JP2001500606A - Method and apparatus for statistically certain polymer sequencing using mass spectrometry - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書に開示した方法および装置は質量分析法を用いたポリマー類の配列決定に有用なものである。本法は質量分析計での使用に適するようにした反応表面上に、加水分解剤/ポリマー比の異なるものを配置する。本法はさらに複数のシリーズの加水分解ポリマー・フラグメントの質量スペクトル分析から得られたデータを統合する方法、ならびにそのための統計的解釈基準およびコンピュータ・ソフトウェアを提供する。本装置は、ホルダ上に加水分解剤を配置する質量分析計用サンプル・ホルダを有するが、これはポリマー配列決定を行なうためのスペクトル分析計すべてに適用するのに有用なものである。   (57) [Summary] The methods and apparatus disclosed herein are useful for sequencing polymers using mass spectrometry. The method places different hydrolyzing agent / polymer ratios on a reaction surface that is suitable for use in a mass spectrometer. The method further provides a method of integrating data obtained from mass spectrometric analysis of multiple series of hydrolyzed polymer fragments, as well as statistical interpretation criteria and computer software therefor. The apparatus has a mass spectrometer sample holder that places the hydrolyzing agent on the holder, which is useful for all spectral analyzers for performing polymer sequencing.

Description

【発明の詳細な説明】 質量スペクトル分析を用いた統計的に確実性のあるポリマー配列決定のための方 法および装置 発明の技術分野 本発明は、質量スペクトル分析を用いてポリマー類、特にバイオポリマー（生 物高分子物質）類の配列を決定するための方法および装置に関する。 背景技術 生化学者達はバイオポリマーの配列の信頼性の高いかつ迅速な決定に頼ること が多い。たとえば、配列情報はペプチド・スクリーン、遺伝子プローブ、遺伝子 マッピング、および薬剤モデル化の研究および開発、ならびに診断用および/ま たは治療用に製造されるバイオポリマー類の品質管理に極めて重要なものである 。 アミノ酸、炭水化物およびヌクレオチド類で構成されたポリマー類の配列決定 用としては各種の方法が知られている。たとえば、ペプチド配列決定のための既 存の方法としては、エドマン分解のN末端化学法、NおよびC末端の酵素的方法、 ならびにC末端化学法がある。オリゴヌクレオチド類の配列決定の既存の方法と しては、マクサムーギルバート［Maxam-Gilbert］塩基特異性化学開裂法、およ びジデオキシ塩基特異性ターミネーション法による酵素的ラダー（段階的）合成 法がある。それぞれの方法には固有の限界があるため、それらを専ら完全な一次 構造同定のために使用することが妨げられている。今日までのところ、エドマン 配列法およびその応用法が特定の蛋白質およびペプチド類の残基ごとの配列決定 のために最も広く使用されている道具となっており、一方酵素的合成法はオリゴ ヌクレオチド類の配列決定に好適とされている。 蛋白質およびペプチド配列決定の場合には、化学法によるC末端配列決定は特 に難しいとされており、せいぜいほんの少し役に立つ程度である（たとえば、ス ピース[Spiess]，J．(1986)蛋白質特性付け法：実用ハンドブック（シブリー[Sh ively]，J．E.編）、Humana Press、N.J.刊）363-377頁；ツギタ[Tsugita]ら（1 994）J．Protein Chemistry、13:476-479参照）。 その結果、C末端は信頼性の高い方法がないためにしばしば分析できない領域 として残っている。 ペプチドおよびオリゴヌクレオチド類の場合はともに、化学配列決定に代わる 方法は酵素開裂配列決定法である。オリゴヌクレオチド類の場合、150以上の異 なる酵素が単離されており、これらはオリゴヌクレオチド・フラグメントの調製 に好適とされている。ペプチド類の場合は、セリンカルボキシペプチダーゼ類が 蛋白質またはペプチドのC末端からアミノ酸を残基ごとに順番に開裂させる簡単 な方法を提供するものとして過去20年以上にわたり多用されている。 カルボキシペプチダーゼY（CPY）は特に、プロリンを含めすベての残基をC末 端から非特異的に開裂するということから魅力的な酵素である（たとえば、ブレ ダム[Breddam]ら、（1987）Carsburg Res．Commun．52:55-63参照）。 カルボキシペプチダーゼ消化によるペプチド類の配列決定は伝統的に、解離さ れたアミノ酸を残基ごとに手間のかかる直接分析することによって行われてきた 。この方法は手間がかかるだけでなく、酵素および蛋白質/ペプチド溶液中のア ミノ酸夾雑物や酵素の自己分解によって複雑なものとなる。この種の配列決定作 業すべてにおけるさらなる障害は、使用する特定の酵素による個々の残基の加水 分解および解離に関する良好な動力学的情報が絶対的に必要とされる点である。 フィールド・ディソープション法（ホン[Hong]ら（1983）、Biomed．Mass Spe ctrom．10:450-457）、エレクトロ・スプレー法（スミス[Smith]ら（1993）4 Te chniques Protein Chem．463-470）、およびサーモ・スプレ一法（スタチョイア ック[Stachowiak]ら（1988）、J．Am．Chem．Soc.110:1758-1765）など、高質量 物質の分析が可能な質量スペクトル分析技術の進歩によって、CPY消化で得られ るペプチド・フラグメントなどで配列順序が保存されている大きなバイオポリマ ー類の直接質量分析を行なうことが可能となり、解離されたアミノ酸を残基ごと にアミノ酸分析をする必要性が回避されることとなった。この“ラダー（段階的 ）”配列決定方式では、隣接するペプチドピーク間の質量差を計算することによ り、配列を正しい順序で導き出すことができる−つまり、測定された差は特定の アミノ酸残基の消失を表すものである。 さらに最近では、飛行時間型のマトリックス支援レーザー・ディソープション ・イオン化（MALDI-TOF:Matrix-Assisted Laser Desorption ionization Time-o f-Flight）質量スペクトル分析もまた、高い感度、分解能、および質量精度を有 するとして、ラダー配列分析に好適であることが示されている。チャイト[Chait ]ら（（1993） 262 Science 89-92）はこうしたMALDI-TOFの長所を、エドマン分解法による化学 消化の各ステップの部分的遮断により形成されるN末端ラダーのラダー配列決定 に活用している。この方式もなお、プロセスの複雑さ、時間のかかるプロセスの 性質、ならびにC末端情報の欠如といった従来のエドマン化学と同じ限界を抱え ている。しかしながら、この方法はペプチドラダー・シナリオを使用したペプチ ドの配列決定に対するMALDI-TOFの有用性を認めるものである。他の研究者達も また、得られた切形ペプチド混合物を分析するためにペプチドのカルボキシペプ チダーゼ消化をMALDI-TOFと組み合わすことができることを示している。たとえ ば、ヒト甲状腺ホルモンの1-34フラグメントのC末端から8つの連続したアミノ酸 配列が決定されている（シャー[Schar]ら（1991）、Chimia 45:123-126）。 さらに、ペプチドのカルボキシペプチダーゼ消化はプラズマ・ディソープショ ン法などその他の質量分析法とも組み合わされている(ワン[Wang]ら(1992)Techn iques Protein Chemistry III（アンゲレッティ[Angeletti]編、Academic Press ,，N.Y.刊）503-515頁)。しかしながら上述の配列決定方法はすべて、単調かつ 時間のかかる予備的な最適化ステップを必要とする。さらに、そうした予備的最 適化ステップは試薬ならびに通常限られた量しか得られないポリマーのサンプル を不必要に消費してしまう。そのうえ、上述の配列決定方法は終局的には数が限 られた単一の質量分析スペクトルおよび単一の質量/電荷比データに頼ることに なり、これは最終的なポリマー配列を決定するためには統計的に不十分な根拠を 与えるものにしかならない。 本発明の目的の1つは、質量分析およびポリマーの時間非依存性/濃度依存性の 加水分解を利用して、ポリマー類、特にバイオポリ マー類の配列決定を行なうための方法および装置を提供することにある。さらに 詳細には、複数の並列質量スペクトルから得られる質量/電荷比を総合すること をベースとするデータ解釈戦略を組み入れた配列情報を得るための方法を提供す るのが本発明の1つの目的である。本発明の別の目的は、先行技術の方法で必要 とされる時間のかかる最適化および方法強化を回避して、配列情報を得るための 迅速な方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、感度の高い質量分 光分析と、加水分解を質量スペクトル分析と緊密に統合することによるサンプル 損失の排除を組み合わせて、少ないポリマー総量を使用して配列情報を提供する ことにある。 発明の要旨 したがって、本発明の視点の1つは質量分析で集められる情報を利用してポリ マー類の配列決定を行なうための統合された方法を指向するものであり、この方 法はこの分野にまつわる問題点を実質的に克服するものである。ここに概説する ように、本発明は質量既知の複数のモノマーを包含するポリマーについての配列 情報を得る方法を提供するものである。当分野の熟練技術者はまず、ポリマーの 加水分解で作り出された1組のフラグメント、ただし各セットは1以上のモノマー が異なるものを用意し、そして少なくとも一対のフラグメントの質量/電荷比の 差を決定する。次に、1以上の異なるモノマーの既知の質量/電荷比に対応する平 均の質量/電荷比を確定する（訳注：原文のassertは“一応確定する”または“ 推量して断定する”というニュアンスのようであるが、断定や仮定では強すぎ、 想定では弱すぎ、推定ではestimateと誤解される恐れもあるた め、煩雑さを避けるために単純に“確定”と訳出した。以下同じ。）。この確定 平均値を測定平均値と比較し、これら２つの値が望ましい信頼水準において統計 的に異なるかどうかを判断する。もし統計的差異がある場合には、確定平均差は 実際の測定差に割り当てることはできない。現在の好ましい実施方法のいくつか では、測定平均差の精度を上げるために、フラグメント対間の差の追加測定値を 採用している。このような方法のステップを、一対のフラグメント間の単一差と して望ましいすべてのμｓを確定するまで反復する。その他の追加フラグメント 対についても、望ましい配列情報が得られるまでこの方法を反復する。 本発明でクレームされた方法は、DNA、RNA、PNA、蛋白質、ペプチドおよび炭 水化物ならびにこれらポリマー類の修飾物などのバイオポリマー類を含め、すべ てのポリマーに適用可能である。ポリマー・フラグメントのセットはポリマーの モノマー間結合を加水分解することによって作り出すことができる。前述のポリ マーに関しては、本発明は異なる一連のモノマーで特徴付けられる天然および合 成成分の両者に適用することを意図している。ある実施態様においては、ポリマ ーを修飾することもできる。本発明はまた、加水分解を起こさせるための加水分 解剤を包含させることも意図している。加水分解剤は、酵素または酵素以外の試 薬、およびそれらのいかなる組み合わせでもよい。 現在の好ましい実施態様の1つにおいて、ポリマーの配列情報を得る方法は、 当該ポリマーを加水分解することによって作り出されるポリマー・フラグメント のセット、ただしそれぞれのフラグメントは既知の質量の1以上のモノマーが異 なるもの、を用意し、この 次に1以上のモノマーの既知の質量/電荷比と関連する平均差μを確定し、またμ の所望する信頼水準を選択する。フラグメント対間の質量/電荷比の差xを測定す るステップを反復して測定数nを得ることにより、測定フラグメント対間の統計 的平均質量/電荷比の 統計t計算値を求める： そしてフラグメント対間の質量/電荷比の差について望ましいμｓがすべて確 定されるまでこの方法のステップを繰り返す。ポリマーの配列情報はさらにこの 方法のステップを追加のフラグメント対に繰り返すことによって得られる。 本明細書に開示した別の実施態様においては、本発明はさらに一連の異なるモ ノマーを包含するポリマーに関する配列情報を得る方法も提供するが、この方法 は反応表面上に、当該ポリマーを加水分解してモノマー間結合を破壊する少なく とも1用量の加水分解剤とポリマー・サンプルを供して、異なる加水分解剤/ポリ マー比を作り出し、これを複数のシリーズの加水分解ポリマー・フラグメントを 得るのに十分な時間インキュベートし、この複数のシリーズについて質量分析を 行なってそのシリーズに含まれている加水分解ポリマー・フラグメントの質量/ 電荷比データを得、そして上記のように複数のシリーズからのデータを総合して ポリマーサンプルに特徴的な配列情報を得ることを包含する。 本発明は配列決定ラダーを作るためのポリマー加水分解能のある 加水分解剤を使用する実施態様、ならびにポリマー・マップを形成する能力のあ る加水分解剤を使用する別の実施態様も考案している。 さらに別の実施態様においては本発明はそれら加水分解剤の組み合わせによる ポリマーの加水分解、ならびに酵素的および非酵素的な加水分解剤を使用するポ リマー加水分解法も提供する。現在好ましい方法とされているものでは、加水分 解剤は区分された分離ゾーンのアレイの形で反応表面上に配置される。いくつか の実施態様においては、１以上の異なる用量の加水分解剤を有する反応表面上で ポリマーを加水分解することによって、複数のポリマー・フラグメントのセット の配列が決定される。最も好ましい実施態様においては、濃度依存性加水分解が 並列で起きるように、加水分解剤を反応表面上にスペースをあけて別々の異なる 用量で供する。別の実施態様においては、加水分解剤を勾配をもって配置する。 さらに別の実施態様においては、加水分解剤を一定量で反応表面に配置する。別 の実施態様においてはポリマーを反応表面上に同様の形で配置する。すべての実 施態様において、複数のシリーズの加水分解ポリマー・フラグメントを得るため に、異なるポリマー/加水分解剤比率のものを反応表面上に配置し、そしてイン キュベートする。そのような異なる比率を作り出す種々の方法については熟練技 術者は承知している。 たとえば、一連の濃度の加水分解剤を、パーセプティブ・バイオシステムズ[P erSeptive Biosystems Inc.]社製のVoyager*TM MALDI-TOFバイオスペクトロメト リー・ワークステーションのサンプル・プレートのμＬ穴1列に分散させる。自 然蒸発後に、マトリックスを各穴に加え、サンプル・プレートをMALDI-TOF質量 分析計で読みとる。時間依存性の消化および濃度依存性の消化は類似した配列 情報をもたらすが、濃度依存性の方法を使用する方が容易に自動化できること、 すべてのサンプルが同時に用意でき、また反応容器から分析プレートへの移動に より失われるサンプル物質が少ないという理由から好ましい。したがって濃度依 存性のオン・プレート加水分解を行い、次いでMALDI質量分析計による分析を行 なうのが好ましい。これはMALDIの良好な感度と消化段階から分析段階への移動 にかかわるサンプル損失がないということがあいまって、全ペプチドとして数ピ コモルしか必要としないからである。 MALDIにより配列情報を得る場合、質量/電荷比の測定前のいつの時点でも、適 当な光吸収性マトリックスをポリマー・フラグメントに加えることもできる。た とえば、マトリックスを反応表面上にあらかじめ乗せて置くこともでき、あるい は代わりに加水分解の前、途中、あるいは後に、加水分解混合物に加えることも できる。 別の実施態様のいくつかにおいては、本法はまた加水分解剤とポリマーをその 他の有用な成分と組み合わせる方法も提供する。１つの実施態様では、加水分解 されたフラグメントを質量スペクトル分析の前に選択的にシフトする成分が含ま れている。別の実施態様においては、加水分解されたフラグメントのイオン化を 改善する能力のある成分が含まれている。さらに別の実施態様においては、光吸 収性マトリックスを含めるための方法を提供している。本発明方法はまた1以上 の上記成分のいずれかを、質量スペクトル分析の前に加水分解剤とポリマーに組 み合わせる実施態様も考案している。 本発明の別の視点は、ポリマーの配列を決定するための装置およびキットに関 するものである。種々の実施態様における本発明の装置およびキット類は、質量 スペクトル分析計とそれに応答するコンピュータまたは質量スペクトル分析計に 連動するコンピュータのい ずれかを含む。実施態様の1つにおける本発明の装置は、イオンを発生させる手 段と、イオンを加速する手段ならびにイオンを判別する手段を有する質量スペク トル分析計を含む。この質量スペクトル分析計は質量スペクトル分析計に応答す るコンピュータと連動し、このコンピュータが本発明の方法を実施する手段を有 する。 さらに別の実施態様における本発明の装置は、質量スペクトル分析計との組み 合わせで本発明の方法を実施するのに必要な情報を収納したコンピュータ読み取 り可能なディスクを含む。別の実施態様においては、本装置は本発明の方法を実 施する手段を有するコンピュータそのものを含む。 さらに具体的には、本発明の装置の実施態様の1つでは質量分析計用の新規な 形のサンプル・プレートまたはサンプル・ホルダを含む。このサンプル・プレー トまたはサンプル・ホルダは、異なるポリマー/加水分解剤比率を有する別々の 間隔をあけた領域を持つ反応表面を包含する。加水分解剤が各領域のポリマーの モノマー間結合を加水分解する適当なインキュベーション期間の後、加水分解さ れたポリマー・フラグメントを含む複数の、典型的にはすべての、領域が質量分 析計の中で、典型的には連続的に、イオン化され、これらフラグメントの質量/ 電荷比を表すデータが得られる。1以上のこれらの領域は多かれ少なかれ、有用 なラダー成分またはその他のポリマー・フラグメントを発生させるのに適した加 水分解剤/ポリマー比率を有する。サンプル・ホルダ上のいくつかの領域は、配 列情報を導き出すには役に立たない過度に加水分解されたポリマー・フラグメン トを含むことがある。別の領域は実質的に加水分解されていないポリマーを含む こともある。しかしながら、すべての領域の質量分析をすることにより、少なく とも1以上の領域で発生し たフラグメントからいくつかの質量/電荷比のデータを得ることができる。した がって異なる領域からのデータを総合することによって、本発明の方法は加水分 解剤/ポリマーの比率を適当なものとするために実験的にサンプルを調製する必 要性、ならびに従来必要とされていた最適反応時間や注意深い反応温度の制御と いった必要性を回避できる。そのうえ、さらに有用な加水分解フラグメントを発 生させるために、サンプル・ホルダ上の異なる一連の領域に異なる加水分解剤を 使用することができ、これらから得られるデータを配列決定プロセスを改善する ために統合的に利用することができる。データ分析を本発明に基づくコンピュー タ・プログラムによって実施すれば、全プロセスを前記インキュベーション終了 後数分内に完了させることができる。 現在好ましいとされている実施態様のあるものにおいては、質量分析計のサン プル・プレートまたはサンプル・ホルダは少なくともその上に配置されたポリマ ーを加水分解することができる1用量の加水分解剤を含む平面状固相表面を有す る。実施態様の1つにおいては、加水分解剤は脱水した形で反応表面上に配置さ れる。別の実施態様においては、加水分解剤は反応表面上に固定化される。さら に別の実施態様においては、加水分解剤は反応表面上に、物理的転移に抵抗性の ある液体またはゲル状の形で配置される。さらに別の実施態様においては、サン プル・ホルダの表面上に光吸収性マトリックスが配置される。加えて、サンプル ・ホルダのそれら実施態様の1つ以上においては、それらの表面にさらにマイク ロ反応容器を備える。上記サンプル・ホルダの実施態様のあるものは使い捨て型 のものである。さらにこの反応表面をさまざまな基質で作り上げ、質量分析計用 として好適なさまざまな形状としたものも考案されて いる。本明細書に開示するように、サンプル・プレートまたはサンプル・ホルダ のすべての実施態様は、ポリマーの配列決定のための質量分析装置に応用するの に有用なものである。 熟練当業者には明らかな通り、本発明に基づく配列情報を得るための方法およ び装置は従来のポリマー配列決定法にまつわる問題点を解決するものである。前 述のように、従来の液相消化方法を用いて作り出したペプチド・ラダー、すなわ ち、酵素消化物から決められた時間間隔で取り出したサンプルのアリコートは多 くの欠点を抱えている。たとえば、可能性のあるすべての配列情報を保存しなが ら短時間に顕著な消化を得るためには、多くの展開（準備）時間と、大量の酵素 およびペプチドが必要とされる。配列情報を導き出そうとするそれぞれのペプチ ドについて、実際の配列分析に先立って時間のかかる方法を展開しなければなら ないのである。なぜならば1つのペプチドに対する最適条件の組み合わせは、た とえばCPYのようなさまざまな酵素剤の加水分解速度が組成依存的であることを 考えると、別のペプチドに対して有用ということはありえない。本発明で考案さ れているように、これに代わる戦略は消化をMALDIサンプル表面で実施すること である。たとえば、本発明に基づいてエキソペプチダーゼ消化のようなオン・プ レートでのポリマー加水分解を実施する場合、全体的なポリマー配列決定作業は 先行技術の時間依存性の消化に比べて次の点で優れる。すなわち、方法が極めて 簡便であり、手間のかかる最適化の必要性を省くことができること；反応容器か ら反応表面への移送によるサンプルの損失が減ること；使用する酵素およびペプ チドの量が少ないこと；そして大規模に応用する場合に特に重要なこととして、 使用/自動化が容易なことである。同様に、本発明の質量分析用サンプル・プレ ートまたはサン プル・ホルダは熟練技術者が従来得ることができなかった利点を与えるものであ る。たとえば実施態様のあるものは試薬の操作を最少限にし、サンプル処理を著 しく容易にする。熟練技術者は単にポリマーのサンプルを供するだけでよい。そ の他の実験的パラメータもほとんどすべてが事前に最適化される。 本発明の前述およびその他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明でより 明らかになるであろう。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は例示的か つ説明的なものであり、請求項の本発明をさらに詳しく説明することを意図した ものである。付帯図面は本発明の理解を深めるために組み入れたもので、本明細 書の一部を構成するものであり、本発明のいくつかの実施態様を説明するもので あって、明細書とともに本発明の原理を説明するためのものである。 図面の簡単な説明 本発明の前述およびその他の目的、特徴および利点、ならびに本発明そのもの については、以下の好ましい実施態様を付帯図面と合わせて読むことによってさ らに完全に理解されることになるが、 図1は、MALDI分析のための例示的なサンプル・プレートまたはサンプル・ホル ダである。穴はマイクロ反応容器として働き、その中でオン・プレート消化が行 われる。プレートの寸法は57x57mmで、穴は直径2.54mmである。 図2A、2Bおよび2Cは、ACTH 7-38フラグメント［FRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAE AFPLE］（配列番号22）の時間依存性CPY消化の1分（2A）、５分（2B）、および2 5分（2C）のMALDIスペクトルを示す。ピーク・ラベルの数字は、示されたアミノ 酸の消失ペプチド群 を示す。ピークはC末端からの19個のアミノ酸の消失を示す。*記号は2倍に荷電 されたイオンを示し、#記号はm/z=2001.0および2744.4ダルトンにおける朱確認 ピークを示す。 図3は、ACTH 7-38フラグメントの時間依存性CPY消化からの15秒、105秒、6分 および25分の冷却アリコートを集めて混ぜ合わせたものを示すMALDI質量スペク トルである。6分アリコートで小ピークとして認められ、かつこの集められた画 分では希釈されて検出できない濃度となったGlu（28）、Asn（25）およびPro（2 4）を除いて、すべてのアミノ酸消失が認められる。すべての条件は本文中に記 載されている。 図4Aおよび図4Bは、種々の濃度のカルボキシペプチダーゼY（CPY）（6.10x10^{- 4} U/μＬ（4A）；1.53x10^-3U/μＬ（4B）によるACTH 7-38フラグメントのオン・ プレート消化による種々のMALDIスペクトルを示す。パネルAおよびBは、それぞ れ6.10x10^-4および1.53x10^-3U/μＬの濃度のCPYを使用した消化で得られたスペ クトルを示す。ピーク分解能を犠牲にしてスペクトル中の小ピークのシグナル/ ノイズ比を改善するために、閾値より相当大きいレーザー出力を使用した。*記 号は2倍に荷電されたイオンを示し、#記号はm/z=2517.6ダルトンにおける未確認 ピークを示す。 図5A、5Bおよび5Cは、以下の3種類の選定ペプチドのそれぞれ3.05x10^-3、3.05 x10^-4、および6.10x10^-4U/μＬの濃度のCPYを使用したオン・プレート消化によ り得られた種々のMALDIスペクトルを示す：オステオカルシン7-19フラグメント ［GAPVPYPDPLEPR（配列番号13）（5A）、アンギオテンシン１［DRVYIHPFHL（配 列番号8）（5B）、およびブラジキニン［RPPGFSPFR］（配列番号５）（5C）。記 号Naはナトリウム付加物のピークを示し、#はm/z=568.5 ダルトンにおけるマトリックス・ピークを示す。 図6A-6Eは、種々の濃度（0.002μＵ/μＬ（6A）；0.005μＵ/μＬ（6B）；0.0 1μＵ/μＬ（6C）；0.02μＵ/μＬ（6D）；0.05μＵ/μＬ（6E））のホスホジエ ステラーゼI（PhosI）による核酸ポリマー（配列番号23）のエキソヌクレアーゼ 加水分解の種々のMALDIスペクトルを示す。 図7は、加水分解された核酸ポリマー（配列番号23）と光吸収性マトリックス の組み合わせめMALDIスペクトルを示す。 発明の詳細な説明 以下に詳細を説明するように、本発明は質量分析計を用いてポリマー類の配列 決定をなうための方法、キットおよび装置に関する。本発明は既知の質量の複数 のモノマー類を含むポリマーに関する配列情報を得るための統合的な戦略を提供 する。具体的には本発明はポリマー・フラグメントのセット（複数）と質量分析 計を用いて、質量分析計により得られた配列データを解釈する方法を提供するが 、これにより迅速な、自動化された、かつコスト効果が高い、統計的確実性を有 するポリマーの配列決定が可能となる。本発明はさらにポリマーおよび加水分解 剤を反応表面上に配置して利用する方法も提供する。加水分解剤は酵素あるいは 非酵素的なものである。これら加水分解剤はポリマーと反応し、配列を規定する ポリマー・ラダーまたはポリマー・マップを作り出す。本発明の方法はさらに、 加水分解したポリマー・シリーズに関連する質量分析データを得るステップと、 複数のポリマー・シリーズのデータを総合してポリマー配列を決定するステップ を含む。本発明の質量分析法はすべてのイ オン形成方式ならびにすべての質量分析方法に適用可能である。本発明のキット と装置は、その一部分は本発明の方法に基づいてポリマーの配列情報を得るよう に質量分析計を適応させるための質量分析計用サンプル・プレートまたはサンプ ル・ホルダに関する。具体的には、サンプル・プレートはその上に脱水型、固定 化型、液体および/またはゲル形状の加水分解剤、および/または光吸収性マトリ ックスを配置する。任意には、本発明のサンプル・プレートのあるものは使い捨 て型のものである。本発明の装置の別の実施態様は、ポリマーの配列決定をする 前記の方法に使用するのに適する質量分析計、コンピュータおよびコンピュータ ・ディスクに関する。 本明細書で使用するように、“ポリマー”とは、本発明の方法に適切に使用で きる一連の異なるモノマー群を包含するあらゆる成分を意味するものとする。つ まり、モノマー間結合が加水分解に敏感な一連の異なるモノマー群を包含するす べての成分は、本明細書に開示する方法に使用するのに適している。たとえば、 ペプチドは特定のモノマー類、すなわちアミノ酸で構成されたポリマーであり、 これらは酵素または化学薬品のいずれかで加水分解できる。同様に、DNAは別の モノマー類、すなわち塩基ヌクレオチド類で構成されたポリマーであり、これら はさまざまな薬剤により加水分解できる。 ポリマーは天然成分ならびに合成的に作られた成分のいずれでもよい。現在好 ましいとされている実施態様においては、ポリマーは蛋白質、ペプチド、DNA、R NA、PNA（ペプチド核酸）、炭水化物、およびそれらの修飾型などのグループか ら選択されるバイオポリマーであるが、これらに限定されるものではない。 “配列情報”とは本明細書で使用しているように、ポリマーまたはそれらの部 分の中の一連の異なるモノマー群の一次構造に関連す るすべての情報を意味するものとする。配列情報には異なるモノマー類の化学的 同一性、ならびにポリマー内でのそれらの特定の位置に関する情報が含まれる。 一次配列が既知のポリマー類、ならびに一次配列が未知のポリマー類も、本発明 の方法に使用するのに適している。末端モノマー群ならびに内部モノマー群に関 する配列情報も、本明細書に開示した方法を使用して得ることができるように考 案されている。ある応用では欠陥のない完全なポリマーのサンプルを使用して配 列情報を得ることができる。他の応用では、欠陥のない完全なポリマーではない ものを含むサンプル、たとえばポリマー・フラグメント、を使用して配列情報を 得ることができる。それらフラグメントは天然、単離および精製した人工産物、 および/または熟練技術者によりin vitroで作り出されたものとすることができ る。さらに、ポリマー・フラグメントは本発明の方法に使用する前に、高性能液 体クロマトグラフィなどさまざまな精留および分離法などにより取り出して調製 したものでもよい。 本発明の“反応表面”とは、対象ポリマーを規定の薬剤で加水分解するのに好 適な表面すべてを含む。反応表面は金属、箔、プラスチック、セラミック、およ びワックス類など、これらには限定されないが、さまざまな基質で加工されたも のであることができる。反応表面はすべて質量分析装置に使用するのに適したも のでなければならない。本発明の反応表面は特定の質量分析装置に使用するのに 適したあらゆる形状のものとすることができる。たとえば、反応表面は平面状の 固相表面とすることができる。あるいは、この表面はマイクロ反応容器をその上 面に配置したものでもよい。さらに別の実施態様においては、特定の質量分析計 装置での使用に適したプローブ形状とすることができる。いくつかの実施態様に おいては、本 発明に基づくポリマーの配列決定を強化または容易にするために、反応表面を活 性化および/または誘導化できることは、熟練当業者は周知の通りである。 本発明は、質量分析によって得られた質量/電荷比のデータ分析の方法に関す る。以下に詳しく例示するように、本法はポリマーの加水分解によって作り出さ れたフラグメントのセット、ただしそれぞれのセットは1以上のモノマーが異な るもの、を用意する。そして少なくとも一対のフラグメントの質量/電荷比の差 を求める。次に1以上の異なるモノマー類の既知の質量/電荷比に相当する平均質 量/電荷比を確定する。確定平均値を測定平均値と比較し、これら２つの値が望 ましい信頼水準で統計的に異なるかどうかを判別する。もし統計的差異がある場 合には、この確定平均差は実際に測定された差異に割り当てることはできない。 いくつかの実施態様においては、一対のフラグメント間の差の追加測定値を取り 、測定平均差の精度を高める。本法のこのステップを、すべての望ましい平均差 異が一対のフラグメント間の単一差異と確定されるまで反復する。 上述の方法を追加のフラグメント対についても反復し、複数の並行質量スペク トルからの質量/電荷比のデータを総合し、望ましい配列情報が得られるまで繰 り返す。したがって、本発明は最も広い視点においては、質量が既知の複数のモ ノマー群を包含するポリマーに関する配列情報を作り出す総合的な方法である。 本方法は、フラグメント対間のモノマーの差異を統計的に確定するために、ポリ マーから得られるフラグメント・セット（複数）の質量/電荷比データを解釈す ることを含む。過去においては、研究者達はいくつかの質量測定値について既知 の分子質量をMALDIで導いた質量と比較し、機器による測定の質量精度について 一般的な表現をしようと試 みてきた。総体的に、本発明の方法は多段階の統合されたステップを含むもので あり、これらは本発明に基づいて自動化することができる。 1以上のモノマーが異なるポリマー・フラグメントのセットを用意した後、少 なくとも一対のフラグメント間の質量/電荷比の差xを測定する。次に、測定され たフラグメント対間の質量/電荷比の平均差μを確定する。ただし、μは1以上の 異なるモノマーの既知の質量/電荷比に相当するものである。そして次にxを分析 して、選択した信頼水準でxが統計的にμと異なるかどうかを判断する。 もし統計的差が存在すると判断した場合、確定されたμは選定した信頼水準で は質量差xに割り当てることはできない。 上記のステップを、すべての望ましいμｓが確定されるまで繰り返し、さらに 追加のフラグメント対についても繰り返す。 ある実施態様においては、xが統計的μと異なるかどうかを判断する分析は、x をn回反復測定し、少なくとも一対のフラグメント間の測定平均質量/電荷比差x を求めることを包含する。そして測定平均xの標準偏差sを求め、その測定平均x を確定平均μと比較し、それらが望ましい信頼水準で統計的に異なるかどうかを 判断する。 本発明のある実施態様においては、1セットのポリマー・フラグメントをオン ・プレート消化または外部源のいずれかから得、一対のフラグメントの質量/電 荷比の1以上の測定値を求める。1以上のモノマーの消失を表すピークをt-統計を 用いて分析して、望ましい信頼区間で割り当てを行なうことができる。1実験平 均に関する両側t検定には下記の式を適用する。施した反復複製数であり、sは平均の実験標準偏差である。すべての考えられる 質量（1残基、2残基、3残基...など、ならびに修飾残基の質量）を確定質量差μ として使用してt計算値のリストを作り、これを次に特定の信頼区間でｔ分布表 の値と比較する。確定質量と統計的に異ならないすべての質量、つまりｔ計算値 ＜ｔ表値、は所定の信頼水準でその残基に割り当てられる。この情報は仮定の組 成物をチェックするため、あるいは配列のデータベースを検索するために使用す ることができる。データベース検索をする場合、これらの信頼水準は高い“的中 率”を得る助けとするための道具として、検索アルゴリズムに利用することがで きる。 終局的には、この技法は未知の配列のペプチドの配列決定に使用されるもので ある。研究者達はいくつかの質量測定値について既知の分子質量をMALDIで導い た質量と比較し、機器による測定の質量精度について一般的な表現（たとえば、 0.1％より良い）をしようと試みてきた。しかし残基割当ての目的でこの質量精 度を個々の質量測定値に当てはめるのは統計的な有効性がなく、したがって真の 残基割当てや未知のものへの直接適用は難しい。ラダー配列決定/MALDI戦略によ るアミノ酸配列を得るためには、残基割り当てに統計的な信頼水準を課さなけれ ばならないのである。 本明細書に開示するように、上記のデータ統合法にはさらに次のステップを包 含させることができる。すなわち、反応表面上に、ポリマーを加水分解してモノ マー間結合を破壊してポリマー・フラグ メントのセットを作り出す少なくとも1用量の加水分解剤とポリマー・サンプル を、反応表面上で異なる加水分解剤/ポリマー比ができるように供するステップ と、ポリマーと加水分解剤の混合物を複数のシリーズの加水分解ポリマー・フラ グメントを得るのに十分な時間インキュベートするステップ、ならびに質量/電 荷比データを得るために複数のシリーズについて質量分析を行なうステップを包 含させるものである。 たとえば、ポリマーの末端加水分解で作り出されたポリマー・フラグメントの セットを本発明の実施に利用することができる。典型的には、エンドヒドロラー ゼの使用によって前記ポリマーのマップを規定するフラグメントのセットを作り 出す。フラグメントの質量/電荷比を測定し、測定したフラグメントの仮の成分 同定が行われる。仮の同定成分は参照ポリマーのフラグメントの既知の同一成分 に対応する。参照ポリマーの情報は本法で使用するデータベースに簡単に組み入 れることができる。望ましい信頼水準を選定した後、確定された仮の成分同定が 行われたフラグメントの質量/電荷比が、確定された既知のポリマーのフラグメ ントの質量/電荷比と統計的に異なるかどうかを判断する。もし統計的な差があ る場合、これらのステップを異なる追加の仮のフラグメントで繰り返す。この方 法は望ましい信頼水準でポリマーを同定できる十分な情報が得られるまで、その フラグメントについて繰り返される。したがってマップを検討する場合、ポリマ ー・フラグメントが既知のポリマーのフラグメントに、ポリマーの同一性につい て十分な確実性をもって対応するかどうかを基本的に判断する。確定された仮の 同一性（仮の同定成分）が既知の配列のコンピュータ・データベースから取り出 された既知の同定成分に相当するものであることが望ましい。 本発明の方法はまた、同一ポリマーの複数の異なるフラグメント・セット、す なわちマップおよびラダーを供し、最大限の配列情報を得ることも考案している 。 ポリマー・フラグメントのセットはいかなる方法でも作り出すことができる。 本発明の請求方法のあるものは、フラグメントを得るために加水分解剤によりポ リマーを加水分解するステップ、あるいはフラグメントの合成、ならびに事前に 得たフラグメントのセットを単に供するというステップも考案している。本明細 書で使用しているように、“加水分解剤”という用語は特定のポリマー中のモノ マー間結合を破壊することのできるすべての薬品を意味するものとする。つまり 、ポリマーの一次配列を切断することができる薬剤はすべて本明細書開示の方法 に使用するのに適している。加水分解剤はポリマーの末端でモノマーを解離する か、あるいは内部結合を破断することのいずれかの働きをし、それにより対象ポ リマーのフラグメントまたは一部分を作り出す。一般的に、好ましい加水分解剤 は特定のモノマーの前後を切断することにより一次配列を破壊する。 つまり、加水分解剤はポリマーの特定のモノマーまたはポリマー中の好ましい 加水分解部位として加水分解剤により認識される特定のモノマー配列と特異的に 反応する。現在好ましいものとして本明細書に記述している加水分解剤はすべて シグマ・ケミカル[Sigma Chemicals]社（モンタナ州セントルイス）などの薬剤 供給者から市販品を入手することができるものである。 好ましい実施態様のあるものでは、賦形剤を加水分解剤に添加して、加水分解 剤と併用する。ここで意図する賦形剤は、加水分解剤の凍結乾燥および/または 溶解を促進する。たとえば、フコースおよびその他の糖類が本発明に好適に使用 できると考えられる。使用 に好適とは、それらを使用することによって質量分析に何ら干渉が起こらないこ とを意味する。本発明に有用なその他の賦形剤は酢酸アンモニウムなどのpH調節 剤である。さらに本明細書に開示した方法および装置で好適に使用できるその他 の賦形剤は、加水分解剤の一体性の安定化剤として働くものである。賦形剤に関 しては、熟練技術者であれば通常の実験操作だけで好適なものを見つけることが できよう。好ましい賦形剤のいくつかを上に挙げたが、それらに匹敵する相当品 を見つけだすことは通常の技術者の技術の範囲内のことである。 現在好ましいとされる実施態様の1つにおいては、加水分解剤はヒドロラーゼ 酵素である。ヒドロラーゼ類のあるものはエンドヒドロラーゼであり、他のもの はエキソヒドロラーゼである。使用する特定のヒドロラーゼはポリマーの性質お よび/または希望する配列情報のタイプによって決められる。その決定は熟練技 術者が通常の実験以上のことをすることなく容易に行うことができる。たとえば 、現在好ましいとされるエンドヒドロラーゼ類としてはエンドヌクレアーゼ、エ ンドペプチダーゼ、エンドグリコシダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エン ドプロテイナーゼLys-C、エンドプロテイナーゼArg-C、およびテルモリシンなど であるが、これらに限定されるものではない。現在好ましいとされるエキソヒド ロラーゼ類としては、エキソヌクレアーゼ、エキソグリコシダーゼ、およびエキ ソペプチダーゼなどがあるが、これらに限定されるものではない。現在好ましい とされているエキソヌクレアーゼ類としては、ホスホジエステラーゼタイプIお よびII、エキソヌクレアーゼVII、λ-エキソヌクレアーゼ、T7遺伝子エキソヌク レアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、BAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌク レアーゼV、 エキソヌクレアーゼII、ならびにDNAポリメラーゼIIIなどがあるが、これらに限 定されるものではない。 現在好ましいとされるエキソグリコシダーゼ類としては、α-マンノシダーゼI 、α-マンノシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-フコ シダーゼI、α-フコシダーゼII、α-ガラクトシダーゼ、α-ノイラミニダーゼ、 α-グルコシダーゼI、およびα-グルコシダーゼIIなどがあるが、これらに限定 されるものではない。現在好ましいとされているエキソペプチダーゼ類としては 、カルボキシペプチダーゼY、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダー ゼB、カルボキシペプチダーゼP、アミノペプチダーゼI、LAP、プロリンアミノペ プチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ならびにカテプシンCなどがあるが 、これらに限定されるものではない。 その他の実施態様のあるものでは、加水分解剤は酵素以外の薬剤である。たと えば、そうした薬剤は酸のような化学薬品でもよい。酵素以外で現在好ましいと されている薬剤としては、臭化シアン、塩酸、硫酸、およびペンタフルオロプロ ピオン酸フルオロハイドライドなどがあるが、これらに限定されるものではない 。いくつかの実施態様においては、加水分解は本明細書に開示した方法に基づい て部分的な酸加水分解を利用して行なうことができる。ここでも、酵素以外の加 水分解剤の決定はポリマーの性質および希望する配列情報のタイプによって決め られる。好適な薬剤の決定ならびにそれら薬剤の好ましい条件の決定は熟練技術 者の能力の範囲内のことである。 本発明の方法はさらに上記個々の加水分解剤を組み合わせて使用する方法も提 供する。たとえば、請求項にある酵素の組み合わせを 使用することができる。酵素以外の加水分解剤の組み合わせもまた使用すること ができる。さらに、酵素と酵素以外の薬剤との組み合わせもまた本発明の方法に 使用することができる。ここでも、具体的な組み合わせおよびそのような組み合 わせが適当な条件はポリマーの性質および希望する配列情報により異なることに なる。熟練技術者であればどのような場合に加水分解剤の組み合わせが本開示の 方法に好適に使用できるかを承知している。 加水分解剤/ポリマー配列特異性反応についての多くの例が当分野では周知と なっている。たとえば上記のように、蛋白質およびDNAなどの現在好ましいとさ れているポリマー類はそれぞれプロテイナーゼ類およびヌクレアーゼ類と反応す る。好ましいプロテイナーゼのあるものは蛋白質のアミノ酸配列のC-末端（カル ボキシペプチダーゼY）またはN-末端（アミノペプチダーゼI）を特異的に認識す る。好ましいヌクレアーゼ類のあるものは、ポリヌクレオチドの塩基配列の5'ま たは3'末端を特異的に認識する。ヌクレアーゼ類のあるものは、１重鎖ポリヌク レオチド類を認識し、他のものは2重鎖ポリヌクレオチド類を、またさらにその 他のものはこれら両者を認識する。 請求の本発明は、蛋白質、ペプチド、核酸、炭水化物などの天然バイオポリマ ー、ならびにPNAおよびチオりん酸化核酸などの合成バイオポリマー類すべての 配列決定に適用することができる。ラダーは、エキソヒドロラーゼ類、エンドヒ ドロラーゼ類を使用して酵素的に、あるいはサンガー[Sanger]法および/または 切形合成による化学的方法ないしは失敗配列などの手法により意識的に作り出す ことができる。オン・プレート消化を利用し、カルボキシペプチダーゼY、カル ボキシペプチダーゼPおよびアミノペプチダーゼI消 化により数多くのペプチド類から作り出されたペプチド・ラダーを解釈する方法 を利用することが好ましい。 本発明に基づいて、エキソヒドロラーゼ類はポリマーの配列を規定する“ラダ ー”を包含する一連の加水分解フラグメントを作り出す。つまりこれらの薬剤は 一連の加水分解フラグメントを作り出し、それら一連の各加水分解フラグメント は“ラダー要素”であり、これらが集合的にポリマーの配列を規定する“ラダー ”を包含することになる。ラダー要素は加水分解フラグメントであり、それらか らモノマー類が連続的および/または漸進的に、ポリマー末端の一端または他端 に作用するエキソヒドロラーゼによって解離される。したがって、ラダー要素は 切形の加水分解ポリマー・フラグメントであり、またラダーそれ自体はこれら切 形の加水分解ポリマー・フラグメントの集合連結物ということになる。このよう な方法により、たとえば蛋白質のアミノ酸配列に関する配列情報を、カルボキシ 末端に作用する薬剤であるカルボキシペプチダーゼYを使用することによって得 ることができる。開示した本法を使用することにより熟練技術者は、アミノ酸残 基の連続、反復解離で相互に関連した一連の蛋白質加水分解物を作り出して、以 下に詳細を説明するように完全な蛋白質ポリマーの一次配列を再構築することが できる。 同様に、ポリマーの末端の1つに同じく作用するエキソヒドロラーゼ類以外の 加水分解剤も、配列を規定する一連のラダーを集合的に包含するラダー要素を作 り出す。たとえば、この目的のために公知のエドマン分解技法および関連試薬を 本発明の方法に使用するのに応用することができる。したがって上記の減法型（ subtractive-type）の配列決定法もまた、蛋白質ポリマーからの連続的なアミノ 末端残基の反復除去が起こることから、本明細書に開示した酵素以 外の加水分解剤を利用して行なうことができる。 前述のように、配列情報はまた内部モノマー間結合を破壊する働きをする加水 分解剤を使用して得ることもできる。たとえばエンドヒドラーゼは、最終的にポ リマーの“マップ”を構築するのに有用な一連の加水分解フラグメントを作り出 すことができる。つまりこの薬剤は一連の関連する加水分解フラグメントを作り 出し、これらはポリマーの配列を規定する“マップ”に集合的に寄与する情報と なる。たとえばペプチドマップは、トリプシン内部加水分解を臭化シアン内部加 水分解と連繋させ、重複するアミノ酸配列を有する加水分解フラグメントを得る ことにより、作り出すことができる。それら重複フラグメントは最終的に完全な ポリマーのアミノ酸配列全体を再構築するのに有用なものである。たとえばこの 加水分解剤の組み合わせは、複数の有用な加水分解フラグメントのシリーズを作 り出す。なぜならばトリプシンはカルボキシ基がリシンまたはアルギニンモノマ ーのいずれかによって生成されたペプチド結合の加水分解だけを特異的に触媒し 、一方臭化シアンはカルボニル基がメチオニンモノマー類によって生成されたペ プチド結合だけを切断するからである。したがってトリプシンと臭化シアン加水 分解を併用することにより、２つの異なるシリーズの加水分解された“マッピン グ”用フラグメントを得ることができる。これらのマッピング・フラグメントの シリーズを次に質量分析で検査し、トリプシンによる第1の加水分解からの特定 の加水分解産物と連続および/または重複するアミノ酸配列を持つ第2の臭化シア ン加水分解からの特定の加水分解産物を同定する。第2の加水分解からの重複配 列は第1のトリプシン加水分解により産生された加水分解フラグメントの正しい 配列順に関する情報を提供する。これらのペプチド・マッピング の一般的な原理は先行技術で公知となっているが、これらの原理を本明細書の開 示のように質量分析により配列情報を得るために利用することは当分野ではこれ まで知られてなかった。 当分野の熟練技術者にとっては、ある場合には上記のラダー・シナリオを利用 して配列を決定するのが最善であり、一方マッピング・シナリオがより適するケ ースがあることは周知のことである。ある場合にはラダー法と本開示のマッピン グによる配列決定法の組み合わせが最適の配列情報を提供する。ルーチンの実験 手法を利用するだけで、熟練技術者はラダーおよび/またはマッピング法と複数 の一連の加水分解ポリマー・フラグメントの質量分析を組み合わせて利用するこ とによって最適の配列情報を得ることができる。 本方法で考案されているように、ポリマーのサンプルとしては対象のポリマー を含む（または含むと考えられる）生物学的流体も含む。本明細書で使用してい るように、ポリマーのサンプルとしてはまた単離および精製ポリマーも含むもの とする。さらに、ポリマーのサンプルは水性または非水性のものでもよい。 反応表面へのポリマーのサンプルの添加は、さまざまな方法により行なうこと ができる。たとえば、サンプルを個々のアリコートとして導入することもでき、 あるいはサンプルを前処理または定性カラムから溶離するサンプルとするような 連続的な方法で導入することもできる。この両方の場合とも、サンプルは手操作 または自動化された手段で導入することができる。 ポリマーのサンプルおよび加水分解剤を反応表面に添加するに際し、本発明の 方法は異なる濃度の加水分解剤、または異なる加水分解剤/ポリマー比を当該反 応表面に形成する方法を提供する。たとえば、もしポリマーのサンプルが均一な 量のポリマーを含むもので ある場合、本法では異なった量の薬剤を反応表面に配置するように考案している 。これによって異なる薬剤/ポリマー比がもたらされることになる。異なる薬剤 の量は、区分された分離ゾーンに対して一定量のポリマーを添加する形とするこ ともできる。あるいは、異なる薬剤の量を少量から大量の範囲の非区分的勾配の 形、おそらくは適当な長さと幅のストリップという形、にすることもできる。一 定量のポリマーを含む等しい長さと幅のポリマー・ストリップを導入することに より、異なる薬剤/ポリマー比が作り出される。本発明で考案しているように、 薬剤とポリマーはどのような形でも、またどのような量でも存在させることがで きる。すなわち、唯一必要なことは薬剤とポリマーの組み合わせが異なった比率 で反応表面上に配置されることである。薬剤/ポリマーの異なる比率はまた、一 定量の薬剤を反応表面上に配置し、異なる量のポリマーを、たとえば、ポリマー 勾配または異なる量のポリマーあるいはポリマー溶液の区分された分離ゾーンに より添加する方法によって達成できることは熟練技術者は周知のことである。ポ リマー勾配とする場合、ガウス分布勾配の形でカラムから溶離されるポリマーの 形が現在好まれている。 本方法はさらに上記薬剤/ポリマー比のものを、必要な複数シリーズの加水分 解ポリマー・フラグメントを得るのに必要な時間インキュベートする方法も提供 する。インキュベーションは、ポリマーを加水分解するのに好適かつ複数のシリ ーズの加水分解フラグメントを得るのに必要とされる時間であれば、いかなる条 件下でも進行させることができる。一般的に言えば、開示の方法は、たとえば、 1時間以内という比較的短時間で配列情報を得ることが可能である。 しかしながら、インキュベーション時間はポリマーおよび/また は加水分解剤の性質により短くしたり、長くしたりすることができる。適当なイ ンキュベーション時間をいかにして求め、かつそれをいかに最適化するかは当分 野の熟練技術者には自明のことである。インキュベーション反応は蒸発によって 終了させることができる。 本明細書で使用しているように、加水分解ポリマー・フラグメントの“複数の シリーズ”とは、加水分解フラグメントが少なくとも2つの異なる薬剤/ポリマー 比で作り出され、かつそれぞれの薬剤/ポリマー比が1シリーズの加水分解フラグ メントを作り出すことを意味する。たとえば、一定量のポリマーを異なる量の薬 剤を含む2つの区分された薬剤ゾーンに添加する場合、各ゾーンが1つの薬剤/ポ リマー比を表し、また各ゾーンが1シリーズの加水分解フラグメントを作り出す ことになる。これらを合わせると、この2つのゾーンが複数のシリーズの加水分 解ポリマー・フラグメントを集合的に含むということになる。本明細書に開示お よび例示するように、本方法は複数のシリーズの加水分解フラグメントについて 質量分析を行い、その中に含まれている加水分解ポリマー・フラグメントの質量 /電荷比を得ることによって配列情報を得る方法を教示するものである。この方 法は少なくとも2つの異なる薬剤/ポリマー比を用意し、質量分析により分析する ことを考案したものである。 本請求の発明は当分野で公知のあらゆるタイプの質量分析法を使用して実施す ることができる。そのうえ、質量/電荷比データを得るためには、マトリックス 支援レーザー・ディソープション・イオン化、プラズマ・ディソープション・イ オン化、エレクトロスプレー・イオン化、サーモスプレー・イオン化、およびフ ァースト・アトム・ボンバードメント・イオン化など、これらに限定されないが 、あらゆるイオン形成方式を適用することができる。加えて、本発明 に使用する質量分析方式としては、飛行時間型、四重極型、イオン・トラップ型 、ならびにセクター分析型など、これらに限定されないが、あらゆる方式が好適 に使用できる。現在好まれている質量分析計装置は、改良された飛行時間型の装 置であり、これは同日付けで出願した同時係属中の米国特許願第08/446,544号（ 代理人書類番号SYP-111）に記載されているように、サンプルおよび抽出要素の 電位差の独立した制御が可能なものであるが、これをレファレンスとして本明細 書に援用する。ある実施態様においては、本発明を実施するために使用される質 量分析計は、イオン発生手段、イオン加速手段、ならびにイオン検出手段を含む ものである。あらゆるイオン化方法を使用することができ、たとえばディソープ ション、負イオン・ファースト・アトム・ボンバードメント、マトリックス支援 レーザー・ディソープションおよびエレクトロスプレー・イオン化方式などが使 用できる。マトリックス支援レーザー・ディソープション質量分析法を使用する のが好ましい。 本発明の方法はすべてさらに本明細書に記載のとおり、配列情報を得ようとす るポリマーまたはポリマー・フラグメントを含むサンプルを液体クロマトグラフ ィ・カラムから溶離させるステップを包含させることができる。そのような実施 態様の場合、カラムから溶離されるサンプルは質量/電荷比を決定するステップ の前に適当な緩衝液と接触させることにより質量分析計に適合性のあるものにす る。 本発明の方法はまた質量分析に有用な成分を包含させることも提供する。たと えば、光吸収性マトリックスをレーザー・ディソープションによる質量分析を行 なう前の適当な時点で導入することができる。光吸収性マトリックスは特にバイ オポリマー類の分析用とし て有用である。マトリックス支援レーザー・ディソープションイオン化技法、な らびにそれらに適するさまざまなマトリックス類は当分野では公知であり、たと えば米国特許第5,288,644号（1994年2月22日発行）および米国特許願08/156,316 （代理人書類番号Vestec-14-2、1995年4月18日許可）に記載されており、これら の開示を本明細書にレファレンスとして援用する。 本法に有用なその他の成分としては、ある種の加水分解フラグメントの質量を 選択的にシフトする能力のあるものが含まれる。これらもまた質量分析に先立つ いかなる時点でも添加することができる。現在好ましいとされている質量シフト 成分としては、アルキル、アリール、アルケニル、アシル、チオアシル、オキシ カルボニル、カルバミル、チオカルバミル、スルフォニル、イミノ、グアニル、 ウレイド、およびシリルなどの反応産物を産生する成分などが含まれるが、これ らに限定されるものではない。それら成分の加水分解ポリマーへの付加は確立さ れた付加化学法を利用して行われる。特定の配列決定に最適の特定の成分は、ポ リマーおよび加水分解フラグメントの性質により異なる。熟練技術者であればも し使うべき成分があるとすれば、どの成分を使用するかを決定することができる であろう。 本方法に使用するのに好適なその他の好適な成分グループは、加水分解フラグ メントのイオン化を改善することができるものである。 そのような成分は質量分析に先立ついかなる時点でも導入することができる。 現在好ましいとされているイオン化改善成分としては、以下のものに限定はされ ないが、アミノ、第四級アミノ、ピリジノ、イミジノ、グアニジノ、オキソニウ ム、およびスルホニウム反応産物を産生する成分である。そのような成分の調製 および/または使 用については当分野では周知のことである。 もう1つ別の視点において、本発明は質量分析計のサンプル・プレートまたは サンプル・ホルダを提供する。本明細書で使用しているように“サンプル・プレ ート”および“サンプル・ホルダ”という用語は同義語的に使用される。本発明 のサンプル・プレートは、開示の方法に基づいて配列情報を得るためのあらゆる 質量分析計装置に適用するのに有用なものである。現在好まれている実施態様の 1つにおいては、このサンプル・ホルダは平面状の固相表面を有し、その上に加 水分解剤が配置される。もう1つ別の現在好まれている実施態様においては、サ ンプル・ホルダは特定の質量分析計装置に有用なプローブの形状を有する。サン プル・プレートまたはホルダのすべての実施態様において、薬剤は脱水型、固定 化型、液体および/またはゲル形状とすることができる。薬剤を液体またはゲル 形状とする実施態様においては、薬剤は物理的転移に対する抵抗性があり、かつ 少なくとも1ないし2ヵ月間化学的に安定なもので、それにより輸送と貯蔵が容易 なものとする。これらの配慮は特に、本発明のサンプル・プレートを含む商業的 な利用において有用なことである。さらに、薬剤は異なる量の分離された区分ゾ ーン、または非区分勾配の形で配置することができる。あるいは、薬剤はサンプ ル・プレートの表面上に一定量を配置することもできる。他の実施態様において は、サンプル・プレートがその表面上に光吸収性マトリックスを配置したものを 有し、これは加水分解剤と併用または加水分解剤なしとすることができる。 本発明の好ましい実施態様のあるものでは、ポリマーを加水分解する能力のあ る少なくとも一定量の脱水型薬剤をサンプル・プレートの平面状固相表面に配置 する。同様にポリマーを加水分解する能 力のある少なくとも一定量の固定化した薬剤をその上に配置することもできる。 さらに別の好ましい実施態様においては、サンプル・プレートの上に少なくとも 1用量の液体またはゲル形状の加水分解剤を配置する。当該液体またはゲル形状 は物理的転移に抵抗性のあるものである。 サンプル・プレートはまたその表面にマイクロ反応容器を配置したものとする こともできる。実施態様の1つにおいては、これらの容器は化学エッチングまた は類似の技法により作られたプレート表面上の窪みとすることができる。サンプ ル・プレートは金属、箔、プラスチック、セラミック、およびワックス類など、 これらには限定されないがさまざまな基質で作ることができる。ある実施態様に おいては、このサンプル・プレートは使い捨て型のものである。別のある実施態 様においては、本明細書に開示したサンプル・プレートは質量分析によりポリマ ーの配列を決定するために有用なキットの1要素となっている。 本明細書に考案されているサンプル・プレートまたはサンプル・ホルダのすべ てに関しては、その表面に前記薬剤の異なる量の区分された分離ゾーンのアレイ を包含するものとすることができる。あるいは、その表面が前記薬剤の非区分型 勾配、または前記薬剤の一定量を含むものとすることができる。 加えて、実施態様はすべてさらに光吸収性マトリックス、および/またはマイ クロ反応容器、および/または使い捨て材料で組み立てたものを包含することが できる。 さらに別の視点においては、本発明は反応表面を包含するサンプル・プレート またはホルダを有するキットを提供するが、当該表面は前記ポリマーを前記フラ グメントに加水分解するための加水分解 剤を異なる量で提供する。実施態様の1つにおいては、当該キットはマトリック ス支援レーザー・ディソープション質量分析に適するマトリックスを包含するサ ンプル・プレートまたはホルダを含む。 本請求の発明はまた、上記の方法を実施する他の質量分析計装置およびキット にも関する。ポリマーに関する配列情報を得るための本発明の装置の実施態様の 1つでは、サンプルからイオンを発生させるための手段、発生したイオンを加速 する手段、ならびに検出手段を有する質量分析計を包含する。これらの基本的な 要素については多くの形態のものが利用可能であり、したがって本発明は特定の タイプの質量分析計に限定されるものではない。この装置はさらに質量分析計に 応答するコンピュータも包含するが、このコンピュータは一対のポリマー・フラ グメント間の質量/電荷比の差xを決定する手段と、フラグメント対間の質量/電 荷比の平均差μを確定する手段、ただしμは1以上のモノマーの既知の質量/電荷 比に相当するもの、ならびに望ましい信頼水準においてμが統計的に差があるか どうかを判断するためにxを分析する手段、および望ましい数の（可能性のある ）μｓが確定されたことを判断する手段を包含するものである。 加えて、本請求の方法に必要な情報はコンピュータで読み取り可能なディスク 上に組み入れることができるが、このディスクは分析を実施するためにコンピュ ータを質量分析計に応答させるようにするものである。請求したソフトウェアは データを取得し解釈するプロセスを、ソフトウェア・フィードバック制御を利用 して知的な方法で自動化する。データ解釈ソフトウェアは、アミノ酸割り当ての ための複数の候補を統計的に差別化するのに要求される取得データ 数（最低2）をコントロールするものである。オペレータは割り当てに適合する 最低の統計的信頼水準の規定をコントロールすることになる。 本発明の実施は以下の実施例によりさらに理解されるであろうが、これらの実 施例は説明のためだけに提示するものであり、本発明をいかなる形でも限定する ものでないことはいうまでもない。 実施例1 材料と方法 （a）ACTH 7-38フラグメントの液相消化 時間依存消化のために、予め0.5mLエッペンドルフ管中で乾燥固化させた500P モルの合成ヒト副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）フラグメント（7-38［FRWGKPVGKK RRPVKVYPNGAEDESAEAFPLE］（配列番号22）：シグマ・ケミカル社（モンタナ州セ ントルイス）から入手）を、33.3μＬのHPLCグレード水（ニュージャージー州フ ィリプスバーグのJ.T.ベーカー[Baker]社製）に再懸濁させた。予め乾燥した0.5 mLエッペンドルフ管に、シグマ社から購入したパン酵母（E.C.3.416.1）からの カルボキシペプチダーゼYの3.05ユニット（pH=6.75で25℃において1分当たり1ユ ニットは1.0μモルのN-CBZ-phe-alaをN-CBZ-フェニルアラニン＋アラニンに加水 分解する）を610μＬのHPLCグレード水に再懸濁させた。20μＬのACTH 7-38フラ グメント溶液に10μＬのCPY溶液を加え、反応を開始させた。最終濃度は10pモル /μＬ ACTHおよび1.67x10^-3U/μＬ CPYで酵素/基質比が1.67x10^-8U CPY/モルACT H（CPY分子量=61,000と想定するとモル比は1：37）であった。反応容器から1μ Ｌのアリコートを、15秒、60秒、75秒、105秒、2分、135秒、4分、5分、6分、7 分、8分、9分、10分、15分および25分に採取した。25分 時点で、15μＬの5x10^-3U/μＬ CPYを反応容器に加えた。合計反応時間1時間お よび24時間時点で2μＬのアリコートを取り出した。反応は温度が37℃に上昇す る２分まで室温で進行させた。すべてのアリコートをシグマ社から入手した9μ ＬのMALDIマトリックス、α−シアノ-4-ヒドロキシシナモン酸（CHCA）に、1：1 アセトニトリル（ACN）:0.1％トリフロロ酢酸（TFA））中5mg/mLの濃度で加えた 。ただしl時間と24時間アリコートは8μＬのマトリックスに加えた。マトリック ス溶液中のACTH消化アリコートの最終全ペプチド濃度は1pモル/μＬであった。 ２μＬの15秒、105秒、6分および25分アリコートを混ぜ合わせて集合ペプチド溶 液を調製した。MALDIサンプル・プレート上の個々のμＬ穴に各アリコート溶液1 μＬを配分し、質量分析計へ挿入する前に蒸発乾燥させた。 （b）オン・プレート消化： すべてのオン・プレート消化は、1pモル/μＬ濃度の0.5μＬのペプチドをピペ ットにより、マサチューセッツ州フラミンガムのパーセプティブ・バイオシステ ムズ社で製造・供給し、商標Voyager^TMとして知られる質量分析装置に使用でき るように作られたものと同じ形状のサンプル・プレートの1列各10個の1μＬ穴に 入れて行なった。表1に挙げたすべてのペプチドはシグマ社から購入したもので あり、最高純度のものである。第1の穴での反応を開始させるために0.0122U/μ ＬのCPY0.5μＬを添加した。続く９穴にはCPYをそれぞれ、6.10x10^-3、3.05x10^{- 3} 、1.53x10^-3、6.10x10^-4、3.05x10^-4、1.53x10^-4、7.63x10^-5、3.81x10^-5およ び0U/μＬの濃度で加えた。各穴で1μＬの反応容器をピペット先端で前後に動か して確実に混合させた。反応は1μＬ全量がプレート上で 蒸発するまで（約10分）室温で進行させた。その時点で各穴に、1:1ACN：0.1％T FAに入れた5mg/mL CHCAの1μＬを攪拌せずに加え、質量分析に先立って約10分間 蒸発させた。 （c）MALDI-T0F質量分析： Voyager^TMバイオスペクトロメトリー^TMワークステーション（マサチューセッ ツ州ケンブリッジのパーセプティブ・バイオシステムズ社製）を使用してMALDI- TOF質量分析を行なった。質量分析のための1.2mの直線飛行チューブに正に荷電 したイオンを導入するために、28.125KVの電圧勾配をサンプル・プレートとイオ ン光学加速プレートを含むイオン源にかけた。ACTH 7-38フラグメントとグルカ ゴン消化のデータを採取するために、低質量ゲートを使用してマトリックス・イ オンが検出プレートに衝突しないようにした。低質量ゲートを適用するために、 ガイドワイヤにパルスを短時間与えて低質量イオン（約＜1000ダルトン）をそら せた。その他のすべてのスペクトルは低質量ゲートをオフにして記録した。信号 /ノイズ比を良くするために、窒素レーザー（337nm）からの64-128シングル・シ ョットを平均化させて各質量スペクトルに適用した。ここに提示したデータは11 ポイントのSavitsky-Golay第二級フィルタを使用して滑らかにした。すべてのデ ータは、ブラジキニン（MH⁺=1061.2）および酸化インスリンB鎖（MH⁺=3496.9） （ともにシグマ社から購入）の外部較正用標準混合物を5mg/mL CHCAマトリック ス溶液中に1pモル/μＬの濃度で使用して較正した。 （d）統計的質量割り当て： 以下に詳細を説明するように、ここに開示した統計的プロトコル では両側t検定の式を使用した： そしてsは実験の標準偏差である。実験的に導かれたΔ質量へ残基を割り当てる ために、各確定平均質量（それぞれ可能性のあるアミノ酸割当て）に対するt計 算値を、所定の信頼区間でt表値と比較した。t計算値＞t表値は、所定の信頼水 準において、実験質量が確定質量とは異なる平均値を有する母集団からくるもの であることを示す。 実施例2 バイオポリマー類の配列決定 （a）液相配列： 図2は、ACTH7-38フラグメントの液相時間依存性CPY消化の1分、5分および25分 時点で取り出したアリコートのMALDIスペクトルを示す。ピーク・ラベルの数字 は表示したアミノ酸の消失から得られたペプチド群を示す。C-末端からの19個の アミノ酸のピークの消失が認められる。*記号は2倍に荷電されたイオンを示し、 #記号はm/z=2001.0および2744.4ダルトンにおける未確認ピークを示す。 酵素消化において相の制御をしないことがペプチド・ラダーを作り出している ことがこの図で観察された。消化1分後（図2A）では、完全なACTH 7-38フラグメ ントおよびC-末端からの最初の8個のアミノ酸の消失を示すペプチド類を含む9個 の検出可能ペプチド群がある。5分時点でのアリコート（図2B）は、Ala（32）お よびSer（31）の消失が、1分時点でのアリコートよりさらに支配的になっ ていることを表すペプチド群を示している。この消化時点で、Ala（32）からVal （22）までの11のアミノ酸残基の消失が見られる。図2Cは、４つの主要ペプチド 群として最終的に検出されたLys（21）およびVal（20）を示している。酵素濃度 を25分時点で2倍に増加したが、24時間までそれ以上の消化は認められなかった 。消化はVal（20）まで進み、ペプチド-KKRRPのアミノ酸のラン（連）で停止し た。CPYはプロリン（たとえばPro（24））、塩基性残基であるアルギニンまで急 速に進行すると考えられるが、この場合最後から２番目の位置がCPYに対する不 応条件になっていると考えられる。 相の制御をしないことと加水分解速度の変化が重なると、酵素的配列決定に特 有の問題が生ずる。図2におけるピークのイオン強度の変化は主として加水分解 速度によるもので、これはC-末端とその直前位置のアミノ酸の違いによるもので ある。残基が隣接の残基に比べて低速で加水分解される場合、その濃度と、した がってその残基の消失を表すペプチド群の信号は先行アミノ酸のそれらに比較し て小さくなる。これが図2に示されている質量スペクトルに見られる。Ala（34） の切断は緩やかなようであり、Phe（35）の消失を表す大きな信号が見られる。 グリシンとバリンの加水分解もまた低速のようであり、Ala（27）とTyr（23）の 消失を表すピークはGly（26）とVal（22）のそれらに比べてそれぞれ比較的強い 。 ここに提示した先行技術の時間依存性の方法は広範な最適化をしたものであり 、最短時間で最大の配列情報を得るように最適化されている。この特に最適化さ れたケースでは、25分間で検出可能な量のすべての成分が3つの選定時間アリコ ートに認められた。こうした最適化条件の選択に至る過程で行った多くの予備的 な液相消化の場合にはこのようにはならなかった。高濃度のCPYではGlu（28） およびPro（24）の消失を表すピークがしばしば観察されなかったが、これはア ラニンとチロシンがそれぞれ末端直前位置にある場合にCPYがこれらの残基を極 めて簡単に切断することを示している。低濃度のCPYではすべてのアミノ酸が配 列されたが、この場合は十分な消化のためには、たとえば何日もという長時間を 必要とすることが多かった。ここに開示したケースでは最終的に、酵素/基質比 として1.67x10⁸U CPY/ペプチド・モルが、25分間の消化で十分な配列情報をもた らすことが突きとめられた。 代わりに、全反応時間の15秒、105秒、6分、および25分時点でのアリコートを 集めると、MALDI分析ではC-末端からのほとんどすべてのアミノ酸の消失を表す ピークを含むペプチド・ラダーが形成されていることを示している（図３）。Gl u（28）、Asn（25）、およびPro（24）を除いたすべてのアミノ酸消失が観察さ れたが、観察されなかった3つは6分時点のアリコートでは小さなピークとして存 在していたが、この集合画分では検出不能濃度に希釈されていた。 Glu（28）、Asn（25）、およびPro（24）の消失を表すペプチド群として配列 ギャップが存在することが、信号/ノイズ比3以下で認められる。これらの成分は 6分時点アリコートの質量スペクトルでは小ピークとして認められたが、他のア リコートによる4倍希釈では検出できないほどの低濃度となった。このことは各 時点アリコートの個々の質量スペクトルを記録しておく必要性を強調するもので ある。集めたアリコートを表す単一のスペクトルを記録するという時間のかから ない方法は、単に配列ギャップを作り出すだけでなく、消化の時間依存性の経過 を分からなくしてしまうことになる。 上述のように、液相消化には多くの欠点がある。可能性のあるす ベての配列情報を保存しながら短時間に顕著な消化を得るためには、多くの時間 と、大量の酵素およびペプチドが必要とされる。配列情報を導き出そうとするペ プチドそれぞれについて、時間のかかる方法を展開しなければならない。なぜな らば1つのペプチドに対する最適条件のセットは、CPYの組成依存的加水分解速度 を考えると、別のペプチドに有用ということはありえない。これに代わる戦略は 、以下に説明するように消化をMALDIサンプル表面で実施することである。 （b）オン・プレートでの配列決定： 図1は、ステンレス・スチールの基盤に1μＬの穴を10x10グリッド状にエッチ ングしたMALDI分析用のVoyager^TMのサンプル・プレートを示す。これらの穴は、 その中でオン・プレート消化が行われるマイクロ反応容器となる。プレートの形 状寸法は57x57mmで、穴は直径2.54mmである。 酵素と基質合わせて1/2μＬを穴に入れ、ピペット先端で混合した。消化は約1 0分間、溶剤蒸発によって反応が停止されるまで続けた。この時点で1μＬのマト リックスを穴の中に入れることにより消化混合物を再懸濁させた。CHCAマトリッ クスは1：1ACN：0.1TFAに溶解されているため、消化混合物からの親水性および 疎水性ペプチド群は低pHでそれ以上のCPY活性は抑制しながら再懸濁しなければ ならない。マトリックスの結晶状態は（時間法実験に比べて）、オン・プレート 消化を行なうことによって変化したようには見えない。このオン・プレート戦略 は、複数の濃度依存（時間依存）消化を並行して実施することが可能なために、 方法を最適化する時間を著しく短縮した。また、反応容器から分析プレートへの サンプル移 動による損失は、オン・プレート方式を使うことによりすべての消化された物質 が質量測定用に使えることになり回避された。 図4のパネルaおよびbにはそれぞれ、CPY濃度6.10x10^-4および1.53x10^-3U/μＬ のACTH 7-38フラグメントのオン・プレート濃度依存消化に対応するMALDIスペク トルが示されている。パネルＡおよびBは、それぞれ6.10x10^-4および1.53x10^-3U /μｌの濃度のCPYを使用した消化で得られたスペクトルを示す。ピーク分解能を 犠牲にしてスペクトル中の小ピークのシグナル/ノイズ比を改善するために、閾 値より相当大きいレーザー出力を使用した。*記号は2倍に荷電されたイオンを示 し、#記号はm/z=2517.6ダルトンにおける未確認ピークを示す。 低濃度消化ではC-末端からの11個のアミノ酸消失を表す12の顕著なピークが得 られた。高濃度のCPY消化では低濃度消化で存在したペプチド群、ならびにVal（ 20）までのアミノ酸の消失を表すペプチド群といくらか重複していることを示し た。最初の数個のアミノ酸の消失を表すペプチドの濃度は、Leu（37）ピークを 除いて検出レベル以下（約＜10fモル）に減少した。両図の情報を総合すること により、ACTH 7-38フラグメントの配列はギャップなしにC-末端からの19個のア ミノ酸を読み取ることができ、時間依存消化と同じくペプチド-RRKKPの同一アミ ノ酸のランで停止している。図4は、同時に実施した9つのCPY濃度のうちの2つを 示す。この場合には方法の最適化が戦略的に必要不可欠であった。このオン・プ レート方式採用の場合の、方法の開発（最適消化条件選定）、消化、データ収集 およびデータ分析の総時間は30分以下であった。ペプチドと酵素両方の消費量は 極めて少なく、9つの消化用穴と1穴のペプチドと水を含む1列10穴で合計5pモル のペプチドが消費された。ま た、すべての実験で僅か1.97pモルのCPY（100U/mgおよび分子量=61,000として） が必要とされただけであった。注：1:計算値 2．pH6.5における値 3.配列情報得られず。 表1に掲げたのは、この新規オン・プレート戦略を使用して消化および分析し たペプチド類である。これらのペプチドはアミノ酸組成、大きさ（分子量=3659. 15まで）、電荷および極性の異なるペプチドを表すものとして選択した。太字の アミノ酸は、1列消化から得られた1以上のMALDIスペクトルでその残基の消失を 表すピークが観察されたものを示している。残基の同定を可能にするためには、 そのアミノ酸の消失を表すピークとその直前のアミノ酸が存在しなければならな い。括弧で囲んだ残基は、配列順が導き出されなかったものである。全体として CPYは消化したペプチドのほとんどについてC-末端からのいくつかの配列情報を 提供し、配列情報が得られなかったのは22のケースでわずかに3つだけであった 。これら3つのケースのうち2つでは、C-末端がリシンで直前位置が酸性残基であ った。CPYはC-末端の塩基性残基に近づくにつれ活性が減ることが報告されてい るが、隣接する酸性残基の存在がさらに活性を減らすようである。黄体ホルモン 放出ホルモン（LH-RH）の場合、直前位置がプロリンのアミド化グリシンのC-末 端はCPY活性を抑制したが、これはCPYがプロリンとグリシン残基の両方で抑制さ れるという報告（ハヤシ[Hayashi]ら（1975）J．Biochem．77：69-79；ハヤシ[H ayashi]，R．（1976）Methods Enzymol．45：568-587）と一致している。CPYは ジペプチド類のアミド化C-末端残基を加水分解することが知られているが、ここ でもフィサラエミン、カシニン、サブスタンスP、ボメシン、およびα-MSHを切 断したことが示されている。 表1のデータに見られるように、CPYはLH-RHを除き、ブロックされたN-末端残 基を有するすべてのペプチドから配列情報を導き出すことができた（フィサラエ ミン、ボンベシンおよびα−MSH）。こ れらのペプチド類はエドマン法では全く情報が得られないことから重要なことで ある。多くのペプチドが、切形ペプチドピークの検出がCHCAマトリックスイオン （＜600ダルトン）の存在によって阻害されるところまで配列決定された。その 他のペプチド類の配列は、C-末端および直前位置の残基の組み合わせがCPY活性 を抑制するところまでは進まなかった。先に議論したようにボンベシン、アンギ オゲニンおよびグルカゴンは、緩やかに切断される残基がより迅速に加水分解さ れる残基に続くことから配列にギャップをもたらした。 オン・プレートCPY消化/MALDI検出戦略の実行可能性はペプチドの全体的な極 性および電荷とは無関係のようである。 図5は、それぞれ3.05x10^-3、3.05x10^-4、および6.10x10^-4U/μｌのCPY濃度を 使用したオン・プレート消化により得られたオステオカルシン7-19フラグメント 、アンギオテンシン1およびブラジキニンのオン・プレート消化結果を示す。記 号Naはナトリウム付加物のピークを示し、#はm/z=568.5ダルトンにおけるマトリ ックス・ピークを示す。 各スペクトルは1列の穴で行われた9個の消化のうちの1つの結果を示す。オス テオカルシン7-19フラグメントの場合、CPYはプロリンまで進行し（マーチン[Ma rtin]，B.（1977）Carlsburg Res．Commun．42:99-102；ブレダム[Breddam]ら、 （1987）Carsburg Res．Commun．52:55-63；ブレダム[Breddam]，K．ら、（1986 ）Carsburg Res．Commun．51:83-128;ハヤシ[Hayashi]，R．（1977）Methods En zymol．74：84-94；ハヤシ[Hayashi]ら（1973）J．Biolog．Chem．248：2296-23 02）、2つのペプチドのそれぞれ最後から2番目の位置でのAspとHisの存在が以後 のCPY活性を抑制した。 ブラジキニンはマトリックスがピーク検出を干渉し始めるまでの ものが配列された。選択したペプチド3つについてはすべて、全部で9つの穴消化 で得られた全体の配列情報を表示の単一の消化で示している。その他多くのペプ チドについてはこのようにはしていない。全体の配列情報は、図4に示したACTH 7-38フラグメントの場合のように多くは2以上の穴から導かれた。 実施例3 MALDIによるラダー配列決定の統計的分析 （a）本発明に基づく統計的分析の一般原理 先に開示したように、切形ラダーが形成された後マトリックスを穴に加え、そ れらの穴から複数の測定値を取るが、それらの穴にはアミノ酸の消失を表すピー クが存在する。統計的な解釈にはt-検定を使用し、関連する信頼区間での割り当 てを行う。1つの実験平均値に対する両側検定に、次の式を適用する。 ただしxは実験平均質量差、μは確定質量差、nは実施した複製標本数であり、 そしてsは平均値の実験標準偏差である。すべての測定質量（1残基、2残基、3残 基...など、ならびに修飾残基の質量）を確定質量μとして使用してt計算値のリ ストを作り、これを次に特定の信頼区間でt分布表の値と比較する。確定質量と 統計的に異ならないすべての質量、つまりt計算値＜t表値、は所定の信頼水準で その残基に割り当てられる。この情報は仮定の組成物をチェックするため、また は配列のデータベースを検索するために使用することができる。データベース検 索をする場合、これらの信頼水準は品質的な“ヒット”を得る助けとするための 道具として、検 索アルゴリズムに利用することができる。 さらに、データの解釈にはソフトウェア・フィードバック制御を利用してデー タを取得し解釈する自動化されたプロセスを使用した。データ解釈ソフトウェア は、アミノ酸割り当てのための複数の候補を統計的に差別化するのに要求される 取得データ数（最低2）をコントロールするものである。オペレータは割り当て に適合する最低の統計的信頼水準の規定をコントロールすることになる。 （b）実験的に得た質量/電荷比データの分析：ペプチド類 切形ラダーの分析のためにMALDIを使用するのは、本明細書に開示しているよ うに正確な配列データを得るために決定的に重要なことである。先行技術におい ては、この技法は規定された配列を有するペプチドを配列することに専ら利用さ れてきたが、その場合は質量の測定精度はあまり重要ではない。対照的に、ここ に開示した方法は未知の配列のペプチド類の配列決定に有用なものである。技術 者達は従来、既知の分子の質量をMALDIで導かれた質量とほんの数回の質量測定 値について比較することにより、計器による質量測定精度について一般的に表現 （たとえば、0.1％より良いと）するだけであったが、この質量精度を残基割り 当ての目的で個々の質量測定値に当てはめるのは統計的妥当性がない。したがっ て、真の残基割り当ておよび未知のものに対する直接的な応用は今までは難しく かつ試験的なものであった。アミノ酸配列をラダ一配列決定/MALDI戦略で導き出 すためには、本明細書に開示するように統計的な信頼水準を残基割り当てに課さ なければならない。 残基割り当てに信頼水準を課すためには、まず最初に実験的誤差の性格を規定 しなければならない。誤差がランダム（無作為）のシ ステムにおいては、単純なt-統計学をアミノ酸割り当てに利用することができる 。 前述の切形ペプチド・ラダーのMALDI分析を支配する誤差の性質を評価するた めに、前記のACTH 7-38フラグメントの時間依存性消化から取り出された15アリ コート（各アリコートに1つのスペクトル）で行われたすべてのアミノ酸割り当 てに関するΔ質量差（すなわち、実験質量差-実際のアミノ酸質量）を測定して 、平均0.0089±0.605（n＝107）のガウス分布を得た。この実験におけるt計算値 （0.152）＜t表値（1.99）は、平均Δ質量差＝0という帰無仮説は95％信頼水準 では棄却できないことを示している。このことは誤差がランダムで、統計的に有 意なシステム上の誤差がないことを示している。これは2点の質量測定での不正 確なy切片値といった個々のペプチドピークの質量割り当てにおいて存在するシ ステム上の誤差と同じように、2つの隣接ピークの質量差を計算する時には相殺 されるものと考えられる。同位体の部分的分解によって起きる2つの隣接ピーク の片方の質量中心の不正確な計算のような、相殺されないシステム上の誤差要素 はありうる。この現象は平滑化フィルタの使用によって、すべてのピークが実際 の平均質量値で検出されるようにすることによって回避された。注：*1 表示の質量は平均値で単位はダルトン。 *2 実験質量測定値の不確実性は標準偏差で与えられている。（括弧内は平 均値の95％信頼区間） 表2はACTH 7-38フラグメントの配列された残基の実際の平均質量、ならびに時 間依存性消化について計算した実験質量差とその標準偏差および95％信頼区間を 比較したものである。複製の数は、特定の残基の質量差測定に必要な検出可能な 隣接ピークを有していたスペクトルの数を示す。平均値を確定するために相当な 測定数が必要なことはこの表から明らかであるが、これは95％信頼水準が測定数 の平方根で減少するからである。配列されたすべての残基につい ては、実際の質量は実験質量分布の±3σに収まった。それぞれのケースの計算t 値は95％信頼区間でt表値以下であり、このことは実験質量が実際の既知の質量 とは大きく異なっていなかったということを意味する。統計的に残基に割り当て るためには、それぞれ可能性のあるアミノ酸の計算t値をt表値と比較しなければ ならない。 言い換えれば、可能性のあるすべてのアミノ酸の実際の質量を確定平均μとし て使用し、可能性のある割当てのそれぞれについて計 0）をたてねばならない。 20の通常の無修飾アミノ酸だけ可能性があると想定して、これを先行技術の時 間依存性ACTH 7-38フラグメント消化について行なった。結果の要約が表3に示さ れている。太字の数値は実験平均値が確定アミノ酸平均値と大きく異ならなかっ たものである。ここでも十分な母集団サンプリング数が必要なことは明らかであ る。Glu（28）についてはわずか2つの測定値だけが観察されたので、95％信頼区 間は4.22ダルトンとなった(表２)。このことは、Gln、Lys、GluおよびMetを区分 することは不可能ということになる(表３)。Glu（30）が認められた12例から、9 5％信頼区間は0.39ダルトンとなり、これによりGln、LysおよびMetは統計的にア ミノ酸割り当てはできないこととなる。 表3は20の通常の無修飾アミノ酸の確定平均値を与えた場合のACTH 7-38フラグ メントの19の配列アミノ酸の実験平均値に対する計算t値を表す。t表値はそれぞ れの欄の最後に示されている。t計算値＜t表値は、実験平均値が95％信頼区間で 確定アミノ酸の平均値と有意に異ならないことを示している。このケースに該当 するそれぞれのt計算値は太字で示されている。注:適当な自由度v、ここではv=n-1、に対応するt分布の片側の0.025領域に関す るt表値。 表4は、先行技術の時間依存性戦略を利用してACTH 7-38フラグメントのC-末端 から配列された19のアミノ酸に対する統計的アミノ酸割り当ての結果を要約した ものである。表に掲げたアミノ酸の質量はこの信頼水準においては実験的に導か れた質量差と統計的には差が見られない。太字で示されたアミノ酸はその位置に 存在する既知の残基である。表示した信頼区間は、示されたもの以外のすべての アミノ酸質量が実験平均値と統計的に異なるという、最高の水準である。注:20の通常の無修飾アミノ酸だけを可能性のある候補と想定。 たとえば残基21のアミノ酸割り当てにおけるGlnおよびLysの区分は、実験平均 値（128.15ダルトン）がちょうどGln（128.13ダルトン）およびLys（128.17ダル トン）の確定平均値を2分したためできなかった。同じ現象は残基37の割り当て についても発生した。実験平均値（113.63ダルトン）がLeu（Ile）の確定平均値 （113.16ダルトン）およびAsnの確定平均値（114.10ダルトン）を2分した。28お よび38位置のアミノ酸の割り当ては、複製数が少ない（それぞれ2および3）ため に困難であった。残基28は、95％以上98％以下の信頼区間でGln/Lys/Glu/Metと 割り当てられた。表3はこの残基に関して、最小のt計算値となった確定アミノ酸 質量はメチオニンのものであることを示している。信頼区間80％を使用すると、 Gluの正しい割り当ては統計的にできないと考えられる。同様に残基38の割り当 ては95％信頼水準でGln/Lys/Gluとされたが、正しい割り当て(Glu)はここでも80 ％水準では統計的にできないことになる。 誤差はランダムに分散しているため、十分な母集団サンプリングをすることに よって、すべてのアミノ酸（LeuおよびIleを除いて）を区別することができる。 実験の標準偏差をすべての実験について上記のs=0.604に近似させると、GlnとLy s（Δ質量=0.04ダルトン）を95％信頼区間で区別するためには＞876の測定値（t 表値=1.960）が必要となる。この数字は実験的には実施不可能なものであるが、 実験平均値の標準偏差を小さくすることによってこれを著しく減らすことができ る。実験の標準偏差を減らすことは、２つのアミノ酸を区分するのに必要とされ るサンプル数が質量差の実験標準偏差の平方根に比例することから、重要な価値 を有する。ペプチド母集団を干渉マトリックスの外に移動させるために質量シフ ト試薬を 使用することが、低質量領域（＜600ダルトン）に現れるペプチドに関する実験 誤差を改善する可能性のある化学的手段と考えられる。リフレクトロンおよび/ または拡張型飛行チューブ形状の使用もまた誤差を減らすのに適した器具的な方 法と考えられる。 ここに開示したオン・プレート戦略を使用した残基の統計的割り当てのプロト コルは、消化を実施する各穴から複数のサンプリングをすることになる。必要と される複製の数は、1種類のCPY濃度で配列されることになるアミノ酸の種類によ って異なる。たとえば、ただ1つの割り当てを除いては統計的に確実にありえな いとするためには、113-115ダルトン（Ile/Leu、AsnおよびAsp）ならびに128-12 9ダルトン(Gln/Lys/Glu)あたりの質量差については、163（Tyr）または57(Gly) あたりの質量差の場合よりもより多くの複製数が必要とされる。この方法（1サ ンプルにつき複数の複製）の実験誤差は、時間依存性消化（1サンプルにつき1つ の複製）と同じようにランダムになると思われる。 残基割り当てに関するこの一般的な統計的プロトコルを、2以上のアミノ酸の 消失を表す2つの隣接ピークに適用した。このケースでは、t値を計算するために すべてのジペプチド、トリペプチドなどの確定平均値を使用することができる。 残基の順番に関する情報は失われるが、組成は導き出すことができる。ただ1つ のアミノ酸およびジペプチド質量を確定平均値として使用して、Phe-Argの配列 ギャップを有するアンギオゲニンについて実施した(表1)。Arg(15)とPhe(13)の 消失を表すピークの間の平均実験質量差は303.45±0.328（n=5）であった。Phe/ Arg以外のすべての単一アミノ酸およびジペプチド質量については、99.8％の信 頼区間において計算t値はt表値より大きかった。この特定のケースでは、ギャッ プを 包含するアミノ酸は同定されたが、それらの順番は実験的には解明されなかった 。この統計的戦略はまた、ラダー配列決定/MALDI実験の双方向データ分析および 解釈を行なうためにコンピュータ・アルゴリズムに組み入れた。 かくして上記のように、CPY消化をMALDI検出と組み合わせて使用することは、 ここに開示の通りC-末端配列情報を得るのに有効であった。ACTH 7-38フラグメ ントでは、C-末端からギャップなしに19のアミノ酸の配列情報が得られた。この オン・プレートの濃度依存性による方式は、時間と試薬を消費する展開方法を回 避して、複数の消化を並行して行なう方法として有用であることを示している。 このオン・プレート戦略は物理的な操作が少なく、かつ酵素とペプチドの総量 が少なくて済む。オン・プレート方式を利用した22ペプチドでの試みでは、3例 を除いてすべてが何らかのC-末端配列情報を得ることに成功した。CPYはまたア ミド化C-末端残基を切断するが、C-末端およびその直前位置に存在する特定の残 基の組み合わせに対しては活性を有さないことが示された。 要約すれば、“オン・プレート”のCおよびN末端ペプチド・ラダー配列決定実 験から残基割り当てを作り出すための統合された1つの戦略が開発された。この 戦略は以下の作業の論理的な組み合わせをベースとしたものである： 1）Voyager^TMサンプル・プレートのμＬ穴をマイクロ反応容器として使用する 濃度依存性エキソペプチダーゼ消化戦略からペプチド・ラダーを作り出し、 2)ペプチド・フラグメントの質量を割り出すための道具としてVoyager^TM MALD I-TOFワークステーションを使用し、 3）t統計学をベースとした解釈アルゴリズムにより確定割り当て 候補を排除し、そして、 4)統計をベースとした割り当てを完全に行うか、またはコスト効果の高い点ま で導くために取得する複製数を統御する解釈アルゴリズムからのデータ取得ソフ トウェアのフィードバック制御。 （c）実験的に得た質量/電荷比データの分析：核酸類 ここに開示した方法をまた、40塩基を含む核酸ポリマーに関する配列情報を得 るために使用した。3'末端に特異性のエキソヌクレアーゼを使用した加水分解を 、0.002μＵ/μＬから0.05μＵ/μＬの範囲の異なる濃度のPhos I（ホスホジエ ステラーゼI）を使用して行なった。加水分解は3分間進行させた。MALDI-T0Fを 使用した加水分解配列のスペクトルが図6A-6Eに示されている。本明細書に開示 したデータ統合により、この配列は、CGC TCT CCC TTA TGC GAC TCC TGC ATT AG G AAG CAG CCC A（配列番号23）であると確認された。 別の実験において、光吸収性マトリックスCHCAの添加を評価した。40塩基を含 む核酸ポリマー（上記の通り）をマトリックスと、5'末端に特異性のエキソヌク レアーゼPhos II（ホスホジエステラーゼII）0.4μＵ/μＬに混合した。マトリ ックスの存在下での加水分解を10分間進行させた。MALDI-TOFにより得られたそ のスペクトルを図7に示す。これらのデータは、ポリマー、加水分解剤およびマ トリックスを質量スペクトル分析に先立って混合する効力を裏付けている。この 混合によって試薬の取り扱い操作が減り、サンプルの処理が促進される。図7と 同様のデータを使用して、この核酸ポリマーの配列が上記の通りであることが追 認された。 実施例4 本発明のその他の利用 本明細書に開示したように、この戦略は、蛋白質、ペプチド、核酸、炭水化物 、およびそれらの修飾物などの天然バイオポリマー、ならびにPNAやチオリン酸 化核酸などの合成バイオポリマー類すべての配列に適用することができる。ラダ ーはエキソヒドロラーゼ類、エンドヒドロラーゼ類を使用して酵素的に、あるい はサンガー法および/または切形合成または失敗配列による化学的な方法により 作り出すことができる。 本明細書に開示したCPY/MALDIラダー配列決定法の有用性を拡大するために、 その他の方式を取り入れることができると考えられる。 たとえば、異なる酵素特異性を利用することにより、CPY活性を抑制する残基 の組み合わせを配列する手段ならびに配列ギャップを防止する手段として、開示 したオン・プレート戦略を利用したカルボキシペプチダーゼ混合物の使用を進め ることができる。また、小ペプチド類にN-末端および/またはC-末端リンカーを 共有結合させることにより、すべての配列ピークを低質量マトリックス領域外に 現れるようにすることも考えられる。MALDIを上記のカルボキシペプチダーゼ混 合物と質量シフト試薬修正物と組み合わせることによって、ギャップなしにペプ チドのN-末端を完全に配列決定することができることも考えられる。 均等 本発明の精神または基本的な特徴からそれることなく、本発明をその他特定の 形で実施することができるであろう。したがって前記の実施態様は、すべての点 においてここに開示した発明を限定する ものではなく、説明するためのものである。したがって本発明の範囲は、前記の 説明によるものではなく付帯の請求項により示されるものとし、それら請求項の 意味するところと均等範囲内にあるすべての変更は本発明の範疇に属するものと する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION A method for statistically certain polymer sequencing using mass spectrometry Law and equipment                              TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION   The present invention uses mass spectroscopy to analyze polymers, especially biopolymers (biopolymers). The present invention relates to a method and an apparatus for determining the sequence of a substance (polymer).                                 Background art   Biochemists rely on reliable and rapid determination of biopolymer sequences There are many. For example, sequence information can be found in peptide screens, gene probes, Research and development of mapping and drug modeling, as well as diagnostic and / or Or critical for quality control of biopolymers manufactured for therapeutic or therapeutic use .   Sequencing of polymers composed of amino acids, carbohydrates and nucleotides Various methods are known for use. For example, for peptide sequencing, Known methods include N-terminal chemistry of Edman degradation, N- and C-terminal enzymatic methods, As well as C-terminal chemistry. Existing methods for sequencing oligonucleotides and For example, Maxam-Gilbert base-specific chemical cleavage, and Ladder (step-wise) synthesis by the method of specificity and dideoxy base termination There is a law. Each method has its own limitations, so they can only be Use for structural identification is hampered. To date, Edman Sequencing and its applications determine residue-by-residue sequencing of specific proteins and peptides Has become the most widely used tool for It is suitable for sequencing nucleotides.   For protein and peptide sequencing, chemical C-terminal sequencing is particularly And is at best only a little useful (for example, Peace [Spiess], J. (1986) Protein Characterization Method: Practical Handbook (Shivly [Sh individually], J. E.), Humana Press, N.J., pp. 363-377; Tsugita et al. (1 994) J. Protein Chemistry, 13: 476-479).   As a result, the C-terminus is an area that cannot often be analyzed due to lack of reliable methods. Remains as.   Both peptides and oligonucleotides replace chemical sequencing The method is enzyme cleavage sequencing. For oligonucleotides, more than 150 different Enzymes have been isolated and these have been used for the preparation of oligonucleotide fragments. It is suitable for. In the case of peptides, serine carboxypeptidases Simple cleavage of amino acids in order from the C-terminus of a protein or peptide It has been used extensively over the past 20 years to provide a simple way.   Carboxypeptidase Y (CPY) specifically has all residues, including proline, at the C-terminus. It is an attractive enzyme because it cleaves nonspecifically from the end (for example, Breddam et al., (1987) Carsburg Res. Commun. 52: 55-63).   Sequencing of peptides by carboxypeptidase digestion has traditionally been a dissociation Has been done by direct and time-consuming analysis of each amino acid . This method is not only tedious, but also reduces enzyme and protein / peptide solution concentrations. Complicated by autolysis of amino acid contaminants and enzymes. This kind of sequencing An additional obstacle in all industries is the hydrolysis of individual residues by the particular enzyme used. Good kinetic information on degradation and dissociation is absolutely needed.   Field desorption method (Hong et al. (1983), Biomed. Mass Spe ctrom. 10: 450-457), electrospray method (Smith et al. (1993) 4 Te chniques Protein Chem. 463-470), and the Thermospray method (Stachioia) [Stachowiak] et al. (1988); Am. Chem. Soc.110: 1758-1765) With the development of mass spectrometry technology that can analyze substances, Large biopolymers in which the sequence order is preserved by different peptide fragments -Direct mass spectrometry analysis of amino acids The need for amino acid analysis has been avoided. This “ladder (stepwise The "sequencing" method involves calculating the mass difference between adjacent peptide peaks. Sequence can be derived in the correct order-that is, the measured difference is It indicates the disappearance of amino acid residues.   More recently, time-of-flight matrix-assisted laser desorption ・ Ionization (MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption ionization Time-o f-Flight) mass spectral analysis also has high sensitivity, resolution, and mass accuracy. It is shown that the method is suitable for ladder sequence analysis. Chait ] Et al. (1993) 262 Science 89-92) describes the advantages of MALDI-TOF as Ladder sequencing of the N-terminal ladder formed by partial blocking of each step of the digestion We are utilizing it. This method still has the complexity of the process, Has the same limitations as traditional Edman chemistry, such as properties and lack of C-terminal information ing. However, this method does not work with peptide ladder scenarios. This confirms the usefulness of MALDI-TOF for sequencing DNA. Other researchers In addition, in order to analyze the obtained truncated peptide mixture, the peptide carboxypeptin was used. It shows that tidase digestion can be combined with MALDI-TOF. for example Eight consecutive amino acids from the C-terminus of the 1-34 fragment of human thyroid hormone The sequence has been determined (Schar et al. (1991) Chimia 45: 123-126).   In addition, carboxypeptidase digestion of peptides is (Wang et al. (1992) Techn. iques Protein Chemistry III (Angeletti), Academic Press , N.Y.) 503-515). However, all of the above sequencing methods are monotonous and Requires time consuming preliminary optimization steps. In addition, such a preliminary The optimization step involves reagents as well as polymer samples that usually yield only limited amounts Is unnecessarily consumed. Moreover, the sequencing methods described above are ultimately limited in number. A single mass spectrometry spectrum and a single mass / charge ratio data This provides a statistically inadequate basis for determining the final polymer sequence. I can only give.   One of the objects of the present invention is mass spectrometry and time-independent / concentration-dependent Utilizing hydrolysis, polymers, especially biopoly It is an object of the present invention to provide a method and an apparatus for performing sequencing of a mer. further In particular, to combine the mass / charge ratios obtained from multiple parallel mass spectra Provide a method for obtaining sequence information incorporating a data interpretation strategy based on It is one object of the present invention. Another object of the present invention is the need for prior art methods. To obtain sequence information, avoiding time-consuming optimizations and method enhancements The aim is to provide a quick method. A further object of the present invention is to provide a sensitive mass fraction. Samples by light analysis and tight integration of hydrolysis with mass spectrometry Combines loss elimination to provide sequence information using less total polymer It is in.                                Summary of the Invention   Therefore, one aspect of the present invention is to utilize information gathered by mass spectrometry to It is directed to an integrated method for sequencing The law substantially overcomes the problems in this area. Outlined here Thus, the present invention provides an arrangement for a polymer comprising a plurality of monomers of known mass. It provides a way to obtain information. The skilled technician in the field first A set of fragments produced by hydrolysis, where each set contains one or more monomers Are different, and the mass / charge ratio of at least one pair of fragments is Determine the difference. Next, the average corresponding to the known mass / charge ratio of one or more different monomers. Determine the average mass-to-charge ratio. It is a nuance of guessing and guessing, but assertions and assumptions are too strong, The assumption was too weak, and the estimation could be mistaken for estimate. Therefore, in order to avoid complexity, it is simply translated as “confirmed”. same as below. ). This confirmation Compare the mean to the measured mean and make sure these two values are statistically To determine if they are different. If there is a statistical difference, the determined mean difference is It cannot be assigned to the actual measurement difference. Some of the current preferred practices Now, to improve the accuracy of the measured average difference, Has adopted. The steps of such a method are defined as the single difference between a pair of fragments. Until all desired μs have been determined. Other additional fragments The method is repeated for the pairs until the desired sequence information is obtained.   The method claimed in the present invention comprises DNA, RNA, PNA, protein, peptide and charcoal. Biopolymers, including hydrates and modifications of these polymers Applicable to all polymers. The set of polymer fragments is It can be created by hydrolyzing inter-monomer bonds. The above poly With respect to mers, the invention relates to natural and synthetic products characterized by a different set of monomers. It is intended to apply to both components. In some embodiments, the polymer Can be modified. The present invention also provides a hydrolyzate for causing hydrolysis. It is also intended to include a peptizer. The hydrolyzing agent should be an enzyme or non-enzymatic test. It can be a drug, and any combination thereof.   In one presently preferred embodiment, the method of obtaining sequence information for a polymer comprises: Polymer fragments created by hydrolyzing the polymer Set, but each fragment differs by one or more monomers of known mass Prepare this, this The average difference μ associated with the known mass / charge ratio of one or more monomers is then determined, and μ Select the desired confidence level of Measure the mass / charge ratio difference x between the fragment pairs. The number of measurements n by repeating the steps Of the average mass / charge ratio Find a statistical t-calculated value:   And all the desired μs for the difference in mass / charge ratio between fragment pairs are confirmed. Repeat the steps of this method until defined. The sequence information of the polymer It is obtained by repeating the steps of the method on additional fragment pairs.   In another embodiment disclosed herein, the invention further comprises a series of different models. Also provided is a method of obtaining sequence information for a polymer including a nomer. Is on the reaction surface to hydrolyze the polymer and break the intermonomer bonds. Provide one dose of the hydrolyzing agent and the polymer sample and A series of hydrolyzed polymer fragments Incubate for a time sufficient to obtain Of the hydrolyzed polymer fragments contained in the series Obtain charge ratio data, and combine data from multiple series as described above Obtaining sequence information characteristic of the polymer sample.   The present invention has polymer hydrolytic capacity to create sequencing ladders Embodiments using hydrolyzing agents, as well as the ability to form polymer maps Other embodiments using different hydrolyzing agents are also contemplated.   In yet another embodiment, the invention is directed to a combination of these hydrolyzing agents. Hydrolysis of polymers, and the use of enzymatic and non-enzymatic hydrolytic agents Also provided is a limmer hydrolysis method. In the currently preferred method, water The peptizer is disposed on the reaction surface in an array of partitioned separation zones. A few In an embodiment of the invention, on a reaction surface having one or more different doses of a hydrolyzing agent, Set of multiple polymer fragments by hydrolyzing the polymer Are determined. In a most preferred embodiment, the concentration dependent hydrolysis is Separate the hydrolyzing agents into separate, spaced Serve in doses. In another embodiment, the hydrolyzing agent is placed in a gradient. In yet another embodiment, the hydrolyzing agent is disposed in a fixed amount on the reaction surface. Another In one embodiment, the polymer is disposed in a similar manner on the reaction surface. All the real In embodiments, to obtain multiple series of hydrolyzed polymer fragments Next, different polymer / hydrolyzing agent ratios are placed on the reaction surface and Cubate. Various techniques for producing such different ratios are The surgeon is aware.   For example, a range of concentrations of the hydrolyzing agent can be purchased from Perceptive Biosystems [P erSeptive Biosystems Inc.] Voyager * TM MALDI-TOF biospectrometry Disperse into one row of μL holes on the Lee Workstation sample plate. Self After the evaporation, add the matrix to each well and place the sample plate on the MALDI-TOF mass. Read with an analyzer. Time-dependent digestion and concentration-dependent digestion are similar sequences Informative, but easier to automate using concentration-dependent methods, All samples can be prepared at the same time, and transfer from the reaction vessel to the analysis plate This is preferred because less sample material is lost. Therefore, the concentration On-plate hydrolysis followed by MALDI mass spectrometry analysis. It is preferred that This is the good sensitivity of MALDI and the move from digestion to analysis Combined with the lack of sample loss associated with It only requires komol.   If sequence information is obtained by MALDI, the appropriate A suitable light absorbing matrix can also be added to the polymer fragments. Was For example, the matrix can be pre-loaded on the reaction surface, Can alternatively be added to the hydrolysis mixture before, during or after the hydrolysis. it can.   In some other embodiments, the method also includes hydrolyzing the agent and the polymer. Methods for combining with other useful ingredients are also provided. In one embodiment, the hydrolysis Includes components that selectively shift fragments prior to mass spectral analysis Have been. In another embodiment, the ionization of the hydrolyzed fragment Contains ingredients that can improve. In yet another embodiment, the light absorption Methods are provided for including a yield matrix. The method of the invention may also comprise one or more Any of the above components into a hydrolyzing agent and polymer prior to mass spectral analysis. Interlocking embodiments are also devised.   Another aspect of the invention relates to devices and kits for sequencing polymers. Is what you do. The devices and kits of the present invention in various embodiments For spectrum analyzers and their corresponding computers or mass spectrum analyzers Computers that work together Including In one embodiment, the device of the invention is a means for generating ions. Mass spectrometer having a step, means for accelerating ions and means for identifying ions Includes Torr analyzer. This mass spectrometer responds to the mass spectrometer. Linked to a computer having means for performing the method of the present invention. I do.   In yet another embodiment, the device of the present invention is associated with a mass spectrometer. Computer readout containing the information necessary to carry out the method of the invention together Includes removable disks. In another embodiment, the apparatus performs the method of the invention. And the computer itself that has the means for performing the operations.   More specifically, in one embodiment of the device of the present invention, a novel Includes a shaped sample plate or sample holder. This sample play The sample or sample holder can be separated by different polymer / hydrolyzing agent ratios. Include a reaction surface with spaced regions. The hydrolysis agent is After an appropriate incubation period to hydrolyze the inter-monomer bonds, Multiple, typically all, regions containing isolated polymer fragments In the spectrometer, typically continuously, ionized, the mass / Data representing the charge ratio is obtained. One or more of these areas are more or less useful A suitable ladder component or other polymer fragment Has a water splitting agent / polymer ratio. Some areas on the sample holder Overly hydrolyzed polymer fragment that is useless to derive column information May include Another region contains substantially unhydrolyzed polymer Sometimes. However, by performing mass spectrometry in all regions, Both occur in one or more areas Some mass / charge ratio data can be obtained from the fragments. did Thus, by combining data from different regions, the method of the present invention Samples must be prepared experimentally to achieve the appropriate peptizer / polymer ratio. Control of the reaction time and careful reaction temperature Need can be avoided. Furthermore, it generates more useful hydrolyzed fragments. Different hydrolyzing agents in different series of areas on the sample holder to produce The data obtained from these can be used to improve the sequencing process Can be used in an integrated manner. Data analysis based on the computer If performed by the data program, the entire process is terminated It can be completed within minutes later.   In some currently preferred embodiments, the mass spectrometer The pull plate or sample holder must have at least the polymer Has a planar solid surface containing one dose of hydrolyzing agent capable of hydrolyzing You. In one embodiment, the hydrolyzing agent is disposed on the reaction surface in a dehydrated form. It is. In another embodiment, the hydrolyzing agent is immobilized on the reaction surface. Further In another embodiment, the hydrolyzing agent is resistant to physical transfer on the reaction surface. It is arranged in a liquid or gel-like form. In yet another embodiment, the sun A light absorbing matrix is disposed on the surface of the pull holder. In addition, samples -In one or more of those embodiments of the holder, a microphone B) A reaction vessel is provided. Certain embodiments of the sample holder are disposable belongs to. Furthermore, this reaction surface is made up of various substrates and used for mass spectrometry. Various shapes that are suitable as I have. As disclosed herein, a sample plate or sample holder All embodiments of the invention have application in mass spectrometers for polymer sequencing. It is useful for   As will be apparent to the skilled artisan, methods and methods for obtaining sequence information according to the present invention are provided. The apparatus and apparatus solve the problems associated with conventional polymer sequencing methods. Previous As mentioned earlier, peptide ladders created using conventional liquid-phase digestion methods, Aliquots of samples taken at fixed time intervals from enzyme digests Have many disadvantages. For example, while saving all possible sequence information Requires a lot of development (preparation) time and a large amount of enzyme And peptides are required. Each pepti trying to derive sequence information Have to develop time-consuming methods for sequencing prior to actual sequence analysis. There is no. Because the optimal combination of conditions for one peptide is For example, the hydrolysis rate of various enzyme agents such as CPY is composition-dependent. When considered, it cannot be useful for another peptide. Invented in the present invention As an alternative, an alternative strategy is to perform digestion on the surface of the MALDI sample. It is. For example, in accordance with the present invention, an on-site such as exopeptidase digestion may be used. When performing polymer hydrolysis at a rate, the overall polymer sequencing work is It has the following advantages over the time-dependent digestion of the prior art. That is, the method is extremely Simple and eliminates the need for tedious optimization; Reduces sample loss due to transfer to the reaction surface from the enzyme; Low levels of tide; and of particular importance for large scale applications, Easy to use / automate. Similarly, the sample pre- Or sun Pull holders offer advantages not previously available to skilled technicians. You. For example, some embodiments minimize reagent manipulation and significantly reduce sample processing. Make it easier. The skilled technician need only provide a sample of the polymer. So Almost all other experimental parameters are also pre-optimized.   The foregoing and other objects, features and advantages of the invention will be more fully described in the following detailed description. Will be clear. Are the foregoing general description and the following detailed description exemplary? It is illustrative and is intended to further illustrate the invention as claimed. Things. The accompanying drawings are incorporated to enhance the understanding of the present invention, and And constitutes a part of the textbook and describes some embodiments of the present invention. The purpose is to explain the principle of the present invention together with the specification.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The foregoing and other objects, features and advantages of the invention, and the invention itself By reading the following preferred embodiments in conjunction with the accompanying drawings. Will be fully understood,   Figure 1 shows an exemplary sample plate or sample holder for MALDI analysis. It is da. The well acts as a microreactor in which on-plate digestion takes place. Will be The dimensions of the plate are 57x57mm and the holes are 2.54mm in diameter.   Figures 2A, 2B and 2C show the ACTH 7-38 fragment [FRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAE AFPLE] (1 minute (2A), 5 minutes (2B), and 2 minutes) for time-dependent CPY digestion of (SEQ ID NO: 22) 5 shows a MALDI spectrum at 5 minutes (2C). The number on the peak label is the indicated amino acid. Acid-dissipating peptides Is shown. The peak indicates the loss of 19 amino acids from the C-terminus. * Symbol is double charged # Sign indicates m / z = 2001.0 and 2744.4 daltons Indicates a peak.   FIG. 3 shows 15 seconds, 105 seconds, and 6 minutes from time-dependent CPY digestion of the ACTH 7-38 fragment. MALDI mass specs showing pooled and mixed 25 min aliquots It is torr. A 6-minute aliquot was seen as a small peak and this collected image Glu (28), Asn (25) and Pro (2 Except for 4), all amino acids are lost. All conditions are described in the text. It is listed.   4A and 4B show different concentrations of carboxypeptidase Y (CPY) (6.10 × 10^{- Four} U / μL (4A); 1.53 × 10^-3Turn on / off ACTH 7-38 fragment with U / μL (4B) Figure 3 shows various MALDI spectra from plate digestion. Panels A and B are each 6.10x10^-FourAnd 1.53x10^-3Species obtained by digestion using U / μL of CPY Indicate the coutle. The signal / small peak in the spectrum at the expense of peak resolution To improve the noise ratio, a laser power much higher than the threshold was used. *Record Symbols indicate doubly charged ions, # symbol unidentified at m / z = 2517.6 daltons Indicates a peak.   FIGS.5A, 5B and 5C show 3.05 × 10 3 of the following three selected peptides, respectively.^-3, 3.05 x10^-Four, And 6.10x10^-FourOn-plate digestion using U / μL concentration of CPY The various MALDI spectra obtained are shown: Osteocalcin 7-19 fragment [GAPVPYPDPLEPR (SEQ ID NO: 13) (5A), angiotensin 1 [DRVYIHPFHL (control Column No. 8) (5B), and bradykinin [RPPGFSPFR] (SEQ ID No. 5) (5C). Record No. Na indicates the peak of the sodium adduct, and # indicates m / z = 568.5. 2 shows the matrix peak in Daltons.   FIGS. 6A-6E show various concentrations (0.002 μU / μL (6A); 0.005 μU / μL (6B); 1 μU / μL (6C); 0.02 μU / μL (6D); 0.05 μU / μL (6E)) Exonuclease of nucleic acid polymer (SEQ ID NO: 23) by sterase I (PhosI) 1 shows various MALDI spectra of hydrolysis.   Figure 7 shows the hydrolyzed nucleic acid polymer (SEQ ID NO: 23) and the light absorbing matrix 2 shows a combined MALDI spectrum.                             Detailed description of the invention   As described in detail below, the present invention uses a mass spectrometer to align polymers. Methods, kits and devices for making decisions. The present invention relates to multiple Provides an Integrated Strategy for Obtaining Sequence Information for Polymers Containing Different Monomers I do. More specifically, the present invention relates to a set of polymer fragments and mass spectrometry. Provide a method for interpreting sequence data obtained by mass spectrometry using This provides fast, automated, cost-effective, statistical certainty The sequence of the polymer to be determined can be determined. The invention further relates to polymers and hydrolysis A method is also provided for utilizing an agent disposed on a reaction surface. The hydrolyzing agent is an enzyme or It is non-enzymatic. These hydrolyzing agents react with the polymer and define the sequence Create a polymer ladder or polymer map. The method of the present invention further comprises: Obtaining mass spectrometry data associated with the hydrolyzed polymer series; Determining polymer sequence by combining data from multiple polymer series including. The mass spectrometry of the present invention Applicable to ON formation method as well as all mass spectrometry methods. Kit of the invention And a device for obtaining sequence information of a polymer based in part on the method of the present invention. Mass spectrometer sample plate or sample to adapt the mass spectrometer to The holder. Specifically, the sample plate is dehydrated and fixed on it Hydrolyzing agents in liquid, liquid and / or gel form, and / or light absorbing matrices Place the box. Optionally, some of the sample plates of the present invention may be disposable. Type. Another embodiment of the device of the present invention performs polymer sequencing Mass spectrometer, computer and computer suitable for use in the above method -Discs.   As used herein, "polymer" refers to any suitable use in the methods of the present invention. It is intended to mean any component comprising a series of different monomer groups. One In other words, the inter-monomer bond encompasses a series of different monomer groups that are sensitive to hydrolysis. All components are suitable for use in the methods disclosed herein. For example, Peptides are polymers composed of specific monomers, namely amino acids, These can be hydrolyzed with either enzymes or chemicals. Similarly, DNA is another It is a polymer composed of monomers, that is, base nucleotides. Can be hydrolyzed by various agents.   The polymer can be either a natural component or a synthetically made component. Currently good In the preferred embodiment, the polymer is a protein, peptide, DNA, R, Groups such as NA, PNA (peptide nucleic acid), carbohydrates and their modified forms Biopolymers selected from, but not limited to.   “Sequence information”, as used herein, refers to polymers or portions thereof. Related to the primary structure of a series of different monomers in the Shall mean all information. Sequence information includes chemicals of different monomers Includes information about identities, as well as their particular location within the polymer. Polymers of which primary sequence is known, as well as polymers whose primary sequence is unknown, Suitable for use in the method. Terminal monomer group and internal monomer group Sequence information to be obtained using the methods disclosed herein. Is being planned. In some applications, a complete polymer sample without defects is used for delivery. Column information can be obtained. Not a perfect polymer without defects in other applications Sequence information using a sample containing Obtainable. These fragments are natural, isolated and purified artifacts, And / or may have been produced in vitro by a skilled technician. You. In addition, the polymer fragments may be used in high performance liquids prior to use in the method of the invention. Prepared by extraction using various rectification and separation methods such as solid-state chromatography May be done.   The “reactive surface” of the present invention is suitable for hydrolyzing a target polymer with a specified drug. Includes all suitable surfaces. Reaction surfaces are metal, foil, plastic, ceramic, and And waxes, but are not limited to these Can be. All reaction surfaces are suitable for use in mass spectrometers. It must be the. The reaction surface of the present invention is suitable for use in a specific mass spectrometer. It can be of any suitable shape. For example, the reaction surface is flat It can be a solid surface. Alternatively, this surface can It may be arranged on a surface. In yet another embodiment, the specific mass spectrometer A probe shape suitable for use in the device can be obtained. In some embodiments In the book Activate the reaction surface to enhance or facilitate the sequencing of the polymers according to the invention. It is well known to those skilled in the art that it can be converted and / or derivatized.   The present invention relates to a method for analyzing mass / charge ratio data obtained by mass spectrometry. You. The method is created by the hydrolysis of a polymer, as illustrated in detail below. Sets of fragments, with each set differing by one or more monomers Prepare something. And the difference in mass / charge ratio of at least one pair of fragments Ask for. Next, the average quality corresponding to the known mass / charge ratio of one or more different monomers Determine the amount / charge ratio. The determined average is compared to the measured average, and these two values are Determine if the confidence levels are statistically different. If there are statistical differences In this case, this determined average difference cannot be assigned to the actually measured difference. In some embodiments, an additional measure of the difference between a pair of fragments is taken. Improve the accuracy of the measured average difference. Repeat this step of the method for all desired mean differences Iterate until the difference is determined to be a single difference between a pair of fragments.   The above method is repeated for additional fragment pairs, resulting in multiple parallel mass spectra. Of the mass / charge ratio data from Return. Thus, in the broadest aspect, the present invention provides for multiple models of known mass. It is a comprehensive way to generate sequence information for polymers that include a group of nomers. The method is used to statistically determine the monomer differences between fragment pairs. Interpret mass / charge ratio data for fragment sets from the Including In the past, researchers were aware of some mass measurements The molecular mass of MALDI with the mass derived by MALDI, Try to use general expressions I've seen it. Overall, the method of the present invention involves multiple integrated steps. Yes, these can be automated according to the present invention.   After preparing a set of polymer fragments that differ by one or more monomers, At least measure the difference x in the mass / charge ratio between the pair of fragments. Then it is measured The average difference μ in mass / charge ratio between the paired fragments is determined. Where μ is 1 or more It corresponds to the known mass / charge ratio of different monomers. And then analyze x Then, it is determined whether or not x is statistically different from μ at the selected confidence level.   If it is determined that there is a statistical difference, the determined μ is at the selected confidence level. Cannot be assigned to the mass difference x.   Repeat the above steps until all desired μs have been determined, Repeat for additional fragment pairs.   In one embodiment, the analysis to determine whether x is different from the statistical μ is x Is repeated n times, and the measured average mass / charge ratio difference x between at least one pair of fragments . Then, the standard deviation s of the measured average x is obtained, and the measured average x To the determined mean μ to determine if they are statistically different at the desired confidence level. to decide.   In one embodiment of the invention, one set of polymer fragments is turned on. Mass / current of a pair of fragments, obtained from either plate digestion or an external source Obtain one or more measurements of the load ratio. Peaks representing the disappearance of one or more monomers are t-statistical And assign it with the desired confidence interval. 1 experiment flat The following equation applies to the two-tailed t-test for the mean.The number of replicate replicates performed, and s is the average experimental standard deviation. All conceivable Mass (1 residue, 2 residues, 3 residues. . . And the mass of the modified residue) As a list of t-calculated values, which is then To the value of. All masses that are not statistically different from the deterministic mass, ie, t-calculated values The <t table value is assigned to that residue with a predetermined confidence level. This information is Used to check the product or to search a database of sequences. Can be When searching the database, these confidence levels are high Can be used in search algorithms as a tool to help Wear.   Ultimately, this technique is used to sequence peptides of unknown sequence. is there. Researchers use MALDI to find known molecular masses for some mass measurements A general expression for the mass accuracy of the instrument measurement (eg, 0. 1% better). However, for the purpose of residue assignment, Applying degrees to individual mass measurements is not statistically valid, Therefore true Difficult to apply directly to residue assignments or unknowns. Ladder sequencing / MALDI strategy In order to obtain the amino acid sequence You must impose a statistical confidence level on residue assignments You have to.   As disclosed herein, The above data integration method further includes the following steps: Can be included. That is, On the reaction surface, Hydrolyze polymer Polymer flag by breaking intermer bond At least one dose of hydrolyzing agent and polymer sample to create a set of To Providing different hydrolyzing agent / polymer ratios on the reaction surface When, A mixture of polymer and hydrolyzing agent is used for multiple series of hydrolyzed polymer Incubating for a time sufficient to obtain And mass / electricity Includes performing mass spectrometry on multiple series to obtain load ratio data It is to be included.   For example, Of polymer fragments produced by terminal hydrolysis of the polymer The set can be used in the practice of the present invention. Typically, Endhydrolar Make a set of fragments that define the polymer map by using put out. Measure the mass / charge ratio of the fragment, Temporary component of measured fragment Identification is performed. The tentatively identified component is a known identical component of a fragment of the reference polymer. Corresponding to Reference polymer information is easily incorporated into the database used in this method Can be After selecting the desired confidence level, Confirmed temporary component identification The mass / charge ratio of the fragments performed is Fragmentation of known known polymers Is determined to be statistically different from the mass / charge ratio of the If there is a statistical difference If These steps are repeated with different additional temporary fragments. This one The method continues until sufficient information is available to identify the polymer with the desired level of confidence. That Repeated for fragments. So when considering a map, Polymer -The fragment is a fragment of a known polymer, About the identity of the polymer Basically judge whether to respond with sufficient certainty. Confirmed temporary Retrieving a sequence of known identity (temporary identified component) from a computer database It is desirable that it corresponds to the known identified component.   The method of the present invention also A plurality of different fragment sets of the same polymer, You Providing maps and ladders, It is also devised to obtain the maximum sequence information .   The set of polymer fragments can be created in any manner. Some of the claim methods of the present invention are: In order to obtain the fragments, Hydrolyzing the limmer, Or synthesis of fragments, And in advance A step of simply providing the obtained set of fragments is also devised. This specification As used in the book, The term "hydrolyzing agent" refers to the All chemicals capable of breaking the intermer bond are meant. I mean , All agents capable of cleaving the primary sequence of the polymer are disclosed in the methods disclosed herein. Suitable to use for. Hydrolytic agents dissociate monomers at the end of the polymer Or Or it acts either to break the internal bond, As a result, Create fragments or parts of limers. Typically, Preferred hydrolyzing agent Destroys the primary sequence by cutting before and after a particular monomer.   That is, The hydrolyzing agent is preferred in certain monomers of the polymer or in the polymer. Specific to a specific monomer sequence recognized by a hydrolyzing agent as a hydrolysis site react. All hydrolyzing agents described herein as presently preferred are Drugs such as Sigma Chemicals (St. Louis, Montana) Commercial products can be obtained from suppliers.   In some preferred embodiments, Add the excipient to the hydrolyzing agent, Hydrolysis Use in combination with the agent. The intended excipients are Lyophilization of the hydrolyzing agent and / or Promotes dissolution. For example, Fucose and other sugars are suitable for use in the present invention It is considered possible. use Suitable for Their use will not cause any interference in mass spectrometry. Means Other excipients useful in the present invention include pH adjustments such as ammonium acetate Agent. Others that can be suitably used in the methods and apparatus disclosed herein The excipients are It acts as a stabilizer for the integrity of the hydrolyzing agent. Excipient Then, Skilled technicians can find suitable ones using only ordinary experimental operations. I can do it. Some of the preferred excipients are listed above, Equivalent to them Finding out is within the skill of ordinary technicians.   In one currently preferred embodiment, Hydrolase is hydrolase It is an enzyme. Some hydrolases are endohydrolases, Others Is an exohydrolase. The particular hydrolase used depends on the nature of the polymer. And / or the type of sequence information desired. The decision is a skill It can be easily performed without the operator performing more than a normal experiment. For example , Currently preferred endohydrolases include endonucleases, D Ndopeptidase, Endoglycosidase, Trypsin, Chymotrypsin, En Doproteinase Lys-C, Endoproteinase Arg-C, And thermolysin etc. In Although, It is not limited to these. Exohydrite currently preferred Lolases include: Exonuclease, Exoglycosidase, And ex Such as sopeptidase, It is not limited to these. Currently preferred Exonucleases are said to be Phosphodiesterase type I And II, Exonuclease VII, λ-exonuclease, Exonuc T7 gene Lease, Exonuclease III, BAL-31, Exonuclease I, Exonuk Lease V, Exonuclease II, And DNA polymerase III, etc., Limited to these It is not specified.   Currently preferred exoglycosidases include: α-mannosidase I , α-mannosidase, β-hexosaminidase, β-galactosidase, α-fuco Sidase I, α-fucosidase II, α-galactosidase, α-neuraminidase, α-glucosidase I, And α-glucosidase II, Limited to these It is not something to be done. Exopeptidases that are currently preferred include , Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase A, Carboxypeptider Ze B, Carboxypeptidase P, Aminopeptidase I, LAP, Proline aminope Peptidase, Leucine aminopeptidase, And Cathepsin C , It is not limited to these.   In certain other embodiments, Hydrolyzing agents are agents other than enzymes. And For example, Such an agent may be a chemical such as an acid. Currently preferred except for enzymes Drugs that have been Cyanogen bromide, hydrochloric acid, Sulfuric acid, And pentafluoropro There are pionic acid fluorohydride etc. Not limited to these . In some embodiments, Hydrolysis is based on the method disclosed herein And partial acid hydrolysis. even here, Additives other than enzymes The determination of the hydrolyzing agent depends on the nature of the polymer and the type of sequence information desired. Can be The determination of suitable drugs and the determination of the preferred conditions for those drugs is a skill in the art. Within the ability of the person.   The method of the present invention further provides a method using a combination of the above individual hydrolyzing agents. Offer. For example, Combining the enzymes in the claims Can be used. Also use a combination of hydrolyzing agents other than enzymes Can be. further, Combinations of enzymes and non-enzyme agents may also be used in the method of the invention. Can be used. even here, Specific combinations and such combinations The appropriate conditions depend on the nature of the polymer and the desired sequence information. Become. In any case, a combination of hydrolyzing agents may be I know that it can be suitably used for the method.   Many examples of hydrolytic agent / polymer sequence specific reactions are well known in the art. Has become. For example, as described above, Currently preferred for proteins and DNA Polymers react with proteinases and nucleases, respectively. You. Some of the preferred proteinases include the C-terminal (Cal) of the amino acid sequence of the protein. Specific recognition of boxypeptidase Y) or N-terminus (aminopeptidase I) You. Some of the preferred nucleases are Up to 5 'of the polynucleotide base sequence Or specifically recognizes the 3 'end. Some nucleases are Single heavy chain polynucle Recognize leotides, Others include double-stranded polynucleotides, And even more Others recognize both.   The claimed invention is: protein, peptide, Nucleic acids, Natural biopolymers such as carbohydrates - And all synthetic biopolymers such as PNA and thiophosphorylated nucleic acids It can be applied to sequencing. The ladder is Exohydrolases, Endhi Enzymatically using drolases, Or the Sanger method and / or Deliberately produce by truncated synthesis chemical method or failed sequence method be able to. Using on-plate digestion, Carboxypeptidase Y, Cal Boxypeptidase P and aminopeptidase I For interpreting peptide ladders created from a large number of peptides It is preferable to use   Based on the present invention, Exohydrolases are "ladders" that define the sequence of polymers. To produce a series of hydrolyzed fragments containing So these drugs Create a series of hydrolyzed fragments, Each of these series of hydrolysis fragments Is the “ladder element” These collectively define the sequence of the polymer "ladder ". The ladder element is a hydrolysis fragment, Those or Monomers are continuous and / or progressive, One or other end of polymer end Dissociated by exohydrolase acting on Therefore, The ladder element is Truncated hydrolyzed polymer fragments, Also, the ladder itself is It is a collective concatenation of hydrolytic polymer fragments in the form. like this By the way For example, sequence information on the amino acid sequence of a protein Carboxy It is obtained by using carboxypeptidase Y, a terminal acting drug. Can be By using the disclosed method, a skilled technician can: Amino acid residue Group continuity, Creating a series of interrelated protein hydrolysates with iterative dissociation, Less than Reconstructing the primary sequence of a complete protein polymer as described in detail below it can.   Similarly, Except for exohydrolases that also act on one of the ends of the polymer The hydrolysis agent also Create a ladder element that collectively contains a series of ladders that define an array. Start. For example, Known Edman degradation techniques and related reagents are used for this purpose. It can be applied to use in the method of the invention. Therefore, the above subtraction type ( subtractive-type) sequencing method, Continuous amino from protein polymers Since repeated removal of the terminal residue occurs, Less than the enzymes disclosed herein It can be performed using an external hydrolyzing agent.   As aforementioned, Sequence information can also be used to break down inter-monomer bonds. It can also be obtained by using a decomposing agent. For example, endohydrase Finally Creates a series of hydrolyzed fragments useful for constructing a "map" of limers Can be That is, the drug forms a series of related hydrolytic fragments. broth, These are information that collectively contributes to a “map” that defines the sequence of the polymer. Become. For example, a peptide map Internal hydrolysis of trypsin with cyanogen bromide Linked with water splitting, Obtain hydrolyzed fragments with overlapping amino acid sequences By doing Can be produced. Those overlapping fragments will eventually be complete It is useful for reconstructing the entire amino acid sequence of a polymer. For example this The combination of hydrolyzing agents is Creates a series of several useful hydrolytic fragments Start. Because trypsin has a carboxy group of lysine or arginine monomer. Specifically catalyzes only the hydrolysis of peptide bonds produced by either , On the other hand, cyanogen bromide has a carbonyl group formed by methionine monomers. This is because only the peptide bond is cleaved. Therefore trypsin and cyanogen bromide water By using decomposition together Two different series of hydrolyzed "mappins" Can be obtained. Of these mapping fragments The series is then examined by mass spectrometry, Identification from the first hydrolysis by trypsin Second shea bromide with an amino acid sequence that is continuous and / or overlapping with the hydrolyzate of Identify specific hydrolysates from hydrolyzate hydrolysis. Overlap from the second hydrolysis Row is correct for hydrolyzed fragment produced by first trypsin hydrolysis Provides information about the sequence order. These peptide mappings The general principle of is known in the prior art, These principles are discussed in this document. As shown, the use to obtain sequence information by mass spectrometry is Was not known until.   For skilled technicians in the field, In some cases, use the above ladder scenario It is best to sequence On the other hand, if the mapping scenario is more suitable It is well known that there is a source. In some cases, the ladder method and the mapping of the present disclosure The combination of sequencing methods provides optimal sequence information. Routine experiment Just by using the technique, Skilled technicians can use ladder and / or mapping methods and Of a series of hydrolyzed polymer fragments in combination Thus, optimal sequence information can be obtained.   As devised by this method, The target polymer is a sample of the polymer Biological fluids that contain (or are thought to contain) As used herein Like Polymer samples also include isolated and purified polymers And further, The polymer sample may be aqueous or non-aqueous.   The addition of a sample of the polymer to the reaction surface What to do in various ways Can be. For example, Samples can also be introduced as individual aliquots, Alternatively, if the sample is to be eluted from a pretreatment or qualitative column It can also be introduced in a continuous manner. In both cases, Samples are manually operated Or it can be introduced by automated means.   Upon adding the polymer sample and the hydrolyzing agent to the reaction surface, Of the present invention The method uses different concentrations of hydrolyzing agent, Or different hydrolyzing agent / polymer ratios Provided is a method of forming the surface. For example, If the polymer sample is uniform Containing an amount of polymer If so, The method devises different amounts of drug to be placed on the reaction surface . This will result in different drug / polymer ratios. Different drugs The amount of Add a certain amount of polymer to the separated separation zone. Can also be. Or, The amount of different drugs can be varied from small to large form, Probably in the form of strips of appropriate length and width, You can also one Introducing equal length and width polymer strips containing a fixed amount of polymer Than, Different drug / polymer ratios are created. As invented in the present invention, Drugs and polymers in any form, It can also be present in any amount Wear. That is, The only requirement is that the drug and polymer combination have different ratios At the reaction surface. The different drug / polymer ratios also one Placing a fixed amount of drug on the reaction surface, Different amounts of polymer For example, polymer Gradient or separate separation zones for different amounts of polymer or polymer solution Those skilled in the art are well aware of what can be achieved by the more addition method. Po In case of rimmer gradient, Of the polymer eluted from the column in the form of a Gaussian gradient Shape is now preferred.   The method further comprises using the drug / polymer ratio Multiple series of water needed Also provides a method to incubate for the time required to obtain depolymerized fragments I do. Incubation is Suitable for hydrolyzing the polymer Time required to obtain the hydrolyzed fragment of Any article You can also proceed under the matter. Generally speaking, The method of disclosure is For example, Sequence information can be obtained in a relatively short time of less than one hour.   However, The incubation time depends on the polymer and / or May be shortened depending on the nature of the hydrolyzing agent, And can be longer. Suitable a How to find the incubation time, And how to optimize it for now It is self-evident to skilled field engineers. Incubation reaction is by evaporation Can be terminated.   As used herein, "Multiple" of hydrolyzed polymer fragments Series ” At least two different drugs / polymers with hydrolytic fragments Produced by ratio, And hydrolysis flag with 1 series of each drug / polymer ratio Means to create a statement. For example, A certain amount of polymer to a different amount of drug When added to two separate drug zones containing the drug, Each zone has one drug / port Represents the limmer ratio, Each zone also produces a series of hydrolyzed fragments Will be. Together, These two zones represent multiple series of water It will collectively contain depolymerized fragments. Disclosed herein And as an example, The method works on multiple series of hydrolyzed fragments. Perform mass spectrometry, The mass of the hydrolyzed polymer fragment contained therein It teaches a method of obtaining sequence information by obtaining a charge ratio. This one The method provides at least two different drug / polymer ratios, Analyze by mass spectrometry It is something that was devised.   The claimed invention may be practiced using any type of mass spectrometry known in the art. Can be Besides, To obtain mass / charge ratio data, matrix Support laser desorption ionization, Plasma Desorption I On, Electrospray ionization, Thermospray ionization, And First atom bombardment ionization, etc. But not limited to , Any type of ion formation can be applied. in addition, The present invention The mass spectrometry method used for Flight time type, Quadrupole type, Ion trap type , And sector analysis type, etc. Without limitation, Any method is suitable Can be used for Currently preferred mass spectrometer devices are: Improved time-of-flight equipment And This is a co-pending U.S. patent application Ser.No. 08/446, filed on the same date. Issue 544 ( As stated in the agent document number SYP-111) Of sample and extraction elements Independent control of potential difference is possible, Use this as a reference Invite to book. In some embodiments, Quality used to practice the invention The mass spectrometer Ion generation means, Ion acceleration means, Including ion detection means Things. Any ionization method can be used, For example, Disorpe , Negative ion first atom bombardment, Matrix support Laser desorption and electrospray ionization methods are used. Can be used. Use matrix-assisted laser desorption mass spectrometry Is preferred.   All of the methods of the present invention, as further described herein, Try to get sequence information Liquid chromatographic samples containing polymers or polymer fragments Eluting from the column. Such an implementation In the case of the embodiment, The sample eluted from the column determines the mass / charge ratio To make it compatible with the mass spectrometer by contacting it with an appropriate buffer prior to You.   The method of the present invention also provides for the inclusion of components useful for mass spectrometry. And For example, Mass spectrometry of the light-absorbing matrix by laser desorption It can be introduced at an appropriate time before sacrifice. Light absorbing matrices are especially For the analysis of copolymers And useful. Matrix-assisted laser desorption ionization technique, What Various matrices suitable for them are known in the art, And For example, US Patent 5, 288, No. 644 (issued February 22, 1994) and U.S. Patent Application 08/156, 316 (Attorney document number Vestec-14-2, April 18, 1995). these Is hereby incorporated by reference.   Other components useful in this method include: The mass of certain hydrolyzed fragments Includes those capable of selectively shifting. These also precede mass spectrometry It can be added at any time. Currently preferred mass shift As the components, Alkyl, Aryl, Alkenyl, Acyl, Thioacyl, Oxy Carbonyl, Carbamyl, Thiocarbamyl, Sulfonyl, Imino, Guanil, Ureido, And components that produce reaction products such as silyl, this It is not limited to them. Addition of these components to hydrolyzed polymers is well established It is performed using the added chemistry method. Specific components that are best suited for specific sequencing Po Depends on the nature of the rimer and hydrolyzed fragment. Even if it is a skilled technician If there are ingredients to use, Can decide which ingredients to use Will.   Other suitable groups of components suitable for use in the method include: Hydrolysis flag Can improve the ionization of the cement.   Such components can be introduced at any time prior to mass spectrometry. Currently preferred ionization improving components include: Limited to the following No, amino, Quaternary amino, Pyridino, Imidino, Guanidino, Oxoniu , And a component that produces a sulfonium reaction product. Preparation of such components And / or use Use is well known in the art.   In another perspective, The present invention relates to a mass spectrometer sample plate or Provide a sample holder. As used herein, "sample pre- The terms "port" and "sample holder" are used synonymously. The present invention The sample plate is Any method for obtaining sequence information based on the disclosed method It is useful for application to mass spectrometer devices. Of the currently preferred embodiment In one, This sample holder has a planar solid surface, On top of that A water splitting agent is placed. In another currently preferred embodiment, Sa The sample holder has the shape of a probe useful for a particular mass spectrometer device. Sun In all embodiments of the pull plate or holder, The drug is dehydrated, Fixed Chemical type, It can be in liquid and / or gel form. Drug or gel In the embodiment to be shaped, The drug is resistant to physical metastasis, And Chemically stable for at least one or two months, It is easy to transport and store It is assumed that These considerations, in particular, Commercial including the sample plate of the present invention This is useful for efficient use. further, The drug has different amounts of separated compartments , Or they can be arranged in a non-piecewise gradient. Or, Drug is sump An aliquot can also be placed on the surface of the plate. In another embodiment Is Sample plate with light absorbing matrix on its surface Have It can be used with or without a hydrolyzing agent.   In certain preferred embodiments of the present invention, Its ability to hydrolyze polymers Place at least a fixed amount of dehydrated drug on a planar solid surface of the sample plate I do. Ability to hydrolyze polymers as well A powerful at least a fixed amount of the immobilized drug can also be placed thereon. In yet another preferred embodiment, At least on the sample plate Place a dose of hydrolyzing agent in liquid or gel form. Liquid or gel form Are resistant to physical transitions.   The sample plate shall also have a microreactor on its surface You can also. In one embodiment, These containers can be chemically etched or Can be a depression on the plate surface made by a similar technique. Sump Le plate is metal, Foil, plastic, ceramic, And waxes, They can be made from a variety of substrates, including but not limited to. In one embodiment In addition, This sample plate is of a disposable type. Another embodiment In The sample plates disclosed herein can be used to analyze polymer It is one element of a useful kit for determining the sequence of a protein.   All of the sample plates or sample holders devised herein Regarding Array of segmented separation zones of different amounts of the drug on its surface May be included. Or, The surface is non-segmented type of the drug Slope, Alternatively, it may contain a certain amount of the drug.   in addition, All embodiments further include a light absorbing matrix, And / or my Black reaction vessel, And / or include disposable materials assembled it can.   In yet another perspective, The present invention relates to a sample plate containing a reaction surface. Or provide a kit with a holder, The surface is coated with the polymer Hydrolysis to hydrolyze The agents are provided in different amounts. In one embodiment, The kit is matrix Including a matrix suitable for laser-assisted laser desorption mass spectrometry Includes sample plate or holder.   The claimed invention also provides Other mass spectrometer devices and kits for performing the above method Related to An embodiment of the device of the present invention for obtaining sequence information about a polymer In one, Means for generating ions from the sample, Accelerate generated ions Means to do And a mass spectrometer having detection means. These basic Many forms of the element are available, Therefore, the present invention It is not limited to the type of mass spectrometer. This device is also used in mass spectrometers. Includes responding computers, This computer has a pair of polymer Means for determining the mass / charge ratio difference x between the Mass / electron between fragment pairs Means for determining the average difference μ of the load ratio, Where μ is the known mass / charge of one or more monomers The equivalent of a ratio, And whether μ is statistically different at the desired confidence level Means to analyze x to determine if And the desired number (possibly ) Means for determining that μs has been determined.   in addition, The information required for the claimed method is a computer readable disk Can be incorporated above, This disc will be used by the computer to perform the analysis. To make the data respond to the mass spectrometer. The software requested The process of acquiring and interpreting data Use software feedback control And automate in an intelligent way. Data interpretation software Amino acid assignment Data required to statistically differentiate multiple candidates for It controls the number (minimum 2). Operator fits assignment It will control the definition of the lowest statistical confidence level.   The practice of the present invention will be better understood from the following examples, These fruits The examples are provided for illustrative purposes only, Limit the invention in any way It goes without saying that it is not a thing. Example 1 Materials and Methods (A) Liquid phase digestion of ACTH 7-38 fragment   For time-dependent digestion, 0 in advance. 500P dried and solidified in a 5mL Eppendorf tube Molar synthetic human adrenocorticotropic hormone (ACTH) fragment (7-38 [FRWGKPVGKK RRPVKVYPNGAEDESAEAFPLE] (SEQ ID NO: 22): Sigma Chemical Co. (Se, Montana From Louisville), 33. 3 μL HPLC grade water (FJ, NJ) J. Lipsburg T. (Manufactured by Baker). Pre-dried 0. Five In a mL Eppendorf tube, place baker's yeast (E. C. 3. 416. From 1) Carboxypeptidase Y 3. 05 units (pH = 6. 75 units per minute at 25 ° C Knit is 1. Hydrolysis of 0 μmol N-CBZ-phe-ala to N-CBZ-phenylalanine + alanine Decompose) was resuspended in 610 μL of HPLC grade water. 20 μL ACTH 7-38 FLA The reaction was started by adding 10 μL of the CPY solution to the fragment solution. Final concentration is 10 pmol / μL ACTH and 1. 67x10^-3U / μL CPY with enzyme / substrate ratio of 1.67x10^-8U CPY / Mole ACT H (assuming a CPY molecular weight of 61,000, the molar ratio was 1:37). 1μ from reaction vessel L aliquots for 15 seconds, 60 seconds, 75 seconds, 105 seconds, 2 minutes, 135 seconds, 4 minutes, 5 minutes, 6 minutes, 7 Sampled at minutes, 8, 9, 10, 15, and 25 minutes. 25 minutes At this point, 15 μL of 5x10^-3U / μL CPY was added to the reaction vessel. 1 hour total reaction time A 2 μL aliquot was removed at 24 hours. Reaction temperature rises to 37 ° C Allowed to proceed at room temperature for up to 2 minutes. All aliquots obtained from Sigma, 9μ L MALDI matrix, α-cyano-4-hydroxycinnamonic acid (CHCA), 1: 1 Acetonitrile (ACN): added at a concentration of 5 mg / mL in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) . However, 1 hour and 24 hour aliquots were added to 8 μL of matrix. Matric The final total peptide concentration of the ACTH digested aliquot in the solution was 1 pmol / μL. Mix 2 μL aliquots of 15 sec, 105 sec, 6 min and 25 min to dissolve the assembled peptide A liquid was prepared. Add 1 aliquot of each aliquot to each μL well on the MALDI sample plate. μL was dispensed and evaporated to dryness before insertion into the mass spectrometer. (B) On-plate digestion:   All on-plate digestions pipet 0.5 μL of peptide at 1 pmol / μL concentration. To launch a perceptive biosystem in Framingham, Mass. Manufactured and supplied by Muzu, under the trademark Voyager^TMCan be used with mass spectrometers known as Sample plate with the same shape as the one made as above I did it. All peptides listed in Table 1 were purchased from Sigma Yes, of the highest purity. 0.0122 U / μ to start the reaction in the first well 0.5 μL of L CPY was added. 6.10x10 each for CPY in the following 9 holes^-3, 3.05x10^{- Three} , 1.53x10^-3, 6.10x10^-Four, 3.05x10^-Four, 1.53x10^-Four, 7.63x10^-Five, 3.81x10^-FiveAnd And 0 U / μL. Move 1 μL reaction vessel back and forth with pipette tip in each hole To ensure mixing. The reaction was performed on a plate Proceed at room temperature until evaporation (about 10 minutes). At that time, 1: 1 ACN: 0.1% T in each hole Add 1 μL of 5 mg / mL CHCA in FA without stirring and allow about 10 minutes prior to mass spectrometry Evaporated. (C) MALDI-T0F mass spectrometry:   Voyager^TMBiospectrometry^TMWorkstation (Massachusetts MALDI using Perceptive Biosystems, Inc., Cambridge, UK) TOF mass spectrometry was performed. Positively charged 1.2m straight flight tube for mass spectrometry A 28.125 KV voltage gradient was applied between the sample plate and the The sample was subjected to an ion source containing an optical acceleration plate. ACTH 7-38 fragment and gluka Use a low-mass gate to capture matrix digestion data. The ON did not collide with the detection plate. To apply a low mass gate, Give a short pulse to the guidewire to deflect low mass ions (approximately <1000 daltons) I let you. All other spectra were recorded with the low mass gate turned off. signal To improve the noise / noise ratio, a 64-128 single chip from a nitrogen laser (337 nm) was used. The boats were averaged and applied to each mass spectrum. The data presented here is 11 Points were smoothed using a Savitsky-Golay secondary filter. All de Data is bradykinin (MH⁺= 1061.2) and oxidized insulin B chain (MH⁺= 3496.9) 5 mg / mL CHCA matrix for external calibration standard mixture (both purchased from Sigma) And used at a concentration of 1 pmol / μL in the solution. (D) Statistical mass assignment:   As described in detail below, the statistical protocols disclosed herein We used a two-tailed t-test formula: And s is the standard deviation of the experiment. Assign residues to experimentally derived Δ mass T for each determined average mass (each possible amino acid assignment) The calculated value was compared with the t-table value at a predetermined confidence interval. t Calculated value> t Table value is the specified reliable water In the standard, the experimental mass comes from a population with an average value different from the determined mass It is shown that. Example 2 Sequencing of Biopolymers (A) Liquid phase arrangement:   FIG. 2 shows 1, 5 and 25 minutes of liquid phase time-dependent CPY digestion of ACTH7-38 fragment. Figure 3 shows a MALDI spectrum of an aliquot taken at time points. Number of peak label Indicates a peptide group obtained from disappearance of the indicated amino acid. 19 from the C-terminus The disappearance of the amino acid peak is observed. The * symbol indicates a doubly charged ion, The # symbol indicates an unidentified peak at m / z = 2001.0 and 2744.4 daltons.   Lack of phase control in enzymatic digestion creates peptide ladder Was observed in this figure. One minute after digestion (Figure 2A), complete ACTH 7-38 fragment 9 including peptides showing disappearance of the first 8 amino acids from the C-terminus and the C-terminus Of detectable peptides. An aliquot at 5 minutes (Figure 2B) was from Ala (32) and And Ser (31) disappearance became more dominant than aliquots at 1 minute Are shown. At the time of this digestion, Ala (32) The disappearance of 11 amino acid residues up to (22) is seen. FIG. 2C shows the four major peptides Lys (21) and Val (20) finally detected as a group are shown. Enzyme concentration Increased by a factor of 2 at 25 minutes, but no further digestion was observed up to 24 hours . Digestion proceeds to Val (20), stopping at the amino acid run of peptide-KKRRP Was. CPY is prone to proline (eg Pro (24)), the basic residue arginine. It is assumed that the vehicle moves quickly, but in this case the penultimate position is It is considered that the conditions have been met.   The lack of phase control and the change in hydrolysis rate overlap, making it particularly useful for enzymatic sequencing. A problem arises. The change in the ionic strength of the peak in Fig. 2 is mainly due to hydrolysis. This is due to the difference in amino acids between the C-terminus and the position immediately before it. is there. If a residue is hydrolyzed at a slower rate than its neighbors, its concentration and Thus, the signals of the peptides representing the loss of that residue are compared to those of the preceding amino acid. Smaller. This can be seen in the mass spectrum shown in FIG. Ala (34) Seems to be gradual, with a large signal indicating the disappearance of Phe (35). The hydrolysis of glycine and valine also appears to be slow, with Ala (27) and Tyr (23) The disappearance peaks are relatively strong compared to those of Gly (26) and Val (22), respectively. .   The prior art time-dependent method presented here has been extensively optimized. , So that the maximum sequence information can be obtained in the shortest time. This especially optimized In all cases, a detectable amount of all components was reduced to three selection times in 25 minutes. Was recognized by the team. Many preliminary steps were taken in the process leading to the selection of these optimization conditions. This was not the case in a liquid-phase digestion. Glu (28) for high concentrations of CPY And peaks representing the disappearance of Pro (24) were often not observed, CPY polarizes these residues when lanine and tyrosine are immediately before the end, respectively. It is easy to cut. At low concentrations of CPY, all amino acids are present. However, in this case, a long period of time, for example, Often needed. Finally, in the case disclosed here, the enzyme / substrate ratio As 1.67x10⁸U CPY / peptide mole provides enough sequence information after 25 minutes of digestion It was found out that   Instead, aliquots at 15, 105, 6 and 25 minutes of the total reaction time Collected, MALDI analysis shows the disappearance of almost all amino acids from the C-terminus This indicates that a peptide ladder including a peak is formed (FIG. 3). Gl All amino acids were deleted except u (28), Asn (25), and Pro (24). However, three that were not observed remained as small peaks in the aliquot at 6 minutes. However, this aggregate fraction was diluted to an undetectable concentration.   Sequence as a group of peptides representing the disappearance of Glu (28), Asn (25), and Pro (24) The presence of a gap is observed at a signal / noise ratio of 3 or less. These components A small peak was observed in the mass spectrum of the aliquot at 6 minutes; The concentration was so low that it could not be detected by 4-fold dilution with recoat. This means that each Emphasizes the need to record individual mass spectra of time-point aliquots. is there. From the time of recording a single spectrum representing the collected aliquot No method simply creates a sequence gap, but also a time-dependent course of digestion Will be lost.   As mentioned above, liquid phase digestion has many disadvantages. Possible To obtain significant digestion in a short time while preserving all sequence information, Large amounts of enzymes and peptides are required. A page that attempts to derive sequence information For each of the peptides, a time-consuming method must be developed. Why The optimal set of conditions for a single peptide is the composition-dependent hydrolysis rate of CPY. Considering this, it cannot be useful for another peptide. An alternative strategy is The digestion is performed on the MALDI sample surface as described below. (B) On-plate sequencing:   Figure 1 shows a 1x10 grid of 1μL holes on a stainless steel substrate. Voyager for MALDI analysis^TM2 shows the sample plate of FIG. These holes A microreaction vessel in which on-plate digestion is performed is provided. Plate shape The dimensions are 57x57mm and the holes are 2.54mm in diameter.   1/2 μL of the enzyme and the substrate were put in a well and mixed with a pipette tip. Digestion is about 1 Continued for 0 minutes until the reaction was stopped by solvent evaporation. At this point, 1 μL of mat The digestion mixture was resuspended by placing ricks into the wells. CHCA Matri Is dissolved in 1: 1 ACN: 0.1TFA, so that hydrophilicity from the digestion mixture and Hydrophobic peptides must be resuspended at low pH while suppressing further CPY activity No. The crystalline state of the matrix (compared to the time method experiment) It does not appear to have changed due to digestion. This on-plate strategy Is because multiple concentration-dependent (time-dependent) digestions can be performed in parallel, The time to optimize the method has been significantly reduced. Also, transfer from the reaction vessel to the analysis plate Sample transfer Loss due to dynamics is reduced by using the on-plate method for all digested materials. Can be used for mass measurement and was avoided.   Panels a and b in FIG. 4 each have a CPY concentration of 6.10 × 10^-FourAnd 1.53x10^-3U / μL MALDI spec for on-plate concentration-dependent digestion of the ACTH 7-38 fragment Tor is shown. Panels A and B are 6.10 × 10^-FourAnd 1.53x10^-3U 2 shows a spectrum obtained by digestion using CPY at a concentration of / μl. Peak resolution To improve the signal / noise ratio of small peaks in the spectrum at the expense of A laser power significantly higher than the value was used. * Symbol indicates doubly charged ion The symbol # indicates an unidentified peak at m / z = 2517.6 Dalton.   The low digestion yielded 12 prominent peaks representing the loss of 11 amino acids from the C-terminus. Was done. In the high-concentration CPY digestion, peptides present in the low-concentration digestion and Val ( 20) shows some overlap with the peptides that represent the loss of amino acids up to 20) Was. The concentration of the peptide, which represents the disappearance of the first few amino acids, shows the Leu (37) peak Except reduced to below detection level (about <10 fmol). Combining the information in both figures The sequence of the ACTH 7-38 fragment has 19 gaps from the C-terminus without gaps. Amino acids can be read and the same amino acids of peptide-RRKKP Stopped by no acid run. Figure 4 shows two of the nine CPY concentrations performed simultaneously. Show. In this case, method optimization was strategically essential. This on-p Method development (optimal digestion condition selection), digestion, data collection when rate method is adopted And the total time of data analysis was less than 30 minutes. Consumption of both peptides and enzymes Extremely low, 9 digestion holes and 5 holes per row containing 10 holes of peptide and water for a total of 5 pmol Of the peptide were consumed. Ma In all experiments, only 1.97 pmoles of CPY (assuming 100 U / mg and molecular weight = 61,000) Was just needed.Note: 1: Calculated value 2. Value at pH 6.5 3. No sequence information was obtained.   Table 1 lists digests and analyzes using this new on-plate strategy. Peptides. These peptides have amino acid composition and size (molecular weight = 3659. 15), and were chosen to represent peptides of different charge and polarity. Bold An amino acid has lost its residue in one or more MALDI spectra obtained from a single digestion. The indicated peaks indicate what was observed. To enable residue identification, There must be a peak representing the disappearance of that amino acid and the amino acid immediately preceding it. No. Residues in parentheses are those for which no sequence order was derived. as a whole CPY provides some sequence information from the C-terminus for most of the digested peptides. Provided, only 3 of 22 cases lacked sequence information . In two of these three cases, the C-terminus was a lysine and the immediately preceding position was an acidic residue. Was. CPY has been reported to decrease in activity as it approaches the C-terminal basic residue. However, the presence of adjacent acidic residues appears to further reduce activity. Progesterone In the case of releasing hormone (LH-RH), the position immediately before is the C-terminal of amidated glycine of proline The end inhibited CPY activity, which was inhibited by both proline and glycine residues. (Hayashi et al. (1975) J. Biochem. 77: 69-79; Hayashi [H. ayashi], R. (1976) Methods Enzymol. 45: 568-587). CPY is It is known to hydrolyze the amidated C-terminal residue of dipeptides. But cut off fisaraemin, casinin, substance P, bomesin, and α-MSH It is shown that it was turned off.   As can be seen from the data in Table 1, CPY, except for LH-RH, had a blocked N-terminal residue. Sequence information could be derived from all the peptides with a group (Fisarae Min, bombesin and α-MSH). This These peptides are important because no information can be obtained by the Edman method. is there. For many peptides, detection of truncated peptide peaks is based on CHCA matrix ions. (<600 daltons) to the extent inhibited by the presence of. That In the sequence of other peptides, the combination of residues at the C-terminus and immediately preceding position is CPY active Did not go to the point where it was suppressed. Bombesin, Angi as discussed earlier Ogenin and glucagon are more rapidly hydrolyzed by slowly cleaved residues. Following the remaining residues resulted in gaps in the sequence.   The feasibility of an on-plate CPY digestion / MALDI detection strategy is the overall extreme of the peptide It appears to be independent of gender and charge.   Figure 5 shows 3.05x10^-3, 3.05x10^-Four, And 6.10x10^-FourU / μl CPY concentration Osteocalcin 7-19 fragment obtained by on-plate digestion used Shows the results of on-plate digestion of angiotensin 1 and bradykinin. Record No. Na indicates the peak of the sodium adduct, and # indicates the matrix at m / z = 568.5 dalton. The peaks are shown.   Each spectrum represents the result of one of the nine digestions performed in one row of wells. male In the case of the theeocalcin 7-19 fragment, CPY proceeds to proline (Martin [Ma rtin], B. (1977) Carlsburg Res. Commun. 42: 99-102; Breddam et al. (1987) Carsburg Res. Commun. 52: 55-63; Breddam, K.M. (1986 ) Carsburg Res. Commun. 51: 83-128; Hayashi, R .; (1977) Methods En zymol. 74: 84-94; Hayashi et al. (1973) J. Med. Biolog. Chem. 248: 2296-23 02), the presence of Asp and His at the penultimate position of each of the two peptides CPY activity was suppressed.   Bradykinin is used until the matrix begins to interfere with peak detection. Things were arranged. Nine hole digests for all three selected peptides Shows the entire sequence information obtained in a single digest of the display. Many other pep This is not the case for Pide. The whole sequence information is ACTH shown in FIG. Many were derived from more than one hole, as was the case with the 7-38 fragment. Example 3 Statistical analysis of ladder sequencing by MALDI (A) General principle of statistical analysis based on the present invention   As previously disclosed, after the truncated ladder has been formed, the matrix is added to the hole and Multiple measurements are taken from these holes, with peaks representing the loss of amino acids. There is a click. Use a t-test for statistical interpretation and assign Do. The following equation applies to a two-sided test for one experimental mean.   Where x is the experimental average mass difference, μ is the definite mass difference, n is the number of duplicate samples performed, And s is the experimental standard deviation of the mean. All measured masses (1 residue, 2 residues, 3 residues Group, etc., and the mass of the modified residue) as the definitive mass μ. A test is made and this is then compared with the values in the t-distribution table at certain confidence intervals. Definite mass and All masses that are not statistically different, that is, t-calculated <t-table, are Assigned to that residue. This information is used to check the hypothetical composition, and Can be used to search a database of sequences. Database inspection When searching, these confidence levels are used to help you get a quality “hit”. As a tool, It can be used for search algorithms.   In addition, data is interpreted using software feedback control. We used an automated process to capture and interpret data. Data interpretation software Is required to statistically differentiate multiple candidates for amino acid assignment It controls the number of acquired data (minimum 2). Operator assigned Controls the minimum statistical confidence level that conforms to (B) Analysis of experimentally obtained mass / charge ratio data: peptides   The use of MALDI for truncated ladder analysis is disclosed herein. This is crucial for obtaining accurate sequence data. Prior art smell In some cases, this technique is exclusively used to sequence peptides with a defined sequence. In that case, the accuracy of the mass measurement is not so important. In contrast, here Is useful for sequencing peptides of unknown sequence. Technology Traditionally, MALDI derived masses of known molecules and only a few mass measurements Generally expresses the accuracy of mass measurement by an instrument by comparing values. (For example, better than 0.1%), but this mass accuracy is It is not statistically valid to fit individual mass measurements for the purpose of estimation. Accordingly And direct application to true residue assignments and unknowns has been difficult And it was experimental. Determining amino acid sequence with ladder sequencing / MALDI strategy To do so, we impose a statistical confidence level on residue assignment as disclosed herein. There must be.   To impose a confidence level on residue assignments, first characterize the experimental error. Must. The error is random (random). In the stem, simple t-statistics can be used for amino acid assignment .   To assess the nature of the errors governing MALDI analysis of the truncated peptide ladder described above For reference, 15 ants removed from the time-dependent digestion of the ACTH 7-38 fragment described above All amino acid assignments made on the coat (one spectrum for each aliquot) Mass difference (ie, experimental mass difference-actual amino acid mass) , And a Gaussian distribution with an average of 0.0089 ± 0.605 (n = 107). T calculated value in this experiment (0.152) <t table value (1.99) is the null hypothesis that mean Δ mass difference = 0 is 95% confidence level Indicates that it cannot be rejected. This means that the errors are random and statistically significant. This indicates that there is no significant system error. This is incorrect for two-point mass measurements The system exists in the mass assignment of individual peptide peaks, such as As with errors on the stem, cancel when calculating the mass difference between two adjacent peaks It is thought that it is done. Two adjacent peaks caused by partial isotope decomposition Error factors in the system that do not cancel, such as inaccurate calculation of one center of mass of Is possible. This is due to the fact that all peaks are actually By detecting at an average mass value ofNote: * 1 The indicated mass is an average value and the unit is Dalton.     * 2 Uncertainties of experimental mass measurements are given as standard deviations. (The parentheses are flat. 95% confidence interval of the mean)   Table 2 shows the actual average mass of the sequenced residues of the ACTH 7-38 fragment, as well as the time The experimental mass difference, its standard deviation, and 95% confidence interval calculated for It is a comparison. Number of copies is detectable as required for differential mass determination of a particular residue Shows the number of spectra that had adjacent peaks. Considerable to determine the average The need for a number of measurements is evident from this table, which is a 95% confidence level. Because it decreases by the square root of. For every residue in the sequence Thus, the actual mass was within ± 3σ of the experimental mass distribution. Calculation of each case t Values are below the t-table with 95% confidence intervals, which means that the experimental mass is Means that it was not so different. Statistically assigned to residues In order to calculate the t value for each possible amino acid, No.   In other words, the actual mass of all possible amino acids is taken to be the definite mean μ For each possible quota. 0) must be applied.   Assuming that only the 20 common unmodified amino acids are possible, An interdependent ACTH 7-38 fragment digest was performed. A summary of the results is shown in Table 3. Have been. For bold numbers, the experimental average does not differ significantly from the confirmed amino acid average It is a thing. Again, it is clear that sufficient population sampling is needed. You. Since only two measurements were observed for Glu (28), a 95% confidence The interval was 4.22 daltons (Table 2). This separates Gln, Lys, Glu and Met. It is impossible to do that (Table 3). From 12 patients with Glu (30), 9 The 5% confidence interval is 0.39 daltons, which gives Gln, Lys and Met statistically No amino acid assignment will be possible.   Table 3 shows the ACTH 7-38 flag given a definitive average of 20 normal unmodified amino acids Calculated t-values relative to the experimental average of the 19 sequence amino acids of the ment. tTable values are Are shown at the end of these columns. t calculated value <t table value, the experimental mean is 95% confidence interval This indicates that the average value of the definite amino acids is not significantly different. Corresponds to this case The respective calculated values of t are shown in bold.Note: For the 0.025 region on one side of the t distribution corresponding to the appropriate degree of freedom v, here v = n-1. T table value.   Table 4 shows the C-terminus of the ACTH 7-38 fragment using the prior art time-dependent strategy. Summarizes the results of statistical amino acid assignments for 19 amino acids sequenced from Things. The amino acid masses listed are experimentally derived at this confidence level. There is no statistical difference with the obtained mass difference. Amino acids shown in bold are at that position Known residues that are present. The confidence intervals shown are for all but the indicated This is the highest level where the amino acid mass is statistically different from the experimental mean.Note: Only the 20 normal unmodified amino acids are assumed as possible candidates.   For example, the Gln and Lys categories in the amino acid assignment of residue 21 are Values (128.15 Dalton) are just Gln (128.13 Dalton) and Lys (128.17 Dalton) Tonnes) was not possible due to the two-minute definitive average. The same phenomenon is the assignment of residue 37 Also happened. The experimental mean (113.63 daltons) is the confirmed mean of Leu (Ile) (113.16 daltons) and the determined mean value of Asn (114.10 daltons) were bisected. 28 The assignment of amino acids at positions 38 and 38 is due to the low number of copies (2 and 3 respectively) Was difficult. Residue 28 is Gln / Lys / Glu / Met with a confidence interval between 95% and 98%. Assigned. Table 3 shows the definitive amino acids with the lowest t-calculated values for this residue. Mass indicates methionine. Using a confidence interval of 80%, It is considered that the correct assignment of Glu cannot be made statistically. Similarly assignment of residue 38 Gln / Lys / Glu at 95% confidence level, but the correct assignment (Glu) is again 80 At the% level, it cannot be done statistically.   Because the errors are randomly distributed, it is important to sample enough population Thus, all amino acids (except Leu and Ile) can be distinguished. By approximating the standard deviation of the experiment to s = 0.604 above for all experiments, Gln and Ly To distinguish s (Δ mass = 0.04 Dalton) with 95% confidence interval, the measured value (t Table value = 1.960) is required. This number is not feasible experimentally, This can be significantly reduced by reducing the standard deviation of the experimental means. You. Reducing the standard deviation of the experiment is needed to separate the two amino acids Value is proportional to the square root of the experimental standard deviation of the mass difference. Having. Mass shift to move peptide populations out of the interference matrix Reagent Experiments with peptides that appear in the low mass region (<600 daltons) It is considered a chemical measure that could improve the error. Reflectron and / or Or the use of an expanded flight tube shape is also an instrumental method suitable for reducing errors. It is considered a law.   Prototype statistical assignment of residues using the on-plate strategy disclosed herein Koll will take multiple samples from each well to perform digestion. Need The number of copies made depends on the type of amino acids that will be sequenced at one CPY concentration. Is different. For example, statistically not possible except for one quota In order to be effective, 113-115 daltons (Ile / Leu, Asn and Asp) and 128-12 For the mass difference per 9 daltons (Gln / Lys / Glu), 163 (Tyr) or 57 (Gly) More copies are required than in the case of a mass difference per unit. This method (1 The experimental error of multiple replicates per sample is the time-dependent digestion (one per sample). Seems to be just as random).   This general statistical protocol for residue assignment Applied to two adjacent peaks representing disappearance. In this case, to calculate the t value Determined average values for all dipeptides, tripeptides, etc. can be used. Information about the order of the residues is lost, but the composition can be derived. Only one The amino acid and dipeptide masses of the Phe-Arg Performed on gap angiogenin (Table 1). Arg (15) and Phe (13) The average experimental mass difference between the peaks representing disappearance was 303.45 ± 0.328 (n = 5). Phe / For all single amino acid and dipeptide masses except Arg, 99.8% confidence The calculated t value was larger than the t table value in the long interval. In this particular case, The Included amino acids were identified, but their order was not experimentally determined . This statistical strategy also supports interactive data analysis and ladder sequencing / MALDI experiments. Incorporated into computer algorithms for interpretation.   Thus, using CPY digestion in combination with MALDI detection, as described above, As disclosed herein, it was effective in obtaining C-terminal sequence information. ACTH 7-38 flag In this case, sequence information of 19 amino acids was obtained without gap from the C-terminus. this The on-plate concentration-dependent approach recycles time and reagent consuming deployment methods. This indicates that the method is useful as a method for performing a plurality of digestions in parallel.   This on-plate strategy requires less physical manipulation and the total amount of enzymes and peptides Requires less. Three trials with 22 peptides using the on-plate method All succeeded in obtaining some C-terminal sequence information except for. CPY is also Cleaves the imidized C-terminal residue, but removes the specific residue at and just before the C-terminus. No activity was shown for the combination of groups.   In summary, “on plate” C and N-terminal peptide ladder sequencing One integrated strategy for generating residue assignments from experiments was developed. this The strategy is based on a logical combination of the following tasks:   1) Voyager^TMUse μL hole of sample plate as micro reaction vessel Create a peptide ladder from a concentration-dependent exopeptidase digestion strategy,   2) Voyager as a tool to determine the mass of peptide fragments^TM MALD Using an I-TOF workstation,   3) Determined assignment by interpretation algorithm based on t-statistics Eliminate candidates, and   4) Make a full statistical-based allocation or go to cost-effective Data acquisition software from the interpretation algorithm that controls the number of copies acquired to guide Software feedback control. (C) Analysis of experimentally obtained mass / charge ratio data: nucleic acids   The methods disclosed herein also provide sequence information for nucleic acid polymers containing 40 bases. Used to Hydrolysis using an exonuclease with specificity at the 3 'end , Different concentrations of Phos I (phosphodidie) ranging from 0.002 μU / μL to 0.05 μU / μL. This was carried out using sterase I). The hydrolysis was allowed to proceed for 3 minutes. MALDI-T0F The spectra of the hydrolysis sequences used are shown in FIGS. 6A-6E. Disclosed herein Due to the data integration, CGC TCT CCC TTA TGC GAC TCC TGC ATT AG G AAG CAG CCC A (SEQ ID NO: 23).   In another experiment, the addition of the light absorbing matrix CHCA was evaluated. Including 40 bases A nucleic acid polymer (as described above) and a exonucleic acid having specificity at the 5 'end The mixture was mixed with 0.4 μU / μL of the reductase Phos II (phosphodiesterase II). Matri The hydrolysis in the presence of ox was allowed to proceed for 10 minutes. That obtained by MALDI-TOF FIG. 7 shows the spectrum. These data are based on polymers, hydrolyzing agents and This confirms the efficacy of mixing the tricks prior to mass spectral analysis. this Mixing reduces handling of reagents and facilitates sample processing. Figure 7 and Using similar data, it is added that the sequence of the nucleic acid polymer is as described above. It has been certified. Example 4 Other Uses of the Invention   As disclosed herein, this strategy involves the use of proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, , And their modifications, natural biopolymers, as well as PNA and thiophosphate The present invention can be applied to all sequences of synthetic biopolymers such as nucleic acid. Lada Is enzymatically using exohydrolases and endohydrolases, or By Sanger method and / or chemical method by truncation synthesis or failure sequence Can be produced.   To extend the utility of the CPY / MALDI ladder sequencing method disclosed herein, It is thought that other methods can be adopted.   For example, residues that suppress CPY activity by utilizing different enzyme specificities Disclosed as a means for arranging combinations of The use of carboxypeptidase mixtures using a modified on-plate strategy Can be Also, small peptides may have N-terminal and / or C-terminal linkers. Covalent attachment ensures that all sequence peaks are outside the low mass matrix area It is possible to make it appear. Mix MALDI with the above carboxypeptidase Combine compounds with mass-shift reagent corrections to eliminate peptides without gaps. It is also possible that the N-terminus of the tide can be completely sequenced.                                   Equal   Without departing from the spirit or essential characteristics of the invention, Could be implemented in form. Therefore, the above embodiment is Limit the invention disclosed herein It is not a thing but an explanation. Therefore, the scope of the present invention is as described above. It is to be indicated not by way of explanation but by the appended claims. All changes that come within the meaning and range of equivalency are deemed to be within the scope of the present invention. I do.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年７月３日（１９９７．７．３） 【補正内容】 その結果、C末端は信頼性の高い方法がないためにしばしば分析できない領域 として残っている。 ペプチドおよびオリゴヌクレオチド類の場合はともに、化学配列決定に代わる 方法は酵素開裂配列決定法である。オリゴヌクレオチド類の場合、150以上の異 なる酵素が単離されており、これらはオリゴヌクレオチド・フラグメントの調製 に好適とされている。ペプチド類の場合は、セリンカルボキシペプチダーゼ類が 蛋白質またはペプチドのC末端からアミノ酸を残基ごとに順番に開裂させる簡単 な方法を提供するものとして過去20年以上にわたり多用されている。カルボキシ ペプチダーゼY（CPY）は特に、プロリンを含めすベての残基をC末端から非特異 的に開裂するということから魅力的な酵素である（たとえば、ブレダム[Breddam ]ら、（1987）Carsburg Res．Commun．52:55-63参照）。 カルボキシペプチダーゼ消化によるペプチド類の配列決定は伝統的に、解離さ れたアミノ酸を残基ごとに手間のかかる直接分析することにより行われてきた。 この方法は手間がかかるだけでなく、酵素および蛋白質/ペプチド溶液中のアミ ノ酸夾雑物や酵素の自己分解によって複雑なものとなる。この種の配列決定作業 すべてにおけるさらなる障害は、使用する特定の酵素による個々の残基の加水分 解および解離に関する良好な動力学的情報が絶対的に必要とされる点である。 米国特許第5,382,513号は、ペプチドのライブラリをスクリーニングする方法 ならびに、受容体分子をペプチドライブラリに導入することによりペプチド・リ ガンドを配列決定し、受容体分子に結合するペプチドを有する個相支持体を同定 し、少なくとも１つの同定支持体を単離し、同支持体に付着したペプチド種を配 列する方法を 開示している。 フィールド・ディソープション法（ホン[Hong]ら（1983）、Biomed．Mass Spe ctrom．10:450-457）、エレクトロ・スプレー法（スミス[Smith]ら（1993）4 Te chniques Protein Chem．463-470）、およびサーモ・スプレー法（スタチョイア ック[Stachowiak]ら（1988）、J．Am．Chem．Soc.110:1758-1765）など、高質量 物質の分析が可能な質量スペクトル分析技術の進歩によって、CPY消化で得られ るペプチド・フラグメントなどで配列順序が保存されている大きなバイオポリマ ー類の直接質量分析を行なうことが可能となり、解離されたアミノ酸を残基ごと にアミノ酸分析をする必要性が回避されることとなった。この“ラダー（段階的 ）”配列決定方式では、隣接するペプチドピーク間の質量差を計算することによ り、配列を正しい順序で導き出すことができる一つまり、測定された差は特定の アミノ酸残基の消失を表すものである。 さらに最近では、飛行時間型のマトリックス支援レーザー・ディソープション ・イオン化（MALDI-TOF:Matrix-Assisted Laser Desorption ionization Time-O f-Flight）質量スペクトル分析もまた、高い感度、分解能、および質量精度を有 するとして、ラダー配列分析に好適であることが示されている。 クールトン[Coulton]はNIMPR、218（1983）276-286において、高質量分子およ びクラスターイオンを発生させるためのマトリックス補助法を含め二次イオン質 量スペクトロスコピーの使用法を議論している。 チャイト[Chait]ら（（1993）262 Science 89-92）はこうしたMALDI-TOFの長 所を、エドマン分解法による化学消化の各ステップの部分的遮断により形成され るN末端ラダーのラダー配列決定に活 用している。この方式もなお、プロセスの複雑さ、時間のかかるプロセスの性質 、ならびにC末端情報の欠如といった従来のエドマン化学と同じ限界を抱えてい る。しかしながら、この方法はペプチドラダー・シナリオを使用したペプチドの 配列決定に対するMALDI-TOFの有用性を認めるものである。 レプストーフ[Roepstorff]は、TAC12巻、10号（1993）413-421において、蛋白 質を特性付けするためのMALDIを含め、各種の質量スペクトル分析技法を議論し ている。ソヴィエト特許第A-5 382513号はグラム陰性バクテリアおよびエンドト キシン類の存在を検出するための質量分析計の使用について開示している。 他の研究者達もまた、得られた切形ペプチド混合物を分析するためにペプチド のカルボキシペプチダーゼ消化をMALDI-TOFと組み合わすことができることを示 している。たとえば、ヒト甲状腺ホルモンの1-34フラグメントのC末端から８つ の連続したアミノ酸が配列されている（シャー[Schar]ら（1991）、Chimia 45:1 23-126）。 さらに、ペプチドのカルボキシペプチダーゼ消化はプラズマ・ディソープショ ン法などその他の質量分析法とも組み合わされている（ワン[Wang]ら(1992)Tech niques Protein Chemistry III（アンゲレッティ[Angeletti]編、Academic Pres s、N.Y.刊）503-515頁）。米国特許第5,288,644号はMALDI質量分析法を用いてゲ ノムの配列決定を行なう方法を開示している。 しかしながら上述の配列方法はすべて、単調かつ時間のかかる予備的な最適化 ステップを必要とする。さらに、そうした予備的最適化ステップは試薬ならびに 通常限られた量しか得られないポリマーのサンプルを不必要に消費してしまう。 そのうえ、上述の配列方法は終局的には数が限られた単一の質量分析スペクトル および単一の 質量/電荷比データに頼ることになり、これは最終的なポリマー配列を決定する ためには統計的に不十分な根拠を与えるものにしかならない。 ラホースト[Raaphorst]らは、International Journal of Mass Spectroscopy and Ion Physics、31巻（1979）65-69において、サーマル・イオン化質量分析計 から得られたデータの評価のための統計的方法の使用について議論している。 本発明の目的の1つは、質量分析およびポリマーの時間非依存性/濃度依存性の 加水分解を利用して、ポリマー類、特にバイオポリマー類の配列を行なうための 方法および装置を提供することにある。 さらに詳細には、複数の並列質量スペクトルから得られる質量/電荷比を総合 することをベースとするデータ解釈戦略を組み入れた配列情報を得るための方法 を提供するのが本発明の1つの目的である。本発明の別の目的は、先行技術の方 法で必要とされる時間のかかる最適化および方法強化を回避して、配列情報を得 るための迅速な方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、感度の高 い質量分析と、加水分解を質量スペクトル分析と緊密に統合することによるサン プル損失の排除を組み合わせて、少ないポリマー総量を使用して配列情報を提供 することにある。 請求の範囲 1．a)1以上のモノマーが異なるポリマー・フラグメントのセットを供するステ ップと、 b)少なくとも一対のフラグメント間の質量/電荷比の差xを測定するステッ プと、 c)ステップbで測定されたフラグメント対の質量/電荷比間の平均差μ、た だしμは1以上の異なるモノマーの既知の質量/電荷比に相当するもの、を確定す るステップと、 d)μに対する望ましい信頼水準を選定するステップと、 e)選定した信頼水準においてxが統計的にμと異なるかどうかを判断するた めにxを分析するステップと、 f)ステップe)の分析に基づき、確定平均μを質量差xに選定した信頼水準に おいて割当てできるかどうかを判断するステップからなる質量既知の複数のモノ マーを包含するポリマーに関する配列情報を得る方法。 2.ステップe)の分析において確定された統計的差が、選定した信頼水準におい て確定平均μを質量差xに割り当てできないことを示す請求項１記載の方法。 3.ステップc)からf)のステップを複数の望ましいμｓについて繰り返すことを 包含する請求項2の方法。 4.ステップe)の分析が、１実験平均に対する両側t検定を包含する請求項２記 載の方法。 5.ステップe)が、 g)ステップb)をn回繰り返し、少なくとも一対のフラグメント間の測定平 均質量/電荷比の差xを決定するステップと、 h)ステップg)で決定した平均質量/電荷比のx標準偏差s を決定するステップと、 i)xを確定平均差μと比較するステップと、 j)ステップc)からi)のステップを複数の望ましいμｓが確定されるまで 繰り返すステップを包含する請求項ｌ記載の方法。 6.追加のフラグメント対についてステップb)からステップj)までを繰り返すこ とを包含する請求項５記載の方法。 7.ステップi)の比較が確定平均差の絶対値を取る請求項５記載の方法。 8.ステップe)の分析に基づいて測定回数nを決定するステップをさらに包含す る請求項５記載の方法。 9.ステップa)でポリマー・フラグメントを得るためにポリマーを加水分解する ステップをさらに包含する請求項1記載の方法。 10．ポリマーが反応表面で加水分解され、当該表面が異なる量の加水分解剤を 供することによって、前記ポリマーのモノマー間結合を破壊して分解する請求項 ９記載の方法。 11．反応表面が前記加水分解剤の非区分勾配を包含するものである請求項１０ 記載の方法。 12．前記反応表面が前記ポリマーの区分勾配を包含するものである請求項１０ 記載の方法。 13．質量/電荷比をマトリックス支援レーザー・ディソープション質量分析法 により分析する請求項１記載の方法。 14．ステップb)がプラズマ・ディソープション・イオン化またはファースト・ アトム・バンバードメント・イオン化により行われる請求項１記載の方法。 15．ステップb)が飛行時間型、四重極型、イオントラップ型、およびセクター 型よりなるグループから選択される質量分析方式を用 いて行われる請求項１記載の方法。 16．ステップe)とf)が下記のステップを包含する請求項１の方法、 測定回数nとするためにステップb)を繰り返すことにより、一対のフラグメン ト間の測定平均質量/電荷比の差xを決定するステップと、 ステップe)で決定した測定平均質量/電荷比の差xの標準偏差sを決定するステ ップと、 下記の演算式： によりテスト統計t計算値を計算するステップと、 ステップg)において計算したテスト統計t計算値を測定回数およ望ましい信頼 水準に相当するt分布と比較するステップと、 t計算値を前記分布と比較するステップでの比較に基づいて、確定平均μが選 定した信頼水準において質量差xに割当てできるかどうかを判断するステップ。 17． 18．テスト統計t計算値を測定回数および望ましい信頼水準に相当するt分布と 比較することをさらに包含する請求項１６記載の方法。 19．追加のフラグメント対についてステップb)からステップi)までを繰り返す ことにより配列情報を得る請求項１６記載の方法。 20．既知の質量の１以上のモノマーを包含するポリマーに関する配列情報を質 量分析法により得るためのキットであって、当該キットが、 a)それぞれ1以上のモノマーが異なるポリマー・フラグメントのセットを 保持する質量分析計用サンプル・プレートと、 b) i)少なくとも一対のポリマー・フラグメント間の質量/電荷比の差xを 決定し、 ii)ステップi)で決定されたポリマー・フラグメント対の質量/電荷比 を分析し、それらが望ましい信頼水準において確定された質量/電荷比の差μと 統計的に異なるかどうかを、ただしμは1以上の異なるモノマーの既知の質量/電 荷比に相当するものであり、また統計的差がμを望ましい信頼水準においてxに 割り当てられないことを示すものである場合に、判断し、 iii)ステップi)からii)を繰り返すステップを行なうためにコンピュー タを質量分析計に応答せしめるためのコンピュータ読み取り可能ディスクを包含 するキット。 21．サンプルプレートが反応表面を含有し、当該表面が前記ポリマーを前記フ ラグメントに加水分解するために異なる量の加水分解剤を提供する請求項８５記 載のキット。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] July 3, 1997 (1997.7.3) [Content of Amendment] As a result, there is no reliable method for the C-terminal Often remains as an area that cannot be analyzed. An alternative to chemical sequencing, both for peptides and oligonucleotides, is enzyme cleavage sequencing. In the case of oligonucleotides, more than 150 different enzymes have been isolated and are considered suitable for the preparation of oligonucleotide fragments. In the case of peptides, serine carboxypeptidases have been used extensively over the past 20 years as a simple method for cleaving amino acids, residue by residue, from the C-terminus of proteins or peptides. Carboxypeptidase Y (CPY) is an attractive enzyme, particularly because it non-specifically cleaves all residues, including proline, from the C-terminus (eg, Breddam et al., (1987) Carsburg Res. Commun. 52: 55-63). Sequencing of peptides by carboxypeptidase digestion has traditionally been performed by laborious direct analysis of dissociated amino acids on a residue-by-residue basis. This method is not only laborious, but also complicated by the autolysis of enzymes and amino acid contaminants in protein / peptide solutions. A further obstacle to all this kind of sequencing work is that good kinetic information on the hydrolysis and dissociation of individual residues by the particular enzyme used is absolutely required. U.S. Patent No. 5,382,51 No. 3, a method for screening a library of peptides and, the peptide ligands were sequenced by introducing an acceptor molecule to a peptide library, individual phase with a peptide that binds to a receptor molecule supporting identifying the body, at least one identified support isolated, discloses a method of arranging the peptide species attached to the support. Field desorption method (Hong et al. (1983), Biomed. Mass Spectrom. 10: 450-457), electrospray method (Smith [Smith] et al. (1993) 4 Techniques Protein Chem. 463-). 470) and thermospray method (Stachowiak et al. (1988), J. Am. Chem. Soc. 110: 1758-1765), and the development of mass spectrometry technology capable of analyzing high mass substances. This makes it possible to perform direct mass spectrometry of large biopolymers whose sequence order is preserved in peptide fragments obtained by CPY digestion, etc. It was to be avoided. In this “ladder” sequencing method, by calculating the mass difference between adjacent peptide peaks, the sequence can be derived in the correct order—that is, the measured difference is determined for a particular amino acid residue. It represents disappearance. More recently, time-of-flight matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI-TOF) mass spectrometry has also increased sensitivity, resolution, and mass accuracy. Has been shown to be suitable for ladder sequence analysis. Kuruton [Coulton] In NIMP R, 21 8 (1983) 276-28 6, discusses the use of a secondary ion mass spectroscopy, including matrix-assisted method for generating a high mass molecular and cluster ions. Chait et al. ((1993) 262 Science 89-92) exploited the strengths of MALDI-TOF for ladder sequencing of the N-terminal ladder formed by partial blocking of each step of the chemical digestion by Edman degradation. are doing. This approach still has the same limitations as traditional Edman chemistry, such as process complexity, time-consuming process properties, and lack of C-terminal information. However, this method recognizes the utility of MALDI-TOF for peptide sequencing using the peptide ladder scenario. Repusutofu [Roepstorff] is, TAC1 2 vol, in No. 10 (1993) 413-421, including MALD I to characterize the protein, it discusses the various mass spectrometry techniques. Soviet Patent A-5 382513 discloses the use of a mass spectrometer to detect the presence of Gram negative bacteria and endotoxins. Other investigators have also shown that carboxypeptidase digestion of peptides can be combined with MALDI-TOF to analyze the resulting truncated peptide mixture. For example, eight consecutive amino acids from the C-terminus of the 1-34 fragment of human thyroid hormone have been sequenced (Schar et al. (1991) Chimia 45: 123-126). In addition, carboxypeptidase digestion of peptides has also been combined with other mass spectrometry techniques such as plasma desorption (Wang et al. (1992) Techniques Protein Chemistry III (Angeletti [Angeletti] eds., Academic Pres s. New York) 503-515). U.S. Patent No. 5,288,64 No.4 discloses a method of performing genomic sequencing using MALD I mass spectrometry. However, all of the above alignment methods require tedious and time-consuming preliminary optimization steps. Furthermore, such a pre-optimization step unnecessarily consumes reagents as well as samples of polymers, which usually are only available in limited quantities. Moreover, the above-described sequencing methods will ultimately rely on a limited number of single mass spectroscopy spectra and single mass / charge ratio data, which may be necessary to determine the final polymer sequence. It only gives statistically inadequate evidence. Rahosuto [Raaphorst] et al., International Journal of Mass Spectroscopy and Ion Physics, 31 vol (1979) 65-6 at 9, discusses the use of statistical methods for the evaluation of the data obtained from the thermal ionization mass spectrometer are doing. One object of the present invention is to provide a method and apparatus for performing sequencing of polymers, especially biopolymers, utilizing mass spectrometry and time independent / concentration dependent hydrolysis of polymers. It is in. More specifically, it is an object of the present invention to provide a method for obtaining sequence information incorporating a data interpretation strategy based on combining the mass / charge ratios obtained from multiple parallel mass spectra. is there. It is another object of the present invention to provide a rapid method for obtaining sequence information, avoiding the time-consuming optimization and method enhancement required in prior art methods. It is a further object of the invention to provide sequence information using a low amount of polymer, combining sensitive mass spectrometry with elimination of sample loss by tightly integrating hydrolysis with mass spectrometry. . Claims 1. a) providing a set of polymer fragments in which one or more monomers differ, b) measuring the mass / charge ratio difference x between at least one pair of fragments; c) determining the fragment pair measured in step b. Determining an average difference μ between the mass / charge ratios, where μ corresponds to a known mass / charge ratio of one or more different monomers; d) selecting a desired confidence level for μ; e. ) Analyzing x to determine whether x is statistically different from μ at the selected confidence level; andf) confidence level based on the analysis in step e) and selecting the definite average μ for the mass difference x. A method for obtaining sequence information on a polymer containing a plurality of monomers of known masses, comprising the step of determining whether or not the monomers can be assigned in the method. 2. The method of claim 1, wherein the statistical difference determined in the analysis of step e) indicates that the determined mean μ cannot be assigned to the mass difference x at the selected confidence level. 3. The method of claim 2, comprising repeating steps c) to f) for a plurality of desired μs. 4. The method of claim 2, wherein the analysis of step e) comprises a two-tailed t-test for one experimental mean. 5.Step e) comprises: g) repeating step b) n times to determine a difference x in the measured average mass / charge ratio between at least one pair of fragments; h) the average mass / charge determined in step g) Determining x standard deviation s of the ratio; i) comparing x with the determined mean difference μ; j) repeating steps c) through i) until a plurality of desired μs are determined. The method of claim 1, wherein 6. The method of claim 5, comprising repeating steps b) to j) for additional fragment pairs. 7. The method according to claim 5, wherein the comparison of step i) takes the absolute value of the determined mean difference. 8. The method of claim 5, further comprising the step of determining the number of measurements n based on the analysis of step e). 9. The method of claim 1, further comprising the step of hydrolyzing the polymer to obtain a polymer fragment in step a). Ten. 10. The method of claim 9, wherein the polymer is hydrolyzed at the reaction surface and the surface is broken down by providing different amounts of hydrolyzing agent to break inter-monomer bonds of the polymer. 11． The method of claim 10, wherein the reaction surface comprises a non-partitioned gradient of the hydrolyzing agent. 12． The method of claim 11, wherein the reaction surface comprises a piecewise gradient of the polymer. 13. The method of claim 1 wherein the mass / charge ratio is analyzed by matrix assisted laser desorption mass spectrometry. 14. The method of claim 1, wherein step b) is performed by plasma desorption ionization or first atom bombardment ionization. 15． The method of claim 1, wherein step b) is performed using a mass spectrometry selected from the group consisting of time-of-flight, quadrupole, ion trap, and sector. 16． 2. The method of claim 1 wherein steps e) and f) include the following steps: determining a difference x in the measured average mass / charge ratio between the pair of fragments by repeating step b) to obtain a number of measurements n. Determining the standard deviation s of the difference x in the measured average mass / charge ratio determined in step e); Calculating the test statistic t calculated value by the step of: comparing the test statistic t calculated value in step g) with a t distribution corresponding to the number of measurements and a desired confidence level; and comparing the t calculated value with the distribution. Determining whether the determined mean μ can be assigned to the mass difference x at the selected confidence level based on the comparison in the performing step. 17． 18． 17. The method of claim 16, further comprising comparing the test statistic t calculation to a number of measurements and a t distribution corresponding to a desired confidence level. 19. 17. The method of claim 16, wherein sequence information is obtained by repeating steps b) to i) for additional fragment pairs. 20. A kit for obtaining by mass spectrometry sequence information on a polymer comprising one or more monomers of known mass, the kit comprising: a) a mass holding a set of polymer fragments, each of which differs by one or more monomers. An analyzer sample plate; b) i) determining the mass / charge ratio difference x between at least one pair of polymer fragments; ii) determining the mass / charge ratio of the polymer fragment pair determined in step i). Analyze and determine whether they are statistically different from the determined mass / charge ratio difference μ at the desired level of confidence, where μ corresponds to the known mass / charge ratio of one or more different monomers, Also, if the statistical difference indicates that μ cannot be assigned to x at the desired confidence level, judge and iii) perform steps i) through ii) Computer-readable kits including disks for allowing responding computer to the mass spectrometer in order. twenty one. 86. The kit of claim 85, wherein the sample plate contains a reactive surface, the surface providing different amounts of a hydrolyzing agent to hydrolyze the polymer to the fragments.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者 タール，ジョージ，イー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01982，エス．ハミルトン，エセックス ストリート 640────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), JP (72) Inventor Tar, George, Y.             United States Massachusetts             01982, S. Hamilton, Essex             Street 640

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1.a) 1以上のモノマーが異なるポリマー・フラグメントのセットを供するステ ップと、 b) 少なくとも一対のフラグメント間の質量/電荷比の差xを測定するステッ プと、 c) ステップbで測定されたフラグメント対の質量/電荷比間の平均差μ、た だしμは1以上の異なるモノマーの既知の質量/電荷比に相当するもの、を確定す るステップと、 d) μに対する望ましい信頼水準を選定するステップと、 e) 選定した信頼水準においてxが統計的にμと異なるかどうかを判断するために xを分析するステップと、 f) ステップe)の分析に基づき、確定平均μを質量差xに選定した信頼水準に おいて割当てできるかどうかを判断するステップからなる質量既知の複数のモノ マーを包含するポリマーに関する配列情報を得る方法。 2.ステップe)の分析において確定された統計的差が、選定した信頼水準におい て確定平均μを質量差xに割り当てできないことを示す請求項１記載の方法。 3.ステップc)からf)のステップを複数の望ましいμｓについて繰り返すことを 包含する請求項2の方法。 4.ステップe)の分析が、1実験平均に対する両側t検定を包含する請求項２記載 の方法。 5.ステップe)が、 g) ステップb)をn回繰り返し、少なくとも一対のフラグメント間の測定平 均質量/電荷比の差xを決定するステップと、 h) ステップg)で決定した平均質量/電荷比のx標準偏差sを決定するステッ プと、 i) ｘを確定平均差μと比較するステップと、 j) ステップc)からi)のステップを複数の望ましいμｓが確定されるまで 繰り返すステップを包含する請求項１記載の方法。 6.追加のフラグメント対についてステップb)からステップj)までを繰り返すこ とを包含する請求項５記載の方法。 7.ステップi)の比較が確定平均差の絶対値を取る請求項５記載の方法。 8.ステップe)の分析に基づいて測定回数nを決定するステップをさらに包含す る請求項５記載の方法。 9.ポリマーがバイオポリマーである請求項１記載の方法。 10．バイオポリマーが、DNA、RNA、PNA、蛋白質、ペプチド、炭水化物および それらの修飾物類よりなるグループから選択される請求項９記載の方法。 11．ステップa)でポリマー・フラグメントを得るためにポリマーを加水分解す るステップをさらに包含する請求項１記載の方法。 12．反応表面においてポリマーを加水分解剤により加水分解することをさらに 包含する請求項１記載の方法。 13．ポリマーが反応表面で加水分解され、当該表面が異なる量の加水分解剤を 供することによって、前記ポリマーのモノマー間結合を破壊して加水分解する請 求項12記載の方法。 14．加水分解剤がエキソヒドロラーゼまたはエンドヒドロラーゼである請求項 11、12または13記載の方法。 15．前記エキソヒドロラーゼによる加水分解が前記ポリマーの配列決定ラダー を包含する一連のフラグメントを産生するものである 請求項14記載の方法。 16．エキソヒドロラーゼが、エキソヌクレアーゼ、エキソグリコシダーゼ、お よびエキソペプチダーゼよりなるグループから選択される請求項15記載の方法。 17．エキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼY、カルボキシペプチダ ーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、アミノペプチダ ーゼI、ロイシンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノジペプチダーゼおよびカ テプシンCよりなるグループから選択される請求項16記載の方法。 18．エキソグリコシダーゼが、 a) α-マンノシダーゼI b) α-マンノシダーゼ c) β-ヘキソサミノダーゼ d) β-ガラクトシダーゼ e) α-フコシダーゼIおよびII f) α-ガラクトシダーゼ g) α-ノイラミニダーゼ h) α-グルコシダーゼIおよびII、 よりなるグループから選択される請求項１６記載の方法。 19．エキソヌクレアーゼが、 a) λ-エキソヌクレアーゼ b) t7遺伝子エキソヌクレアーゼ c) エキソヌクレアーゼIII d) エキソヌクレアーゼI e) エキソヌクレアーゼV f) エキソヌクレアーゼII g) DNAポリメラーゼII、 よりなるグループから選択される請求項１６記載の方法。 20．前記エンドヒドロラーゼによる加水分解が前記ポリマーのマップを規定す る一連のフラグメントを産生するものである請求項１４記載の方法。 21．前記エンドヒドロラーゼが、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテ イナーゼLys-C、エンドプロテイナーゼArg-Cおよびテルモリシンよりなるグルー プから選択されるエンドペプチダーゼである請求項２０記載の方法。 22．薬剤が酵素以外の加水分解剤であることを特徴とする請求項１２記載の方 法。 23．前記ポリマーを加水分解する能力のある前記薬剤が、少なくとも１酵素と 少なくとも酵素以外の1薬剤の組み合わせよりなる請求項１２記載の方法。 24．反応表面が区分された分離できるゾーンのアレイを包含し、各ゾーンが前 記加水分解剤の異なる量を包含するものである請求項１３記載の方法。 25．反応表面が前記加水分解剤の非区分勾配を包含するものである請求項１３ 記載の方法。 26．前記反応表面が前記ポリマーの一定量を包含するものである請求項１２記 載の方法。 27．前記反応表面が前記ポリマーの異なる量の区分された分離できるゾーンの アレイを包含するものである請求項１２記載の方法。 28．前記反応表面が前記ポリマーの非区分勾配を包含するものである請求項１ ２記載の方法。 29．前記反応表面が前記薬剤の一定量を包含するものである請求項１２記載の 方法。 30．ステップb)で質量/電荷比を測定する前に、さらにポリマー・フラグメン トにマトリックスを添加することを包含する請求項１記載の方法。 31．前記比をマトリックス支援レーザー・ディソープション質量分析法により 分析する請求項１記載の方法。 32．ステップb)がプラズマ・ディソープション・イオン化またはファースト・ アトム・バンバードメント・イオン化により行われる請求項１記載の方法。 33．ステップb)が飛行時間型、四重極型、イオントラップ型、およびセクター 型よりなるグループから選択される質量分析方式を用いて行われる請求項１記載 の方法。 34．前記反応表面が、その上にマイクロ反応容器が配置された質量分析計サン プル・ホルダを包含する請求項１２記載の方法。 35．前記反応表面が、質量分析計サンプル・プローブを包含する特徴とする請 求項１２記載の方法。 36．前記反応表面が金属、箔、プラスチック、セラミック、およびワックス類 よりなるグループから選択される基質を包含するものである請求項１２記載の方 法。 37．加水分解が脱水した加水分解剤を用いて前記反応表面上で行われる請求項 １２記載の方法。 38．加水分解が前記薬剤を前記反応表面上に固定化することにより行われる請 求項１２記載の方法。 39．加水分解が液体またはゲル形状の加水分解剤を使用して行われ、当該液状 またはゲル形状の加水分解剤が物理的転移に抵抗性の あるものである請求項１２記載の方法。 40．ステップb)の前に、光吸収性マトリックスを前記フラグメントと組み合わ せる追加のステップを包含する請求項１記載の方法。 41．ステップb)の前に、加水分解された配列の質量を選択的にシフトするため の成分を前記ポリマー・フラグメントと組み合わせる追加のステップを包含する ことを特徴とする請求項１記載の方法。 42．ステップb)の前に、イオン化を改善するための成分を前記ポリマー・フラ グメントと組み合わせる追加のステップを包含することを特徴とする請求項１記 載の方法。 43.a) 1以上のモノマーが異なるポリマー・フラグメントのセットを供するス テップと、 b) 一対のフラグメントの質量/電荷比の差xを測定するステップと、 c) 1以上のモノマーの既知の質量/電荷比に関連する平均差μを確定するス テップと、 d) μに対する望ましい信頼水準を選定するステップと、 e) 測定回数nとするためにステップb)を繰り返すことにより、一対のフラ グメント間の測定平均質量/電荷比の差xを決定するステップと、 f) ステップe)で決定した測定平均質量/電荷比の差xの標準偏差sを決定す るステップと、 g) 下記の演算式： によりテストの統計t計算値を計算するステップ、 h) ステップgで計算した統計ｔ計算値を測定数および望ましい信頼水準に 相当するt-分布と比較するステップ、および i)確定平均μが、ステップhの比 較に基づく所定の信頼水準で質量差 xに割り当てられるかどうかを決定するステップを包含する質量既知の一連の異 なるモノマーを包含するポリマーに関する配列情報を得る方法。 44．ステップg)における計算したテスト統計t計算値を測定回数および望まし い信頼水準に相当するt分布と比較することをさらに包含する請求項４３記載の 方法。 45．追加のフラグメント対についてステップb)からステップi)までを繰り返す ことにより、配列情報を得ることをさらに包含する請求項４３記載の方法。 46．測定数nをステップh)での比較に基づいて決定するステップをさらに包含 する請求項４３記載の方法。 47．ポリマーがバイオポリマーである請求項４３記載の方法。 48．バイオポリマーがDNA、RNA、PNA、蛋白質、ペプチド、炭水化物およびそ れらの修飾物類よりなるグループから選択される請求項４７記載の方法。 49．ステップa)でフラグメントを得るためにポリマーを加水分解剤で加水分解 するステップをさらに包含する請求項４３記載の方法。 50．加水分解剤が、前記ポリマーの配列を規定するラダーを包含する一連のフ ラグメントを産生するエキソヒドロラーゼである請求項４９記載の方法。 51．エキソヒドロラーゼがエキソヌクレアーゼ、エキソグリコシダーゼ、およ びエキソペプチダーゼ類よりなるグループから選択される請求項５０記載の方法 。 52．エキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼY、カルボキシペプチダ ーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、アミノペプチダ ーゼI、ロイシンアミノペプチダーゼ、 プロリンアミノペプチダーゼおよびカテプシンCよりなるグループから選択され る請求項５１記載の方法。 53．エキソグリコシダーゼが、 a) α-マンノシダーゼI b) α-マンノシダーゼ c) β-ヘキソサミニダーゼ d) β-ガラクトシダーゼ e) α-フコシダーゼIおよびII f) α-ガラクトシダーゼ g) α-ノイラミニダーゼ h) α-グルコシダーゼIおよびII、 よりなるグループから選択される請求項５１記載の方法。 54．エキソヌクレアーゼが、 a) エキソヌクレアーゼ b) λ-エキソヌクレアーゼ c) t7遺伝子エキソヌクレアーゼ d) エキソヌクレアーゼIII e) エキソヌクレアーゼI f) エキソヌクレアーゼV g) エキソヌクレアーゼII h) DNAポリメラーゼII、 よりなるグループから選択される請求項５１記載の方法。 55．加水分解剤が酵素以外のである請求項４９記載の方法。 56．加水分解剤が、少なくとも1酵素と少なくとも酵素以外の1薬剤の組み合わ せを包含するものである請求項４９記載の方法。 57．加水分解が反応表面で行われ、当該表面が異なる量の加水分 解剤を提供する請求項４９記載の方法。 58．反応表面が区分された分離できるゾーンのアレイを包含し、各ゾーンが異 なる量の前記加水分解剤を包含するものである請求項５７記載の方法。 59．反応表面が加水分解剤の連続濃度勾配を包含するものである請求項４９記 載の方法。 60．ステップb)で質量/電荷比を測定する前に、さらにポリマー・フラグメン トにマトリックスを添加することを包含する請求項４３記載の方法。 61．a) 1以上のモノマーが異なるポリマー・フラグメントのセットを供するス テップと、 b) 一対のフラグメント間の質量/電荷比の差xを測定するステップと、 c) ステップbで測定されたフラグメント対の質量/電荷比間の平均差μ、た だしμは1以上の異なるモノマーの既知の質量/電荷比に相当するもの、を確定す るステップと、 d) μに対する望ましい信頼水準を選定するステップと、 e) 選定した信頼水準においてxが統計的にμと異なるかどうかを判断するために Xを分析するステップと、 f) ステップb)-e)を、複数の望ましいμｓが確定 されるまでn回繰り返すステップと、 g) ステップeにおける分析に基づく選定された信頼水準で質量差xに割り当 てられるかどうかを決定するステップと、 h) ステップb)-f)を追加のフラグメント対について繰り返すステップ、と を包含する質量既知の複数のモノマーを有するポリマーに関する配列情報を得る 方法。 62．ポリマーがバイオポリマーである請求項６１記載の方法。 63．バイオポリマーがDNA、RNA、PNA、蛋白質、ペプチド、炭水化物およびそ れらの修飾物類よりなるグループから選択される請求項６２記載の方法。 64．ステップa)のフラグメントがポリマーの濃度依存性加水分解により作り出 すれる請求項６１記載の方法。 65．ステップa)でポリマー・フラグメントを作り出すために、さらに前記ポリ マーを加水分解剤により加水分解するステップを包含する請求項６１記載の方法 。 66．加水分解剤がエキソヒドロラーゼである請求項６５記載の方法。 67．前記エキソヒドラーゼによる加水分解が、前記ポリマーのラダー規定する 一連のフラグメントを産生する請求項６６記載の方法。 68．エキソヒドロラーゼが、エキソヌクレアーゼ、エキソグリコシダーゼ、お よびエキソペプチダーゼ類よりなるグループから選択される請求項６６記載の方 法。 69．エキソグリコシダーゼが、 a) α-マンノシダーゼI b) α-マンノシダーゼ c) β-ヘキソサミニダーゼ d) β-ガラクトシダーゼ e) α-フコシダーゼIおよびII f) α-ガラクトシダーゼ g) α-ノイラミニダーゼ h) α-グルコシダーゼIおよびII、 よりなるグループから選択される請求項６８記載の方法。 70．エキソヌクレアーゼが、 a) エキソヌクレアーゼ b) λ-エキソヌクレアーゼ c) t7遺伝子エキソヌクレアーゼ d) エキソヌクレアーゼIII e) エキソヌクレアーゼI f) エキソヌクレアーゼV g) エキソヌクレアーゼII h) DNAポリメラーゼII、 よりなるグループから選択される請求項６８記載の方法。 71．エキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼY、カルボキシペプチダ ーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、アミノペプチダ ーゼI、ロイシンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼおよびカテ プシンCよりなるグループから選択される請求項６８記載の方法。 72．前記薬剤が酵素以外の加水分解剤を包含する請求項６５記載の方法。 73．ポリマー・フラグメントが、少なくとも1酵素と少なくとも酵素以外の1薬 剤の組み合わせを用いる加水分解により得られる請求項６５記載の方法。 74．加水分解が反応表面で起こり、当該表面が異なる量の加水分解剤を提供す る請求項６５記載の方法。 75．反応表面が区分された分離できるゾーンのアレイを包含し、各ゾーンが異 なる量の加水分解剤を包含する請求項７４記載の方法。 76．反応表面が前記加水分解剤の濃度勾配を包含する請求項７４記載の方法。 77．ステップb)で質量/電荷比を測定する前に、さらにポリマー・フラグメン トにマトリックスを添加することを包含することを特徴とする請求項６１記載の 方法。 78．a)それぞれ1以上のモノマーの異なるポリマー・フラグメントのセットを 保持するサンプル・プレートを有する質量分析計と、 b)i)一対のポリマー・フラグメント間の質量/電荷比の差xを決定し、 ii) ステップi)で決定されたフラグメント対の質量/電荷比間の平均差 μ、ただしμは1以上の異なるモノマーの既知の質量/電荷比に相当するもの、を 確定し、 iii) 統計的差が確定平均μは望ましい信頼水準においてxに割り当てら れないことを示すものである場合に、望ましい信頼水準においてxが統計的にμ と異なるかどうかを判断するためにxを分析し、 iv) ステップii)-iii)を、望ましいμｓが確定されるまで繰り返し、 v) ステップi)-iv)を追加のフラグメント対について繰り返す、ための 質量分析計に応答するコンピュータを包含し、質量既知の複数のモノマーを有す るポリマーに関する配列情報を得るための装置。 79．コンピュータがポリマー・フラグメント対間の確定質量/電荷比の差を決 定する請求項７８記載の装置。 80．サンプルプレートが、前記ポリマーを加水分解することによってモノマー 間結合を破壊する加水分解剤の異なる量を提供する反応表面を包含する請求項７ ８記載の装置。 81．前記反応表面が前記薬剤の異なる量の区分された分離できる ゾーンのアレイまたは前記薬剤の比区分勾配のアレイを包含する請求項８０記載 の装置。 82．前記反応表面が前記薬剤の勾配を包含する請求項８０記載の装置。 83．マトリックス支援レーザー・ディソープション質量分析計に好適な光吸収 性マトリックスをさらに包含する請求項７８記載の装置。 84．A．a) イオンを発生する手段と b) イオンを加速する手段と、 c) イオンを検出する手段を包含する質量分析計と、 B．d) 一対のポリマー・フラグメント間の質量/電荷比の差xを決定する手段と 、 e) フラグメント対間の質量/電荷比間の平均差μ、ただしμは1以上の 異なるモノマーの既知の質量/電荷比に相当するもの、を確定する手段と、 f) 望ましい信頼水準においてxが統計的にμと異なるかどうかを判断 するためにxを分析する手段と、 g) 望ましい数のμｓが確定されたことを判断する手段を包含する質量 分析計に応答するコンピュータを包含する質量既知の複数のモノマーを有するポ リマーに関する配列情報を得るための装置。 85．既知の質量の1以上のモノマーを包含するポリマーに関する配列情報を質 量分析法により得るためのキットであって、当該キットが、 a) それぞれ1以上のモノマーが異なるポリマー・フラグメントのセットを 保持する質量分析計用サンプル・プレートと、 b) i) 少なくとも一対のポリマー・フラグメント間の質量/電荷比の差xを 決定し、 ii) ステップi)で決定されたポリマー・フラグメント対の質量/電荷比 を分析し、それらが望ましい信頼水準において確定された質量/電荷比の差μと 統計的に異なるかどうかを、ただしμは1以上の異なるモノマーの既知の質量/電 荷比に相当するものであり、また統計的差がμを望ましい信頼水準においてxに 割り当てられないことを示すものである場合に、判断し、 iii) ステップi)からii) を繰り返すステップを行なうためにコンピュ ータを質量分析計に応答せしめるためのコンピュータ読み取り可能ディスクを包 含するキット。 86．サンプル・プレートが反応表面を包含し、当該表面が前記ポリマーを前記 フラグメントに加水分解する異なる量の加水分解剤を提供する請求項85のキット 。 87．サンプル・プレートがさらにマトリックス支援レーザー・ディソープショ ン質量分析計に好適なマトリックスを包含する請求項８５記載のキット。 88．i)複数のモノマーを有するポリマーから作り出された、１以上のモノマー が異なる少なくとも一対のポリマー・フラグメント間の質量/電荷比の差xを決定 し、 ii)所定の信頼区間においてxが統計的に確定質量/電荷比と異なるかどう かを判断するために質量/電荷比を分析し、 iii) ステップii)を追加の確定質量/電荷比について繰り返し、 iv)ステップi)からii)を追加のフラグメント対に繰り返す、 ようにコンピュータを質量分析計に応答させるためのコンピュータ読み取り可能 ディスク。 89．a) 複数のモノマーを有するポリマーから作り出された、1以上のモノマー が異なる少なくとも一対の配列を規定するポリマー・フラグメント間の質量/電 荷比の差xを決定する手段と、 b) 所定の信頼区間においてxが統計的に確定質量/電荷比と異なるかどう かを判断するために質量/電荷比を分析する手段と、 c) すべての望ましい確定差が確定されるまでステップb)を繰り返す手段 と、 d) 配列情報が得られるまでステップa)-c)を繰り返す手段を包含すること を特徴とする質量分析計に応答するコンピュータ。 90．a) 複数のモノマーを有するポリマーから作り出された、1以上のモノマー が異なる少なくとも一対の配列を規定するフラグメント間の質量/電荷比の差xを 決定する手段と、 b) 所定の信頼区間においてxが統計的に確定質量/電荷比と異なるかどう かを判断するために質量/電荷比を分析する手段と、 c) すべての望ましい 確定差が確定されるまでステップb)を繰り返す手段と、 d) 配列情報が得られるまでステップa)-c)を繰り返す手段を包含する質量 分析計に応答するコンピュータ。 91．望ましい信頼水準でポリマーの同一性について情報が得られるまで、ステ ップb)-f)を追加のフラグメントに配列情報が得られるまで繰り返す請求項９０ 記載の方法。 92．ステップc)における仮の同定成分が既知の配列のコンピュータ・データベ ースから導き出された既知の成分に相当するものである請求項９０記載の方法。 93．配列情報を得ようとするポリマー・フラグメントを包含するサンプルを液 体クロマトグラフィ・カラムから溶離するステップをさらに包含する請求項１、 ４３、６１または９０のいずれかに記載の方法。 94．ステップb)に先立ち緩衝液と接触させることによりカラムから溶離される サンプルを質量分析計に適合するようにする請求項９３記載の方法。 95． (1) 反応表面に少なくとも、 (i) 前記ポリマーを加水分解することによりモノマー間結合を破壊し、ポリマー ・フラグメントの前記セットを産生する1用量の加水分解剤、ならびに (ii) 前記反応表面上に薬剤とポリマーの異なる比を形成させるための前記ポリ マーのサンプル 提供するステップと、 (2) 加水分解されたポリマー・フラグメントの複数のシリーズを得るために 十分な時間ステップ(1)の産物をインキュベートするステップと、 (3) 中に含まれている加水分解ポリマー・フラグメントの質量/電荷比デー タを得るために前記シリーズを複数のフラグメントに対して質量分析を行なうス テップを さらにステップa)に包含する請求項１、４３、６１または９０記載の方法。 96．前記サンプル・プレートが、ポリマーを加水分解する能力のある脱水型の 薬剤をその中に少なくとも1用量配置した平面状固体表面を包含する請求項７８ 記載の装置。 97．前記サンプル・プレートが、ポリマーを加水分解する能力の ある固定化型の薬剤を少なくとも1用量その上に配置した平面状固体表面を包含 する請求項７８記載の装置。 98．前記サンプル・プレートが、物理的転移に抵抗性のある液状またはゲル状 の加水分解剤を少なくとも1用量のその上に配置した平面状固体表面を包含する 請求項７８記載の装置。 99．質量分析装置を一連の異なるモノマーを包含するポリマーに関する配列情 報を得るのに使用できるようにするための、ポリマーを加水分解する能力のある 脱水型の薬剤を少なくとも1用量配置した平面状固体表面を包含する、質量分析 形用サンプル・プレート。 100. 質量分析装置を一連の異なるモノマーを包含するポリマーに関する配列 情報を得るのに使用できるようにするための、ポリマーを加水分解する能力のあ る固定化型の薬剤を少なくとも1用量配置した平面状固体表面を包含する、質量 分析形用サンプル・プレート。 101. 質量分析装置を一連の異なるモノマーを包含するポリマーに関する配列 情報を得るのに使用できるようにするための、ポリマーを加水分解する能力のあ る、物理的転移に抵抗性のある液状またはゲル状の1用量の加水分解剤をその上 に配置した平面状固体表面を包含する、質量分析形用サンプル・プレート。 102. 前記表面が前記薬剤の異なる量の区分された分離できるゾーンのアレイ を包含する請求項７８、８５、９９、100または101のいずれか記載のサンプル・ プレート。 103. 前記表面が前記薬剤の非区分勾配を包含する請求項７８、８５、９９、 100または101のいずれか記載のサンプル・プレート。 104. 前記表面が前記薬剤の一定量を包含する請求項７８、８５、９９、100 または101のいずれか記載のサンプル・プレート。 105. 光吸収性マトリックスをさらに包含する請求項７８、８５、９９、100 または101のいずれか記載のサンプル・プレート。 106.マイクロ反応容器をさらに包含する請求項７８、８５、９９、100または1 01のいずれか記載のサンプル・プレート。 107. 前記プレートが使い捨てのものである請求項７８、８５、９９、100ま たは101のいずれか記載のサンプル・プレート。 108. 質量が既知の複数のモノマーを包含する同一性に関する情報を得る方法 であって、該方法が、 a) 上記ポリマーのエンド内部加水分解によりポリマー・フラグメントのセ ットを作りだすステップ、 b) フラグメントの質量/電荷比を測定するステップ、 c) 仮の成分が、質量/電荷比が既知であるレファランス・フラグメントの既 知の成分に相当する場合に、フラグメントの仮の成分を確定するステップ、 d) 仮の成分に対して望ましい信頼水準を選定するステップ、 e) 測定した質量/電荷比が、確定した仮のフラグメントの質量/電荷比と統 計的に異なるかどうかを判断するステップ、 f) 確定した仮の成分が、ステップeにおける決定に基づいた設定した信頼水 準で、フラグメントの確定した質量/電荷比に割り当てることができるかどうか を判断するステップ、および g)b)-e)のステップを繰り返す、 ことよりなる方法。 109. ステップc)における仮の成分が既知配列のコンピューター・データベー スから導き出された既知の成分に相当する請求項108の方法。[Claims]   1.a) Steps in which one or more monomers provide a different set of polymer fragments And     b) Step to measure the mass / charge ratio difference x between at least one pair of fragments And     c) the average difference μ between the mass / charge ratio of the fragment pairs measured in step b, Where μ is equivalent to the known mass / charge ratio of one or more different monomers. Steps     d) selecting a desired confidence level for μ; e) To determine whether x is statistically different from μ at the chosen confidence level analyzing x; and     f) Based on the analysis in step e), determine the confirmed average μ to the confidence level selected for the mass difference x. A plurality of objects with known masses A method for obtaining sequence information for a polymer including a mer.   2. Make sure that the statistical differences identified in the analysis of step e) 2. The method of claim 1, wherein the method does not indicate that a determined mean μ can be assigned to the mass difference x.   3. Repeat steps c) to f) for multiple desired μs 3. The method of claim 2 comprising.   4. The method of claim 2, wherein the analysis of step e) comprises a two-tailed t-test for one experimental mean. the method of.   5.Step e)       g) Repeat step b) n times, measuring at least the pair of fragments Determining a homogeneous quantity / charge ratio difference x;       h) Step to determine x standard deviation s of the average mass / charge ratio determined in step g) And       i) comparing x with the determined mean difference μ;       j) Repeat steps c) to i) until several desired μs are determined The method of claim 1, comprising the step of repeating.   6.Repeat steps b) to j) for additional fragment pairs 6. The method of claim 5, comprising:   7. The method according to claim 5, wherein the comparison of step i) takes the absolute value of the determined mean difference.   8. The method further includes the step of determining the number of measurements n based on the analysis of step e). A method according to claim 5, wherein   9. The method of claim 1, wherein the polymer is a biopolymer.   Ten. Biopolymers contain DNA, RNA, PNA, proteins, peptides, carbohydrates and 10. The method of claim 9, wherein the method is selected from the group consisting of those modifications.   11． Hydrolyze the polymer to obtain polymer fragments in step a) The method of claim 1, further comprising the step of:   12． Further hydrolyzing the polymer with a hydrolyzing agent on the reaction surface. The method of claim 1 comprising:   13. The polymer is hydrolyzed on the reaction surface, and the surface is treated with different amounts of hydrolyzing agent. By this, the bond between the monomers of the polymer is broken to hydrolyze the polymer. 13. The method according to claim 12.   14. The hydrolyzing agent is an exohydrolase or an endohydrolase. The method according to 11, 12, or 13.   15． Hydrolysis by the exohydrolase results in sequencing of the polymer To produce a series of fragments containing 15. The method according to claim 14.   16． Exohydrolases are exonucleases, exoglycosidases, 16. The method according to claim 15, wherein the method is selected from the group consisting of and exopeptidase.   17． Exopeptidase is carboxypeptidase Y, carboxypeptida A, carboxypeptidase B, carboxypeptidase P, aminopeptida Protease I, leucine aminopeptidase, proline aminodipeptidase and 17. The method of claim 16, wherein the method is selected from the group consisting of tepsin C.   18． Exoglycosidase,       a) α-mannosidase I       b) α-mannosidase       c) β-hexosaminodase       d) β-galactosidase       e) α-fucosidase I and II       f) α-galactosidase       g) α-neuraminidase       h) α-glucosidase I and II, 17. The method of claim 16, wherein the method is selected from the group consisting of:   19. Exonuclease,       a) λ-exonuclease       b) T7 gene exonuclease       c) Exonuclease III       d) Exonuclease I       e) Exonuclease V       f) Exonuclease II       g) DNA polymerase II, 17. The method of claim 16, wherein the method is selected from the group consisting of:   20. Hydrolysis by the endohydrolase defines a map of the polymer 15. The method of claim 14, wherein the method produces a series of fragments.   twenty one. The endohydrolase is trypsin, chymotrypsin, endoprotein; Glue composed of inase Lys-C, endoproteinase Arg-C and thermolysin 21. The method according to claim 20, which is an endopeptidase selected from the group consisting of:   twenty two. 13. The method according to claim 12, wherein the drug is a hydrolyzing agent other than the enzyme. Law.   twenty three. The agent capable of hydrolyzing the polymer comprises at least one enzyme 13. The method according to claim 12, comprising a combination of at least one drug other than an enzyme.   twenty four. The reaction surface includes an array of partitioned, separable zones, each zone being 14. The method according to claim 13, which comprises different amounts of said hydrolyzing agent.   twenty five. 14. The reaction surface comprising a non-section gradient of the hydrolyzing agent. The described method.   26. 13. The reaction surface of claim 12, wherein the reaction surface includes a fixed amount of the polymer. The method described.   27. The reaction surface has different amounts of segmented separable zones of the polymer. 13. The method of claim 12, comprising an array.   28. 2. The reaction surface of claim 1, wherein the reaction surface includes a non-partitioning gradient of the polymer. 2. The method according to 2.   29. 13. The method according to claim 12, wherein the reaction surface includes an amount of the drug. Method.   30. Before measuring the mass / charge ratio in step b), further polymer fragmentation 2. The method of claim 1 comprising adding a matrix to the matrix.   31. The ratio is determined by matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. The method of claim 1, wherein the method is to analyze.   32. Step b) is for plasma desorption ionization or fast 2. The method of claim 1, wherein said method is performed by atom bombardment ionization.   33. Step b) is time-of-flight, quadrupole, ion trap, and sector 2. The method according to claim 1, wherein the measurement is performed using a mass spectrometry method selected from the group consisting of molds. the method of.   34. The reaction surface is a mass spectrometer sun on which a microreactor is placed. 13. The method of claim 12, including a pull holder.   35. Wherein the reaction surface includes a mass spectrometer sample probe. The method of claim 12.   36. The reaction surface is made of metal, foil, plastic, ceramic, and wax. 13. The method according to claim 12, which comprises a substrate selected from the group consisting of: Law.   37. Wherein the hydrolysis is performed on the reaction surface using a dehydrated hydrolyzing agent. 12. The method according to 12.   38. Hydrolysis is performed by immobilizing the drug on the reaction surface. The method of claim 12.   39. Hydrolysis is carried out using a hydrolyzing agent in liquid or gel form, Or hydrolyzing agent in gel form is resistant to physical transition 13. The method of claim 12, which is one.   40. Before step b), combine a light absorbing matrix with said fragment The method of claim 1 including the additional step of causing   41. Before step b), to selectively shift the mass of the hydrolyzed sequence And the additional step of combining the components of The method of claim 1, wherein:   42. Prior to step b), the components for improving ionization are 2. The method according to claim 1, further comprising the additional step of combining with a fragment. The method described.   43.a) One or more monomers provide a set of different polymer fragments. Tep,      b) measuring the mass / charge ratio difference x of the pair of fragments;      c) Determine the mean difference μ associated with the known mass / charge ratio of one or more monomers. Tep,      d) selecting a desired confidence level for μ;      e) Repeat step b) to obtain n Determining the difference x in the measured average mass / charge ratio between the      f) Determine the standard deviation s of the difference x in the measured average mass / charge ratio determined in step e). Steps      g) The following equation: Calculating a statistical value of the test by:      h) Calculate the statistic t calculated in step g to the number of measurements and the desired confidence level. Comparing with the corresponding t-distribution, and i) the determined mean μ is the ratio of step h Mass difference at a given confidence level based on a series of differences of known mass, including the step of determining whether A method for obtaining sequence information on a polymer comprising a monomer comprising:   44. The test statistic calculated in step g) t 44. The method of claim 43, further comprising comparing to a t distribution corresponding to a confidence level. Method.   45. Repeat steps b) to i) for additional fragment pairs 44. The method of claim 43, further comprising obtaining sequence information.   46. Further includes the step of determining the number of measurements n based on the comparison in step h) 44. The method according to claim 43.   47. 44. The method according to claim 43, wherein the polymer is a biopolymer.   48. Biopolymers contain DNA, RNA, PNA, proteins, peptides, carbohydrates and 48. The method of claim 47, wherein the method is selected from the group consisting of these modifications.   49. Hydrolyze the polymer with a hydrolyzing agent to obtain the fragments in step a) 44. The method of claim 43, further comprising the step of:   50. A series of primers, including a ladder that defines the sequence of the polymer, is used. 50. The method of claim 49, which is an exohydrolase that produces a fragment.   51. Exohydrolases are exonucleases, exoglycosidases, and 51. The method according to claim 50, wherein the method is selected from the group consisting of and exopeptidases. .   52. Exopeptidase is carboxypeptidase Y, carboxypeptida A, carboxypeptidase B, carboxypeptidase P, aminopeptida Ase I, leucine aminopeptidase, Selected from the group consisting of proline aminopeptidase and cathepsin C 52. The method according to claim 51.   53. Exoglycosidase,       a) α-mannosidase I       b) α-mannosidase       c) β-hexosaminidase       d) β-galactosidase       e) α-fucosidase I and II       f) α-galactosidase       g) α-neuraminidase       h) α-glucosidase I and II, The method of claim 51, wherein the method is selected from the group consisting of:   54. Exonuclease,       a) Exonuclease       b) λ-exonuclease       c) t7 gene exonuclease       d) Exonuclease III       e) Exonuclease I       f) Exonuclease V       g) Exonuclease II       h) DNA polymerase II, The method of claim 51, wherein the method is selected from the group consisting of:   55. 50. The method according to claim 49, wherein the hydrolyzing agent is other than an enzyme.   56. The hydrolysis agent is a combination of at least one enzyme and at least one non-enzyme drug. 50. The method according to claim 49, wherein the method comprises diagnosing.   57. Hydrolysis is carried out on the reaction surface, where the surface has different amounts of water 50. The method of claim 49, wherein a peptizer is provided.   58. The reaction surface includes an array of partitioned, separable zones, each zone distinct. 58. The method of claim 57, comprising a quantity of said hydrolyzing agent.   59. 50. The reaction surface according to claim 49, wherein the reaction surface comprises a continuous concentration gradient of the hydrolyzing agent. The method described.   60. Before measuring the mass / charge ratio in step b), further polymer fragmentation 44. The method of claim 43, comprising adding a matrix to the matrix.   61. a) one or more monomers providing different sets of polymer fragments Tep,      b) measuring the mass / charge ratio difference x between the pair of fragments;      c) the average difference μ between the mass / charge ratio of the fragment pairs measured in step b, Where μ is equivalent to the known mass / charge ratio of one or more different monomers. Steps      d) selecting a desired confidence level for μ; e) To determine whether x is statistically different from μ at the chosen confidence level Analyzing X and f) Steps b) -e) determine multiple desired μs Repeating n times until      g) Assign to mass difference x at the selected confidence level based on the analysis in step e. Determining whether or not      h) repeating steps b) -f) for additional fragment pairs; and Obtain sequence information for polymers with multiple monomers of known mass, including Method.   62. 63. The method according to claim 61, wherein the polymer is a biopolymer.   63. Biopolymers contain DNA, RNA, PNA, proteins, peptides, carbohydrates and 63. The method of claim 62, wherein the method is selected from the group consisting of these modifications.   64. The fragment of step a) is created by concentration-dependent hydrolysis of the polymer 62. The method of claim 61, wherein   65. In order to create a polymer fragment in step a), 63. The method of claim 61 comprising hydrolyzing the mer with a hydrolyzing agent. .   66. 66. The method according to claim 65, wherein the hydrolyzing agent is exohydrolase.   67. Hydrolysis by the exohydrase determines the ladder of the polymer 67. The method of claim 66, wherein a series of fragments is produced.   68. Exohydrolases are exonucleases, exoglycosidases, 67. The method of claim 66, wherein the method is selected from the group consisting of and exopeptidases. Law.   69. Exoglycosidase,       a) α-mannosidase I       b) α-mannosidase       c) β-hexosaminidase       d) β-galactosidase       e) α-fucosidase I and II       f) α-galactosidase       g) α-neuraminidase       h) α-glucosidase I and II, 69. The method of claim 68, wherein the method is selected from the group consisting of:   70. Exonuclease,       a) Exonuclease       b) λ-exonuclease       c) t7 gene exonuclease       d) Exonuclease III       e) Exonuclease I       f) Exonuclease V       g) Exonuclease II       h) DNA polymerase II, 69. The method of claim 68, wherein the method is selected from the group consisting of:   71. Exopeptidase is carboxypeptidase Y, carboxypeptida A, carboxypeptidase B, carboxypeptidase P, aminopeptida Protease I, leucine aminopeptidase, proline aminopeptidase and cat 70. The method of claim 68, wherein the method is selected from the group consisting of Psin C.   72. 66. The method of claim 65, wherein said agent comprises a hydrolyzing agent other than an enzyme.   73. The polymer fragment contains at least one enzyme and at least one non-enzyme drug 66. The method according to claim 65, obtained by hydrolysis using a combination of agents.   74. Hydrolysis occurs at the reaction surface, which provides different amounts of hydrolyzing agent. 66. The method of claim 65, wherein   75. The reaction surface includes an array of partitioned, separable zones, each zone distinct. 75. The method of claim 74, comprising a quantity of a hydrolyzing agent.   76. 75. The method of claim 74, wherein the reaction surface comprises a concentration gradient of the hydrolyzing agent.   77. Before measuring the mass / charge ratio in step b), further polymer fragmentation 63. The method of claim 61, comprising adding a matrix to the Method.   78. a) Set of different polymer fragments, each with one or more monomers A mass spectrometer having a sample plate for holding;       b) i) determining the mass / charge ratio difference x between the pair of polymer fragments,         ii) the average difference between the mass / charge ratios of the fragment pairs determined in step i) μ, where μ corresponds to the known mass / charge ratio of one or more different monomers. Confirm,         iii) Statistical differences are determined Mean μ is assigned to x at the desired confidence level. Statistically indicates that x is statistically μ at the desired confidence level. Analyze x to determine if it is different from         iv) repeating steps ii) -iii) until the desired μs is determined,         v) Repeat steps i) -iv) for additional fragment pairs. Includes a computer that responds to the mass spectrometer and has multiple monomers of known mass For obtaining sequence information about polymers.   79. Computer determines deterministic mass / charge ratio difference between polymer fragment pairs 79. The apparatus according to claim 78, wherein the apparatus comprises:   80. The sample plate reacts with the monomer by hydrolyzing the polymer. 8. A reaction surface that provides different amounts of a hydrolyzing agent that breaks interlinks. An apparatus according to claim 8.   81. The reaction surface can separate and separate different amounts of the drug 81. An array of zones or an array of specific fractional gradients of the agent. Equipment.   82. 81. The device of claim 80, wherein the reaction surface includes a gradient of the drug.   83. Suitable light absorption for matrix-assisted laser desorption mass spectrometer The device of claim 78, further comprising a sex matrix.   84. A. a) means for generating ions          b) means for accelerating the ions;          c) a mass spectrometer comprising means for detecting ions;   B. d) means for determining the mass / charge ratio difference x between a pair of polymer fragments; ,          e) the average difference μ between the mass / charge ratio between the fragment pairs, where μ is greater than or equal to 1 Means for determining the known mass / charge ratio of the different monomers,          f) Determine if x is statistically different from μ at the desired confidence level Means to analyze x to          g) mass including means for determining that the desired number of μs has been determined A port with multiple monomers of known mass, including a computer that responds to the analyzer. A device for obtaining sequence information about limers.   85. Quality sequence information for polymers containing one or more monomers of known mass A kit for obtaining by a quantitative analysis method, wherein the kit comprises:       a) A set of polymer fragments, each with one or more different monomers A mass spectrometer sample plate to be retained,       b) i) the mass / charge ratio difference x between at least one pair of polymer fragments Decide,         ii) The mass / charge ratio of the polymer fragment pair determined in step i) And analyze the mass / charge ratio differences μ and Whether statistically different, where μ is the known mass / electricity of one or more different monomers And the statistical difference is that μ changes x to x at the desired confidence level. If it indicates that it will not be assigned,         iii) Computer to perform steps that repeat steps i) to ii) A computer readable disk to allow the data to respond to the mass spectrometer. Kit to include.   86. A sample plate includes a reaction surface, the surface containing the polymer. The kit of claim 85, wherein the kit provides different amounts of hydrolyzing agent that hydrolyzes into fragments. .   87. Sample plate further increases matrix-assisted laser desorption 86. The kit of claim 85 comprising a matrix suitable for mass spectrometry.   88. i) one or more monomers made from a polymer having multiple monomers Determine the mass-to-charge ratio difference x between at least one pair of polymer fragments with different And       ii) whether x is statistically different from the deterministic mass / charge ratio in a given confidence interval Analyze the mass / charge ratio to determine       iii) repeating step ii) for additional deterministic mass / charge ratios,       iv) repeating steps i) to ii) for additional fragment pairs, Computer readable to make the computer respond to the mass spectrometer disk.   89. a) one or more monomers created from a polymer with multiple monomers Between the polymer fragments defining at least one pair of sequences Means for determining the load ratio difference x;       b) whether x is statistically different from the determined mass / charge ratio in a given confidence interval Means for analyzing the mass / charge ratio to determine       c) means to repeat step b) until all desired firm differences have been determined When,       d) Include means to repeat steps a) -c) until sequence information is obtained A computer responsive to the mass spectrometer.   90. a) one or more monomers created from a polymer with multiple monomers The difference x in the mass / charge ratio between fragments defining at least one pair of sequences that differ Means for determining;       b) whether x is statistically different from the determined mass / charge ratio in a given confidence interval Means for analyzing the mass / charge ratio to determine whether Means for repeating step b) until the difference is fixed,       d) mass including means for repeating steps a) -c) until sequence information is obtained A computer that responds to the analyzer.   91. Until information about the identity of the polymer is obtained at the desired level of confidence, 90. Repeat steps b) -f) until sequence information is obtained for additional fragments The described method.   92. A computer database of the sequence for which the tentative identification component in step c) is known. 90. The method of claim 90, wherein the method corresponds to a known component derived from the source.   93. Sample containing the polymer fragment for which sequence information is to be obtained 2. The method of claim 1, further comprising the step of eluting from a solid chromatography column. 90. The method according to any of 43, 61 or 90.   94. Eluted from the column by contacting with buffer prior to step b) 94. The method of claim 93, wherein the sample is adapted for mass spectrometry.   95. (1) At least on the reaction surface (i) breaking the inter-monomer bond by hydrolyzing the polymer, A dose of a hydrolyzing agent producing said set of fragments, and (ii) the poly to form different ratios of drug and polymer on the reaction surface. Ma sample Providing steps;     (2) To obtain multiple series of hydrolyzed polymer fragments Incubating the product of step (1) for a sufficient time;     (3) Mass / charge ratio data of hydrolyzed polymer fragments contained in Mass spectroscopy of the series to multiple fragments to obtain Tep A method according to claim 1, 43, 61 or 90, further comprising step a).   96. The sample plate is of a dehydrated type capable of hydrolyzing the polymer. 78. A planar solid surface having at least one dose of an agent disposed therein. The described device.   97. The sample plate has the ability to hydrolyze polymers. Includes a planar solid surface on which at least one dose of an immobilized drug is placed 79. The device of claim 78, wherein   98. The sample plate is liquid or gel resistant to physical transfer Comprises a planar solid surface having at least one dose of a hydrolyzing agent disposed thereon. 79. The device of claim 78.   99. Alignment of mass spectrometer with polymer containing a series of different monomers Capable of hydrolyzing the polymer so that it can be used to obtain information Mass spectrometry, including a planar solid surface with at least one dose of dehydrated drug Sample plate for shaping.   100. Mass spectrometer array for polymers containing a series of different monomers Its ability to hydrolyze polymers so that it can be used to gain information Mass comprising a planar solid surface on which at least one dose of the immobilized drug is disposed. Sample plate for analytical type.   101. Mass spectrometer array for polymers containing a series of different monomers Its ability to hydrolyze polymers so that it can be used to gain information A liquid or gel-like hydrolyzing agent that is resistant to physical transfer A sample plate for mass spectrometry comprising a planar solid surface arranged at   102. An array of segmented separable zones of different amounts of the drug on the surface The sample according to any one of claims 78, 85, 99, 100 or 101, comprising: plate.   103. The method of claim 78, 85, 99, wherein the surface comprises a non-segmented gradient of the drug. Sample plate according to either 100 or 101.   104. The surface of claim 78, 85, 99, 100 wherein the surface comprises an amount of the agent. Or the sample plate of any of 101.   105. Claims 78, 85, 99, 100 further comprising a light absorbing matrix. Or the sample plate of any of 101.   106. Claim 78, 85, 99, 100 or 1 further comprising a microreaction vessel. The sample plate as described in any of 01.   107. The method of claims 78, 85, 99, 100 or 100 wherein said plate is disposable. Or the sample plate of any of 101.   108. A method for obtaining information on identity involving multiple monomers of known mass Wherein the method comprises:     a) The internal fragmentation of the polymer fragment Steps to create     b) measuring the mass / charge ratio of the fragment;     c) If the temporary component is a reference fragment with a known mass / charge ratio, Determining a provisional component of the fragment if it corresponds to a known component;     d) selecting the desired confidence level for the temporary component;     e) The measured mass / charge ratio is integrated with the mass / charge ratio of the determined temporary fragment. Determining whether they are different from each other,     f) The determined temporary component is the reliable water set based on the determination in step e. Can be assigned to the determined mass / charge ratio of the fragment Determining the     g) Repeat steps b) -e), The way that consists.   109. A computer database in which the temporary component in step c) has a known sequence. 111. The method of claim 108, wherein the method corresponds to a known component derived from the source.