DE1965973A1

DE1965973A1 - Verfahren zur Herstellung von Distearinsaeure-trehaloseester,Arthoronsaeureglukoseester und Mono- und Tristearinsaeure-saccharoseester

Info

Publication number: DE1965973A1
Application number: DE19691965973
Authority: DE
Inventors: Takeo Suzuki; Katsunobu Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-02-01
Filing date: 1969-01-31
Publication date: 1971-01-28
Also published as: US3637461A; GB1211674A; DE1965975A1; DE1965972A1; FR2001118A1; DE1965974A1; DE1905472A1

Description

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K 946

FATCNTANWAlH
OMnjj. HANS RUSCH«
D*pl.-lng.HclNZ AQUUII
SEIiUfI S3

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Verfalirer. zur Herstellung von Dl-stearinsäure-trehaloseester, Arthroiisäure-glukoseestei- und Mono« und Tri-stearinsäure

-saeehaioseester

(Ausscheidung II - Stammanmeldung P 19 05 472.9-41) ■

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Di-stearinsäure-trehaloseester, Arthronsäure-glukoseester und Mono- und ™ Tri-stearirsäure-saccharossester durch Fermentation. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter ■

und speziell Arthro'oacter roseoparaffineus AICC 15 584 ^!

unter aeroben Bedingungen 1

in einem wässrigen Näiirmedium züchtet, das einen Kohlenwasserstoff oder ei:. Kohlenwasserstoff gemisch als Hauptkohlenstoff quelle ent- ' hält, und den Fettsäureester- in der erhaltenen Kulturflüssigkeit
anreienert.

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Es wurde gefunden» dass Mikroorganismen, die «it Hilf« der Ver- . Wertung bzw. Nutzbarmachung von Kohlenwasserstoffen wachaen können, im allgemeinen in Ihren Zellen oder an der Oberfläche der Zellen oberflächenaktive Substanzen aufweisen. Ferner wurde durch

Extraktion und Identifizierung dieser Substanzen festgestellt, dass es sich um die Fettsäureester von verschiedenen Zuckern handelt. Ester von Zuckern werden la grossen Umfange als oberflächenaktive Mitel und in verschiedenen Industriezweigen verwendet. Demzufolge besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem Fermentationsverfahren zur Gewinnung der Fettsäureester von Zuckern auf wenig kostspielige Weise und innerhalb kurzer Zeit.

Mit der Erfindung wurde ein Verfahren zur Herstellung von Di-steat rinsäure-trehaloseester, Arthroneäure-glukaseester und Mono- und Tri-stearinsäure-rsaccharoseester gefunden, das in wirksamer und J verhältnismässlg einfacher Heise und vorteilhaft in industriellem Maßstab, eel niedrigen Kosten und mit hoher Produktausbeute durch* geführt werden kann.

Erfindungsgemäss zeigte sich, dass erhebliche Mengen an Di-stearinsäure-trehaloseester, Arthronsäure-glukoseester und Mono- und . Tri-stearinsäure-saccharoseester in der Ferment&tlonsflüssigkeit •produziert und angesammelt werden, wenn man bestirnte zur Verwer-. tung von Kohlenwasserstoffen befähigt· Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium unteifaeroben Bedingungen züchtet. Diese Mikroorganismen sollten -Imstande sein. Kohlenwasserstoffe zu assi* milleren und nutzbar zu machen. Hierzu zählt ein Mikroorganismus der Gattung Arthrobaeter, Arthrobacter roseoparaffineus A¹TCC 15 584. ;

Unabhängig von Gattung und Familie existieren zahlreiche Mikro- ; Organismen, die Fettsäureester von Zuckern unter Verwertung von Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquelle produzieren und anreichern. So wird in der deutschen Patentanmeldung P 19 05 472. 9-41 ein Verfahren zur Herstellung von ArthronsSure-glukoseester und Arthronsäure-txehaloseester durch Züchten des Mikroorganismus Arthrobacter parafflneua ATCC 15 591* in der deutschen Patent-

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anmeldung (heute eingereichte Ausscheidung I, K 9^5) ein Verfahren zur Herstellung eines CgQH^jOp-Fettsäure-tJehaloseestere durch \ Züchten des Mikroorganismus Corynebac ttrlum hydrocarboclaatus j ATCC 15 592, in der deutschen Patentanmeldung (heute eingereichte! Ausscheidung UI₄ K 9^7) ein Verfahren zur Herstellung von ' Di-arthronsäure-ti'ehaloseester durch Züchten des Mikroorganismus Mlcroeoccus epidermidis ATCC 155 und in der deutschen Patentanmeldung (heute eingereichte Ausscheidung IV, K 9^8) ein Verfahren zur Herstellung des Trehaloseesters der einbasischen Fettsäure ^C52^Ho4°2 ^durch Züchten aer Mikroorganismen Mycobacterlum sp. ATCC 12 297 und Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582. vorgeschlagen·

Für die Züchtung des erfindungsg«mässen Stammes Arthrobaoter rosaoparaffineus ATCC 15 584 kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium verwendet werden, solange es die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Veruindungen und dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in .

angemessenen Mengen nutzbar gemacht werden. . ' · "

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Fermentation in einem wässrigen Nährmedium durchgeführt, das «inen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Zu derartigen Kohlenwasserstpffen gehören geradkettlge und verzweigtkettige Paraffine (Alkane) mit 6-25 Kohlenstoffatomen, wie z.B". η-Hexan, n-Octan, n-Deoan, n-Dodecan, n-Hexadtcan, n-Eisocan, Ieooctan usw.» Cycloparaffine, wie Cyclohexan und Cyclooctan, geradkettige und «erzweigtkettlge Olefine, wie Hexen-1, Octen-1, Octen-2 usw.« Cycloolefine, wie Cyclohexen, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, die i^eomeren Xylol« usw. sowie Gemische davon und ausserdera Kohlenwasserstoffe, die sich von Erdöl ableiten, z.B. Kerosin, Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle usw. Zusammen mit dem Kohlenwasserstoff können in dem Fermentationsmedium geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen verwendet werden, wie Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Fructose, Maltoae, Sucrose, Stärke,

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Stärkehydrolysate, Melassen usw., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie aganische oäuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure usw. Diese Substanzen können entweder einzeln oder im Gemisch von zweien oder mehreren verwendet werden.

Als Kohlenstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen verwendet werden, wie Harnstoff, wässriges Ammoniak oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumahlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammonium* phosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Mdsquellwasser,Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pept*on, Fischmehl, Bouillon, CaseinhydrOlyste, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleiee^trakt usw. Auch diese Substanzen können entweder einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren verwende* werden.

Anorganische Verbindungen, die dem Züchtungsmedium hinzugesetzt werden können, sind z.B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrcgenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Mangunchlorid, Ki-lciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw.

Aus s er dein kann .es bei bestimmten Stämmen noch notwendig eein, zu dem Züchtungemedium bestimmte essentielle Nährstoffe hinzuzufügen, wie,Aminosäuren, z.B. Asparaginsäure, Threonin, Methionin usw. und/oder Vitamine, z.B. Biotin, Thiamin, Cobalamin und dgl.

Für die Durchführung der erfindun£Sgemässen Züchtung wird das Züchtungsmedium sterilisiert, und dann wird der zu verwendenden Mikroorganismus in dieses eingeimpft. Die Züchtung wird unte⁵ aero-Den Bedingungen durchgeführt, z.B. als aerobe Schüttelkultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise etwa Z^lj - 4o° C und bei einem pH-Wert von ceispiel^weise etwa 4 eis 9· 'Während der Züchtung wird der pH-'« ;rt auf dßn. angegebenen 3ereich ( vorzugsweise pH ό bis S) eingestellt, und zwar durch Zusatz z.B. von Harnstofflösung, · wässr-igem Ammoniak odex¹ einer Aramoniurncarbonatlösung zu dem Medium. Die Zücatung ist ücliche.'weise inne^ulb von 2 bis 4 Tagen voll-

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ständig abgelaufen. In der Praxis ist die Züchtung beendet, wenn die Messung der Gesamtester einen Maximalwert ergibt.

^; Das Fettsäureesterprodukt des Zuckers sammelt sich vornehmlich in "der öligen schicht der Züchtungsflussigkeit an. Demzufolge wird nacn vollständigem Ablauf der Züchtung der wässrige Anteil der unteren Schicht der Fermentationsflüssigkeit entfernt, indem man _s die Fermentationsflüssigkeit ruhig in einem kalten Raum stehen . lässt oder indem man eine Trennung durch Zentrifugieren anwendet. Eine gemischte Chloroform-Methanol-Lösung (lsi) wird zu der oberen Schicht hinzugefügt, um die Gesamtmenge an Lipoiden darauf zu entfernen. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck bei ^0° C entfernt und der ölige Anteil der oberen Schient wird ; durcii Zentrifugen-Abtrennung gewonnen. Dis so erhaltene ölsehicht wird durch eine Silicagelsäule hindurchgeieltet, und es wird eine Elution mit Hexan vergenommen, ua· die vorhandenen !!«Paraffine zn entfernen. Anschliessend werden polare Verbindungen durch Elution mit Chloroform entfernt. Der Fettsäureester d@s Muckers wird erhalten/Durchführung einer Elution mit einem Chloroform-Methanol -Gemisch, Auffangen der j heiligen Fraktionen,, Entfernen des Lö- ^: sungsrnittels, Hinzufügen von kaltem Aceton* Sammeln dererhaltenen Niederschläge und schliesslich Reinigen mit Hilfe von Aceton. :

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern-, sie jedoch f nicrit oeschränken. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sieh die Prosentangaben auf das Gewicht je Liter Fermentationsflüssigkeit.

Beispiel

j Arthrobacter roseoparafflneus ATCC 15 584 wird in einem Kultur-' medium, welches 2 % Sorbit, 1 -p i'epton, 1 % Fleischextrakt und ! OJ ;'-. Natriumchlorid enthält, unter 24-etündigem Schütteln gezüch-. tet. Als Kohlenstoff quelle wird ein Gemisch aus Ο^^χς"^ enthaltenden Paraffinen verwendet. Die erhaltene Einsaatkultur wird In einera Verhältnis von 10 Vol.- in ein Züohtungsmedium eingeimpft, duy die folgende Zusammensetzung besitati

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-βίο # Kerosin
0,2 ;· K₂HPO₄
0,2 % KH₂PO₄
0,1 # MgSO₄ . 7H₂O
0,005 % MnSO₄ , 4Η'₂Ο
0,01 % FeSO₄ . 7H₂O
1 mg/1 CuSO₄. 5HgO
1.0 % (NH₄)₂SO₄
0,1 jb Maisquellwasser
20 ** /1 Thiamin

Der pH-Wert des Mediums wird vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt» Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C in einem 5-Liter-Jar-Ferraentor unter Rühren bei einer RUhrgesehwinäigkeit von t.00 Upm und unter Belüftung mit sterilisierter Luft mit einer Durchsatzgeachwlndigkeit von 1 Liter je Liter proMinute durcigefUhrt. Zu Beginn der Züchtung werden dem Züchtungsmedium 600 ml eines Gemisches von C₁₂ ~ C,,- n-Paraffinen als Kohlenstoff quelle hinzugefügt, und der pH-Wert des Mediums wird mit wässrigem Ammoniak eingestellt. Nach 72-stUndiger Züchtungsdauer werden 2,3 Liter der erhaltenen KulturflUssigkeit mittels einer Zentrifuge abgetrennt, und der wasserlösliche Teil der unteren S_#chicnt wird durch Absaugen entfernt. Es werden 0,65 Liter eines Ülschicht-Anteils erhalten. 4,5 Liter eines Gemisches aus Äthanol" und Äther (2tl) werden hinzugefügt und nach ausreichendem Mischen wird die Lösung filtriert. Es '/werden 5*1 Liter der Lxtraktionslösung auf 40° C unter vermindertem Druck erhitzt, um das Lösungsmittel aus derselben" zu entfernen, und, nachdem die restliche Lösung erhitzt worden ist, wird die Lösung der oberen Schicht durch Zentrifugen-Abtrennung gewonnen. Die obere Schicht wird abgenommen und η-Hexan zu derselben hinzugefügt. Sann wird die erhaltene Lösung auf 250 ml verdünnt und durch eine Silicagelsäule (5*2 cm χ 20 cm) hindurchgeschickt. Danach wird η-Hexan durch die Säule laufen gelassen, um alle zurückgebliebenen n-Parafflne auszuwaschen. Sodann wird Chloreform"durch die Säule geleitet, um nicnt-polure Substanzen zu entfernen. Nach Sammlung der- Fraktionen

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die mit dem Chloroform-Methanol-Oemlsch (95»5) eluiert worden waren, Entfernen des Lösungsmittels bei 40° C unter vermindertem Druck, Hinzufügen vcn warmem Aceton zwecks Auflösung des Gemisches und Stehenlassen des Gemisches unbewegt in einem kalten Raun ! wird ein Niederschlag mit gelatineartiger Konsistenz erhalten. '. Nach nochmaligem Unfällen werden 1,2 g pro Liter des Stearin· säuredi-*esterB der Tiehalose, 0,2 g pro Liter des Arthronsäuremonoesters der Glukose und 1,3 E eines Gemisches von StearinsHure* mono- und Triestein der Sucroae erhalten. '

- Patentanspruchs -

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von Di-stearinsäure-trehaloseester, Arthronsäure-glukoseester und Mono- und Trl»stearinsäuresaceharoseester, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismus Arthropacter roseoparaffineus ATCC 15 584 unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das einen Kohlenwasser-. stoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als Hauptkohlenstoffquelle enthält, und die Fettsäureester in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert.

A

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

als Kohlenwasserstoff ein n-Paraffin mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff Kerosin verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 25° bis 40 und bei einem pH-Wert von 4 bis 9 durchführt.

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5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff ein n-Paraffln mit 12 bis 3,5 Kohlenstoffatomen verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ! man die Fettsäureester aus dem Ölschicht-Antell der erhaltenen! KuItürflüssigkeit gewinnt. " 1

Dr. Pa./31·.

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