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Die
Erfindung betrifft ein Analyseverfahren für chemische und/oder biologische
Proben.
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Derartige
Proben weisen zu analysierende Partikel, insbesondere Zellen auf.
Die Analyse erfolgt beispielsweise mittels Screeningverfahren, insbesondere
Hochdurchsatz-Screening Verfahren, mit denen insbesondere die Wirkstoffforschung
unterstützt
wird. Bei derartigen Verfahren werden eine Vielzahl von Proben,
die sich beispielsweise in einzelnen Wells einer Titerplatte befinden,
mit bildgebenden Verfahren untersucht. Hierbei wird je Well ein Probenbild
insbesondere durch Screening erzeugt. Das Probenbild wird beispielsweise
mit Hilfe einer CCD Kamera oder einer Photodiode aufgenommen, wobei
die Probe beispielsweise zeilenweise abgetastet wird. Hierzu wird
beispielsweise von einem Laser ein entsprechender Beleuchtungs- bzw. Anregungsstrahl
erzeugt und in der Probe zeilenweise bewegt. Die von der Probe abgegebene
Strahlung wird mittels einer Detektoreinrichtung, die mehrere Detektoren umfassen
kann, bei denen es sich insbesondere um CCD-Kameras oder Photodioden handelt, aufgenommen.
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Beispielsweise
wird im Bereich einer Zellmembran in einem ersten Schritt ein Probenbild
erzeugt. Die von der Probe abgegebene Strahlung (z.B. Fluoreszenzemission)
wird hierbei registriert und ein korrespondierendes Probenbild wird
gespeichert. Im nächsten
Schritt wird, beispielsweise durch Schwellwertverfahren, die Lage
der Zellmembran, oder eines anderen interessierenden Bereichs der Zelle,
ermittelt. Nach der Ermittlung einer interessierenden Position im
Probenbild wird die korrespondierende Position in der Probe zur
Aufnahme von Analysedaten wie Fluktuationsdaten beobachtet. Dies
erfolgt dadurch, dass die Probe im Bereich dieser Position nochmals über einen
längeren
Zeitraum beleuchtet bzw. angeregt wird und die von der Probe an der
interessierenden Position abgegebene Strahlung gemessen wird. Die
hierdurch erhaltenen Analysedaten werden sodann analysiert, wobei
es sich beispielsweise um Fluoreszenz-Fluktuationsanalysen handelt.
Insbesondere bei hohen Anforderungen an die Auslesegeschwindigkeit,
wie beispielsweise bei lebenden Zellen und beim Wirkstoff-Screening
weist dieses Verfahren jedoch insbesondere den Nachteil auf, dass
die Zeitspanne zwischen der Erzeugung des Probenbildes und der Bestimmung
einer interessierenden Position relativ groß ist, so dass die Zelle sich
bereits derart bewegt hat, dass die anschließend aufgenommenen Analysedaten
verfälscht
werden oder nicht mehr aussagekräftig
sind.
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Dieses
Verfahren, das insbesondere zur Bestimmung von molekularen Eigenschaften
in heterogenen Umgebungen wie zellulären Systemen dient, weist somit
mehrere, aufeinander folgenden Schritte auf. Insbesondere erfolgt
nach der Bildaufnahme eine Untersuchung des Bildes zur Orientierung
in der Probe, wobei häufig
manuell die interessierenden Bereiche bzw. Positionen ausgewählt werden
müssen.
Anschließend
erfolgt eine weitere Datenaufnahme für die interessierenden Positionen,
d.h. eine erneute Datenaufnahme in den interessierenden Bereichen.
In einem weiteren Schritt werden sodann die erhaltenen Analysedaten
zur molekularen Informationsgewinnung analysiert.
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Aufgabe
der Erfindung ist es ein Analyseverfahren für chemische und/oder biologische
Proben, die insbesondere Zellen aufweisen, dahingehend weiter zu
bilden, dass die Qualität
der einzelnen Analysedaten verbessert ist.
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Die
Lösung
der Aufgabe erfolgt durch die Merkmale des Anspruchs 1.
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Das
erfindungsgemäße Analyseverfahren für chemische
und/oder biologische Proben ist insbesondere für zelluläre Systeme, d.h. Proben, in
denen Zellen enthalten sind, geeignet. Insbesondere bei zellulären Systemen
liefern lokale Eigenschaften einzelner Bereiche, wie der Zellmembran,
des Zytoplasma und des Nukleus, wichtige Informationen über das
Gesamtsystem. Durch die Möglichkeit
die molekularen Daten und Attribute einzelner Bereiche miteinander
zu verknüpfen,
zu vergleichen und in Beziehung zu setzen, können zelluläre Vorgänge quantitativ bereits auf
molekularer Ebene beschrieben und Veränderungen beobachtet werden.
Dies ist insbesondere zur Wirkstoffforschung erforderlich; hierbei ist
es wichtig, dass die Analysedaten verlässlich sind und nicht durch
Artefakte verfälscht
werden. Das erfindungsgemäße Analyseverfahren
wird insbesondere mittels Hochdurchsatz-Screening durchgeführt, bei dem eine Vielzahl
von Proben, die insbesondere in Wells einer Titerplatte angeordnet
sind, untersucht werden.
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In
einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens wird
ein Probenbild aufgenommen. Die Aufnahme des Probenbildes erfolgt insbesondere über digitale
Aufnahmeverfahren. Hierzu wird die Probe vorzugsweise zeilenweise
gescannt. Das Probenbild, das eine Vielzahl einzelner Pixel aufweist,
wird vorzugsweise über
CCD-Kameras aufgenommen. Beim Abscannen der Probe wird die Probe
zeilenweise beleuchtet bzw. durch Strahlung angeregt. Die hierdurch
von der Probe abgegebene Strahlung wird insbesondere pixelweise
erfasst. Hierzu wird der Bereich der Probe, der einem Pixel entspricht, über einen
bestimmten Zeitraum bestrahlt und die von der Probe abgegebene Strahlung von
dem entsprechendem Pixel erfasst. Erfindungsgemäß werden bereits während der
Bildaufnahme, d.h. während
des Erzeugens des Probenbildes für
jedes einzelne Pixel Analysedaten erzeugt. Erfindungsgemäß erfolgt
somit das Erzeugen des Probenbildes sowie das Erzeugen bzw. Speichern
der Analysedaten gleichzeitig. Erfindungsgemäß umfassen die Analysedaten
in Zeitreihen aufgelöste
Pixelinformationen, welche später
bevorzugt durch Fluktuationsanalysemethoden ausgewertet werden.
Die in Zeitreihen aufgelöste
Pixelinformation umfasst insbesondere Informationen über das
Eintreffen von Photonen bzw. die zeitliche Abfolge von Photonen
auf einem Detektor. Anschließend
erfolgt ein Bestimmen der für
die Analyse interessierenden Pixel. Dies erfolgt über bekannte
Methoden, wie beispielsweise Schwellwertverfahren, im Probenbild.
Sodann werden die interessierenden Pixel, zu denen die Analysedaten,
welche in Zeitreihen aufgelöste
Pixelinformationen umfassen, bereits vorliegen, ausgewertet. Mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann die für
die Datenaufnahme erforderliche Zeit somit erheblich reduziert werden.
Dies hat insbesondere den Vorteil, dass ein zeitlicher Abstand zwischen
der Erzeugung des Probenbildes und des Beobachtens einzelner interessierender
Pixel, wie im Stand der Technik beschrieben, nicht gegeben ist.
Die Gefahr, dass durch Verschiebungen in der Probe auf Grund der
Zeitdiskrepanz ein falscher Bereich beobachtet wird, ist somit vermieden.
Ebenso können
Verfälschungen
der Analysedaten, die durch sonstige Veränderungen mit der Zeit, wie
sie in lebenden Zellen unweigerlich auftreten, hervorgerufen werden,
vermieden werden. Hierdurch kann die Qualität der Analysedaten erheblich
verbessert werden.
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Vorzugsweise
wird die Zeitreihe je Pixel in einzelne Zeitabschnitte unterteilt.
In den einzelnen Zeitabschnitten werden die Analysedaten erfasst. Beispielsweise
wird über
die gesamte Zeitreihe die Helligkeit des einzelnen Probenbereichs,
der vorzugsweise einem Pixel entspricht, erfasst. Gleichzeitig werden
in den einzelnen Zeitabschnitten Fluktuationsmessungen durchgeführt. Die
einzelnen, bei dieser Analyse erhaltenen Analysedaten werden vorzugsweise
abgespeichert. Hierbei werden insbesondere zur Helligkeitsmessung
sowie zur Fluktuationsbestimmung die auf das Pixel auftreffenden
Photonen innerhalb kurzer Zeitabschnitte gezählt.
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Die
je Zeitabschnitt für
jedes einzelne Pixel aufgenommenen Einzeldaten, wie beispielsweise
die Photonenanzahl je Zeitabschnitt werden insbesondere abgespeichert.
Zur Detektion der Photonen wird vorzugsweise eine CCD- Kamera oder eine
Photodiode verwendet, mit der ein äußerst schnelles Auslesen der
gemessenen Daten je Pixel möglich
ist. Als entsprechender Detektor ist beispielsweise die iXON-Kamera
des Herstellers Andor oder die SPCM-Photodioden des Herstellers
PerkinElmer geeignet.
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Vorzugsweise
umfassen die Analysedaten die Einzeldaten, insbesondere alle Einzeldaten,
je Pixel. Wie vorstehend beschrieben, kann beispielsweise durch
Zählen
der Photonen einerseits die Helligkeit über die gesamte Zeitreihe,
und andererseits zur Fluktuationsbestimmung die Zahl der Photonen
je Zeitabschnitt bestimmt werden, um diese einer Fluktuationsanalyse
zu unterziehen.
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Die
Zeitabschnitte je Pixel innerhalb derer die einzelnen Analysedaten
erzeugt bzw. aufgenommen werden, liegen vorzugsweise im Bereich
von 100 ns bis 10 ms, bevorzugt 1 bis 1000 μs, besonders bevorzugt im Bereich
von 20 bis 200 μs.
Die gesamte Aufnahmezeit zur Erfassung einer Zeitreihe je Pixel
liegt vorzugsweise im Bereich von 0.1 bis 100 s. Die einzelnen Zeitabschnitte
zur Erzeugung von Analysedaten grenzen vorzugsweise zeitlich unmittelbar aneinander.
Ggf. ist zwischen den Zeitabschnitten eine geringe Pause, in der
die gemessenen Daten ausgelesen werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist es auch möglich,
einzelne Zeitabschnitte zu verwerfen und diese nicht einer weiteren
Analyse zu unterziehen. Beispielsweise können dies Zeitabschnitte sein,
in denen keine oder nur eine sehr geringe Anzahl von Photonen auf
dem Detektor eintreffen. Diese bevorzugte Ausführungsform ist insbesondere
im Rahmen der sog. Burst Integrated Lifetime Analyse ausführbar. Sie
hat ferner den Vorteil, dass sie einer generellen Reduktion der
Daten dient.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Bestimmung der für
die Analyse interessierenden Pixel nach der Datenaufnahme. Dies
ist möglich,
da erfindungsgemäß zeitlich
während
der Aufnahme des Probenbildes die Analysedaten, welche bereits in
Zeitreihen aufgelöste
Pixelinformationen umfassen, erfasst werden. Sämtliche, zur anschließenden Bestimmung
der interessierenden Pixel, sowie zur Auswertung der Daten, erforderlichen
Daten liegen bereits vor. Dies hat den Vorteil, dass für die Bestimmung
der interessierenden Daten ausreichend Zeit verbleibt und dies nicht
in einem möglichst
kurzen Zeitraum erfolgen muss, um eine möglichst geringe Veränderung
der Probe zu haben. Vielmehr ist es möglich, mit zeitlich aufwendigen,
dafür sehr
genauen Methoden, die interessierenden Pixel, wie beispielsweise
die Pixel der Zellmembran, auszuwählen. Auch die anschließende Auswertung der
erzeugten Analysedaten je interessierendem Pixel kann über einen
längeren
Zeitraum erfolgen. In der besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist es somit wesentlich, dass die Bestimmung der interessierenden
Pixel zeitlich nach dem Erzeugen der Analysedaten erfolgt.
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Die
interessierenden Pixel können
beispielsweise durch eine Schwellwertanalyse des Probenbildes bestimmt
werden. Zudem können
Verfahren zur Identifikation von Pixeln aufgrund ihrer Nachbarschaft,
bevorzugt über
Faltungsverfahren, modellbasierte Algorithmen, Neuronale oder Cluster
Analyse herangezogen werden.
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Bei
einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt ein Bestimmen von Pixeltypen, welche z.B. bestimmten subzellulären Strukturen
zugeordnet sind. Derartige subzelluläre Strukturen sind beispielsweise
die Zellmembran, das Zytoplasma oder der Nukleus einer Zelle. Die
korrespondierenden Pixel im Probenbild können zu Pixeltypen oder Pixelgruppen
zusammengefasst bzw. diesen zugeordnet werden. Dies hat den Vorteil,
dass die zu diesen Pixeltypen bzw. Pixelgruppen zugehörigen Analysedaten
insbesondere gemeinsam ausgewertet werden können. Beispielsweise kann eine
Fluktuationsanalyse über
sämtliche
Analysedaten I der Zellmembran erfolgen. Dies führt dazu, dass das Analyseergebnis erheblich
verbessert wird, da lokal auftretende Schwankungen oder Messungenauigkeiten
das Analyseergebnis nur geringfügig
verändern.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
weist insbesondere den Vorteil auf, dass pro Messpunkt, d.h. pro
Pixel, eine hohe Zeitauflösung
möglich
ist, so dass für
jedes Pixel statistische Momente, Histogramme und/oder Korrelationen
erstellt werden können.
Mit Hilfe von statistischen Momenten können Zählraten, sowie CPP-Auswertungen
(CPP = counts per particle) erfolgen. Das Erstellen von Histogrammen
ist zur Auswertung mit Hilfe der Analysemethoden FIDA und FIDA 2D
möglich.
Korrelationsdaten werden beispielsweise für FCS-Auswertungen und FCCS-Auswertungen benötigt. Besonders
vorteilhaft ist es, dass die durch die Analyse einzelner Zeitreihen
unter Zuhilfenahme einer molekularen Interpretation gewonnenen Informationen
unmittelbar als Bildattribute (lokale Konzentration, molekulare
Helligkeit, Diffusionszeit, Partikelanzahl etc.) definiert werden
können.
Die zeitaufgelöste
Pixelinformation wird in diesen Verfahren also direkt als mathematische Funktion
umgerechnet oder durch Optimierungsverfahren werden Parameter entsprechend
eines molekularen Modells iterativ angepaßt, so dass z.B. die mittlere
Aufenthaltsdauer eines Partikels innerhalb des Beobachtungspixels
in eine Diffusionszeit umgerechnet werden kann. Diese pixelabhängigen Parameter
können
anschließend
wieder als Bildinformation aufbereitet werden, so dass statt der
allgemein üblichen
integrierten Helligkeitsinformation pro Pixel nun die Partikel-Diffusionszeit
pro Pixel aufgetragen wird.
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Ein
weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
dass durch die punktweise Interpretation je Pixel mehr Informationen
vorliegen, und somit beispielsweise auch eine schärfere Trennung
einzelner Bereiche der Probe möglich
ist. Beispielsweise kann sich ein Bild mit homogener Intensität (Zählrate je
Pixel) durchaus in der molekularen Helligkeit (Zählrate je Molekül) unterscheiden.
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Insbesondere
können
mit Hilfe des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens
folgende Analysen durchgeführt
werden:
Single Trace Imaging (CPP Imaging): Auf Grundlage der
zeitaufgelösten
Pixelinformation (kanalabhängige
Countrate mit z.B. 1 μs
Zeitauflösung)
wird für
die Ermittlung der ortsabhängigen
Counts-Per-Particle (CPP) Information zunächst eine Umsetzung auf eine neue
Zeitbasis (typisch 40 μs)
durch Aufsummierung über
Zeitabschnitte durchgeführt.
Aus diesen Fluktuationstraces oder Zeitreihen werden die Basismomente
(speziell das 1. Moment und 2. ZentralMoment) direkt berechnet,
um hieraus jedem Pixel einen CPP-Wert zuordnen zu können. Dieses
Verfahren ermöglicht
es, Aussagen über
die ortsabhängige
Fluktuationsdetektionseffizienz zu treffen und dient speziell auch
zur Charakterisierung und zur Optimierung des optischen Systems.
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Single
Trace Imaging (FIDA2D Imaging): Die zeitaufgelösten Pixelinformationen (2-Kanal
Countrate mit z.B. 2 μs
Zeitauflösung)
werden in diesem Fall zunächst
auf eine neue Zeitbasis (typisch 40 μs) durch Aufsummierung über Zeitabschnitte
zusammengefasst. Auf Grundlage dieser Fluktuationstraces oder Zeitreihen
kann über
die Verknüpfung
(z.B. Summe über
alle Zeiten t des Verhältnisses (C1(t)–C2(t))/(C1(t)+C2(t))
eine Aussage über
die molekulare Koinzidenz getroffen werden. Die Fluktuationstraces
können
zudem entsprechend der FIDA2D Datenverarbeitung in einem 2D-Histogramm zusammengefaßt und dann
gefittet werden. Dieses Verfahren kann speziell bei FREI und anderen Zwei-Farbstoff-Systemen
eingesetzt werden. Ebenso ist über
einen Polarisationsfilter eine molekulare, bildgebende Anisotropie
bestimmbar.
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Single
Trace Imaging (FCS Imaging): Die zeitaufgelösten Pixelinformationen (kanalabhängie Countrate
mit z.B. 1 μs
Zeitauflösung)
werden in diesem Fall autokorreliert und entsprechend eines FCS-Modells
gefittet. Aufgrund der geringen Meßzeit pro Pixel (typisch 1–100 ms)
ist die Korrelationsfunktion zumeist nur eingegrenzt fittbar, so
dass einfache Vergleiche (z.B. lineare Approximation des Kehrwerts)
teilweise stabilere Beweglichkeitsattribute (Diffusionszeiten) ergeben.
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Single
Trace Imaging (FIMDA Imaging): Die zeitaufgelösten Pixelinformationen (kanalabhängie Countrate
mit z.B. 1 μs
Zeitauflösung)
werden in diesem Fall mit unterschiedlichen Integrationszeiten (z.B.
40 μs, 200 μs) pro Zeitabschnitt
zusammengefasst. Aus diesen verschiedenen Pixeltraces können unterschiedliche
Histogramme erzeugt werden, welche über die FIMDA-Theorie lokale
Aussagen über die
Beweglichkeit von Partikeln und ihre molekulare Helligkeit und Konzentration
liefern.
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Mask
Combined Traces (Additive 2D Histogramme): Die zeitaufgelösten Pixelinformationen (2-Kanal
Countrate mit z.B. 2 μs
Zeitauflösung)
werden in diesem Fall zunächst
auf eine neue Zeitbasis (typisch 40 μs) durch Aufsummierung über Zeitabschnite
zusammengefasst. Diese pixelweisen Fluktuationstraces werden zudem
entsprechend der FIDA2D Datenverarbeitung in einem 2D-Histogramm pro
Pixel zusammengefaßt. Über eine
Maske (z.B. Zytoplasmaregion einer Zelle) werden diese Histogramme
zusammengefaßt
und mit der entsprechenden Theorie (z.B. FIDA2D) gefittet.
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Mask
Combined Traces (Single-Trace FCS Fitting): Die zeitaufgelösten Pixelinformationen
(kanalabhängie
Countrate mit z.B. 1 μs
Zeitauflösung) werden
in diesem Fall über
eine Maske (z.B. Maske aller Zellkernpixel) selektiert, als Gesamttrace
zusammengefügt
und dann mathematisch aufbereitet, üblicherweise autokorreliert,
und gefittet.
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Mask
Combined Traces (Multi-Trace Fitting): Die zeitaufgelösten Pixelinformationen
(kanalabhängige
Countrate mit z.B. 1 μs
Zeitauflösung) werden
in diesem Fall autokorreliert. Aufgrund der geringen Meßzeit pro
Pixel (typisch 1–100
ms) ist die Korrelationsfunktion zumeist nur eingegrenzt fitbar,
so dass in einem Combined-Fitting-Ansatz verschiedene Pixeltraces
gemeinsam betrachte werden. Diese Pixeltraces werden zuvor über eine
Maskengeneration mit Hilfe von Zell-Erkennungsroutinen erzeugt.
D.h. eine Membran-Erkennungsroutine liefert eine für jede Zelle
individuelle Maske (Acapella-Objects-Stencil) und diese dient als
Selektionshilfe für
die Pixeltraces.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme
auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert.
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Es
zeigen:
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1 eine
prinzipielle Darstellung einer Vorrichtung, die zur Durchführung des
Verfahrens geeignet ist, und
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2 ein
Beispiel eines Probenbildes sowie der an einzelnen Pixeln erhaltenen
Analysedaten, und
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3 ein
Flussdiagramm einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist beispielsweise die in 1 schematisch
dargestellte Vorrichtung geeignet. Hierbei wird eine Probe 10 mittels
einer Anregungseinrichtung, wie einem Laser, beleuchtet bzw. angeregt.
Der Anregungsstrahl 14 wird über einen dichroitischer Spiegel 16 über ein
Prisma 18 und einen bewegbaren Spiegel 20 in Richtung
eines Objektives 22 und von diesem in die Probe 10 geleitet
und in dieser fokussiert. Der Fokussierpunkt 24 wird durch
Bewegen des Spiegels 20 in der Probe bewegt, so dass ein Abscannen
der Probe 10 zum Erzeugen eines Probenbildes erfolgt. Die
von der Probe abgegebene Strahlung 26 wird vom Objektiv aufgenommen
und über
den Spiegel 20, das Prisma 18 und durch den dichroitischen
Spiegel 16 hindurch in Richtung einer Aufnahmeeinrichtung 28 gelenkt.
Hierbei wird der Strahl von einer Tubuslinse 30, der ggf.
ein optischer Filter 32 vorgeschaltet ist, gebündelt und
ggf. durch eine Lochblende 34 gelenkt. Über einen hinter der Lochblende
angeordneten Strahlteiler oder eine Polarisationseinrichtung erfolgt
eine Aufteilen des Strahls 26 in zwei Teile 36, 38.
Jeder dieser Teilstrahlen 36, 38 wird von einem
Detektor 40 bzw. 42, bei dem es sich insbesondere
um eine Photodiode handelt, pixelweise erfasst. Ggf. ist jeweils
ein Farbfilter 44 vorgeschaltet. In einer alternativen,
hier in 1 nicht dargestellten Ausführungsform,
ist es bevorzugt, an der Position der Lochblende und anstelle dieser
eine CCD-Kamera anzuordnen.
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Die
Detektoren 40, 42 sind zum schnellen Auslesen
der einzelnen Pixel mit einer nicht dargestellten Steuereinrichtung
verbunden. Die Steuereinrichtung weist insbesondere einen Prozessor
zur Analyse der Daten sowie einen Großdatenspeicher auf.
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Ein
Probenbild 46 einer zellulären Probe ist als Beispiel
in 2 dargestellt. Es handelt sich hierbei um ein
Helligkeitsbild einer Probe, wobei für jedes einzelne Pixel zeilenweise
die Helligkeit ermittelt wurde. Gut erkennbar ist in dem Bild eine
Zellmembran 48 sowie das Zytoplasma 50 und auch
der Zellkern 52.
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Wie
vorstehend beschrieben wurden erfindungsgemäß gleichzeitig mit der Datenaufnahme
zur Erzeugung des Probenbildes 46 Analysedaten je Pixel
erzeugt und gespeichert. Beispielsweise wurden die Analysedaten
eines Pixels der Zellmembran 48 gespeichert. Die einzelnen
Analysedaten können
aus dem in 2 rechten Histogramm entnommen
werden.
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Die
Analysedaten eines intrazellularen Pixels, die ebenfalls während der
Erzeugung des Probenbildes erzeugt wurden, können dem in 2 linken
Histogramm entnommen werden.
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Bei
der in 3 dargestellten, bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden insbesondere Pixeltypen bestimmt, die beispielsweise der
Zellmembran, dem Zytoplasma oder dem Nukleus zuzuordnen sind. In
einem ersten Schritt 54 werden die Bildinformationen einschließlich der
zeitaufgelösten
Pixelinformationen gespeichert. Im Schritt 56 folgt die
Berechnung der Bildhelligkeit, d.h. der Intensität der einzelnen Pixel des aufgenommenen
Bildes. Anschließend
werden im Schritt 58 insbesondere mit Hilfe von Masken
spezifische Bildbereiche bestimmt. Bei diesen Bildbereichen handelt
es sich beispielsweise um die Zellmembran, das Zytoplasma, den Zellkern
oder den Hintergrund. Die Bildbereiche entsprechen Pixeltypen. Durch
eine Verknüpfung
der Bildinformationen aus Schritt 54 mit den Bildbereichen
aus Schritt 58 werden im Schritt 60 Bildbereiche
ausgewählt
und als Gruppe zusammengefaßt.
Die Information der einzelnen Pixel dieser Gruppen, die Gruppenanalysedaten,
werden in dem anschließenden
Schritt 62 beispielsweise durch Integration ermittelt.
Dies erfolgt zum Beispiel durch eine Korrelation der ausgewählten Gruppenanalysedaten.
Das hieraus erhaltene Ergebnis führt über einen
weiteren Auswerteschritt, beispielsweise über das Fitten gemäß eines
FCS Modells, zu molekularen Erkenntnissen (Schritt 64).
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In
der in 3 angegebenen Gleichung sind die Parameter x und
y die Bild-Pixelpositionen,
d eine zusätzliche
Dimension, wie z.B. die z-Koordinate der Pixel, und t die Fluktuationszeit.