DE2711489A1 - Verfahren zur herstellung von stabilisierten erythrocyten und ihre verwendung als indikator zur durchfuehrung von antigen-antikoerper-reaktionen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von stabilisierten erythrocyten und ihre verwendung als indikator zur durchfuehrung von antigen-antikoerper-reaktionenInfo
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Description
" Verfahren zur Herstellung von stabilisierten Erythrocyten und ihre Verwendung als Indikator zur Durchführung
von Antigen-Antikörper-Reaktionen "
Priorität: 16. 3- 1976, V.St.A., Nr. 667 316
In der medizinischen Diagnose ist es häufig zweckmäßig, Erythrocyten als Trägerpartikel zur Feststellung von Antigenen
oder Antikörpern in einer Testflüssigkeit zu benutzen. Die Erythrocyten v/erden in diesem Fall als Indikator
benutzt, an die ein Antigen oder Antikörper gebunden ist. Beim Zusammenbringen einer antigenen Substanz mit einem
Antikörper, der für diese Substanz spezifisch ist, erfolgt eine Antigen-Antikörper-Reaktion. In einigen Systemen ist
diese Reaktion sichtbar. Es bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex,
der entweder mit dem unbewaffneten Auge oder unter dem Mikroskop festgestellt v/erden kann. In anderen
Fällen, bei denen zwar eine Antigen-Antikörper-Reaktion auftritt, ist das Reaktionsprodukt mit dem unbewaffnetem
Auge oder unter dem Mikroskop nicht feststellbar. In diesen Fällen ist es zweckmäßig, einen Träger entweder für das
Antigen oder den Antikörper vorzusehen, so daß die nachfol-
L- 709838/0919
gende Reaktion mit dem komplexbildenden Reaktionsteilnehmer
auf Grund einer Verklumpung oder Agglutination der Partikel sichtbar gemacht werden kann.
Es sind verschiedene Träger für Antigene oder Antikörper bekannt, beispielsweise Latexpartikel und Erythrocytes Die
Erythrocyten sind sehr labile Zellen, die Antigene durch das Wirtssystem transportieren können. Beispielsweise können humane
Erythrocyten die verschiedensten Antigene transportieren, deren Natur und Zusammensetzung einen Hinweis gibt, welche Art
von Blut ein Empfänger bei einer Transfusion vertragen kann.
Bei Verwendung von Erythrocyten zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen
wird die erhaltene Agglutination als Hämmagglutination bezeichnet. Wenn die Erythrocyten mit einem
Antikörper beladen sind, um ein Antigen in einem Wirtsserum nachzuweisen,wird die Agglutination als "reverse" passive
Hämagglutination bezeichnet.
Ein Beispiel für eine "reverse" passive Hämagglutination ist
der Test zur Bestimmung von Hepatitis-B-Antigen im Serum eines Patienten. Der passive Hämagglutinationstest hat den Nachteil,
daß die Erythrocyten extrem leicht zerfallen und instabil sind.
Wenn Erythrocyten in einem isotonischen Medium suspendiert sind, erfolgt innerhalb etwa 21 Tagen Lysis. Dabei erfolgt
eine Schwächung der Trägerstruktur der Erythrocyten, was zum
Austritt von Hämoglobin in das Medium führt, wodurch die Erythrocyten für den passiven Hämagglutinationstest unbrauchbar
werden.
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271U89 γ π
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, stabilisierte Erythrocyten zu schaffen, die für Antigen-Antikörper-Reaktionen
geeignet sind. Das Verfahren zum Stabilisieren der
Erythrocyten wird als Fixierung bezeichnet. 5
Die Fixierung von Erythrocyten zur Verbesserung ihrer Stabilität ist an sich bekannt. Bei der Wahl der Fixiermittel muß
darauf geachtet werden, daß hierbei keine nennenswerte Lysis der Erythrocyten auftritt und diese Fixiermittel sich auf den
Hämagglutinationstest nicht nachteilig auswirken. Vermutlich erfolgt bei der Fixierung eine chemische Reaktion mit Proteinkomponenten
an der Oberfläche der Erythrocyten, die zu einer stabilisierten Zelle führt.
In der US-PS 3 714 345 ist ein zweistufiges Verfahren zur Behandlung
von Erythrocyten mit Aldehyden beschrieben. In einer ersten Stufe werden die Erythrocyten mit Brenztraubenaldehyd
und in der zweiten Stufe mit Formaldehyd behandelt. In der Patentschrift ist angegeben, daß diese stabilisierten Erythrocyten
keine nennenswerte Änderung in ihrer Kapazität, mit Anti-A oder Anti-B-Serum zu reagieren, erfahren. Die Stabilisierung
soll also die Antigenität der Erythrocyten nicht vermindern.
Auch aus anderen Veröffentlichungen sind verschiedene Methoden der Fixierung bekannt. Beispielsweise ist in der Zeitschrift
Brit. J. Haeraat., Bd. 7 (1961), S. 299, die Behandlung von Erythrocyten mit Formaldehyd, Brenztraubenaldehyd, Glyoxal,
, Glutardialdehyd oder Glyoxylsäure beschrieben. Als Fixier- ^
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271H89
• mittel wird Brenztraubenaldehyd bevorzugt. Die Verwendung großer Mengen Glyoxal lieferte fixierte Erythrocyten, die
nicht zuverlässig als Träger zur Beladung mit Serumproteinen, wie Antigenen und Antikörpern, verwendet werden konnten.
Daraus wurde der Schluß gezogen, daß die Fixierung mit Glyoxal ungeeignet ist. Im Gegensatz zu den mit Brenztraubenaldehyd
behandelten Erythrocyten wurde bei den mit Glyoxal behandelten Erythrocyten eine schlechte Stabilität nach
6 Monaten erhalten. 10
Erythrocyten wurden auch mit Salzen von Peroxyverbindungen behandelt (vgl. Chem. Abstracts 1961, S. 27495) und für Antigen-Antikörper-Agglutinationssysteme
benutzt; vgl. Chem.
Abstracts, 1961, S. 20672. 15
Der Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe liegt der Befund
zugrunde, daß Erythrocyten durch eine zweistufige Behandlung mit Aldehyden wirksam stabilisiert werden können und sich
dennoch für Antigen-Antikörper-Reaktionen eignen, wenn man die Erythrocyten in einer ersten Stufe mit einer bestimmten
Menge Glyoxal und in
einer zweiten Stufe mit einer bestimmten Menge Formaldehyd oder Glyoxal behandelt. Glyoxal ist ein Aldehyd, der in monomerer,
dimerer, trimerer oder polymerer Form vorliegen kann.
25 Monomeres Glyoxal hat die Formel
Die Verbindung ist ein Feststoff, die in trimerer Form mit L · 709838/0919 J
271U89
zwei Molekülen Kristallwasser vorliegt und folgende Formel
hat:
"Vhoh
* 2H2°
Glyoxal ist auch als 40prozentige wäßrige Lösung, bezogen auf das Gewicht an monomerem freiem Glyoxal, erhältlich.
Formaldehyd ist in der Regel als wäßrige Lösung erhältlich, die 40 g Formaldehyd pro 100 ml wäßrige Lösung enthält.
Die Menge an Erythrocyten in einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit, unabhängig von ihrer Herkunft, beispielsweise
^5 vom Schaf, Truthahn, Kaninchen oder Menschen, wird durch das
Volumen ausgedrückt, das diese Zellen einnehmen. Ein brauchbares Maß der Menge der Erythrocyten in einer Flüssigkeit
ist das Volumen der Zellen, ausgedrückt als Prozentsatz am Gesamtvolumen der Suspension in einer bestimmten
Probe. Dieser Parameter wird als Hämatokrit oder konzentriertes Zellvolumen · bezeichnet. Er gibt einen zuverlässigen Y/ert
des Erythrocytenvolumens wieder. Der Hämatokrit ist ein standardisierter Parameter, der durch einen Prozentwert ausgedrückt
wird. Beispielsweise bedeutet ein Hämatokrit von 40 %, daß die Erythrocyten in 100 ml einer Suspension von roten
Blutkörperchen ein Volumen von 40 ml einnehmen. Somit ist das konzentrierte Zellvolumen 40 ml. Bei einer Verdoppelung
des Volumens einer Erythrocytensuspension bleibt zwar das
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Volumen der Erythrocyten in der Suspension das gleiche, der Hämatokrit nimmt jedoch um die Hälfte des ursprünglichen
Wertes ab, d.h. er beträgt im gegebenen Beispiel 20 %.
Der Hämatokrit wird nach üblichen Methoden bestimmt. Für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Hämatokrit nach Wintrobe bestimmt. Es handelt sich um eine Makrohämatokrit-
Methode, die in Clinical Diagnosis By Laboratory Methods,
14. Auflage, W.B. Saunders Company, Herausgeber Israel Davidsohn und John Bernard Henry, S. 146, beschrieben ist.
Es wurde festgestellt, daß die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete Menge an Glyoxal und Formaldehyd zu einer Einheit des Hämatokritmeßverfahrens nach Wintrobe in Beziehung gesetzt
werden kann. Der Hämatokritwert ist der Volumenanteil an Erythrocyten im Blut. Dieses Volumen ändert sich normalerweise
nicht in signifikantem Ausmaß bei verschiedenen Blutproben, sofern die Bedingungen des Zentrifugierens der Proben praktisch
gleichwertig sind. So kann beispielsweise eir. Hämatokritwert für Schaferythrocyten mit dem Hämatokritwert verglichen werden,
der bei Erythrocyten des Truthahns oder bei humanen Erythro-
der
cyten erhalten wird, hinsichtlich / Menge an Fixierungsmittel,
cyten erhalten wird, hinsichtlich / Menge an Fixierungsmittel,
die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden muß. Im
erfindungsgemäßen Verfahren bezieht sich der Hämatokritwert auf
das konzentrierte Volumen der Erythrocyten, bestimmt nach der Wintrobe-Makromethode bei 20 bis 30minütiger Zentrifugation bei
mindestens 2500 G. Der Ausdruck konzentriertes Zellvolumen bedeutet hier das Volumen der Erythrocyten, das unter den vorste-
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271Η89
hend aufgeführten Bedingungen erhalten wurde, sofern nichts anderes angegeben ist.
Ein zweckmäßiger Hämatokritwert. für das erfindungsgemäße Verfahren liegt bei 8 %. Dies entspricht 0,8 mi Erythrocyten
pro 10 ml Blut. Diese Konzentration ergibt eine leicht zu handhabende Suspension der Erythrocyten, die wesentlich
weniger viskos ist als Nativblut, jedoch noch genügend konzentriert, um eine signifikante Menge an Erythrocyten
umzusetzen. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird in der
ersten Stufe Glyoxal in einer Menge von 0,1 bis 0,4 g, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 g/0,8 ml Erythrocyten verwendet. Vorzugsweise
wird Glyoxal in Form einer verdünnten 1 bis 4prozentigen Lösung, d.h. 1 bis 4 g Glyoxal, bezogen auf das
freie Monomer, in 100 ml Lösung, verwendet. Zweckmäßig wird eine 40prozentige Glyoxallösung auf diese Konzentration verdünnt.
Die Art der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten
Erythrocyten hängt von der Art der Anti gen-Antikörper-Reaktionen
ab, für die sie verwendet werden sollen. In zahlreichen Fällen werden humane Erythrocyten verwendet, doch können
auch Erythrocyten vom Schaf, Pferd, Hühnern, Truthühnern und Kaninchen eingesetzt werden. Die Erythrocyten werden mit
Glyoxal in Gegenwart eines wäßrigen Mediums zusammengebracht, dessen osraotischer Druck die Erythrocyten nicht beeinträchtigt.
Vorzugsweise wird ein hypertones Medium verwendet, beispielsweise eine Natriumcitratlösung, und die Behand-
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271U89
γ π
lung wird vorzugsweise über 18 bis 2k Stunden durchgeführt.
Kürzere oder längere Behandlungszeiten ergeben keine nennenswerten
Vorteile. Die Temperatur des Mediums beträgt gewöhnlich 18 bis 25°C.
Die Konzentration an Natriumeitrat im fertigen Medium hängt
von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise der Konzentration des Aldehyds und der Herkunft der Erythrocyten. Vorzugsweise
enthält das wäßrige Medium 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen Natriumcitrat-dihydrat.
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist für die
Stabilisierung der Erythrocyten von entscheidender Bedeutung. In dieser Stufe werden die sehr instabilen nativen Erythrocyten
in eine stabilere Form überführt, die gegen Änderungen des Milieus widerstandsfähiger sind. Dies hat zur Folge, daß
die Bedingungen in der zweiten Behandlungsstufe in einem weiteren Umfang variieren können, als in der ersten Stufe.
Nach der Behandlung in der ersten Stufe werden die Erythrocyten von gegebenenfalls entstandenen hämolysierten Zellen
freigewaschen. Gewöhnlich wird dazu eine isotone Kochsalzlösung verwendet. Sodann werden die Erythrocyten in der zweiten
Stufe entweder mit Formaldehyd oder Glyoxal in einer Menge von mindestens 0,1 g, vorzugsweise von 0,1 bis 0,6 g und am
günstigsten von 0,1 bis 0,3 g/0,8 ml Erythrocyten behandelt. Diese Behandlung wird zweckmäßig unter den gleichen Bedingung
gen durchgeführt wie die Behandlung in der ersten Stufe. Bei
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r t .. 271Η89
höheren Aldehydkonzentrationen verkürzt sich die Behandlungszeit. Nach Beendigung der zweiten Behandlung v/erden die
Erythrocyten vorzugsweise erneut mit einer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung gewaschen. Sodann können sie mit einem
Antigen oder Antikörper zur Herstellung eines Indikators beladen werden.
Es wurde festgestellt, daß erfindungsgemäß stabilisierte
Erythrocyten mindestens 8 Monate bei einer Temperatur von 5°C stabil sind, keine Anzeichen von Hämolyse zeigen und sich mit
einem Antigen oder Antikörper beladen lassen. Dies ist bei unbehandelten Erythrocyten nicht der Fall, bei denen nahezu sofort
die Hämolyse einsetzt und gewöhnlich innerhalb etwa 21 Tagen beendet ist.
Die erfindungsgemäß stabilisierten Erythrocyten behalten ihre
Fähigkeit zur Beladung mit einem Antikörper oder Antigen und zur spezifischen Reaktion. Die erfindungsgemäß stabilisierten
Erythrocyten lassen sich in bekannter Weise mit einem Antikörper
oder Antigen beladen, beispielsweise mit humanem Chorio-Gonadatropin, Heptatitis-Antikörpern, Fibrinogen, Albumin
oder Gamma-Globulin.
Die vorstehend angegebenen Bedingungen zur Bestimmung des Hämatokritwertes nach Wintrobe dienen zv/ei Zwecken, nämlich
zur Angabe eines Standards für alle Quellen von Erythrocyten und zur Verwendung von üblichen Laboratoriumsmethoden. Bei
Verwendung unterschiedlicher Meßmethoden oder elektronischer
L j
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Zellenzähler werden andere Werte für das Erythrocytenvolumen
erhalten, als unter den Bedingungen der Methode von Wintrobe. In diesem Fall muß das Erythrocytenvolumen auf den
Hämatokritwert nach Wintrobe umgerechnet werden.
Als Pufferlösungen oder Verdünnungsmittel können alle üblichen Lösungen verwendet werden, die für Erythrocyten verträglich
sind. Es muß sich also um Lösungen handeln, die die vorhandenen Antigene oder Antikörper nicht verändern und eine
Lysis der Erythrocyten vermeiden. Solche Lösungen sind z.B. Kochsalz- und Natriumcitratlösungen. Besonders bevorzugt sind
4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen enthaltende Natriumcitratlösungen.
15 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung,
100 ml Rh-negatives menschliches Blut der Blutgruppe 0 werden
in einem üblichen Säure-Citrat-Dextrose (ACD) Antikoagulansmedium
gesammelt. Die Zellen werden viermal in 10 Volurnteilen isotoner Kochsalzlösung gewaschen und dann in einem der beiden
nachstehend angegebenen Puffer auf einem Wintrobe-Hämatokritwert
von 8 % suspendiert.
Die verwendeten Puffer haben folgende Zusammensetzung:
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-Mr-
Puffer 1: Citratpuffer; 5,0 Gewichtsprozent/Volumen enthaltende
wäßrige Lösung von Natriumeitrat . 2H2O mit
einem pH-V/ert von 8,7
Puffer 2: Phosphatpuffer; 16,18 g Na2HPO^ ; 9,4 g KH2PO^ ;
vom pH-Wert 7,2; Molarität 0,15.
40prozentige wäßrige Glyoxallösung v/ird mit den in der nachstehenden
Tabelle angegebenen Puffern verdünnt. Sodann werden 10 ml der verdünnten gepufferten Glyoxallösung mit
10 ml Erythrocytensuspension vermischt. Es werden also in jedem Fall 0,8 ml Erythrocyten mit der angegebenen Menge
Glyoxal zusammengebracht.
obe | Υ» Glyoxal | g Glyoxal | Aldehyd-Puffer | Ery thro cy. t en- Puffer |
Λ | 4 | 0,4 | Citrat | Citrat |
B | 4 | 0,4 | Citrat | Citrat |
C | 4 | 0,4 | Citrat | Citrat |
D | 4 | 0,4 | Citrat | Citrat |
E | 6 | 0,6 | Citrat | Citrat |
F | 1 | 0,1 | Phosphat | Phosphat |
G | 3 | 0,3 | Phosphat | Phosphat |
H | 5 | 0,5 | Phosphat | Phosphat |
Jede Probe wird 18 bis 24 Stunden bei 20 bis 25°C mittels eines Magnetrührers vermischt. Sodann werden die fixierten
Zellen jeder Probe viermal in Kochsalzlösung gewaschen und wieder auf einen Hämatokritwert von 8 % in 5prozentigem
Citratpuffer eingestellt.
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1 ' Beispiel2
Die in Beispiel 1 erhaltenen Proben A bis H werden mit dem
in Tabelle II angegebenen Aldehyd in den angegebenen Mengen
behandelt. 5
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Γ | Probe | IO Ui |
Puffer für die behandelte Erythrocyten- Suspension |
Tabelle II |
AG* | Citrat | Aldehyd | ||
BG | Volumen der behandelten Erythrocyten- Suspension |
Citrat | Formaldehyd | |
CG | 10 ml | Citrat | Formaldehyd | |
DG | 10 ml | Citrat | Glyoxal '2' | |
EG | 10 ml | Citrat | Glyoxal | |
ο
co |
FG | 10 ml | Citrat | Formaldehyd |
co co |
GG | 1,15 πα | Citrat | Formaldehyd |
OO | 6,3 ml | Citrat | Formaldehyd | |
co | 10 ml | Formaldehyd | ||
co | 10 ml | |||
Ul
- 13 -
Volumen Puffer für Aide- Menge des den Aide- hyd, Aldehyds,
hyd % g
10 | ml | Citrat | 1,1 | 0,11 |
10 | ml | Citrat | 5,4 | 0,54 |
10 | ml | Citrat | 1,0 | 0,1 |
10 | ml | Citrat | 5,0 | 0,5 |
1,1 | 5 ml | Citrat | 3,2 | 0,037 |
6,3 | ml | Citrat | 3,2 | 0,2 j |
10 | ml | Citrat | 3,2 | 0,32 * |
10 | ml | Citrat | 3,2 | 0,32 |
Anm.: * G = mit Glyoxal behandelt
(1) 40prozentlge wäßrige Formaldehydlösung wird mit Citratpuffer auf die angegebene
Aldehydkonzentration verdünnt.
(2) 40prozentige Glyoxallösung wird mit Citratpuffer auf die angegebene Aldehydkonzentration
verdünnt.
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Die mit Glyoxal behandelten Erythrocyten werden 18 bis 24 Stunden mit dem Aldehyd bei Raumtemperatur behandelt, sodann
viermal mit Kochsalzlösung gewaschen und hierauf in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer der nachstehend angegebenen
Zusammensetzung auf einen Hämatokritwert von 8 c/» eingestellt.
Zusammensetzung des Posphatpuffers:
3,26 g KH2PO4; 10,78 g Na2HPO4 ; 1 g NaN^ mit Wasser auf
1 Liter aufgefüllt.
Die Erythrocyten werden 1 Woche bei +50C stehengelassen und
sodann auf Hämolyse untersucht. Der Überstand der Proben F, G und H ist gelb gefärbt. Dies zeigt, daß die Erythrocyten
nicht vollständig stabilisiert worden sind.
Die in Beispiel 2 erhaltenen Proben A bis H werden in einem Antigen-Antikörper-Indikatorsystem folgendermaßen verwendet:
125 ul der Erythrocytensuspension in 0,1 molarem Phosphatpuffer
mit einem Hämatokritwert von 8 % werden in ein Reagensglas gegeben. Die Erythrocyten werden einmal mit isotoner
Kochsalzlösung gewaschen. Die Kochsalzlösung wird dekantiert, und sodann werden 0,5 ml eines 0,1 molaren Acetatpuffers
der nachstehend angegebenen Zusammensetzung vom pH-Wert 4 zugegeben. Der Acetatpuffer wird aus 2,45 g
Natriumacetat . 3H2O, 4,7 ml Eisessig, aufgefüllt auf 1000 ml
mit destilliertem Wasser hergestellt. Die Zellensuspension wird mit 5 bis 20 ug affinitätsgereinigtem Kepatitis-B
, Oberflächenantikörper aus einem Schimpansen versetzt. So- ,
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271U89 π
_ USr -
^ dann wird die Suspension 75 Minuten bei Raumtemperatur gemischt.
Hierauf werden die Erythrocyten viermal mit isotoner
Kochsalzlösung gewaschen. Die Kochsalzlösung wird dekantiert. Danach werden die Zellen in dem in Beispiel 2 beschriebenen
0,1 molaren Phosphatpuffer suspendiert, der zusätzlich
0,01 molar EDTA, 1 % normales humanes Serum und 0,1 % Gelatine
enthält. Jeweils 25 »1 oeder Zellensuspension v/erden sodann
in eine Vertiefung einer Mikrotestplatte gegeben, die 25 Wl eines Verdünnungsmittels und 7 Ul entweder
a) menschliches Serum mit Hepatitis B Antigen (schwach positiv im Radioimmunoassay-Test),
b) menschliches Serum (im Radioimmunoassay-Test negativ auf Heptatitis B Antigen) oder
c) lediglich das Verdünnungsmittel enthält; Kontrollvertiefung.
durch Schütteln In Jedem Fall werden die mit dem Antikörper beladenen Zellen/
gemischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur ruhig stehengelassen. Hierauf werden die Vertiefungen auf das Vorliegen einer Agglutinationsreaktion
untersucht. Die Proben A bis D ergeben Reaktionen mit dem positiven Serum und keine Reaktion mit den
bekannten negativen Seren. Die Kontrollprobe ergab keine Reaktion.
Die Probe E wurde mit 0,6 g Glyoxal pro 0,8 ml Erythrocyten hergestellt; sie lieferte eine unspezifische Reaktion mit den
negativen Seren.
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271H89
. "* spezifische
Die Proben F bis H ergaben keine /Reaktion. Dies zeigt, daß
. sie in einem Indikatorsystem zur Bestimmung von Hepatitis B Oberflächenantigen ungeeignet sind.
5 ._ Beispiel U
Beispiel 1 wird mit den in Tabelle III angegebenen Mengen an Aldehyd wiederholt.
Behandlung von Erythrocyten in Citratpuffer mit
Glyoxal in Citratpuffer
robe | 1 | Aldehvd | R Aldehvd |
1 | 1 | (Glyoxal) | 0,1 |
2 | 1 | (Glyoxal) | 0,1 |
3 | 1 | (Glyoxal) | 0,1 |
4 | 5 | (Glyoxal) | 0,1 |
5 | 5 | (Glyoxal) | 0,5 |
6 | 5 | (Glyoxal) | 0,5 |
7 | 5 | (Glyoxal) | 0,5 |
8 | 3 | (Glyoxal) | 0,5 |
9 | 3 | (Glyoxal) | 0,3 |
10 | 3 | (Glyoxal) | 0,3 |
11 | 3 | ,2 (Formaldehyd) | 0,32 |
12 | ,2 (Formaldehyd) | 0,32 | |
Die zweite Fixierstufe wird gemäß Beispiel 2 mit den in Tabelle
IV angegebenen Aldehyden in den angegebenen Mengen durchgeführt.
25
25
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Probe
Tabelle IV % Aldehyd
g Aldehyd pro 0,8 ml Erythrocytenvolumen
0,11
0,54
0,1
0,5
0,11
0,54
0,1
0,5
0,3
0,32
0,32
0,3
Die Proben 1 bis 4 sowie 9 und 10 zeigten spezifische Reak tionen mit dem Hepatitis B Oberflächenantigen nach der in
Beispiel 3 beschriebenen Methode. Sie ergaben keine Reaktionen mit der Kontrollprobe und den bekannten negativen
Seren.
1=1 | Gx. | 1,1 | Form. |
2 = 1 | Gx. | 5,4 | Form. |
3 = 1 | Gx. | 1 | Gx. |
4 = 1 | Gx | 5 | Gx. |
5 = 5 | Gx. | 1,1 | Form. |
6=5 | Gx. | 5,4 | Form. |
7 = 5 | Gx. | 1 | Gx. |
8=5 | Gx. | 5 | Gx. |
9 = 3 | Gx. | 3 | Gx. |
10 = 3 | Gx. | 3,2 | Form. |
11 = 3, | 2 Form. | 3,2 | Form. |
12 = 3, | 2 Form. | 3 | Gx. |
20 Die Proben 5 bis 8 ergaben unspezifische Reaktionen mit dem Hepatitis B Oberflächenantigen in den negativen Serumproben.
Die Proben 11 und 12 ergaben keine spezifische Reaktion mit 25 positiven Hepatitis B Oberflächenantigen enthaltenden Seren.
Sie sind deshalb ungeeignet.
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Claims (12)
- Patentansprüche( 1 .J Verfahren zur Herstellung stabilisierter Erythrocyten,dadurch gekennzeichnet, daß man a) Erythrocyten in einem wäßrigen Medium mit 0,1 bis 0,4 g Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte Erythrocyten behandelt undb) die behandelten Erythrocyten in einem wäßrigen Medium mit mindestens 0,1 g Formaldehyd oder Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte behandelte Erythrocyten zusammenbringt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe a) und b) ein wäßriges Medium mit einemfür Erythrocyten verträglichen osmotischen Druck verwendet.
15 - 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe a) und b) eine hypertonische Natriumcitratlösung verwendet.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe a) 18 bis 24 Stunden bei 18 bis 25° C durchführt.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe b) 18 bis 24 Stunden bei 18 bis 250C durchführt.709838/0919271U89
- 6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) die Erythrozyten mit einer wäßrigen Formaldehyd- oder Glyoxallösung behandelt.
- 7. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) die behandelten Erythrocyten mit 0,1 bis 0,6 g Formaldehyd oder Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte behandelte Erythrocyten zusammenbringt.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe a) erhaltenen behandelten Erythrocyten aus dem wäßrigen Medium abtrennt und vor der Behandlung in Stufe b) wäscht.
- 9· Verfahren zur Herstellung von stabilisierten Erythrocyten zur Verwendung im passiven Hämagglutinationstest mit Hepatitis-associiertem Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man(1) eine hypertonische wäßrige Suspension humaner Erythro-cyten mit 4,5 bis 5 Gev/ichtsprozent/Volumen Na tr ium ei trat mit(2) einer wäßrigen Glyoxallösung mit 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen Natriumeitrat in einer Menge von 0,1 bis 0,4 g Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte25 Erythrocyten zusammenbringt,(3) die mit Glyoxal behandelten Erythrocyten aus der Suspension abtrennt,709838/0919Γ . 271Η89 ι- aer -- I.(4) mit den behandelten Erythrocyten eine zweite hypertonische wäßrige Suspension mit 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/ Volumen Natriumeitrat herstellt und(5) diese zweite hypertonische wäßrige Suspension aus behandelten Erythrocyten mit einer wäßrigen Lösung von Glyoxaloder Formaldehyd mit 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen Natriumeitrat in einer Menge von 0,1 bis 0,6 g Glyoxal oder Formaldehyd pro 0,8 ml konzentrierte behandelte Erythrocyten zusammenbringt.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, daß man die erste und zweite Behandlungsstufe bei 18 bis 250C durchführt.
- 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste und zweite Behandlungsstufe 18 bis 24 Stunden durchführt.
- 12. Verwendung der gemäß Anspruch 1 bis 11 hergestellten stabilisierten Erythrocyten als Indikator zur Durchführung von Antigen-Antikörper-Reaktionen.709838/0919
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