WO2009095000A2 - Method for sequencing an rna molecule by means of mass spectrometry - Google Patents

Method for sequencing an rna molecule by means of mass spectrometry Download PDF

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WO2009095000A2
WO2009095000A2 PCT/DE2009/000125 DE2009000125W WO2009095000A2 WO 2009095000 A2 WO2009095000 A2 WO 2009095000A2 DE 2009000125 W DE2009000125 W DE 2009000125W WO 2009095000 A2 WO2009095000 A2 WO 2009095000A2
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sequencing
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Ute Bahr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry

Definitions

  • the invention relates to a method for sequencing an RNA molecule, in particular an RNA oligonucleotide by means of mass spectrometry, and the use of such a method.
  • RNA molecules The mass spectroscopic analysis of RNA molecules is described in the prior art, in particular using enzymatic degradation preceding actual mass spectrometry. This enzymatic degradation is done using exonucleases or endonucleases and has been described by several authors
  • time of termination of the enzymatic digestion must be chosen precisely because it depends strongly on the base composition of the RNA molecule to be analyzed. Normally, therefore, samples are taken from the digestion solution at different times, since it is very rare, due to the enzyme kinetics, for all to be sequenced in a solution taken at a certain time
  • J5 fragments are included. Thus, several mass spectrometric measurements must be performed to determine a sequence.
  • Hahner et al. (Nucleic Acid Res 25, 1997, 1957 to 1964) describes a method for mass spectroscopic analysis of an RNA molecule by means of alkaline hydrolysis and subsequent mass spectrometry.
  • this method has several disadvantages.
  • the method according to Hahner et al. allows only the sequencing of the RNA molecule to be examined from one side of the RNA molecule. Complete sequencing is not possible since signals below about 1000 Da can no longer be detected. Both alkaline hydrolysis and enzymatic digestion of the analyte
  • RNA molecules take place in buffer solutions containing hydroxides or detergents.
  • the direct mass spectrometric analysis of these solutions leads to broad peaks with a low mass resolution.
  • the mass accuracy suffers, so that it is difficult to unambiguously identify the two nucleotides uridine and cytidine, which differ only by 1 Da. 0
  • the object of the present invention is to provide a method by means of which the sequencing of an RNA molecule can be achieved using mass spectrometry without the disadvantages described above occurring.
  • an RNA molecule is provided, for example in the form of an RNA oligonucleotide.
  • RNA molecule is subjected to acid hydrolysis so that exactly one phosphodiester bond of the RNA molecule is cleaved.
  • RNA molecule which can be sequenced by the method according to the invention has adenine, cytosine, guanine and / or uracil as bases.
  • the RNA molecule to be sequenced may also have further bases and / or modified bases (eg bases modified by methylation or deamination), modified sugars and / or modifications to the phosphate backbone (such as phosphorodiamidate morpholino residues) to the extent that these other bases, modified bases and / or chemical groups differ in their mass sufficiently from one another and sufficiently from the bases or chemical groups otherwise present in the RNA molecule, so that they can be distinguished and identified by mass spectrometry.
  • RNA oligonucleotides with a length of up to 30 nucleotides, preferably up to 21 or 22 nucleotides, or with a length of 3 to 30 nucleotides, preferably with a length of 3 nucleotides to 22 nucleotides or, preferably, from 6 nucleotides to 22 nucleotides are sequenced by the method according to the invention.
  • the RNA molecule to be sequenced is provided in a solution.
  • this is an aqueous solution.
  • the concentration of the RNA molecule in the solution or the aqueous solution is in an advantageous embodiment of the method according to the invention 15 .mu.mol / 1 to 25 .mu.mol / 1, wherein a concentration of 20 .mu.mol / 1 is preferred.
  • 1 pmol to 1000 pmol, preferably 100 pmol to 500 pmol, particularly preferably 200 pmol of RNA are used.
  • the acidic hydrolysis of the RNA molecule is advantageously carried out with a strong acid.
  • Suitable strong acids are, for example, formic acid, trifluoroacetic acid and hydrochloric acid, with formic acid and trifluoroacetic acid being preferred, since they are commercially available in high purity and contamination of the sample with salts or other impurities can not occur when they are used.
  • the pH of the solution is between 0 and 2.
  • Preferred for the acidic hydrolysis is a pH of ⁇ 2, more preferably a pH of 1.5 to 1.8.
  • the acidic hydrolysis can be carried out at different temperatures and for a different duration depending on the chosen temperature. In general, temperatures of about 4 0 C to about 60 ° C are possible, the respective incubation time of the sample must be adjusted so that the acid hydrolysis to the cleavage of only one
  • the reaction can be stopped after about 2 minutes. If the acidic hydrolysis is carried out at a temperature of 4 ° C., the necessary incubation time can be 16 hours. A person skilled in the art will be able to determine the parameters of temperature and incubation length by means of routine experiments.
  • the reaction solution or part of the reaction solution can be used directly for mass spectroscopic sequence determination, without the need for a further purification step.
  • sequence determination of the RNA molecule is carried out by means of MALDI (matrix assisted laser desorption / ionization) mass spectrometry.
  • sequencing on the basis of a single spectrum in both 5 'to 3', and 3 'to 5' direction take place.
  • sequencing is in both directions to allow complete sequencing of the RNA molecule.
  • sequencing in both directions serves as an internal control of sequencing in the other direction.
  • mass analyzers are all combinable with MALDI devices into consideration, such as. Linear time of flight mass spectrometers (TOF), reflector TOFs, orthogonal TOFs, FTICR-MS or Orbitrap MS. All of these mass analyzers are known to the person skilled in the art.
  • TOF Linear time of flight mass spectrometers
  • reflector TOFs reflector TOFs
  • orthogonal TOFs FTICR-MS
  • Orbitrap MS Orbitrap MS. All of these mass analyzers are known to the person skilled in the art.
  • RNA fragments obtained from the acidic hydrolysis in conjunction with a matrix.
  • Suitable matrix materials are all matrix compounds which can be used for MALDI, for example 3-hydroxy-picolinic acid (HPA), 6-aza-2-thiothymine (ATT) and 2,4,6-trihydroxyacetophenone. 6-aza-2-thiothymine (ATT) has proven to be particularly advantageous for this sequencing of RNA molecules, in particular of RNA oligonucleotides.
  • Performing the MALDI mass spectrometry leads to a specific intensity value for each detectable mass (m / z) 5.
  • mass peaks result, at which the measured signal intensity reaches a local maximum.
  • the mass difference is determined for every two such mass peaks that are adjacent to each other. From this mass difference can be concluded that the base at a certain position 10 of the RNA molecule or on the nucleotide.
  • the terminal sequence can be determined by MS / MS fragmentation in order to improve the identifiability of the terminal one to two nucleotides of the RNA molecule to be sequenced.
  • the problem underlying the invention is also solved by the use of a method described above for sequencing an RNA molecule, in particular for sequencing an RNA oligonucleotide by mass spectrometry.
  • the description of the use according to the invention is based on the description contained herein.
  • RNA molecules in particular for siRNA molecules, antisense molecules and miRNA molecules.
  • Fig. 1 shows the reaction scheme of acid hydrolysis of an RNA molecule. Both obtained molecular fragments can be detected by mass spectrometry as protonated or deprotonated (0 molecules;
  • the terminal sequence can be amplified by MS / MS.
  • Fragmentation can be determined.
  • the fragment ion of interest can be isolated in the mass analyzer and fragmented by collisions with inert gas atoms.
  • the fragment ion spectra are shown here using the example of two dimers with inverse sequence (FIG. 4a: UGp, FIG. 4b: GUp) and a 3mer (FIG. 4c: GGUp).
  • the fragmentation leads to so-called y- and c-fragments (see FIG. 4d), whereby the y-
  • Ions always have a higher intensity than the c ions, yi or y 2 ions are formed by cleavage of the 3 '-terminal nucleotide, C 1 - and c 2 -ions by cleavage of the 5' -terminal nucleotide.
  • the inventive method allows the complete sequencing of an RNA molecule in the form of an RNA oligonucleotide of 21 nucleotides.
  • a sequencing in 5 '-3' direction (conductor 2)
  • a sequencing in 3 '-5' direction (conductor 1).
  • RNA oligonucleotide of the sequence UAU CAC UUG AUC UCG UAC ATT (SEQ ID NO: 1) is treated in an aqueous solution in a concentration of 20 .mu.mol / 1 with formic acid as a strong acid, that the pH of the solution ⁇ 2 is.
  • the acidic hydrolysis takes place at a temperature of 60 ° C. for 2 minutes and is terminated by rapid cooling of the sample.
  • RNA oligonucleotide As preliminary experiments have shown, the hydrolysis of exactly one phosphodiester bond per RNA oligonucleotide takes place at this temperature and incubation time on average, so that all possible RNA oligonucleotide fragments which can be generated by hydrolysis of a phosphodiester bond are contained in the solution in the same frequency.
  • MS analysis 0.5 ⁇ l of the RNA solution is mixed with 2 ⁇ l of 6-aza-2-thiothymine (ATT) on a sample plate and dried. The obtained spectrum is shown in FIG. The sequence is determined by starting from the intact molecular peak between two mass peaks adjacent in the spectrum, the mass difference is formed.

Abstract

The invention relates to a method for sequencing an RNA molecule, particularly an RNA oligonucleotide by means of mass spectrometry. According to the invention, the method comprises the following steps: a) providing an RNA molecule; b) cleaving the RNA molecule by means of acid hydrolysis; and c) determining the sequence of the RNA molecule by means of mass spectrometry.

Description

Verfahren zur Sequenzierung eines RNA-M oleküls mittels Massenspektrometrie Method for sequencing an RNA molecule by mass spectrometry
5 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenzierung eines RNA-Moleküls, insbesondere eines RNA-Oligonukleotids mittels Massenspektrometrie, sowie die Verwendung eines derartigen Verfahrens.The invention relates to a method for sequencing an RNA molecule, in particular an RNA oligonucleotide by means of mass spectrometry, and the use of such a method.
Einleitungintroduction
1010
Die massenspektroskopische Analyse von RNA-Molekülen wird im Stand der Technik insbesondere unter Verwendung eines der eigentlichen Massenspektrometrie vorausgehenden en- zymatischen Abbaus beschrieben. Dieser enzymatische Abbau erfolgt unter Verwendung von Exonukleasen bzw. Endonukleasen und ist von verschiedenen Autoren beschrieben wordenThe mass spectroscopic analysis of RNA molecules is described in the prior art, in particular using enzymatic degradation preceding actual mass spectrometry. This enzymatic degradation is done using exonucleases or endonucleases and has been described by several authors
15 (siehe z. B. Tolsen et al., Nucleic Acid Res. 26, 1998, 446; Faulstich et al., Analytical Che- mistry 69, 1997, 4349). Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass immer mehrere Enzyme zum Abbau des RNA-Moleküls verwendet werden müssen, um die gesamte Sequenz des Moleküls analysieren zu können.15 (see, for example, Tolsen et al., Nucleic Acid Res. 26, 1998, 446; Faulstich et al., Analytical Chemistry 69, 1997, 4349). A disadvantage of this method is that more and more enzymes have to be used to break down the RNA molecule in order to be able to analyze the entire sequence of the molecule.
JO Weiterhin nachteilig ist, dass der Zeitpunkt des Abbruchs des enzymatischen Verdaus genau gewählt werden muss, da er stark von der Basenzusammensetzung des zu analysierenden RNA-Moleküls abhängt. Normalerweise werden daher zu unterschiedlichen Zeiten Proben aus der Verdau-Lösung entnommen, da es aufgrund der Enzymkinetik sehr selten ist, dass in einer zu einem bestimmten Zeitpunkt entnommenen Lösung alle zur Sequenzierung nötigenIt is also disadvantageous that the time of termination of the enzymatic digestion must be chosen precisely because it depends strongly on the base composition of the RNA molecule to be analyzed. Normally, therefore, samples are taken from the digestion solution at different times, since it is very rare, due to the enzyme kinetics, for all to be sequenced in a solution taken at a certain time
J5 Fragmente enthalten sind. Es müssen also mehrere massenspektrometrische Messungen durchgeführt werden, um eine Sequenz zu bestimmen.J5 fragments are included. Thus, several mass spectrometric measurements must be performed to determine a sequence.
Hahner et al. (Nucleic Acid Res 25, 1997, 1957 bis 1964) beschreibt ein Verfahren zur mas- senspektroskopischen Analyse eines RNA-Moleküls mittels alkalischer Hydrolyse und an- iθ schließender Massenspektrometrie. Dieses Verfahren ist jedoch mit mehreren Nachteilen behaftet. Das Verfahren nach Hahner et al. erlaubt nur die Sequenzierung des zu untersuchenden RNA- Moleküls von einer Seite des RNA-Moleküls. Eine vollständige Sequenzierung ist nicht möglich, da unterhalb von ungefähr 1000 Da keine Signale mehr detektiert werden können. Sowohl die alkalische Hydrolyse als auch der enzymatische Verdau des zu analysierendenHahner et al. (Nucleic Acid Res 25, 1997, 1957 to 1964) describes a method for mass spectroscopic analysis of an RNA molecule by means of alkaline hydrolysis and subsequent mass spectrometry. However, this method has several disadvantages. The method according to Hahner et al. allows only the sequencing of the RNA molecule to be examined from one side of the RNA molecule. Complete sequencing is not possible since signals below about 1000 Da can no longer be detected. Both alkaline hydrolysis and enzymatic digestion of the analyte
5 RNA-Moleküls finden in Pufferlösungen statt, die Hydroxide oder Detergenzien enthalten. Die direkte massenspektromerische Analyse dieser Lösungen führt zu breiten Peaks mit einer geringen Massenauflösung. Die Massengenauigkeit leidet darunter, so dass es schwierig ist die beiden Nukleotide Uridin und Cytidin, die sich nur um 1 Da unterscheiden, eindeutig zu identifizieren. 05 RNA molecules take place in buffer solutions containing hydroxides or detergents. The direct mass spectrometric analysis of these solutions leads to broad peaks with a low mass resolution. The mass accuracy suffers, so that it is difficult to unambiguously identify the two nucleotides uridine and cytidine, which differ only by 1 Da. 0
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Demgemäß liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde ein Verfahren bereitzustellen, mittels dessen die Sequenzierung eines RNA-Moleküls unter Verwendung der Mas- 5 senspektrometrie erreicht werden kann, ohne dass die oben geschilderten Nachteile auftreten.Accordingly, the object of the present invention is to provide a method by means of which the sequencing of an RNA molecule can be achieved using mass spectrometry without the disadvantages described above occurring.
Dieses Problem wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenzierung eines RNA- Moleküls, insbesondere zur Sequenzierung eines RNA-Oligonukleotids mittels Mas- senspektrometrie gelöst. Ein derartiges Verfahren weist die folgenden Schritte auf: :0This problem is solved by the method according to the invention for the sequencing of an RNA molecule, in particular for the sequencing of an RNA oligonucleotide by means of mass spectrometry. Such a method comprises the following steps: 0
1. Zunächst wird ein RNA-Molekül, beispielsweise in Form eines RNA-Oligonukleotids bereitgestellt.1. First, an RNA molecule is provided, for example in the form of an RNA oligonucleotide.
2. Dann wird das RNA-Molekül einer sauren Hydrolyse unterworfen, so dass genau eine 5 Phosphordiesterbindung des RNA-Moleküls gespalten wird.2. Then the RNA molecule is subjected to acid hydrolysis so that exactly one phosphodiester bond of the RNA molecule is cleaved.
3. Nach erfolgter saurer Hydrolyse wird die Sequenz des RNA-Moleküls massenspektro- metrisch bestimmt. Ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenzierbares RNA-Molekül weist als Basen Adenin, Cytosin, Guanin und/oder Uracil auf. Weiterhin kann das zu sequenzierende RNA- Molekül auch weitere Basen und/oder modifizierte Basen (z. B. durch Methylierung oder Deaminierung modifizierte Basen), modifizierte Zucker und/oder Modifikationen am Phos- phatrückgrat (wie z. B. Phosphorodiamidate Morpholino Reste) aufweisen, soweit sich diese genannten weiteren Basen, modifizierten Basen und/oder chemischen Gruppen in ihrer Masse ausreichend voneinander und ausreichend von den sonst noch im RNA-Molekül vorhandenen Basen bzw. chemischen Gruppen unterscheiden, so dass sie massenspektrometrisch unterschieden und identifiziert werden können. Somit können natürlich vorkommende oder synthe- tische RNA-Moleküle, insbesondere RNA-Oligonukleotide mit einer Länge von bis zu 30 Nukleotiden, bevorzugt bis zu 21 oder 22 Nukleotiden, oder mit einer Länge von 3 bis 30 Nukleotiden, bevorzugt mit einer Länge von 3 Nukleotiden bis 22 Nukleotiden oder ebenso bevorzugt von 6 Nukleotiden bis 22 Nukleotiden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert werden.3. After acid hydrolysis, the sequence of the RNA molecule is determined by mass spectrometry. An RNA molecule which can be sequenced by the method according to the invention has adenine, cytosine, guanine and / or uracil as bases. Furthermore, the RNA molecule to be sequenced may also have further bases and / or modified bases (eg bases modified by methylation or deamination), modified sugars and / or modifications to the phosphate backbone (such as phosphorodiamidate morpholino residues) to the extent that these other bases, modified bases and / or chemical groups differ in their mass sufficiently from one another and sufficiently from the bases or chemical groups otherwise present in the RNA molecule, so that they can be distinguished and identified by mass spectrometry. Thus, naturally occurring or synthetic RNA molecules, in particular RNA oligonucleotides with a length of up to 30 nucleotides, preferably up to 21 or 22 nucleotides, or with a length of 3 to 30 nucleotides, preferably with a length of 3 nucleotides to 22 nucleotides or, preferably, from 6 nucleotides to 22 nucleotides are sequenced by the method according to the invention.
Bevorzugterweise wird das zu sequenzierende RNA-Molekül in einer Lösung bereitgestellt. Vorteilhafterweise handelt es sich dabei um eine wässrige Lösung. Die Konzentration des RNA-Moleküls in der Lösung bzw. der wässrigen Lösung beträgt in einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens 15 μmol/1 bis 25 μmol/1, wobei eine Konzen- tration von 20 μmol/1 bevorzugt ist. Dabei werden in einer Ausführungsform des Verfahrens 1 pmol bis 1000 pmol, bevorzugt 100 pmol bis 500 pmol, besonders bevorzugt 200 pmol RNA eingesetzt.Preferably, the RNA molecule to be sequenced is provided in a solution. Advantageously, this is an aqueous solution. The concentration of the RNA molecule in the solution or the aqueous solution is in an advantageous embodiment of the method according to the invention 15 .mu.mol / 1 to 25 .mu.mol / 1, wherein a concentration of 20 .mu.mol / 1 is preferred. In one embodiment of the method, 1 pmol to 1000 pmol, preferably 100 pmol to 500 pmol, particularly preferably 200 pmol of RNA are used.
Die saure Hydrolyse des RNA-Moleküls wird vorteilhafter Weise mit einer starken Säure durchgeführt. Als starke Säuren kommen beispielsweise Ameisensäure, Trifluoressigsäure und Salzsäure in Betracht, wobei Ameisensäure und Trifluoressigsäure bevorzugt sind, da sie kommerziell in hoher Reinheit erhältlich sind und es bei ihrer Verwendung nicht zu einer Kontamination der Probe mit Salzen oder anderen Verunreinigungen kommen kann.The acidic hydrolysis of the RNA molecule is advantageously carried out with a strong acid. Suitable strong acids are, for example, formic acid, trifluoroacetic acid and hydrochloric acid, with formic acid and trifluoroacetic acid being preferred, since they are commercially available in high purity and contamination of the sample with salts or other impurities can not occur when they are used.
Es sollte so viel Säure zu der RNA-haltigen Probe zugegeben werden, dass der pH Wert der Lösung zwischen 0 und 2 liegt. Bevorzugt für die saure Hydrolyse ist ein pH Wert von < 2, besonders bevorzugt ist ein pH Wert von 1,5 bis 1,8. Die saure Hydrolyse kann bei unterschiedlichen Temperaturen und abhängig von der gewählten Temperatur für eine unterschiedliche Dauer durchgeführt werden. Im Allgemeinen sind Temperaturen von etwa 4 0C bis etwa 60 °C möglich, wobei die jeweilige Inkubationszeit der Probe so eingestellt werden muss, das die saure Hydrolyse zu der Spaltung jeweils nur einerAs much acid should be added to the RNA-containing sample that the pH of the solution is between 0 and 2. Preferred for the acidic hydrolysis is a pH of <2, more preferably a pH of 1.5 to 1.8. The acidic hydrolysis can be carried out at different temperatures and for a different duration depending on the chosen temperature. In general, temperatures of about 4 0 C to about 60 ° C are possible, the respective incubation time of the sample must be adjusted so that the acid hydrolysis to the cleavage of only one
5 Phosphordiesterbindung in einem RNA-Molekül führt. Die Wahrscheinlichkeit der sauren Hydrolyse ist für jede Phosphordiesterbindung im RNA-Molekül gleich. Somit muss die saure Hydrolyse zu einem Zeitpunkt abgebrochen werden, zu dem alle durch saure Hydrolyse nur einer Phosphordiesterbindung pro Molekül möglicherweise entstehenden Fragmente in gleicher Häufigkeit in der Lösung vorliegen. Wird die saure Hydrolyse beispielsweise bei einer5 Phosphordiesterbindung leads in an RNA molecule. The likelihood of acid hydrolysis is the same for any phosphodiester bond in the RNA molecule. Thus, acid hydrolysis must be discontinued at a time when all fragments which may be formed by acid hydrolysis of only one phosphodiester bond per molecule are present in the solution at equal frequency. If the acid hydrolysis, for example, in a
10 Temperatur von 60 °C durchgeführt, so kann die Reaktion schon nach etwa 2 Minuten abgebrochen werden. Sofern die saure Hydrolyse bei einer Temperatur von 4 °C durchgeführt wird, so kann die nötige Inkubationszeit 16 Stunden betragen. Ein Fachmann wird die Parameter Temperatur und Inkubationslänge mittels routinemäßiger Versuche feststellen können.10 temperature of 60 ° C carried out, the reaction can be stopped after about 2 minutes. If the acidic hydrolysis is carried out at a temperature of 4 ° C., the necessary incubation time can be 16 hours. A person skilled in the art will be able to determine the parameters of temperature and incubation length by means of routine experiments.
15 Nach dem Beenden der sauren Hydrolyse, etwa durch Lagern der Proben auf Eis, kann die Reaktionslösung oder ein Teil der Reaktionslösung direkt zur massenspektroskopischen Sequenzbestimmung eingesetzt werden, ohne dass ein weiterer Aufreinigungsschritt nötig wäre. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Sequenzbestimmung des RNA- Moleküls mittels MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation) Massenspektro-After the acid hydrolysis has ended, for example by storing the samples on ice, the reaction solution or part of the reaction solution can be used directly for mass spectroscopic sequence determination, without the need for a further purification step. In a preferred embodiment of the invention, the sequence determination of the RNA molecule is carried out by means of MALDI (matrix assisted laser desorption / ionization) mass spectrometry.
10 metrie. Dabei kann die Sequenzierung anhand eines einzelnen Spektrums sowohl in 5' nach 3', als auch 3' nach 5' Richtung erfolgen. Bevorzugterweise erfolgt die Sequenzierung in beiden Richtungen, um eine vollständige Sequenzierung des RNA-Moleküls zu ermöglichen. Außerdem dient die Sequenzierung in beide Richtungen als interne Kontrolle der Sequenzierung in der jeweils anderen Richtung.10 metrics. In this case, the sequencing on the basis of a single spectrum in both 5 'to 3', and 3 'to 5' direction take place. Preferably, sequencing is in both directions to allow complete sequencing of the RNA molecule. In addition, sequencing in both directions serves as an internal control of sequencing in the other direction.
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Als Massenanalysatoren kommen alle mit MALDI kombinierbaren Geräte in Betracht, wie z. B. lineare Flugzeit-Massenspektrometer (TOF), Reflektor-TOFs, orthogonale TOFs, FTICR- MS oder Orbitrap-MS. Alle diese Massenanalysatoren sind dem Fachmann bekannt.As mass analyzers are all combinable with MALDI devices into consideration, such as. Linear time of flight mass spectrometers (TOF), reflector TOFs, orthogonal TOFs, FTICR-MS or Orbitrap MS. All of these mass analyzers are known to the person skilled in the art.
iθ Die massenspektroskopische Analyse des RNA-Moleküls erfolgt mit den aus der sauren Hydrolyse erhaltenen RNA-Fragmenten in Verbindung mit einer Matrix. Als Matrix eignen sich alle für MALDI bekannter Weise verwendbaren Matrixverbindungen, beispielsweise 3- Hydroxy-Picolinsäure (HPA), 6-Aza-2-Thiothymin (ATT) und 2,4,6-Trihydroxyacetophenon. 6-Aza-2-Thiothymin (ATT) hat sich für diese Sequenzierung von RNA-Molekülen, insbesondere von RNA-Oligonukleotiden als besonders vorteilhaft erwiesen.The mass-spectroscopic analysis of the RNA molecule is carried out with the RNA fragments obtained from the acidic hydrolysis in conjunction with a matrix. Suitable matrix materials are all matrix compounds which can be used for MALDI, for example 3-hydroxy-picolinic acid (HPA), 6-aza-2-thiothymine (ATT) and 2,4,6-trihydroxyacetophenone. 6-aza-2-thiothymine (ATT) has proven to be particularly advantageous for this sequencing of RNA molecules, in particular of RNA oligonucleotides.
Die Durchführung der MALDI Massenspektrometrie führt für jede detektierbare Masse (m/z) 5 zu einem bestimmten Intensitätswert. In einem Graphen, der die Intensität über die Masse (m/z) zeigt, ergeben sich somit so genannte Massenpeaks, bei denen die gemessene Signalintensität ein lokales Maximum erreicht. Um die Sequenz des RNA-Moleküls zu bestimmen, wird für jeweils zwei derartiger Massenpeaks, die einander benachbart sind, die Massendifferenz ermittelt. Aus dieser Massendifferenz kann auf die Base an einer bestimmten Position 10 des RNA-Moleküls bzw. auf das Nukleotid geschlossen werden.Performing the MALDI mass spectrometry leads to a specific intensity value for each detectable mass (m / z) 5. In a graph showing the intensity over the mass (m / z), so-called mass peaks result, at which the measured signal intensity reaches a local maximum. To determine the sequence of the RNA molecule, the mass difference is determined for every two such mass peaks that are adjacent to each other. From this mass difference can be concluded that the base at a certain position 10 of the RNA molecule or on the nucleotide.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die endständige Sequenz durch MS/MS-Fragmentierung bestimmt werden, um die Identifizierbarkeit der endständigen ein bis zwei Nukleotide des zu sequenzierenden RNA-Moleküls zu verbessern.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the terminal sequence can be determined by MS / MS fragmentation in order to improve the identifiability of the terminal one to two nucleotides of the RNA molecule to be sequenced.
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Das der Erfindung zugrunde liegende Problem wird auch durch die Verwendung eines oben beschriebenen Verfahrens zur Sequenzierung eines RNA-Moleküls, insbesondere zur Sequenzierung eines RNA-Oligonukleotids mittels Massenspektrometrie gelöst. Insofern wird zur Beschreibung der erfindungsgemäßen Verwendung auf die hierin enthaltene Beschrei-The problem underlying the invention is also solved by the use of a method described above for sequencing an RNA molecule, in particular for sequencing an RNA oligonucleotide by mass spectrometry. In this respect, the description of the use according to the invention is based on the description contained herein.
>0 bung des Verfahrens verwiesen.> 0 the method referenced.
Das beschriebene Verfahren und die Verwendung dieses Verfahrens eignen sich insbesondere zur Qualitätskontrolle und zur de-novo-Sequenzierung für synthetisch hergestellte RNA- Moleküle, insbesondere für siRNA Moleküle, antisense Moleküle und miRNA-Moleküle. >5The method described and the use of this method are particularly suitable for quality control and de novo sequencing for synthetically produced RNA molecules, in particular for siRNA molecules, antisense molecules and miRNA molecules. > 5
Die Erfindung wird nun anhand der Figuren näher beschrieben. Es zeigen:The invention will now be described in more detail with reference to FIGS. Show it:
Fig. 1 das Reaktionsschema der sauren Hydrolyse eines RNA-Moleküls. Beide erhaltenen Molekülfragmente können massenspektrometrisch als protonierte oder deprotonierte (0 Moleküle detektiert werden;Fig. 1 shows the reaction scheme of acid hydrolysis of an RNA molecule. Both obtained molecular fragments can be detected by mass spectrometry as protonated or deprotonated (0 molecules;
Fig. 2 die vollständige Sequenzierung eines siRNA-Moleküls der Sequenz UAU CAC UUG AUC UCG UAC ATT (SEQ. ID. NO. 1) mit einer Länge von 21 Nukleotiden; und Fig. 3 den Vergleich der Sequenzspektren von zwei verschiedenen Matrices, nämlich ATT und HPA.2 shows the complete sequencing of a siRNA molecule of the sequence UAU CAC UUG AUC UCG UAC ATT (SEQ ID NO: 1) with a length of 21 nucleotides; and 3 shows the comparison of the sequence spectra of two different matrices, namely ATT and HPA.
Fig. 4: Um die Identifizierbarkeit der endständigen ein bis zwei Nukleotide des zu sequenzie- renden RNA-Moleküls zu verbessern, kann die endständige Sequenz durch MS/MS-4: In order to improve the identifiability of the terminal one to two nucleotides of the RNA molecule to be sequenced, the terminal sequence can be amplified by MS / MS.
Fragmentierung bestimmt werden. Dazu kann das interessierende Fragmention im Massenanalysator isoliert und durch Stöße mit inerten Gasatomen fragmentiert werden. Die Fragmentionen- Spektren sind hier am Beispiel von zwei Dimeren mit inver- ser Sequenz (Fig. 4a: UGp; Fig. 4b: GUp) und einem 3mer (Fig. 4c: GGUp) gezeigt. Die Fragmentierung fuhrt zu sog. y- und c-Fragmenten (siehe Fig. 4d), wobei die y-Fragmentation can be determined. For this purpose, the fragment ion of interest can be isolated in the mass analyzer and fragmented by collisions with inert gas atoms. The fragment ion spectra are shown here using the example of two dimers with inverse sequence (FIG. 4a: UGp, FIG. 4b: GUp) and a 3mer (FIG. 4c: GGUp). The fragmentation leads to so-called y- and c-fragments (see FIG. 4d), whereby the y-
Ionen immer eine höhere Intensität als die c-Ionen haben, yi- bzw. y2-Ionen entstehen durch Abspaltung des 3 '-terminalen Nukleotids, C1- und c2-Ionen durch Abspaltung des 5 '-terminalen Nukleotids.Ions always have a higher intensity than the c ions, yi or y 2 ions are formed by cleavage of the 3 '-terminal nucleotide, C 1 - and c 2 -ions by cleavage of the 5' -terminal nucleotide.
Wie aus Fig. 2 entnehmbar ist, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die vollständige Sequenzierung eines RNA-Moleküls in Form eines RNA-Oligonukleotids von 21 Nukleotiden. Dabei erfolgt sowohl eine Sequenzierung in 5 '-3' Richtung (Leiter 2), als auch eine Sequenzierung in 3 '-5' Richtung (Leiter 1).As can be seen from Fig. 2, the inventive method allows the complete sequencing of an RNA molecule in the form of an RNA oligonucleotide of 21 nucleotides. In this case, both a sequencing in 5 '-3' direction (conductor 2), as well as a sequencing in 3 '-5' direction (conductor 1).
Beispielexample
Ein RNA-Oligonukleotid der Sequenz UAU CAC UUG AUC UCG UAC ATT (SEQ. ID. NO. 1) wird in einer wässrigen Lösung in einer Konzentration von 20 μmol/1 mit Ameisensäure als starker Säure versetzt, dass der pH Wert der Lösung < 2 beträgt. Die saure Hydroly- se findet bei einer Temperatur von 60 °C für 2 Minuten statt und wird durch schnelle Abkühlung der Probe beendet. Wie Vorversuche gezeigt haben, erfolgt bei dieser Temperatur und dieser Inkubationszeit im Mittel die Hydrolyse genau einer Phosphordiesterbindung pro RNA-Oligonukleotid, so dass alle möglichen, durch Hydrolyse einer Phosphordiesterbindung erzeugbaren RNA-Oligonukleotidfragmente in der Lösung in gleicher Häufigkeit enthalten sind. Für die MS-Analyse werden 0,5 μl der RNA-Lösung mit 2 μl 6-Aza-2-Thiothymin (ATT) auf einem Probenteller gemischt und eingetrocknet. Das erhaltene Spektrum ist in Fig. 2 gezeigt. Die Sequenz wird ermittelt, indem ausgehend vom intakten Molekülpeak zwischen zwei im Spektrum benachbarten Massenpeaks die Massendifferenz gebildet wird.An RNA oligonucleotide of the sequence UAU CAC UUG AUC UCG UAC ATT (SEQ ID NO: 1) is treated in an aqueous solution in a concentration of 20 .mu.mol / 1 with formic acid as a strong acid, that the pH of the solution <2 is. The acidic hydrolysis takes place at a temperature of 60 ° C. for 2 minutes and is terminated by rapid cooling of the sample. As preliminary experiments have shown, the hydrolysis of exactly one phosphodiester bond per RNA oligonucleotide takes place at this temperature and incubation time on average, so that all possible RNA oligonucleotide fragments which can be generated by hydrolysis of a phosphodiester bond are contained in the solution in the same frequency. For the MS analysis, 0.5 μl of the RNA solution is mixed with 2 μl of 6-aza-2-thiothymine (ATT) on a sample plate and dried. The obtained spectrum is shown in FIG. The sequence is determined by starting from the intact molecular peak between two mass peaks adjacent in the spectrum, the mass difference is formed.
Aus dieser Massendifferenz wird auf das an der betrachteten Position im RNA- Oligonukleotid enthaltene Nukleotid geschlossen, da die Massendifferenzen jeweils der Masse eines der vier natürlich vorkommenden Nukleotidbausteine entsprechen.From this mass difference, it is concluded that the nucleotide contained in the considered position in the RNA oligonucleotide, since the mass differences each correspond to the mass of one of the four naturally occurring nucleotide building blocks.
Da die Sequenz vom 3' und vom 5 '-Ende des Oligonukleotids gelesen werden kann, spielt das aus dem Stand der Technik bekannte Problem der schlechten Detektierbarkeit kleiner Fragmente im niedrigen Massenbereich beim erfindungsgemäßen Verfahren keine Rolle. Since the sequence can be read from the 3 'and 5' ends of the oligonucleotide, the problem known from the prior art of poor low particle detectability of small fragments is not important in the method of the invention.

Claims

Ansprüche claims
1. Verfahren zur Sequenzierung eines RNA-Moleküls, insbesondere eines RNA- 5 Oligonukleotids mittels Massenspektrometrie, aufweisend die Schritte: a) Bereitstellen eines RNA-Moleküls, b) Spaltung des RNA-Moleküls mittels saurer Hydrolyse, und c) Bestimmen der Sequenz des RNA-Moleküls.1. A method for sequencing an RNA molecule, in particular an RNA 5 oligonucleotide by mass spectrometry, comprising the steps: a) providing an RNA molecule, b) cleavage of the RNA molecule by acid hydrolysis, and c) determining the sequence of the RNA molecule.
10 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das RNA-Molekül eine Länge von drei Nukleotiden bis 30 Nukleotiden, bevorzugt von sechs Nukleotiden bis 22 Nukleotiden aufweist.2. The method of claim 1, wherein the RNA molecule has a length of three nucleotides to 30 nucleotides, preferably from six nucleotides to 22 nucleotides.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das RNA-Molekül in einer Lösung, insbe- 15 sondere einer wässrigen Lösung bereitgestellt wird.3. The method according to claim 1 or 2, wherein the RNA molecule is provided in a solution, in particular an aqueous solution.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des RNA-Oligonukleotids in der Lösung 15 μmol/1 bis 25 μmol/1 beträgt.4. The method according to claim 3, wherein the concentration of the RNA oligonucleotide in the solution is 15 μmol / 1 to 25 μmol / l.
10 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, wobei die saure Hydrolyse mit einer starken Säure durchgeführt wird.5. The method of claim 1 to 4, wherein the acidic hydrolysis is carried out with a strong acid.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die starke Säure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ameisensäure, Trifluoressigsäure und Salzsäure.6. The method of claim 5, wherein the strong acid is selected from the group consisting of formic acid, trifluoroacetic acid and hydrochloric acid.
>5> 5
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, wobei die saure Hydrolyse bei einem pH Wert von 0 bis 2 durchgeführt wird.7. The method of claim 1 to 6, wherein the acid hydrolysis is carried out at a pH of 0 to 2.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, wobei die saure Hydrolyse bei einer Temperatur von 50 4 0C bis 60 °C durchgeführt wird.8. The method of claim 1 to 7, wherein the acidic hydrolysis is carried out at a temperature of 50 4 0 C to 60 ° C.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, wobei die saure Hydrolyse für einen Zeitraum von 2 Minuten bis 16 Stunden durchgeführt wird. A process according to claims 1 to 8, wherein the acidic hydrolysis is carried out for a period of 2 minutes to 16 hours.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Bestimmung der Sequenz des RNA- Moleküls direkt mit der Lösung nach der sauren Hydrolyse durchgeführt wird, ohne dass ein Aufreinigungsschritt durchgeführt wird.10. The method of claim 1 to 9, wherein the determination of the sequence of the RNA molecule is performed directly with the solution after the acid hydrolysis, without a purification step is performed.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, wobei die Bestimmung der Sequenz des RNA- Moleküls mittels MALDI Massenspektrometrie erfolgt.11. The method of claim 1 to 10, wherein the determination of the sequence of the RNA molecule by means of MALDI mass spectrometry.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, wobei die Massenspektrometrie mit der Lösung der sauren Hydrolyse in Verbindung mit einer Matrix durchgeführt wird.12. The method of claim 1 to 11, wherein the mass spectrometry is performed with the solution of acid hydrolysis in conjunction with a matrix.
13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Hydroxy-Picolinsäure (HPA), 6-Aza-2-Thiothymin (ATT) und 2,4,6- Trihydroxyacetophenon.13. The method of claim 1 to 12, wherein the matrix is selected from the group consisting of 3-hydroxy-picolinic acid (HPA), 6-aza-2-thiothymine (ATT) and 2,4,6-trihydroxyacetophenone.
14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, wobei die Bestimmung der Sequenz des RNA- Moleküls durch Ermittlung einer Massendifferenz zwischen zwei Peaks erfolgt, die bei der Auftragung der bei der Massenspektrometrie erhaltenen Signalintentsitäten über die Masse benachbart sind.14. The method of claim 1 to 13, wherein the determination of the sequence of the RNA molecule is carried out by determining a mass difference between two peaks that are adjacent to the application of the signal intensities obtained in mass spectrometry over the mass.
15. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 1 bis 14 zur Sequenzierung eines RNA- Moleküls, insbesondere eines RNA-Oligonukleotids mittels Massenspektrometrie. 15. Use of a method according to claim 1 to 14 for sequencing an RNA molecule, in particular an RNA oligonucleotide by mass spectrometry.
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