DE19714558A1 - A new method for sequencing biopolymers using mass spectrometry - Google Patents

A new method for sequencing biopolymers using mass spectrometry

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DE19714558A1
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Abstract

The invention relates to a new method for sequencing biopolymers by mass spectrometry. The sequencing of biopolymers is either lengthy or requires exact determination of the mass of the fragments, which is difficult, especially in the case of long polymers. The speed of hydrolysis of phosphodiester, -peptide or -glycoside bonds with exo/endonucleases, -peptidases, -glycosidases or other hydrolytically acting substances is used in the inventive method for the sequence analysis of nucleic acids or other biopolymers. Separation and detection of the fragments produced take place by mass spectrometry by determining the mass and the different peak intensities. The main advantage of the method is that an exact determination of the mass is no longer necessary, and also that low-resolution mass spectrometers can be used. Furthermore, analysis and separation of fragments is extremely rapid, as there is no electrophoresis and the sequence of modified nucleic acids can be determined. A further advantage is that unmarked nucleic acids can be used and no radioactivity is need. The method can be conducted in parallel with a simultaneous sequence analysis of various nucleic acids, which increases sequencing speed. The method can also be used for detecting and determining organisms (fingerprint, footprint), whereby the finger and footprints are more precise than in previous methods: both cleavage fragments are detected after hydrolysis of a phophodiester bond, whereas hitherto known methods could detect only a marked fragment. Finally, the method can contribute to elucidation of the secondary structure of nucleic acids by mass spectrometry. These principles can also be applied to sequencing or secondary structure determination of other biopolymers, like, for example, peptides and oligosaccharides.

Description

Die zunehmenden Aktivitäten in der Forschung von Nukleinsäuren, besonders von Ribonukleinsäuren sowie von Peptiden und Oligosacchariden in den letzten Jahren, erfordern eine schnelle Standard-Sequenziermethode, die auch Modifikationen detektieren kann Bisherige Methoden für die Sequenzierung von RNA beruhen auf zweidimensionalen chromatographischen Methoden1-3, Maxam-Gilbert-Sequenzierung4-7 oder Reverse Transkriptase Sanger Sequenzierung8,9. Neuere Entwicklungen benutzen Massenspektrometrie zur Primärstrukturbestimmung10. Eine Reihe von Arbeiten in den letzten Jahren haben sich mit dem physikalischen Abbau von Oligonukleotiden beschäftigt, wie z. B. Tandem Massenspektrometrie mit Elektrospray Ionisierung, ESI (CID, collision induced dissociation)11-13, enzymatische Reaktionen unter Verwendung von Exonukleasen10,14 oder Oligonukleotid- Aufbau mit Polymerasen15,16 und physikalische spontane Fragmentierung wie "nozzle skimmer dissociation" (NS) von ESI generierten Nukleinsäure Ionen17,18 oder spontane Dissoziation der Nukleinsäuren nach Infrarot-Laser Beschuß einer in einer Matrix kristallisierten Probe18-24 Diese Methoden versagen aber bei der Sequenzierung von RNA, da die Nukleotide Uridin (U, 306,17) und Cytidin (C, 305,18) fast gleiche Massen besitzen. Deshalb wurde argumentiert, daß die Sequenzierung von RNA durch Exonuklease Abbau (Verdau) und Detektion der erhaltenen Fragmente mit Massenspektrometrie nicht möglich sei25.The increasing activities in the research of nucleic acids, especially ribonucleic acids as well as peptides and oligosaccharides in recent years, require a fast standard sequencing method that can also detect modifications. Previous methods for sequencing RNA are based on two-dimensional chromatographic methods 1-3 , Maxam-Gilbert sequencing 4-7 or reverse transcriptase Sanger sequencing 8.9 . More recent developments use mass spectrometry to determine the primary structure 10 . A number of works in recent years have dealt with the physical degradation of oligonucleotides, such as. B. Tandem mass spectrometry with electrospray ionization, ESI (CID, collision induced dissociation) 11-13 , enzymatic reactions using exonucleases 10,14 or oligonucleotide construction with polymerases 15,16 and physical spontaneous fragmentation such as "nozzle skimmer dissociation" (NS ) nucleic acid ions generated by ESI 17,18 or spontaneous dissociation of the nucleic acids after infrared laser bombardment of a sample 18-24 crystallized in a matrix Cytidine (C, 305,18) have almost the same masses. It has therefore been argued that the sequencing of RNA by exonuclease degradation (digestion) and detection of the fragments obtained with mass spectrometry is not possible 25 .

Wir beschreiben hier eine Methode, mit der man RNA durch Exonukleaseverdau, Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente mit Massenspektrometrie, sequenzieren kann. Die Methode kann besonders nützlich sein für die Primärstrukturbestimmung von RNA (oder auch DNA), die länger als 20 Basen ist oder modifizierten Nukleinsäuren, da die Auflösung von Massenspektrometern ein limitierender Faktor für die Sequenzanalyse längerer Nukleinsäurefragmente darstellt. Sie kann auch wertvoll bei der Bestimmung der Sekundärstruktur von Nukleinsäuren sein. Die Nukleinsäurefragmente werden durch unterschiedliche Massen, der beim Verdau von Exonukleasen (vornehmlich 5'→3'- Exonuklease aus Kalbsmilz und 3'→5'-Exonuklease aus Schlangengift von crotalus durissus) austretenden Nukleotide, massenspektrometrisch bestimmt. U und C werden aber durch unterschiedliche Peakintensitäten im Massenspektrum erkannt. Die Unterschiede in den Peakintensitäten werden durch unterschiedliche Geschwindigkeiten bei der Hydrolyse der Phosphodieseterbindungen durch das Enzym hervorgerufen. Dadurch werden Fragmente, die am 5'-Ende ein C enthalten durch 5'→3'-Phosphodiesterase weniger schnell abgebaut und liegen deshalb in viel größeren Konzentrationen vor als z. B. 5'-U enthaltende Fragmente. Die gleiche Beobachtung wird auch für 5'-A-Fragmente gemacht. Adenosin ist jedoch auch durch seine Masse von den anderen Nukleotiden leicht zu unterscheiden. Es ist möglich mehrere Nukleinsäuren gleichzeitig dieser Enzymkinetik zu unterwerfen, um die Sequenziergeschwindigkeit zu erhöhen. Auch der Einsatz von basenspezifischen Exo-/Endo­ nukleasen kann zur Sequenzanalyse und zur schnellen Erkennung und Bestimmung von Organismen, z. B. Viren herangezogen werden, deren RNA oder DNA einem "Fingerprinting" (Verdau von RNA oder DNA mit Exo-/Endonukleasen, die nicht an jedem Nukleotid basenspezifisch schneiden) oder "Footprinting" (Verdau von RNA oder DNA, die mit Nukleinsäure fremden Molekülen wechselwirken und der Hydrolyse mit Exo-/Endonukleasen ausgesetzt werden) unterworfen wird. Die Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente durch Massenspektrometrie kann so z. B. zur Prävention von Seuchen oder zur Bestimmung von Organismen und biologischen Waffen eingesetzt werden. Finger- und Footprint sind genauer als bisherige Methoden: Es werden nach der Hydrolyse einer Phosphodiesterbindung beide Spaltfragmente detektiert, während herkömmliche Verfahren nur das markierte Fragment detektieren können. Eine Sekundärstrukturvorhersage von Nukleinsäuren ist schließlich dadurch möglich, daß die Enzyme oft bevorzugt an einzelsträngigen, linearen Bereichen schneiden. Somit können Domänen, Sekundär- und Tertiärstrukturen wie z. B. "Hairpins" oder "intrnal loops" an ihren doppelsträngigen Bereichen erkannt werden.We describe here a method by which RNA can be digested by exonuclease, separation and detecting the generated fragments with mass spectrometry. the Method can be particularly useful for determining the primary structure of RNA (or also DNA) that is longer than 20 bases or modified nucleic acids, as the dissolution of Mass spectrometers are a limiting factor for longer sequence analysis Represents nucleic acid fragments. They can also be valuable in determining who Be secondary structure of nucleic acids. The nucleic acid fragments are through different masses that occur during the digestion of exonucleases (mainly 5 '→ 3'- Exonuclease from calf's spleen and 3 '→ 5' exonuclease from snake venom from crotalus durissus) emerging nucleotides, determined by mass spectrometry. U and C are however through different peak intensities recognized in the mass spectrum. The differences in the Peak intensities are due to different rates in the hydrolysis of the Phosphodieseter bonds caused by the enzyme. This will remove fragments that contain a C at the 5 'end and are less rapidly degraded by 5' → 3'-phosphodiesterase are therefore in much larger concentrations than z. B. 5'-U containing fragments. the the same observation is made for 5 'A fragments. However, adenosine is also through its mass can be easily distinguished from the other nucleotides. It is possible several To subject nucleic acids to these enzyme kinetics at the same time in order to achieve the Increase sequencing speed. Also the use of base-specific exo / endo Nucleases can be used for sequence analysis and for the rapid recognition and determination of Organisms, e.g. B. Viruses are used whose RNA or DNA a "fingerprinting" (Digestion of RNA or DNA with exo / endonucleases that do not attach to any nucleotide base-specific cut) or "footprinting" (digestion of RNA or DNA, which with Foreign nucleic acid molecules interact and hydrolyze with exo- / endonucleases exposed). The separation and detection of the fragments generated by mass spectrometry, for. B. for the prevention of epidemics or for determination used by organisms and biological weapons. Fingerprint and footprint are more accurate than previous methods: after hydrolysis, a phosphodiester bond is formed both cleavage fragments are detected, while conventional methods only detect the labeled fragment can detect. A secondary structure prediction of nucleic acids is finally possible because the enzymes often preferentially on single-stranded, linear regions cut. Thus, domains, secondary and tertiary structures such as e.g. B. "Hairpins" or "intrnal loops" can be recognized by their double-stranded areas.

Diese Prinzipien lassen sich auch auf die Sequenzierung bzw. Sekundärstrukturbestimmung anderer Biopolymere anwenden, wie z. B. Peptide und Oligosaccharide.These principles can also be applied to sequencing or secondary structure determination apply other biopolymers, such as B. peptides and oligosaccharides.

Die Methode ist sowohl mit MALDI als auch mit DE-MALDI26,27 durchführbar. The method can be carried out with both MALDI and DE-MALDI 26,27 .

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Sequenzierung eines 8mers mit 5'→3' Phosphodiesterase (siehe Fig. 1)Sequencing an 8mer with 5 '→ 3' phosphodiesterase (see Fig. 1) Sequenzierung eines 8mers mit mit RNase CL3 (siehe Fig. 2)Sequencing of an 8mer with with RNase CL3 (see Fig. 2)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

b) mit RNase CL3 (aus Hühnerleber)b) with RNase CL3 (from chicken liver)

ExperimentellesExperimental

Für alle Beispiele der massenspektrometrischen RNA Sequenzierungen gilt, falls nicht anders angegeben: Linear kontinuierliche MALDI-TOF Massenspektrometrie wurde mit einem Fisons VG TOF spec Massenspektrometer (8mer, 9mere RNA und DNA, 16mer, 22mer, 120mer) und DE-MALDI-TOF Messungen mit einem PerSeptive Biosysteins Voyager Massenspektrometer (16mer) durchgeführt, die einen UV Stickstofflaser mit einer Emissionsfrequenz von 337 nm enthalten. Die Laser Pulsbreite ist 4 ns. Die Spektren wurden im negativ Modus aufgenommen mit Ausnahme des 16mers und des 32mers. Diese wurden im positiv Modus gemessen. 2,4,6- Trihydroxyacetophenon/Ammoniumcitrat wurde in allen Sequenzierexperimenten als Matrix verwendet. Herstellung der Matrix: Lösung 1 (2,4,6-Trihydroxyacetophenon gesättigt in Ethanol:Wasser, 1 : 1) und Lösung 2 (0,1 M Ammoniumcitratin Wasser ∼ pH 5,5) werden im Verhältnis 2 : 1 gemischt. Enzyme wurden von Boehringer Mannheim bezogen: 5'→3' Phosphodiesterase aus Kalbsmilz: Das Enzym greift das Oligonukleotid am 5'-Ende an und hinterläßt 3' Nukleotide. 3'→5' Phosphodiesterase aus crotalus durissus: Das Enzym greift das Oligonukleotid am 3'-Ende an und hinterläßt 5' Nukleotide. RNase CL3 aus Hühnerleber: Das Enzym spaltet RNA bevorzugt an Cp/N-Bindungen und produziert Fragmente mit 3' endständigem Cytidinphosphat. Ap/N- und Gp/N-Bindungen werden viel langsamer hydrolysiert, Up/N-Bindungen sehr selten. RNase CL3/Pufferlösung (denaturierend): 2 µl RNase CL3 (0,2 U/µl) + 6 µl 8 M Harnstoff in Wasser resultieren in 8 µl 50 mU/µl Enzymlösung. 3'→5'-Phosphodiesternse/Pufferlösung: 2 µl (4 mU/µl) 3'→5'-Phosphodiesterase + 18 µl 0.1 M Ammoniumcitrat, pH 5,5 resultieren in 20 µl 0.2 mU/µl Enzymlösung. Sequenzen der untersuchten RNA-Stücke waren wie folgt 8mer: 5'-HO-CAUGUGAC-OH-3'; 9mer (RNA): 5'-HO-GCAUGUGAC-OH-3'; 9mer (DNA): 5'-HO-GTCACATGC-OH-3'; 16mer: 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCU-OH-3'; 22mer: 5'-HO- GCUCUUUUCU*UUUUUCUUUUCC-OH-3'; (U* = 13C markiertes Uridin an allen fünf Kohlenstoffatomen des Zuckerbausteins); 120mer (5s-ribosomale RNA): 5'- pUGCCUGGCGGCCGUAGCGCGGUGGUCCCACCUGACCCCAUGCCGAACUCAGAAGUGAAACGCCG­ UAGCGCCGAUGGUAGUGUGGGGUCUCCCCAUGCGAGAGUAGGGAACUGCCAGGCAU-OH-3'.Unless otherwise stated, the following applies to all examples of mass spectrometric RNA sequencing: Linear continuous MALDI-TOF mass spectrometry was carried out with a Fisons VG TOF spec mass spectrometer (8-mer, 9-mer RNA and DNA, 16-mer, 22-mer, 120-mer) and DE-MALDI-TOF measurements a PerSeptive Biosysteins Voyager mass spectrometer (16mer) containing a UV nitrogen laser with an emission frequency of 337 nm. The laser pulse width is 4 ns. The spectra were recorded in negative mode with the exception of the 16mers and 32mers. These were measured in positive mode. 2,4,6-trihydroxyacetophenone / ammonium citrate was used as a matrix in all sequencing experiments. Preparation of the matrix: Solution 1 (2,4,6-trihydroxyacetophenone saturated in ethanol: water, 1: 1) and solution 2 (0.1 M ammonium citrate in water ∼ pH 5.5) are mixed in a ratio of 2: 1. Enzymes were obtained from Boehringer Mannheim: 5 '→ 3' phosphodiesterase from calf's spleen: the enzyme attacks the oligonucleotide at the 5 'end and leaves 3' nucleotides behind. 3 '→ 5' phosphodiesterase from crotalus durissus: The enzyme attacks the oligonucleotide at the 3 'end and leaves 5' nucleotides behind. RNase CL3 from chicken liver: The enzyme cleaves RNA preferentially at Cp / N bonds and produces fragments with 3 'terminal cytidine phosphate. Ap / N and Gp / N bonds are hydrolyzed much more slowly, Up / N bonds are very rare. RNase CL3 / buffer solution (denaturing): 2 µl RNase CL3 (0.2 U / µl) + 6 µl 8 M urea in water result in 8 µl 50 mU / µl enzyme solution. 3 '→ 5' phosphodiesterase / buffer solution: 2 µl (4 mU / µl) 3 '→ 5'-phosphodiesterase + 18 µl 0.1 M ammonium citrate, pH 5.5 result in 20 µl 0.2 mU / µl enzyme solution. Sequences of the investigated RNA pieces were 8-mer as follows: 5'-HO-CAUGUGAC-OH-3 '; 9mer (RNA): 5'-HO-GCAUGUGAC-OH-3 '; 9mer (DNA): 5'-HO-GTCACATGC-OH-3 '; 16-mer: 5'-HO-GCGUACAUCUUCCCCU-OH-3 '; 22mer: 5'-HO-GCUCUUUUCU * UUUUUCUUUUCC-OH-3 '; (U * = 13 C labeled uridine on all five carbon atoms of the sugar building block); 120mer (5s ribosomal RNA): 5'- pUGCCUGGCGGCCGUAGCGCGGUGGUCCCACCUGACCCCAUGCCGAACUCAGAAGUGAAACGCCG UAGCGCCGAUGGUAGUGUGGGGUCUCCCCAUGCGAGAGUAGGGAACUGCC-3AGGCAU-OH '.

In allen Experimenten wurden Proben von je 1 µl nach einer Inkubationszeit von 1, 3, 6, 10, 20 und 60 Minuten genommen (es sind meist nicht alle Spektren gezeigt). Die Proben wurden mit der Matrix im Verhältnis 1 : 1 gemischt, auf die Probenplatte des Spektrometers pipettiert und ca. 20 Minuten an der Luft getrocknet. Die Trocknungs- und Kristallisationszeit kann durch vorsichtiges Anfönen verkürzt werden. Der enzymatische Verdau stoppt, wenn die Proben mit der Matrix vermischt werden.
In all experiments, samples of 1 µl each were taken after an incubation time of 1, 3, 6, 10, 20 and 60 minutes (mostly not all spectra are shown). The samples were mixed with the matrix in a ratio of 1: 1, pipetted onto the sample plate of the spectrometer and air-dried for about 20 minutes. The drying and crystallization time can be shortened by careful tinting. The enzymatic digestion stops when the samples are mixed with the matrix.

RNA 8mer (0,1 OD)RNA 8mer (0.1 OD) 9,0 µl9.0 µl 5'→3'-Phosphodiesterase (24 mU)5 '→ 3'-phosphodiesterase (24 mU)  6,0 µl6.0 µl ΣΣ 15,0 µl15.0 µl

Inkubationstemperatur: 22°C
Inkubationzszeit: 6 Minuten
Incubation temperature: 22 ° C
Incubation time: 6 minutes

RNA 8mer (0,1 OD)RNA 8mer (0.1 OD) 9,0 µl9.0 µl RNase CL3/Pufferlösung (400 mU; denaturierend)RNase CL3 / buffer solution (400 mU; denaturing)  8,0 µl8.0 µl ΣΣ 17,0 µl17.0 µl

Inkubationstemperatur: 50°C
Inkubationszeit: 10 MinutenIncubation temperature: 50 ° C
Incubation time: 10 minutes

Beispiel 2Example 2 Sequenzierung eines 16mers mit 5'→3' Phosphodiesterase (siehe Fig. 3)Sequencing a 16mer with 5 '→ 3' phosphodiesterase (see Fig. 3) Sequenzierung eines 16mers mit 3'→5' Phosphodiesterase (siehe Fig. 4)Sequencing a 16mer with 3 '→ 5' phosphodiesterase (see Fig. 4)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

b) mit 3'→5' Phosphodiesterase (aus crotalus durissus)b) with 3 '→ 5' phosphodiesterase (from crotalus durissus)

ExperimentellesExperimental

RNA 16mer (0,1 OD)RNA 16mer (0.1 OD) 15,2 µl15.2 µl 5'→3'-Phosphodiesterase (24 mU)5 '→ 3'-phosphodiesterase (24 mU)  6,0 µl6.0 µl ΣΣ 21,2 µl21.2 µl

Inkubationstemperatur: 22°C
Incubation temperature: 22 ° C

RNA 16mer (0,1 OD)RNA 16mer (0.1 OD) 15,2 µl15.2 µl 3'→5'-Phosphodiesterase/Pufferlösung (0,6 mU)3 '→ 5'-phosphodiesterase / buffer solution (0.6 mU)  3,0 µl3.0 µl ΣΣ 18,2 µl18.2 µl

Inkubationstemperatur: 40°CIncubation temperature: 40 ° C

Beispiel 3Example 3 Sequenzierung eines 22mers mit 5'→3' Phosphodiesterase (siehe Fig. 5)Sequencing a 22mer with 5 '→ 3' phosphodiesterase (see Fig. 5) Sequenzierung eines 22mers mit 3'→5' Phosphodiesterase (siehe Fig. 6)Sequencing a 22mer with 3 '→ 5' phosphodiesterase (see Fig. 6)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

a) mit 5'→3' Phosphodiesterase (aus Kalbsmilz)a) with 5 '→ 3' phosphodiesterase (from calf's spleen)

b) mit 3'→5' Phosphodiesterase (aus crotalus durissus)b) with 3 '→ 5' phosphodiesterase (from crotalus durissus)

ExperimentellesExperimental

RNA 22mer (0,1 OD)RNA 22mer (0.1 OD) 9,0 µl9.0 µl 5'→3'-Phosphodiesterase (24 mU)5 '→ 3'-phosphodiesterase (24 mU)  6,0 µl6.0 µl ΣΣ 15,0 µl15.0 µl

Inkubationstemperatur: 22°C
Incubation temperature: 22 ° C

RNA 22mer (0,1 OD)RNA 22mer (0.1 OD) 9,0 µl9.0 µl 3'→5'-Phosphodiesterase/Pufferlösung (0,6 mU)3 '→ 5'-phosphodiesterase / buffer solution (0.6 mU)  3,0 µl3.0 µl ΣΣ 12,0 µl12.0 µl

Inkubationstemperatur: 40°CIncubation temperature: 40 ° C

Beispiel 4Example 4 Simultane Sequenzierung von zwei Oligoribonukleotiden (8mer und 22mer; siehe Fig. 7)Simultaneous sequencing of two oligoribonucleotides (8-mer and 22-mer; see Fig. 7) Bezüglich Massen und Sequenzen der Sequenzierfragmente siehe Tabellen 1a und 3aFor the masses and sequences of the sequencing fragments, see Tables 1a and 3a ExperimentellesExperimental

RNA 22mer (0,1 OD)RNA 22mer (0.1 OD) 9,0 µl9.0 µl RNA 8mer (0,1 OD)RNA 8mer (0.1 OD) 9,0 µl9.0 µl 5'→3'-Phosphodiesterase (20 mU)5 '→ 3'-phosphodiesterase (20 mU)  5,0 µl5.0 µl ΣΣ 23,0 µl23.0 µl

Inkubationstemperatur: 22°C
Inkubationszeit: 20 Minuten Incubation temperature: 22 ° C
Incubation time: 20 minutes

Beispiel 5Example 5 Fingerprint einer 5s-ribosomalen RNA (120mer) mit RNase CL3 (siehe Fig. 8)Fingerprint of a 5s ribosomal RNA (120mer) with RNase CL3 (see Fig. 8) ExperimentellesExperimental

RNA 120mer (1 OD)RNA 120mer (1 OD) 10,0 µl10.0 µl RNase CL3/Pufferlösung (400 mU; denaturierend)RNase CL3 / buffer solution (400 mU; denaturing)  8,0 µl8.0 µl ΣΣ 18,0 µl18.0 µl

Inkubationstemperatur: 50°C
Inkubationszeit: 15 MinutenIncubation temperature: 50 ° C
Incubation time: 15 minutes

Beispiel 6Example 6 Sequenzierung eines 16mer Oligoribonukleotids (Fingerprint) mit RNase CL3Sequencing of a 16mer oligoribonucleotide (fingerprint) with RNase CL3 (Sequenz aus Tabelle 2; siehe Fig. 9)(Sequence from Table 2; see Fig. 9) ExperimentellesExperimental

RNA 16mer (0,1 OD)RNA 16mer (0.1 OD) 9,0 µl9.0 µl RNase CL3/Pufferlösung (100 mU; denaturierend)RNase CL3 / buffer solution (100 mU; denaturing) 15,2 µl15.2 µl ΣΣ 24,2 µl24.2 µl

Inkubationstemperatur: 50°C
Inkubationszeit: 1 Minute Incubation temperature: 50 ° C
Incubation time: 1 minute

Beispiel 7Example 7 Simultansequenzierung zweier 9mere (DNA und RNA; siehe Fig. 10)Simultaneous sequencing of two 9mers (DNA and RNA; see Fig. 10)

Fragmente und Massen des Verdaus eines RNA 9mers (5'-HO-GCAUGUGAC-OH- 3') mit 3'→5'-Phosphodiesterase (aus crotalus durissus)Fragments and masses of the digestion of an RNA 9mer (5'-HO-GCAUGUGAC-OH- 3 ') with 3' → 5'-phosphodiesterase (from crotalus durissus)

Fragmente und Massen des Verdaus eines RNA 9mers (5'-HO-GCAUGUGAC-OH- 3') mit 3'→5'-Phosphodiesterase (aus crotalus durissus)Fragments and masses of the digestion of an RNA 9mer (5'-HO-GCAUGUGAC-OH- 3 ') with 3' → 5'-phosphodiesterase (from crotalus durissus)

Fragmente und Massen des Verdaus eines DNA 9mers (5'-HO-d(GTCACATGC)- OH-3') mit 3'→5'-Phosphodiesternse (aus crotalus durissus)Fragments and masses of the digestion of a DNA 9mer (5'-HO-d (GTCACATGC) - OH-3 ') with 3' → 5'-phosphodiester star (from crotalus durissus)

Fragmente und Massen des Verdaus eines DNA 9mers (5'-HO-d(GTCACATGC)- OH-3') mit 3'→5'-Phosphodiesternse (aus crotalus durissus)Fragments and masses of the digestion of a DNA 9mer (5'-HO-d (GTCACATGC) - OH-3 ') with 3' → 5'-phosphodiester star (from crotalus durissus)

DNA-AbgangsgruppenDNA leaving groups

DNA-AbgangsgruppenDNA leaving groups

RNA-AbgangsgruppenRNA leaving groups

RNA-AbgangsgruppenRNA leaving groups

ExperimentellesExperimental

RNA (0,1 OD)RNA (0.1 OD) 12,5 µl12.5 µl DNA (0,1 OD)DNA (0.1 OD) 2,3 µl2.3 µl 3'→5'-Phosphodiesterase/Pufferlösung (2 mU)3 '→ 5'-phosphodiesterase / buffer solution (2 mU) 10,0 µl10.0 µl ΣΣ 24,8 µl24.8 µl

Inkubationstemperatur: 40°CIncubation temperature: 40 ° C

Im folgenden werden die Vorteile der Methode nochmals aufgeführt:
The advantages of the method are listed again below:

  • - Das Verfahren arbeitet elektrophoresefrei und ist damit sehr schnell.- The process works electrophoresis-free and is therefore very fast.
  • - Es wird kein zusätzlicher Marker zur Detektion benötigt auch keine Radioaktivität. Damit entfallen alle Markierungsschritte.- No additional marker is required for detection and no radioactivity. In order to all marking steps are omitted.
  • - Das Verfahren nutzt nicht nur die Bestimmung der Masse zur Dateninterpretation, sondern auch die Peakintensitäten. Damit sind auch Spektrometer mit geringer Auflösung, die auch leicht bedienbar sind, einsetzbar und das Verfahren wird kostengünstig.- The method not only uses the determination of the mass for data interpretation, but also the peak intensities. This also includes spectrometers with low resolution that too are easy to operate, deployable and the process becomes inexpensive.
  • - Es ist keine genaue Massenbestimmung nötig. Deshalb können auch sehr lange Polymere sequenziert werden.- It is not necessary to determine the exact mass. Therefore, very long polymers can also be used sequenced.
  • - Die Methode kann zur Sekundärstrukturvorhersage von Biopolymeren herangezogen werden.- The method can be used to predict the secondary structure of biopolymers will.
  • - Das Verfahren kann zur Sequenzierung von modifizierten Bioploymeren dienen.- The method can be used for sequencing modified biopolymers.
  • - Das Verfahren kann zur Bestimmung von Organismen dienen (Fingerprint/Footprint).- The method can be used to determine organisms (fingerprint / footprint).
  • - Die Methode ist automatisierbar und parallelisierbar.- The method can be automated and parallelized.
Zusammenfassungsummary

Es wird ein neues Verfahren zur Sequenzierung von Biopolymeren mit Massenspektrometrie beschrieben. Die Sequenzierung von Bioploymeren ist entweder langwierig oder benötigt eine genaue Massenbestimmung von Fragmenten. Dies ist vor allem für lange Polymere schwierig. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse von Phosphodiester-, Peptid- oder Glycosidbindungen mit Exo-/Endonukleasen, -peptidasen, -glycosidasen oder anderen hydrolytisch wirkenden Substanzen wird in unserem Verfahren zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren oder anderen Biopolymeren herangezogen. Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente erfolgt mit Massenspektrometrie durch Bestimmung der Masse und unterschiedlichen Peakintensitäten. Der primäre Vorteil der Methode liegt darin, daß keine exakte Massenbestimmung mehr notwendig ist und auch Massenspetrometer mit geringer Auflösung verwendet werden können, Analyse und Trennung der Fragmente extrem schnell sind, da sie elektrophoresefrei sind und die Sequenz modifizierter Nukleinsäuren bestimmt werden kann. Weitere Vorteile sind, daß unmarkierte Nukleinsäuren eingesetzt werden können und keine Radioaktivität benötigt wird. Die Methode kann durch gleichzeitige Sequenzanalyse mehrerer Nukleinsäuren parallelisiert werden, wodurch die Sequenziergeschwindigkeit steigt. Die Methode kann weiterhin zur Erkennung und Bestimmung von Organismen herangezogen werden (Fingerprint, Footprint), wobei Finger- und Footprint genauer sind als bei bisherigen Methoden: Es werden nach der Hydrolyse einer Phosphodiesterbindung beide Spaltfragmente detektiert, während herkömmliche Verfahren nur ein markiertes Fragment detektieren können. Schließlich kann die Methode zur Aufklärung der Sekundärstruktur von Nukleinsäuren mit Massenspektrometrie beitragen. Diese Prinzipien lassen sich auch auf die Sequenzierung bzw. Sekundärstrukturbestimmung anderer Biopolymere anwenden, wie z. B. Peptide und Oligosaccharide. A new method for sequencing biopolymers using mass spectrometry is being used described. The sequencing of biopolymers is either tedious or requires one accurate mass determination of fragments. This is particularly difficult for long polymers. The rate of hydrolysis of phosphodiester, peptide or glycoside bonds with Exo- / endonucleases, -peptidases, -glycosidases or other hydrolytically acting Substances is used in our procedure for sequence analysis of nucleic acids or other Biopolymers used. Separation and detection of the generated fragments is carried out with Mass spectrometry by determining the mass and different peak intensities. Of the The primary advantage of the method is that it is no longer necessary to determine the exact mass and also low resolution mass spectrometers can be used for analysis and separation of the fragments are extremely fast since they are electrophoresis-free and the Sequence of modified nucleic acids can be determined. Other advantages are that unlabeled nucleic acids can be used and no radioactivity is required. The method can be parallelized by simultaneous sequence analysis of several nucleic acids which increases the sequencing speed. The method can still go to Recognition and identification of organisms are used (fingerprint, footprint), whereby the fingerprint and footprint are more precise than with previous methods: According to the Hydrolysis of a phosphodiester bond detected both cleavage fragments while conventional methods can only detect a labeled fragment. After all, the Method for elucidating the secondary structure of nucleic acids using mass spectrometry contribute. These principles can also be applied to sequencing or Apply secondary structure determination of other biopolymers, such as B. peptides and Oligosaccharides.

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Claims (8)

1. Ein Verfahren zur Sequenzierung von Biopolymeren mit Massenspektrometrie, vornehmlich Ribonukleinsäuren (RNA) oder Nukleinsäuren (DNA) oder Peptiden oder Oligosacchariden durch Verdau des zu untersuchenden RNA- oder DNA- oder Peptid- oder Oligosaccharid- Stranges mit spezifischen Exo- /Endonukleasen, -peptidasen, -carboxyesterasen, -amidasen oder -glycosidasen oder anderen Sequenz- oder basenspezifisch spaltenden Verbindungen, wobei die Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente einer Kinetik folgend durch Massenspektrometrie, vornehmlich MALDI, erfolgt und unterschiedliche Peakintensitäten, hervorgerufen durch enzymatische oder chemische Hydrolyse der entsprechenden einzelnen Bindungen, in den Massenspektren zur Interpretation der Sequenzdaten herangezogen werden.1. A method for sequencing biopolymers using mass spectrometry, mainly ribonucleic acids (RNA) or nucleic acids (DNA) or peptides or Oligosaccharides by digesting the RNA or DNA or peptide or Oligosaccharide strand with specific exo- / endonucleases, peptidases, -carboxyesterases, -amidases or -glycosidases or other sequence or base-specific cleavage compounds, with the separation and detection of the generated fragments following kinetics by mass spectrometry, mainly MALDI, occurs and different peak intensities, caused by enzymatic or chemical hydrolysis of the corresponding individual bonds in the Mass spectra can be used to interpret the sequence data. 2. Die Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Sequenzierung von modifizierter und unmodifizierter DNA, RNA, Peptide und Oligosaccharide. Modifikationen können bei Nukleosiden und Nukleotiden -verglichen mit Adenosin, Guanosin, Uridin, Cytidin und Thymidin bzw. deren Phosphate und Oligomere- Veränderungen an der Base, am Zucker oder an der Phosphatgruppe bzw. des Phosphatrückgrates betreffen, bei Peptiden Abweichungen der als "20 natürliche Aminosäuren" bekannten Monomere von Peptiden und bei Oligosacchariden den bekannten "natürlichen" Sacchariden.2. The application of the method according to claim 1 for the sequencing of modified and unmodified DNA, RNA, peptides and oligosaccharides. Modifications can be made at Nucleosides and nucleotides - compared to adenosine, guanosine, uridine, cytidine and Thymidine or its phosphates and oligomeric changes to the base, to the sugar or on the phosphate group or the phosphate backbone, in the case of peptides Variations in monomers known as "20 natural amino acids" from peptides and in the case of oligosaccharides, the well-known "natural" saccharides. 3. Die Verwendung von Enzymen oder anderen Sequenz- oder basenspezifisch spaltenden Verbindungen, die bei der Hydrolyse von Bindungen unterschiedliche Geschwindigkeiten aufweisen und zur Sequenzierung von Nukleinsäuren (RNA/DNA), Peptiden oder Oligosacchariden in einem Verfahren nach Anspruch 1 und 2 eingesetzt werden.3. The use of enzymes or other sequence- or base-specific cleavage Compounds that hydrolyze bonds at different rates have and for sequencing nucleic acids (RNA / DNA), peptides or Oligosaccharides are used in a method according to claims 1 and 2. 4. Ein Verfahren zur simultanen Sequenzierung von mehreren Ribonukleinsäuren (RNA), Nukleinsäuren (DNA), Peptiden und Oligosacchariden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Verdau des zu untersuchenden RNA-, DNA-, Peptid- oder Oligosaccharid-Stranges mit spezifischen Exo-/Endonukleasen, -peptidasen, -amidasen, -carboxyesterasen oder Exo- und Endoglycosidasen oder anderen Sequenz- oder basenspezifisch spaltenden Verbindungen gleichzeitig erfolgt, wobei die Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente einer Kinetik folgend durch Massenspektrometrie, vornehmlich MALDI, erfolgt und unterschiedliche Peakintensitäten, hervorgerufen durch enzymatische oder chemische Hydrolyse der entsprechenden einzelnen Bindungen, in den Massenspektren zur Interpretation der Sequenzdaten herangezogen werden.4. A method for the simultaneous sequencing of several ribonucleic acids (RNA), Nucleic acids (DNA), peptides and oligosaccharides according to Claim 1, characterized characterized in that the digestion of the RNA, DNA, peptide or to be examined Oligosaccharide strand with specific exo- / endonucleases, -peptidases, -amidases, -carboxyesterases or exo- and endoglycosidases or other sequence or base-specific cleaving compounds takes place simultaneously, with the separation and Detection of the generated fragments following kinetics by mass spectrometry, mainly MALDI, and different peak intensities, caused by enzymatic or chemical hydrolysis of the corresponding individual bonds in the Mass spectra can be used to interpret the sequence data. 5. Ein Verfahren zur Sequenzierung von RNA, DNA, Peptiden und Oligosacchariden durch Verdau des zu untersuchenden Stranges mit spezifischen Endonukleasen, -peptidasen, -carboxyesterasen, -amidasen, Endoglycosidasen und anderen sequenz- oder basenspezifisch Endo-spaltenden Verbindungen, wobei die Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente durch Massenspektrometrie, vornehmlich MALDI, erfolgt.5. A method for sequencing RNA, DNA, peptides and oligosaccharides Digestion of the strand to be examined with specific endonucleases, endonucleases, -carboxyesterases, -amidases, endoglycosidases and others sequence- or base-specific Endo-cleavage compounds, with the separation and detection of the generated Fragments by mass spectrometry, principally MALDI, is done. 6. Ein Verfahren zur Analyse und Bestimmung von Organismen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß deren RNA oder DNA einem "Fingerprinting" oder "Footprinting" unterworfen werden und die Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente durch Massenspektrometrie, vornehmlich MALDI, erfolgt.6. A method for the analysis and determination of organisms according to claim 1, characterized in characterized in that their RNA or DNA is subject to "fingerprinting" or "footprinting" are subjected and the separation and detection of the fragments generated by Mass spectrometry, primarily MALDI, takes place. 7. Ein Verfahren zur Sekundärstrukturbestimmung von Nukleinsäuren (DNA/RNA), Peptiden und Oligosacchariden durch Verdau der Biopolymeren mit Exo-/Endonukleasen, -peptidasen, -carboxyesterasen, -amidasen und -glycosidasen oder anderen Sequenz- oder basenspezifisch spaltenden Verbindungen und Trennung und Detektion der erzeugten Fragmente mit Massenspektrometrie, vornehmlich MALDI, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Sekundärstrukturbereiche (z. B. loops, doppelsträngige Bereiche) nur langsam oder gar nicht bzw. sehr viel schneller von diesen Enzymen angegriffen werden.7. A method for determining the secondary structure of nucleic acids (DNA / RNA), peptides and oligosaccharides by digesting the biopolymers with exo- / endonucleases, peptidases, carboxyesterases, amidases and glycosidases or other sequence or base-specific cleavage compounds and separation and detection of the generated Fragments with mass spectrometry, primarily MALDI, according to claim 1, characterized characterized in that secondary structure areas (e.g. loops, double-stranded areas) only be attacked slowly or not at all or much faster by these enzymes. 8. Kombination der Verfahren nach Anspruch 1-7 zur Analyse von (Ribo-) Nukleinsäuren, Peptiden und Oligosacchariden.8. Combination of the methods according to claims 1-7 for the analysis of (ribo-) nucleic acids, Peptides and oligosaccharides.
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