DE1814028B2 - Verfahren zur bestimmung des gehalts an freiem und gebundenem hydroxyprolin von koerperfluessigkeiten - Google Patents
Verfahren zur bestimmung des gehalts an freiem und gebundenem hydroxyprolin von koerperfluessigkeitenInfo
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Description
einem organischen Lösungsmittel zugefügt, so uaÜ
30 man einen roten Chromophor erhält. Die Menge dieses
Chromophors wird spektrophotometrisch bestimmt
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und gibt ein Maß für die Menge an Hydroxyprolin in
des Gehalts an freiem und gebundenem Hydroxy- der untersuchten Probe.
prolin von Körperflüssigkeiten durch Adsorption der Eine der meist angewandten Varianten dieser
Aminosäure an einem Ionenaustauscherharz, Eluieren 35 colorimetrischen Methoden ist das von Pruckop
des Harzes und quantitative Bestimmung des Hydroxy- und Udenfried in Anal. Biochem. 1, S. 228
prolins im Eluat mit HiKe einer Farbreaktion. (I960), beschriebene Verfahren, das dann besteht.
Die Bestimmung des Gehalts an Hydroxyprolin in daß die Hydrolyse in einem Autoklav mit konzenbiologischen
Flüssigkeiten wird erschwert durch trierter Salzsäure 3 Stunden lang bei 124 C durchfolgende
Umstände: 4° geführt wird. Bei dieser Arbeitsweise erhält man eine , . , . ' „ . . ,, , .. große Anzahl von die Bestimmung störenden Produk-
1. In den meisten Fallen ist das Hydroxyprolin vor- * wodurch eine sehr intensive Reinigung des Hydrowiegend
an Peptid gebunden Zur Bestimmung '^ notwendjg wird. Zu diesem Zweck konzentriert
muß aber die Aminosäure im freien Zustand sein, ^ dje betreffende biologische Flüssigkeit und entwas
meistens nur durch Hydrolyse oder andere fcrnt dJ£ SaIzsäure in einem ρ jtary-Evaporator
drastische Bedingungen zu erreichen ist j dje storenden Bestandteile an einem Entfär-
2. Das zerstörte Collagen wird zum größten Teil h haT7 adsorbiert werden. Das durch Oxydation
im Korper abgebaut so daß der Hydroxyprolin- Hydroxyprolin gebildete Chromogen wird unter
gehalt der Körperflüssigkeit«! verhältnismäßig standardisierten Bedingungen extrahiert,
gering ist und dieser in vielen Fallen konzentriert ^ * Dje Hydro]yse die Konzentrierung und die Reini-
gering ist und dieser in vielen Fallen konzentriert ^ * Dje Hydro]yse die Konzentrierung und die Reini-
, W.er,?en ..' , AUA u α gung der biologischen Flüssigkeit sind nicht einfache
3. Neben freiem und pept.dgebundenern Hydroxy- |0lf(inearbeiterii s0 daß es ohne weiteres einzusehen
prolin enthalten die Korperflussigkeiten viele das oben epvähme Verfahren und ^
andere Bestandteile welche die Bestimmung so Methoden nicht zur Verwendung in dem chemischen weit stören können, daß eine Reinigung vor oder Laboratorium einer Klinik ; t sind. Auf be d wahrend der Durchfuhrung der Bestimmung Erfindung waf es daherj dn verbessertes UJ verdn. notig wird. fachtes Verfahren zu entwickeln, um die Bestimmung
andere Bestandteile welche die Bestimmung so Methoden nicht zur Verwendung in dem chemischen weit stören können, daß eine Reinigung vor oder Laboratorium einer Klinik ; t sind. Auf be d wahrend der Durchfuhrung der Bestimmung Erfindung waf es daherj dn verbessertes UJ verdn. notig wird. fachtes Verfahren zu entwickeln, um die Bestimmung
Unter den bisher bekannten Verfahren zur Schätzung des Gesamthydroxyprolins in Körperflüssigkeiten
von Hydroxyprolin nimmt die von Moore und auch leicht im Labor einer Klinik durchführen zu
Stein ausgearbeitete und in Anal. Chem. 30, 60 können.
S. 1185 bis 1190 (1958), beschriebene, chromate- Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß man
graphische Methode einen wichtigen Platz ein. Mit bei dem eingangs erwähnten Verfahren zur Adsorption
Hilfe dieser Methode, von der es zahlreiche Varianten ein das anwesende freie und gebundene Hydroxy-
gibt und zu deren Durchführung eine Vielzahl von prolin adsorbierendes stark saures Kationenaustau-
automatisierten Vorrichtungen benutzt werden, kann 65 scherharz verwendet und vor dem Eluieren durch
das Hydroxyprolin in reinem Zustand isoliert und Erhitzen des mit dem Hydroxyprolin angereicherten
gefärbt werden, beispielsweise mit einem Reagens, das Harzes den peptidgebundenen Anteil des Hydroxy-
Ninhydrin enthält. Die so gebildete gefärbte Substanz prolins hydrolysiert.
Es handelt sich bei dem erfindungsgemäßen Ver- saure Form überzuführen und ihn von störenden
fahren um eine für die Praxis geeignete und absolut Metallionen zu befreien. Zum Schluß wird das Harz
sichere Prüfung, bei welcher das Einengen der zu mit destilliertem Wasser bis zur Neutralität der
untersuchenden Substanz, die Hydrolyse und die Waschflüssigkeit ausgewaschen.
Abtrennung der nicht spezifischen Chromogsne außer- 5 Ein großer Vorteil der erfindungsgemäß vorzugsordentlich vereinfacht wurden und die in vielen Fällen weise verwendeten sulfonierten Polystyrole ist es, daß
in einem einzigen analytischen Arbeitsgang durch- das hydroxyprolinhaltige Material untei wesentlich
geführt werden kann. milderen Bedingungen völlig hydrolysiert wird als bei
tigste Reagens ist (bzw. enthält) ein stark saures io sulfonierten Polystyrolharzen ist es nicht 'ötig,
wird, so daß das freie und das peptidgebundene Zersetzungsreaktionen von Bestandteilen der biolo-
wird. Das beladene Harz wird von der biologischen 15 lyse verläuft schon bei 6O0C, jedoch bei dieser Tem-
Flüssigkeit, beispielsweise durch Sedimentierer. oder peratur ist die Dauer der Hydrolyse zu lang für eine
Zentrifugieren getrennt und dann gewaschen und rasche Bestimmung. Oberhalb 100 C, z. B. bei 120" C,
konzentriert. Man kann die Bestimmung auch in kann die Hydrolyse manchmal innerhalb weniger
Anwesenheit der Flüssigkeitsprobe durchführen, falls Stunden beendet sein, dies stellt jedoch höhere
diese keine störenden Faktoren enthält. Das angerei- 20 Ansprüche an die Hydrolysegefäße. In der Praxis
cherte Harz wird, nachdem es gegebenenfalls resus- erwiesen sich als besonders geeignete Hydrolyse-
pendiert wurde, erhitzt, beispielsweise 3 bis 24 Stunden temperaiuren 90 bis 100 C. Bei dieser Temperatur
auf 90 bis 120 C, um den peptid^ebundenen Anteil des kann die Hydrolyse über Nacht in einfachen Hydroly-
Hydroxyprolins vollkommen zu hydrolysieren. Nach serohren ohne besondere Vorsichtsmaßregeln durch-
der Hydrolyse ist das gesamte Hydroxyprolin als freie 25 geführt werden.
Aminosäure an das Harz gebunden, von dem es auf Der saure Kationenaustauscher kann als Suspension
bekannte Weise mit Alkali, z. B. mit Natronlauge in destilliertem Wasser oder in einem Puffer verwendet
oder Kaliumboiat oder mit einer Sodalösung oder werden, oder die zur Bestimmung notwendige Harz-Ammoniak
eluiert wird. Das E.aieren bewirkt zusatz- menge wird in einem Hydrolyserohr oder einer Kapsel
li"h eine gründliche Reinigung, da die meisten Fremd- 30 verteilt. Man kann aus dem Harz auch Tabletten herstoffe
auf dem Harz adsorbiert jleiben. stellen, die in biologischen Flüssigkeiten rasch ?er-
Die Auswahl des Harzes ist für die Durchführung fallen. Als Bindemittel dienen dabei beispielsweise
des erfindungsgemäßen Verfahrens äußerst wichtig, da Saccharide u. dgl., die aber keine ionisierbaren
diese Substanz fähig sein muß, aus der betreffenden Substanzen enthalten dürfen.
Körperflüssigkeit die hydroxyprolinhaltigen Korn- 35 In manchen Fällen muß die biologische Flüssigkeit
ponenten rasch und vollkommen zu binden. Außerdem einer Vorbehandlung unterworfen werden. So ist
muß das H-irz fähig sein, das Hydroxyprolin voll- beispielsweise Serum sehr reich an hochmolekularen,
ständig aus seiner Peptidbindung zu befreien. Selbst- kein Hydroxyprolin enthaltenden Proteinen, die zwar
verständlich darf das Harz bei der angewandten vom Harz gebunden, jedoch nicht völlig hydrolysiert
Hydrolysetemperatur sich nicht zersetzen und es muß 40 werden. In diesem Falle muß die biologische Flüssig-
außerdem imstande sein, diejenigen Faktoren auszu- keit auf übliche Weise von den hochmolekularen
schalten, welche die Farbreaktion stören. Schließlich Proteinen befreit werden,
darf es selbst die Farbreaktion nicht beeinträchtigen. Die Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der
Im Hinblick auf diese Anforderungen verwendet Erfindung.
man als Austauscherharz vorzugsweise ein sulfoniertes 45 B e i s d i e 1 1
Polystyrol.
Polystyrol.
Was die Beschaffenheit des Harzes betrifft, so Ein granuliertes, sulfoniertes Polystyrolharz, das
verwendet man es vorzugsweise in fein verteiltem in der trockenen Natriumform eine Teilchengröße von
Zustand, wobei im Hinblick auf die größere spezi- 53 bis 62 μ hatte und 8°/0 Vernetzungen enthielt, wurde
fische Oberfläche ein Granulat bevorzugt ist, dessen 50 mit Natronlauge, Salpetersäure und Salzsäure vorbe-
größter Teilchendurchmesser bei 20 bis 200 fzm liegt. handelt und darin bis zur neutralen Reaktion ausge-
AIs Polystyrolmatrix ist ein mäßig vernetztes Harz waschen. Dann wurde es in destilliertem Wasser
mit 2 bis 10% Vernetzungen bevorzugt, das möglichst suspendiert, so daß man eine Suspension mit 250 mg
porös ist, damit der Austausch von Collager.peptiden Trockenstoffe je ml erhielt. Die Suspension wurde in
und Hydroxyprolin rasch erfolgt. Gegebenenfalls kann 55 Mengen von je 1 ml in Glasröhrchen mit Schraub-
das sulfonierte Polystyrolharz auf die Oberfläche eines kappen von 10 ml Inhalt verteilt,
inerten Trägers aufgebracht werden, beispielsweise Eine Probe von 24-Stunden-Urin (1050 ml) einer
auf Infusorienerde, wie Bentonit oder andere Filter- Patientin von 37 Jahren, die an Mammacarcinom litt,
hilfen. Allerdings ist dann die Bindefähigkeit je wurde über einen Faltenfilter filtriert. In zwei der oben
Gewichtsmenge im allgemeinen niedriger als bei den 60 beschriebenen Röhrchen, als (1) und (2) numeriert,
sphärischen Harzen und Granulaten selbst. wurde je 1 ml Urin einpipettiert. Außerdem wurde
Um eine möglichst einheitliche Teilchengröße zu in Röhrchen (1) 0,1 ml Wasser und in Röhrchen (2)
erreichen, wird das Harz zunächst gesiebt und sorg- 0,1 ml einer Lösung mit 100 μg Hydroxyprolin einfältig
gewaschen, d. h. mit wäßriger Lauge, z. B. pipettiert. Die Röhrchen wurden sorgfältig verschlos-2n-Natronlauge,
erhitzt, abgekühlt und die Lauge mit 65 sen, 10 Minuten geschüttelt und dann nebeneinander
Wasser bis zur neutralen Reaktion ausgewaschen. 18 Stunden in einem Ofen auf 95° C gehalten. Dann
Anschließend wird das Harz mit verdünnter Mineral- wurden die Röhrchen in fließendem Leitungswasser
säure behandelt, um den Kationenaustauscher in die abgekühlt.
wurden 4,1 ml 2n-Natronlauge zugegeben, worauf die betrug 25,7 fig/ml, so daß die Ausscheidung auf 27 mg
sich das Harz abgesetzt hatte, wurden aus der über- normalen Werte liegt. Es ergab sich mithin keine
stehenden Flüssigkeit jedes Röhrchen» 2 ml in zwei 5 Indikation einer aktiven Knochenmetastase.
einpipettieii. In die Reagensgläser wurden dann nach- p
einander eingefüllt: 1 ml 0,05molare Kupfersulfat- Ein sphärisches, sulfoniertes Polystyrolharz mit
lösung und 1 ml 6%ige WasserstoFperoxydlösung. 4% Vernetzungen wurde in trockener saurer Form
temperatur innerhalb 5 Minuten. Das überschüssige 0,075 mm erhielt. Nach dem Waschen und Trocknen
die Röhrchen 10 Minuten in einem Wasserbad von 275 ± 10 mg auf Kapseln verteilt.
700C hielt. Dann wurde das Gemisch auf Raum- Bei einer 25 Jahre alten Patientin, die an Periar-
temperatur abgekühlt und 4 ml 3n-Schwefelsäure 15 teritis nodosa litt, wurde die Hydroxyprolinurie an
zugegeben, so daß sich Pyrrol-2-carbonsäure bildete. einigen aufeinanderfolgenden Tagen gemäß folgendem
In jedes der Röhrchen wurden dann 2 ml einer 5°/oigen Schema gemessen:
Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd in η-Pro- Eine Probe des 24-Stund· -Urins wurde filtriert und
panol zugegeben, worauf die Röhrchen im V.'asserbad mit destilliertem Wasser (1:4) verdünnt. Ie zwei
auf 70 C erwärmt and dann in laufendem Leitungs- 20 Milliliter des verdünnten Urins wurden in 2 Röhrchen
wasser abgekühlt wurden. Der gebildete rote Chromo- mit Verschraubung einpipettiert und diese mit (1)
phor wurde gemessen in einem Colorimeter gegen und (2) bezeichnet. Zu dem Röhrchen (1) wurden
destilliertes Wasser bei 553 Nanometer. Die erhaltenen u,l ml destilliertes Wasser, zu dem Röhrchen (2)
Resultate wurden bezeichnet mit E1 und E2. Dann 0,1 ml einer Lösung von Gelatinehydrolysai, die je
wurden 0,1ml 30°/0iges Wasserstoffperoxyd in jedes 25 ml 1,205 mg Hydroxyprolin in Form von Peptiden
der Reagensgläser eingefüllt, um spezifisch den enthielt, zugegeben. Nun wurde in jedes Röhrchen
Chromophor zu zerstören. Nach 5 Minuten wurden noch der Inhalt einer Kapsel mit Harz eingefüllt,
beide Lösungen bei 553 Nanometer gemessen. Die worauf die Suspension kräftig geschüttelt wurde,
optischen Dichten, die innerhalb der Versuchsgrenzen Nach Verschließen wurden die beiden Röhrchen in
gleich waren, betrugen En. 3° einen Ofen bei 9OC eingebracht, wobei sie nach
Der Gesamtgehalt an Hydroxyprolin (X μg/ml) in 2 und nach 4 Stunden wieder kräftig geschüttelt
der Probe wurde nach folgendei Formel berechnet: wurden.
Die Eluierung, die Farbreaktion und die Messung erfolgten gemäß Beispiel 1.
χ — ■ ~fcfl . lQO^g/ml). 35 Die tägliche Ausscheidung (K-ng/Tag) wurde
E2 — E1 berechnet nach der Formel:
Y=I- (Volumen 24-Stunden-Urin) · £' ~- E- · 0,1205 (mg/Tag).
Nach 3 Tagen, an denen aufeinanderfolgend höhere Je 6 ml der verdünnten Flüssigkeit wurden dann
Werte von 76,6 — 80,4 — 72,8 mg gefunden worden in vier Hydrolyseröhrchen, bezeichnet mit A, B, C
waren, wurde der Patientin ein Steroidpräparat in und D, einpipettiert, in welche je eine Harztablette
einer solchen Doms verabreicht, daß am 10., 11. und 45 eingebracht worden war. Nach 15 Minuten wurde
12. Tag eine Hydroxyprolinausscheidung von 43,8 — die Suspension gründlich geschüttelt, dann zentri-41,3
— 27,9 mg erhilten wurde. fugiert und die überstende Flüssigkeit abgezogen.
Dem Inhalt der Röhrchen A und B wurden je 2 ml
Beispiel 3 destilliertes Wasser, demjenigen der Röhrchen C
50 und D je 2 ml einer Standardlösung mit 25 ^g Hydroxy-
Ein pulverisiertes, solfoniertes Styrolharz mit einer prolin jer.il zugefügt, worauf die Röhrchen verschraubt
Teilchengröße von 63 bis 87 ;i und einem Vernetzungs- und gut geschüttelt wurden. Die Röhrchen A und C
grad von 5°/0 wurde gemäß Beispiel 1 gereinigt und wurden dann über Nacht in einem Kühlschrank bei
gewaschen. Das feuchte Harz wurde innig mit Cellu- +40C, die Röhrchen B und D in einem Glycerinlosepulver
(10°/0 des Trockengewichtes des Harzes) 55 heizbad bei 105°C gehalten,
und einer Stärkelösung (enthaltend 5% Stärke, Am nächsten Morgen wurden die vier Röhrchen
und einer Stärkelösung (enthaltend 5% Stärke, Am nächsten Morgen wurden die vier Röhrchen
berechnet auf das Trockengewicht des Harzes) ver- auf völlig gleiche Weise weiterverarbeitet. Das Harz
mischt. Die pastose. Masse wurde im Vakuum getrock- wurde zentrifugiert, zweimal mit je 4 ml destilliertem
net, pulverisiert und gesiebt und das trockene Pulver Wasser gewaschen und mit Salzsäure auf einen
wurde in eine Tablettenmaschine eingebracht, in der 60 pH-Wert \ on 2,50 angesäuert. Die überschüssige Flüsdaraus
Tabletten von 310 ± 2,5 mg hergestellt wurden. sigkeit wurde abgezogen, wobei Vorsorge getroffen
Aus dem Blut eines Patienten, der an einer rheuma- wurde, daß keine Harzteilchen aus den Röhrchen
toiden Störung litt, wurde heparinisiertes Plasma her- entwichen. Dann wurde das Harz unter Zugabe von
gestellt, das dann unter Zugabe des doppelten Vo- 10 ml Kaliumboratpuffer (pH 8,7) je Röhrchen 30 Milumens
an kaltem Äthanol bei 0°C deproteinisiert 65 nuten eluiert. Nach dem Zentrifugieren wurden je
wurde. Nach Abtrennen der ausgeschiedenen Plasma- 2 ml der überstehenden Flüssigkeit in ein anderes,
proteine wurde die überstehende Flüssigkeit mit destil- entsprechend markiertes Reagensglas eingebracht. Das
liertem Wasser im Volumenverhältnis 1:1 verdünnt. Anfärben wurde durchgeführt nach Oxydation mit
2 ml einer 0,02molaren wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von N-Chlor-p-toluolsulfonamid. Ein Überschuß
dieses Salzes wurde eliminiert durch Zugabe von 10 ml wäßriger O,63molarer Perchlorsäure. Dann wurden
2 ml 20°/0iger p-Dimethylaminobenzaldehyd in Äthylenglykolmonomethyläther
zugegeben und die Röhrchen 20 Minuten in einem Wasserbad von 700C
erwärmt und abgekühlt. Die optische Dichte der Lösungen wurde bestimmt gemäß Beispiel 1.
Aus den optischen Dichten der Röhrchen A und C
Aus den optischen Dichten der Röhrchen A und C
errechnete sich der Gehalt an freiem Hydroxyprolin zu 14 μg je ml Plasma; aus den optischen Dichten der
Röhrchen B und D ergab sich ein Gehalt an freiem peptidgebundenem Hydroxyprolin von 42 μg je ml
S Plasma. Der Gehalt an peptidgebundenem Hydroxyprolin beträgt demnach bei diesem Patienten 28 μζ
je ml Plasma.
Die Diagnose einer mäßigen Knochenschädigung
als Ergebnis einer rheumatischen Störung wurde
ίο bestätigt durch Röntgenuntersuchung des Patienten.
Claims (4)
1. Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Methode jedoch keineswegs attraktiv, mindestens
freiem und gebundenem Hydroxyprolin von Kör- 5 wenn es sich nur um die Bestimmung von Hydroxyperflüssigkeiten durch Adsorption der Aminosäure prolin handelt, da sie teuer und so zeitraubend ist,
an einem Ionenaustauscherharz, Eluieren des daß wöchentlich nur einige wen,*,* Bestimmungen
Harzes und quantitative Bestimmung des Hydroxy- durchgeführt werden können.
prolins im Eluat mit Hilfe einer Farbreaktion, Andere bekannte quantitative Besümmungsmetho-
dadurch gekennzeichnet, daß man » den verwenden ebenfalls die colonmetnsche Technik,
zur Adsorption ein das freie und das gebundene die auf einer mehr oder weniger spezifischen Färbung
Hydroxyprolin adsorbierendes, stark saures Ka- des freien Hydroxyprolin beruht. Audiι hierbei wird
tionenaustauscherharz verwendet und vor dem jedoch die Bestimmung durch die obenerwähnten
Eluieren durch Erhitzen des mit dem Hydroxy- Umstände beeinträchtigt. Oft unterscheiden sich die
prolin angereicherten Harzes den peptidgebun- 15 Bestimmungen lediglich in_ den Maü>ihmer., die
denen Anteil des Hydroxyprolin* hydrolysiert. ergriffen werden, um die störenden Einflüsse auszu-
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- schalten.
zeichnet, daß man als Austauscherharz ein sulfo- Die Farbreaktion verlauft gewöhnlich m /uu
niertes Harz, insbesondere sulfoniertes Polystyrol Stufen. In der ersten Stufe wird das Hydroxyprolin /u
verwendet, das vorzugsweise 2 bis 10ü/0 Ver- 20 einer Verbindung mit Pyrrolstruktur naml.ch P>rn,lnetzungen
aufweist. 2-carbonsäure und,oder Pyrrol oxydiert Als Ov>-
3. Verfahren nach Anspruch 1 und Z. dadurch dationsmittel sind Wasserstoff peroxyd £ N e u m a u
gekennzeichnet, daß man das Austauscherharz in & L ο g a η in J. B.ol. Cheml 184, S. 299 1950]) und
einer Teilchengröße von 20 bis 200 μ verwendet. das Natriumsalz von N-Chlor-p-toluolsulfonamid
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch 25 (s. S t e g e m a η η in Zeitschrift Physiologische
gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse durch Chemie 311, S. 41 [1958]) üblich Nachdem der
Erhitzen auf 90 bis 100 C bewirkt. Überschuß an Oxydationsmittel entfernt wurde, wird
als weiteres Reagens p-Dimethylaminobenzaldehyd in
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