beobach tet wird;
Dp = Anzahl aller Datenpunkte, mit der die Reaktion be schrieben wird.
Dsz = Zeit, zu der ein Meßpunkt zur Berechnung herangezogen wird;
k = kinetische Konstante einer Reaktion erster Ordnung
gZ = gesamte Reaktionszeit, über die die Reaktion beobach tet wird;
Dp = Anzahl aller Datenpunkte, mit der die Reaktion be schrieben wird.
Mittels dieser Datenpunkte können nun die genauen kinetischen
Konstanten mittels üblicher Algorithmen berechnet werden. Der
Vergleich dieser Konstanten einzelner Kavitäten erlaubt die
Charakterisierung der Peptidyl-prolyl-cis/trans-Isomerase-
Aktivitäten in humanem Serum.
In eine Titerplatte mit 16 mal 24 Kavitäten werden je 70 µl
Substratlösung 10 µl Enzymlösung und 1 µl einer DMSO-Lösung
pipettiert. Die DMSO-Lösung enthält jeweils unterschiedliche
Naturstoffe einer Naturstoffbank, in einer Konzentration von 1 mg
je ml DMSO. Einige der Lösungen enthalten als Kontrolle
keine solche Zusätze. Das Substrat besitzt die Sequenz A1-A2-
A3-P-A4-A5-A6. Dabei steht P für die Aminosäure Prolin. A1,
A2, A3, A4, A5, A6 stehen für Peptide, vorzugsweise aber
Aminosäuren, aber auch Verbindungen, die sich innerhalb von
Peptidketten einbauen lassen und bei Anregung mit einer geeig
neten Wellenlänge fluoreszieren, bzw. auch Verbindungen, die
bei entsprechender Geometrie und geeignetem Abstand von der
fluoreszierenden Verbindung diese Fluoreszenz löschen (quen
chen) können. Die verwendeten Aminosäuren bzw. Peptide können
mit dem Fachmann bekannten chemischen Modifizierungen weit
gehend verändert sein.
Ein besonderes Kennzeichen dieser Substrate ist, daß es unter
geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer zeitweilig bestän
digen Verbindung zwischen chemischen Funktionalitäten kommen
kann, die zu einem Ringschluß führen können, die die Amino
säure Prolin einschließen. Dieser Ringschluß führt zu der
besonderen Eigenschaft dieser Substrate, daß sich die Konzen
tration der Konformation der Peptidyl-Prolyl-Bindung dieses
Ringes von der Konzentration unterscheidet, die dieses Sub
strat ohne einen solchen Ring in wäßrigen Lösungen, mit phy
siologischen Eigenschaften, ausbilden. Eine weitere Beson
derheit dieser Substrate ist die Eigenschaft, daß dieser
molekulare Geometrieunterschied zwischen offenkettiger und
ringförmiger Struktur zu einem Unterschied in der Fluoreszenz
führt. Die Öffnung des Ringes kann durch physikalische Metho
den erfolgen, so z. B. durch einen Lichtblitz, wenn der Ring
schluß lichtempfindlich ist, sie kann aber auch durch chemi
sche Reagenzien (Starter) ausgelöst werden, wenn der Ring
schluß chemisch empfindliche Gruppierungen wie z. B. protease
sensible Schnittstellen aufweist. Erfolgt die Ringöffnung
durch geeignete Versuchsanordnung so schnell, daß die Einstel
lung des Konformerengleichgewichtes geschwindigkeitsbestimmend
wird, kann dessen Katalyse anhand der Fluoreszenzänderung
beobachtet werden.
Beim hier beschriebenen Verfahrensbeispiel erfolgt die enzyma
tische Katalyse durch Zugabe von 10 µl einer Lösung von Cyclophylin
als Peptidylprolyl-cis/trans-Isomerase. Die Ringöffnung
je Kavität gelingt nach Zugabe von 40 µl Starter innerhalb von
7 sec. Eine notwendige schnelle Mischung wird durch eine
berührungsfreie Methode innerhalb dieser Zeit erreicht. Die
Zugabe des Starters erfolgt hierbei mittels einer 16-fach-
Dosiereinrichtung sequentiell in aufeinanderfolgende 16er-
Reihen der Kavitäten, innerhalb einer Zeit von 4 Sekunden für
alle 16 mal 24 Kavitäten. Dabei gelangt jeweils innerhalb von
3 Sekunden nach Start der Reaktion die jeweilige 16er-Reihe
zur Auswertung. Danach werden alle Kavitäten über eine Zeit
von 20 Minuten gemäß den spektroskopischen Gegebenheiten wie
Beispiel 1 und mit einer Datensammelrate vermessen, die
ähnlich variiert, wie es in Fig. 4 gezeigt ist, entsprechend
einem Zeitgesetz erster Ordnung unter Zugrundelegung einer
Geschwindigkweitskonstante von 4.10-3 s-1 und einer Gesamt
anzahl von 999 Meßwerten je Kavität.
Die Draufsicht auf die Titerplatte wird von der Bildaufnahmeeinrichtung 20
aufgenommen und als Gesamtbild auf dem Monitor 50 wiedergege
ben. Über dieses Bild wird ein virtuelles Netz von 16 mal 24
rechteckigen Einzelflächen so auf dem Bildschirm angeordnet,
daß diese jeweils einen Ausschnitt der Probenabbildungen in
den Kavitäten der Titerplatte abgrenzen. Nach dem Start der
Reaktion und Vermischen der 40 µl Starterlösung in den jeweils
90 µl Vorlagelösung (10 µl Enzym- und 80 µl Substratlösung)
werden, durch Integration von jeweils 4 Pixeln innerhalb jeder
Einzelfläche bei oben beschriebener Registrierhäufigkeit von
insgesamt 999 Meßpunkten je Kavität, alle 384 Flächen zeitbe
zogen ausgewertet, und nach Anpassen einer Reaktion gemäß
einem Geschwindigkeitsgesetz erster Ordnung werden die Geschwin
digkeitskonstanten berechnet. Der Vergleich der Geschwindig
keitskonstanten aller Kavitäten miteinander, beispielsweise
als Balkendiagramm, läßt Wirkstoffe erkennen, die die Aktivi
tät des zugesetzten Enzyms inhibieren.
Dieses Beispiel entspricht im wesentlichem dem Beispiel 3. Es
demonstriert aber in besonderer Weise den Einsatz des Meßver
fahrens innerhalb eines Massenscreenings ("Highthroughput").
Nach Zuführung einer vorbereiteten Titerplatte (16 mal 24
Kavitäten) auf einen Titerplatten-Trägerschlitten des Meßplat
zes beginnt jeweils ein neuer Meßzyklus. Die Vorbereitung
der Titerplatte beinhaltet das Zupipettieren aller notwendigen
Reagenzien in den geeigneten Mengen, so daß durch Zugabe eines
Startreagenz die zu beurteilende Reaktion gestartet werden
kann. Folgende Schritte laufen dann ohne manuelles Eingreifen
automatisch ab:
- 1. Die Titerplatte wird sequentiell mit Startreagenz verse hen.
- 2. Die einzelnen Kavitäten der Titerplatte werden berührungs frei durch Zugabe eines gepulsten Luftstromes homogen gemischt.
- 3. Die Titerplatte fährt unmittelbar weiter in die Zone der Beobachtung, d. h. in das Gesichtsfeld der Bildaufnahmeeinrichtung 20.
- 4. Beim automatischen Bewegen der Titerplatte erfolgt die Lesung der Titerplattenkennung mittels Balkencode- Lesegerät.
- 5. über 20 Minuten erfolgt die Registrierung der Meßsignale, wie dies in Beispiel 3 beschrieben wurde.
- 6. Die 383616 Originalmeßdaten (16 mal 24 mal 999) werden automatisch von den Verarbeitungsmitteln 40 als Datenfile, welches an der Titerplattenkodierung und dem Datum erkennbar ist, auf einem Datenträger (Server) abgelegt.
- 7. Alle Meßdaten werden kavitätsbezogen verrechnet, wie dies im Beispiel 3 beschrieben wurde.
- 8. Die kavitätsbezogenen Ergebnisse, wie Geschwindigkeitskon stante, Amplitude, extrapolierte Endfluoreszenz werden ebenfalls automatisch von den Verarbeitungsmitteln 40 als Datenfile, welches an der Titerplattenkodierung und dem Datum erkenn bar ist, auf einem Datenträger (Server) abgelegt.
- 9. Entsprechend einem vorher eingegebenen Bewertungsmaßstab werden nichtplausible Messungen (dies sind insbesondere solche mit unerwartet extremen Meßwerten) aber auch solche, bei denen ein Bewertungskriterium im Sinne eines sogenannten "Hits" erfüllt wurde, auf einem angeschlosse nen Drucker ausgegeben.
- 10. Die Titerplatte wird aus der Beobachtungszone herausgefah ren und mittels geeigneter Hilfsmittel vom Meßschlitten entfernt.
- 11. Durch Zuführen einer weiteren Titerplatte wird ein näch ster Zyklus gestartet.
Wie bereits erwähnt, können die verschiedenen Proben
auch verschiedene Bereiche in einem
einzelnen Reaktionsgefäß sein, wobei die virtuelle Maske von
Fall zu Fall so angepaßt werden kann, daß Meßwerte nur für
diejenigen Bereiche abgeleitet werden, die eine
auszuwertende Reaktion zeigen. Ein Beispiel hierfür ist in den
Fig. 5 und 6 dargestellt. Die Fig. 5 zeigt das Bild eines
Reaktionsgefäßes 11 nach Ablauf einer Reaktionszeit, in
welcher sich eine Vielzahl diskreter, optisch als Flecken
erkennbarer Zellkulturen entwickelt hat. Anhand dieses
"letzten" Bildes einer zuvor aufgezeichneten Bilderfolge wird
auf dem Bildschirm eine Maske definiert, deren Öffnungen als Teilflächen 91
die einzelnen Kulturen umgrenzen, wie in Fig. 6 gezeigt. Die Aufzeichnung der Bilder
folge wird dann wieder abgespielt, und die entsprechend den
Maskenöffnungen selektierten Bildsignale werden ausgewertet.
Das Erkennen der Flecken und die Plazierung der Maskenöffnun
gen kann auch durch geeignete Bildverarbeitungs-Software
automatisch erfolgen. Für die Auswertung kann mit Globalmeß
werten für jeden Meßort durch räumliche Integration der Meß
ortpixel gearbeitet werden.
Wie weiter oben angesprochen, läßt sich das vorstehend beschriebene Verfahren
auch mit Bildaufnahmeeinrichtungen realisieren, die Bild
information nicht selbst in elektrische Signale umwandeln,
sondern z. B. auf photographische Bildträger aufzeichnen. In
diesem Fall werden die zu verarbeitenden Bildsignale durch
Abtastung dieser Bildträger mittels eines geeigneten Scanners
gewonnen (z. B. mittels eines Filmabtasters, wenn der Bildträ
ger ein photographischer Kinofilm ist).
Claims (11)
1. Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben
über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Viel
zahl von Proben, durch optische Überwachung der Reaktions
abläufe und Auswertung der dabei detektierten Lichtsignale,
wobei zur Detektion der Lichtsignale Strahlung aus den gleichzeitig bereitgestellten Proben an unterschiedliche Orte der Bildaufnahmefläche einer Bildaufnahmeeinrichtung übertragen wird, die während der zu erwartenden Dauer der Reaktionen zyklisch abgetastet wird, um für verschiedene Orte der Bild aufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender Licht meßwerte zu erhalten, die ausgewertet werden,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Gesamtansicht aller Proben über ein einziges Objek tiv (21) der Bildaufnahmeeinrichtung (20) auf die Bildaufnahme fläche als Gesamtabbildung abgebildet wird,
daß bei der Abtastung dieser Gesamtabbildung eine virtuelle Maske mit einer Vielzahl von Öffnungen überlagert wird, deren jede eine Menge von Pixeln aus dem einer jeweils zugeordneten Probe entsprechenden Teil der Gesamtabbildung abgrenzt,
und daß die Lichtmeßwerte aus jeder dieser abgegrenzten Mengen von Pixeln abgeleitet und zur Bestimmung der kinetischen Konstante der Reaktion nach dem Zeitgesetz erster Ordnung in der betref fenden Probe ausgewertet werden.
wobei zur Detektion der Lichtsignale Strahlung aus den gleichzeitig bereitgestellten Proben an unterschiedliche Orte der Bildaufnahmefläche einer Bildaufnahmeeinrichtung übertragen wird, die während der zu erwartenden Dauer der Reaktionen zyklisch abgetastet wird, um für verschiedene Orte der Bild aufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender Licht meßwerte zu erhalten, die ausgewertet werden,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Gesamtansicht aller Proben über ein einziges Objek tiv (21) der Bildaufnahmeeinrichtung (20) auf die Bildaufnahme fläche als Gesamtabbildung abgebildet wird,
daß bei der Abtastung dieser Gesamtabbildung eine virtuelle Maske mit einer Vielzahl von Öffnungen überlagert wird, deren jede eine Menge von Pixeln aus dem einer jeweils zugeordneten Probe entsprechenden Teil der Gesamtabbildung abgrenzt,
und daß die Lichtmeßwerte aus jeder dieser abgegrenzten Mengen von Pixeln abgeleitet und zur Bestimmung der kinetischen Konstante der Reaktion nach dem Zeitgesetz erster Ordnung in der betref fenden Probe ausgewertet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Pixel in mindestens einer der abgegrenzten Pixelmengen
wiederholt und über jeweils eine vorgewählte Anzahl n ≧ 1 von
zyklischen Abtastungen integriert werden, um für die betref
fende Probe eine Reihe aufeinanderfolgender Globalmeßwerte zu
erhalten, anhand derer die Auswertung erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich
net,
daß die bei den aufeinanderfolgenden zyklischen Abtastungen erhaltenen Lichtsignale aufgezeichnet werden
und daß die zur Auswertung der Lichtsignale herangezogenen Meßwerte aus der wiederabgespielten Aufzeichnung abgeleitet werden.
daß die bei den aufeinanderfolgenden zyklischen Abtastungen erhaltenen Lichtsignale aufgezeichnet werden
und daß die zur Auswertung der Lichtsignale herangezogenen Meßwerte aus der wiederabgespielten Aufzeichnung abgeleitet werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die zur Auswertung der Lichtsignale
herangezogenen Meßwerte für jede Probe als eine nicht äquidi
stante Folge aus dem Bildsignal abgeleitet werden, derart, daß
der Abstand aufeinanderfolgender Meßwerte in zeitlich hoch
aufzulösenden Abschnitten des Reaktionsverlaufes größer ist als
in Abschnitten, wo eine geringere zeitliche Auflösung tolerier
bar ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
der Abstand der zur Auswertung herangezogenen aufeinanderfol
genden Meßwerte in Abschnitten schnellerer Lichtsignaländerun
gen kleiner gewählt wird als in Abschnitten langsamerer Licht
signaländerungen.
6. Vorrichtung zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß
geben über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer
Vielzahl von Proben, durch optische Überwachung der Reaktions
abläufe und Auswertung der dabei detektierten Lichtsignale, zur
Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
mit einer Gefäßeinrichtung (10) zur Aufnahme der Proben (12),
einer Bildaufnahmeeinrichtung (20) zum Übertragen von Strahlung aus den in der Gefäßeinrichtung (10) enthaltenen Proben an unterschiedliche Orte der Bildaufnahmefläche der Bildaufnahmeeinrichtung (20) und zum zyklischen Abtasten der Bildaufnahmefläche, um für verschiedene Orte der Bildaufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender Lichtmeßwerte zu erhalten, und mit
Verarbeitungsmitteln (40) zur getrennten Auswertung der für die verschiedenen Orte der Bildaufnahmefläche erhaltenen Licht meßwerte,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) ein einziges Objektiv enthält, das die Gesamtansicht des alle Proben enthaltenden Bereiches der Gefäßeinrichtung (10) auf die Bildaufnahmefläche abbildet,
die Verarbeitungsmittel (40) eine Einrichtung enthalten, um den bei der Abtastung erzeugten Bildsignalen eine virtuelle Maske mit einer Vielzahl von Öffnungen zu überlagern, deren jede eine Menge von Pixeln aus dem einer jeweils zugeordneten Probe entsprechenden Teil der Gesamtabbildung abgrenzt, und daß
die Verarbeitungsmittel ausgebildet sind, um aus jeder dieser ab gegrenzten Mengen von Pixeln die der betreffenden Probe zuge ordneten Lichtmeßwerte abzuleiten und daraus die kinetische Konstante der Reaktion erster Ordnung in der betreffenden Probe zu bestimmen.
mit einer Gefäßeinrichtung (10) zur Aufnahme der Proben (12),
einer Bildaufnahmeeinrichtung (20) zum Übertragen von Strahlung aus den in der Gefäßeinrichtung (10) enthaltenen Proben an unterschiedliche Orte der Bildaufnahmefläche der Bildaufnahmeeinrichtung (20) und zum zyklischen Abtasten der Bildaufnahmefläche, um für verschiedene Orte der Bildaufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender Lichtmeßwerte zu erhalten, und mit
Verarbeitungsmitteln (40) zur getrennten Auswertung der für die verschiedenen Orte der Bildaufnahmefläche erhaltenen Licht meßwerte,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) ein einziges Objektiv enthält, das die Gesamtansicht des alle Proben enthaltenden Bereiches der Gefäßeinrichtung (10) auf die Bildaufnahmefläche abbildet,
die Verarbeitungsmittel (40) eine Einrichtung enthalten, um den bei der Abtastung erzeugten Bildsignalen eine virtuelle Maske mit einer Vielzahl von Öffnungen zu überlagern, deren jede eine Menge von Pixeln aus dem einer jeweils zugeordneten Probe entsprechenden Teil der Gesamtabbildung abgrenzt, und daß
die Verarbeitungsmittel ausgebildet sind, um aus jeder dieser ab gegrenzten Mengen von Pixeln die der betreffenden Probe zuge ordneten Lichtmeßwerte abzuleiten und daraus die kinetische Konstante der Reaktion erster Ordnung in der betreffenden Probe zu bestimmen.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) zur Aufnahme von Farb
bildern ausgelegt ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) eine Videokamera
ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bildwiederholfrequenz der Videokamera veränderbar ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (Lampen 31, 32) zur Beleuchtung
des Inhaltes der Gefäßeinrichtung (10) vorgesehen ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (60) vorgesehen ist zum
Aufzeichnen der von der Bildaufnahmeeinrichtung (20) aufgenom
menen Einzelbilder und zum Abspielen von aus der Aufzeichnung
gewonnenen Bildsignalen an die Verarbeitungsmittel (40).
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