DE2711489A1 - Verfahren zur herstellung von stabilisierten erythrocyten und ihre verwendung als indikator zur durchfuehrung von antigen-antikoerper-reaktionen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von stabilisierten erythrocyten und ihre verwendung als indikator zur durchfuehrung von antigen-antikoerper-reaktionen

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DE2711489A1
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Description

" Verfahren zur Herstellung von stabilisierten Erythrocyten und ihre Verwendung als Indikator zur Durchführung von Antigen-Antikörper-Reaktionen "
Priorität: 16. 3- 1976, V.St.A., Nr. 667 316
In der medizinischen Diagnose ist es häufig zweckmäßig, Erythrocyten als Trägerpartikel zur Feststellung von Antigenen oder Antikörpern in einer Testflüssigkeit zu benutzen. Die Erythrocyten v/erden in diesem Fall als Indikator benutzt, an die ein Antigen oder Antikörper gebunden ist. Beim Zusammenbringen einer antigenen Substanz mit einem Antikörper, der für diese Substanz spezifisch ist, erfolgt eine Antigen-Antikörper-Reaktion. In einigen Systemen ist diese Reaktion sichtbar. Es bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex, der entweder mit dem unbewaffneten Auge oder unter dem Mikroskop festgestellt v/erden kann. In anderen Fällen, bei denen zwar eine Antigen-Antikörper-Reaktion auftritt, ist das Reaktionsprodukt mit dem unbewaffnetem Auge oder unter dem Mikroskop nicht feststellbar. In diesen Fällen ist es zweckmäßig, einen Träger entweder für das Antigen oder den Antikörper vorzusehen, so daß die nachfol-
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gende Reaktion mit dem komplexbildenden Reaktionsteilnehmer
auf Grund einer Verklumpung oder Agglutination der Partikel sichtbar gemacht werden kann. Es sind verschiedene Träger für Antigene oder Antikörper bekannt, beispielsweise Latexpartikel und Erythrocytes Die Erythrocyten sind sehr labile Zellen, die Antigene durch das Wirtssystem transportieren können. Beispielsweise können humane Erythrocyten die verschiedensten Antigene transportieren, deren Natur und Zusammensetzung einen Hinweis gibt, welche Art von Blut ein Empfänger bei einer Transfusion vertragen kann.
Bei Verwendung von Erythrocyten zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen wird die erhaltene Agglutination als Hämmagglutination bezeichnet. Wenn die Erythrocyten mit einem Antikörper beladen sind, um ein Antigen in einem Wirtsserum nachzuweisen,wird die Agglutination als "reverse" passive Hämagglutination bezeichnet.
Ein Beispiel für eine "reverse" passive Hämagglutination ist der Test zur Bestimmung von Hepatitis-B-Antigen im Serum eines Patienten. Der passive Hämagglutinationstest hat den Nachteil, daß die Erythrocyten extrem leicht zerfallen und instabil sind.
Wenn Erythrocyten in einem isotonischen Medium suspendiert sind, erfolgt innerhalb etwa 21 Tagen Lysis. Dabei erfolgt eine Schwächung der Trägerstruktur der Erythrocyten, was zum Austritt von Hämoglobin in das Medium führt, wodurch die Erythrocyten für den passiven Hämagglutinationstest unbrauchbar werden.
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271U89 γ π
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, stabilisierte Erythrocyten zu schaffen, die für Antigen-Antikörper-Reaktionen geeignet sind. Das Verfahren zum Stabilisieren der
Erythrocyten wird als Fixierung bezeichnet. 5
Die Fixierung von Erythrocyten zur Verbesserung ihrer Stabilität ist an sich bekannt. Bei der Wahl der Fixiermittel muß darauf geachtet werden, daß hierbei keine nennenswerte Lysis der Erythrocyten auftritt und diese Fixiermittel sich auf den Hämagglutinationstest nicht nachteilig auswirken. Vermutlich erfolgt bei der Fixierung eine chemische Reaktion mit Proteinkomponenten an der Oberfläche der Erythrocyten, die zu einer stabilisierten Zelle führt.
In der US-PS 3 714 345 ist ein zweistufiges Verfahren zur Behandlung von Erythrocyten mit Aldehyden beschrieben. In einer ersten Stufe werden die Erythrocyten mit Brenztraubenaldehyd und in der zweiten Stufe mit Formaldehyd behandelt. In der Patentschrift ist angegeben, daß diese stabilisierten Erythrocyten keine nennenswerte Änderung in ihrer Kapazität, mit Anti-A oder Anti-B-Serum zu reagieren, erfahren. Die Stabilisierung soll also die Antigenität der Erythrocyten nicht vermindern.
Auch aus anderen Veröffentlichungen sind verschiedene Methoden der Fixierung bekannt. Beispielsweise ist in der Zeitschrift Brit. J. Haeraat., Bd. 7 (1961), S. 299, die Behandlung von Erythrocyten mit Formaldehyd, Brenztraubenaldehyd, Glyoxal,
, Glutardialdehyd oder Glyoxylsäure beschrieben. Als Fixier- ^
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• mittel wird Brenztraubenaldehyd bevorzugt. Die Verwendung großer Mengen Glyoxal lieferte fixierte Erythrocyten, die nicht zuverlässig als Träger zur Beladung mit Serumproteinen, wie Antigenen und Antikörpern, verwendet werden konnten.
Daraus wurde der Schluß gezogen, daß die Fixierung mit Glyoxal ungeeignet ist. Im Gegensatz zu den mit Brenztraubenaldehyd behandelten Erythrocyten wurde bei den mit Glyoxal behandelten Erythrocyten eine schlechte Stabilität nach
6 Monaten erhalten. 10
Erythrocyten wurden auch mit Salzen von Peroxyverbindungen behandelt (vgl. Chem. Abstracts 1961, S. 27495) und für Antigen-Antikörper-Agglutinationssysteme benutzt; vgl. Chem.
Abstracts, 1961, S. 20672. 15
Der Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe liegt der Befund zugrunde, daß Erythrocyten durch eine zweistufige Behandlung mit Aldehyden wirksam stabilisiert werden können und sich dennoch für Antigen-Antikörper-Reaktionen eignen, wenn man die Erythrocyten in einer ersten Stufe mit einer bestimmten Menge Glyoxal und in
einer zweiten Stufe mit einer bestimmten Menge Formaldehyd oder Glyoxal behandelt. Glyoxal ist ein Aldehyd, der in monomerer, dimerer, trimerer oder polymerer Form vorliegen kann.
25 Monomeres Glyoxal hat die Formel
Die Verbindung ist ein Feststoff, die in trimerer Form mit L · 709838/0919 J
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zwei Molekülen Kristallwasser vorliegt und folgende Formel
hat:
"Vhoh
* 2H2°
Glyoxal ist auch als 40prozentige wäßrige Lösung, bezogen auf das Gewicht an monomerem freiem Glyoxal, erhältlich. Formaldehyd ist in der Regel als wäßrige Lösung erhältlich, die 40 g Formaldehyd pro 100 ml wäßrige Lösung enthält.
Die Menge an Erythrocyten in einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit, unabhängig von ihrer Herkunft, beispielsweise
^5 vom Schaf, Truthahn, Kaninchen oder Menschen, wird durch das Volumen ausgedrückt, das diese Zellen einnehmen. Ein brauchbares Maß der Menge der Erythrocyten in einer Flüssigkeit ist das Volumen der Zellen, ausgedrückt als Prozentsatz am Gesamtvolumen der Suspension in einer bestimmten Probe. Dieser Parameter wird als Hämatokrit oder konzentriertes Zellvolumen · bezeichnet. Er gibt einen zuverlässigen Y/ert des Erythrocytenvolumens wieder. Der Hämatokrit ist ein standardisierter Parameter, der durch einen Prozentwert ausgedrückt wird. Beispielsweise bedeutet ein Hämatokrit von 40 %, daß die Erythrocyten in 100 ml einer Suspension von roten Blutkörperchen ein Volumen von 40 ml einnehmen. Somit ist das konzentrierte Zellvolumen 40 ml. Bei einer Verdoppelung des Volumens einer Erythrocytensuspension bleibt zwar das
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Volumen der Erythrocyten in der Suspension das gleiche, der Hämatokrit nimmt jedoch um die Hälfte des ursprünglichen Wertes ab, d.h. er beträgt im gegebenen Beispiel 20 %.
Der Hämatokrit wird nach üblichen Methoden bestimmt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Hämatokrit nach Wintrobe bestimmt. Es handelt sich um eine Makrohämatokrit- Methode, die in Clinical Diagnosis By Laboratory Methods, 14. Auflage, W.B. Saunders Company, Herausgeber Israel Davidsohn und John Bernard Henry, S. 146, beschrieben ist.
Es wurde festgestellt, daß die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Menge an Glyoxal und Formaldehyd zu einer Einheit des Hämatokritmeßverfahrens nach Wintrobe in Beziehung gesetzt werden kann. Der Hämatokritwert ist der Volumenanteil an Erythrocyten im Blut. Dieses Volumen ändert sich normalerweise nicht in signifikantem Ausmaß bei verschiedenen Blutproben, sofern die Bedingungen des Zentrifugierens der Proben praktisch gleichwertig sind. So kann beispielsweise eir. Hämatokritwert für Schaferythrocyten mit dem Hämatokritwert verglichen werden, der bei Erythrocyten des Truthahns oder bei humanen Erythro-
der
cyten erhalten wird, hinsichtlich / Menge an Fixierungsmittel,
die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden muß. Im erfindungsgemäßen Verfahren bezieht sich der Hämatokritwert auf
das konzentrierte Volumen der Erythrocyten, bestimmt nach der Wintrobe-Makromethode bei 20 bis 30minütiger Zentrifugation bei mindestens 2500 G. Der Ausdruck konzentriertes Zellvolumen bedeutet hier das Volumen der Erythrocyten, das unter den vorste-
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hend aufgeführten Bedingungen erhalten wurde, sofern nichts anderes angegeben ist.
Ein zweckmäßiger Hämatokritwert. für das erfindungsgemäße Verfahren liegt bei 8 %. Dies entspricht 0,8 mi Erythrocyten pro 10 ml Blut. Diese Konzentration ergibt eine leicht zu handhabende Suspension der Erythrocyten, die wesentlich weniger viskos ist als Nativblut, jedoch noch genügend konzentriert, um eine signifikante Menge an Erythrocyten umzusetzen. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird in der ersten Stufe Glyoxal in einer Menge von 0,1 bis 0,4 g, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 g/0,8 ml Erythrocyten verwendet. Vorzugsweise wird Glyoxal in Form einer verdünnten 1 bis 4prozentigen Lösung, d.h. 1 bis 4 g Glyoxal, bezogen auf das freie Monomer, in 100 ml Lösung, verwendet. Zweckmäßig wird eine 40prozentige Glyoxallösung auf diese Konzentration verdünnt.
Die Art der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Erythrocyten hängt von der Art der Anti gen-Antikörper-Reaktionen ab, für die sie verwendet werden sollen. In zahlreichen Fällen werden humane Erythrocyten verwendet, doch können auch Erythrocyten vom Schaf, Pferd, Hühnern, Truthühnern und Kaninchen eingesetzt werden. Die Erythrocyten werden mit Glyoxal in Gegenwart eines wäßrigen Mediums zusammengebracht, dessen osraotischer Druck die Erythrocyten nicht beeinträchtigt. Vorzugsweise wird ein hypertones Medium verwendet, beispielsweise eine Natriumcitratlösung, und die Behand-
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γ π
lung wird vorzugsweise über 18 bis 2k Stunden durchgeführt. Kürzere oder längere Behandlungszeiten ergeben keine nennenswerten Vorteile. Die Temperatur des Mediums beträgt gewöhnlich 18 bis 25°C.
Die Konzentration an Natriumeitrat im fertigen Medium hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise der Konzentration des Aldehyds und der Herkunft der Erythrocyten. Vorzugsweise enthält das wäßrige Medium 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen Natriumcitrat-dihydrat.
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist für die Stabilisierung der Erythrocyten von entscheidender Bedeutung. In dieser Stufe werden die sehr instabilen nativen Erythrocyten in eine stabilere Form überführt, die gegen Änderungen des Milieus widerstandsfähiger sind. Dies hat zur Folge, daß die Bedingungen in der zweiten Behandlungsstufe in einem weiteren Umfang variieren können, als in der ersten Stufe.
Nach der Behandlung in der ersten Stufe werden die Erythrocyten von gegebenenfalls entstandenen hämolysierten Zellen freigewaschen. Gewöhnlich wird dazu eine isotone Kochsalzlösung verwendet. Sodann werden die Erythrocyten in der zweiten Stufe entweder mit Formaldehyd oder Glyoxal in einer Menge von mindestens 0,1 g, vorzugsweise von 0,1 bis 0,6 g und am günstigsten von 0,1 bis 0,3 g/0,8 ml Erythrocyten behandelt. Diese Behandlung wird zweckmäßig unter den gleichen Bedingung gen durchgeführt wie die Behandlung in der ersten Stufe. Bei
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r t .. 271Η89
höheren Aldehydkonzentrationen verkürzt sich die Behandlungszeit. Nach Beendigung der zweiten Behandlung v/erden die Erythrocyten vorzugsweise erneut mit einer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung gewaschen. Sodann können sie mit einem Antigen oder Antikörper zur Herstellung eines Indikators beladen werden.
Es wurde festgestellt, daß erfindungsgemäß stabilisierte Erythrocyten mindestens 8 Monate bei einer Temperatur von 5°C stabil sind, keine Anzeichen von Hämolyse zeigen und sich mit einem Antigen oder Antikörper beladen lassen. Dies ist bei unbehandelten Erythrocyten nicht der Fall, bei denen nahezu sofort die Hämolyse einsetzt und gewöhnlich innerhalb etwa 21 Tagen beendet ist.
Die erfindungsgemäß stabilisierten Erythrocyten behalten ihre Fähigkeit zur Beladung mit einem Antikörper oder Antigen und zur spezifischen Reaktion. Die erfindungsgemäß stabilisierten Erythrocyten lassen sich in bekannter Weise mit einem Antikörper oder Antigen beladen, beispielsweise mit humanem Chorio-Gonadatropin, Heptatitis-Antikörpern, Fibrinogen, Albumin oder Gamma-Globulin.
Die vorstehend angegebenen Bedingungen zur Bestimmung des Hämatokritwertes nach Wintrobe dienen zv/ei Zwecken, nämlich zur Angabe eines Standards für alle Quellen von Erythrocyten und zur Verwendung von üblichen Laboratoriumsmethoden. Bei Verwendung unterschiedlicher Meßmethoden oder elektronischer
L j
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Zellenzähler werden andere Werte für das Erythrocytenvolumen erhalten, als unter den Bedingungen der Methode von Wintrobe. In diesem Fall muß das Erythrocytenvolumen auf den Hämatokritwert nach Wintrobe umgerechnet werden.
Als Pufferlösungen oder Verdünnungsmittel können alle üblichen Lösungen verwendet werden, die für Erythrocyten verträglich sind. Es muß sich also um Lösungen handeln, die die vorhandenen Antigene oder Antikörper nicht verändern und eine Lysis der Erythrocyten vermeiden. Solche Lösungen sind z.B. Kochsalz- und Natriumcitratlösungen. Besonders bevorzugt sind 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen enthaltende Natriumcitratlösungen.
15 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung,
Beispiel 1
100 ml Rh-negatives menschliches Blut der Blutgruppe 0 werden in einem üblichen Säure-Citrat-Dextrose (ACD) Antikoagulansmedium gesammelt. Die Zellen werden viermal in 10 Volurnteilen isotoner Kochsalzlösung gewaschen und dann in einem der beiden nachstehend angegebenen Puffer auf einem Wintrobe-Hämatokritwert von 8 % suspendiert.
Die verwendeten Puffer haben folgende Zusammensetzung:
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-Mr-
Puffer 1: Citratpuffer; 5,0 Gewichtsprozent/Volumen enthaltende wäßrige Lösung von Natriumeitrat . 2H2O mit einem pH-V/ert von 8,7
Puffer 2: Phosphatpuffer; 16,18 g Na2HPO^ ; 9,4 g KH2PO^ ; vom pH-Wert 7,2; Molarität 0,15.
40prozentige wäßrige Glyoxallösung v/ird mit den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Puffern verdünnt. Sodann werden 10 ml der verdünnten gepufferten Glyoxallösung mit 10 ml Erythrocytensuspension vermischt. Es werden also in jedem Fall 0,8 ml Erythrocyten mit der angegebenen Menge Glyoxal zusammengebracht.
Tabelle I
obe Υ» Glyoxal g Glyoxal Aldehyd-Puffer Ery thro cy. t en-
Puffer
Λ 4 0,4 Citrat Citrat
B 4 0,4 Citrat Citrat
C 4 0,4 Citrat Citrat
D 4 0,4 Citrat Citrat
E 6 0,6 Citrat Citrat
F 1 0,1 Phosphat Phosphat
G 3 0,3 Phosphat Phosphat
H 5 0,5 Phosphat Phosphat
Jede Probe wird 18 bis 24 Stunden bei 20 bis 25°C mittels eines Magnetrührers vermischt. Sodann werden die fixierten Zellen jeder Probe viermal in Kochsalzlösung gewaschen und wieder auf einen Hämatokritwert von 8 % in 5prozentigem Citratpuffer eingestellt.
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1 ' Beispiel2
Die in Beispiel 1 erhaltenen Proben A bis H werden mit dem in Tabelle II angegebenen Aldehyd in den angegebenen Mengen
behandelt. 5
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Γ Probe IO
Ui		 Puffer für die
behandelte
Erythrocyten-
Suspension		 Tabelle II
AG* Citrat Aldehyd
BG Volumen der
behandelten
Erythrocyten-
Suspension		 Citrat Formaldehyd
CG 10 ml Citrat Formaldehyd
DG 10 ml Citrat Glyoxal '2'
EG 10 ml Citrat Glyoxal
ο
co 		FG 10 ml Citrat Formaldehyd
co
co		 GG 1,15 πα Citrat Formaldehyd
OO 6,3 ml Citrat Formaldehyd
co 10 ml Formaldehyd
co 10 ml
Ul
- 13 -
Volumen Puffer für Aide- Menge des den Aide- hyd, Aldehyds, hyd % g
10 ml Citrat 1,1 0,11
10 ml Citrat 5,4 0,54
10 ml Citrat 1,0 0,1
10 ml Citrat 5,0 0,5
1,1 5 ml Citrat 3,2 0,037
6,3 ml Citrat 3,2 0,2 j
10 ml Citrat 3,2 0,32 *
10 ml Citrat 3,2 0,32
Anm.: * G = mit Glyoxal behandelt
(1) 40prozentlge wäßrige Formaldehydlösung wird mit Citratpuffer auf die angegebene Aldehydkonzentration verdünnt.
(2) 40prozentige Glyoxallösung wird mit Citratpuffer auf die angegebene Aldehydkonzentration verdünnt.
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Die mit Glyoxal behandelten Erythrocyten werden 18 bis 24 Stunden mit dem Aldehyd bei Raumtemperatur behandelt, sodann viermal mit Kochsalzlösung gewaschen und hierauf in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer der nachstehend angegebenen Zusammensetzung auf einen Hämatokritwert von 8 c/» eingestellt.
Zusammensetzung des Posphatpuffers:
3,26 g KH2PO4; 10,78 g Na2HPO4 ; 1 g NaN^ mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.
Die Erythrocyten werden 1 Woche bei +50C stehengelassen und sodann auf Hämolyse untersucht. Der Überstand der Proben F, G und H ist gelb gefärbt. Dies zeigt, daß die Erythrocyten nicht vollständig stabilisiert worden sind.
Beispiel 3
Die in Beispiel 2 erhaltenen Proben A bis H werden in einem Antigen-Antikörper-Indikatorsystem folgendermaßen verwendet: 125 ul der Erythrocytensuspension in 0,1 molarem Phosphatpuffer mit einem Hämatokritwert von 8 % werden in ein Reagensglas gegeben. Die Erythrocyten werden einmal mit isotoner Kochsalzlösung gewaschen. Die Kochsalzlösung wird dekantiert, und sodann werden 0,5 ml eines 0,1 molaren Acetatpuffers der nachstehend angegebenen Zusammensetzung vom pH-Wert 4 zugegeben. Der Acetatpuffer wird aus 2,45 g Natriumacetat . 3H2O, 4,7 ml Eisessig, aufgefüllt auf 1000 ml mit destilliertem Wasser hergestellt. Die Zellensuspension wird mit 5 bis 20 ug affinitätsgereinigtem Kepatitis-B
, Oberflächenantikörper aus einem Schimpansen versetzt. So- ,
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271U89 π
_ USr -
^ dann wird die Suspension 75 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Hierauf werden die Erythrocyten viermal mit isotoner Kochsalzlösung gewaschen. Die Kochsalzlösung wird dekantiert. Danach werden die Zellen in dem in Beispiel 2 beschriebenen 0,1 molaren Phosphatpuffer suspendiert, der zusätzlich 0,01 molar EDTA, 1 % normales humanes Serum und 0,1 % Gelatine enthält. Jeweils 25 »1 oeder Zellensuspension v/erden sodann in eine Vertiefung einer Mikrotestplatte gegeben, die 25 Wl eines Verdünnungsmittels und 7 Ul entweder a) menschliches Serum mit Hepatitis B Antigen (schwach positiv im Radioimmunoassay-Test),
b) menschliches Serum (im Radioimmunoassay-Test negativ auf Heptatitis B Antigen) oder
c) lediglich das Verdünnungsmittel enthält; Kontrollvertiefung.
durch Schütteln In Jedem Fall werden die mit dem Antikörper beladenen Zellen/ gemischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur ruhig stehengelassen. Hierauf werden die Vertiefungen auf das Vorliegen einer Agglutinationsreaktion untersucht. Die Proben A bis D ergeben Reaktionen mit dem positiven Serum und keine Reaktion mit den bekannten negativen Seren. Die Kontrollprobe ergab keine Reaktion.
Die Probe E wurde mit 0,6 g Glyoxal pro 0,8 ml Erythrocyten hergestellt; sie lieferte eine unspezifische Reaktion mit den negativen Seren.
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. "* spezifische
Die Proben F bis H ergaben keine /Reaktion. Dies zeigt, daß
. sie in einem Indikatorsystem zur Bestimmung von Hepatitis B Oberflächenantigen ungeeignet sind.
5 ._ Beispiel U
Beispiel 1 wird mit den in Tabelle III angegebenen Mengen an Aldehyd wiederholt.
Tabelle III
Behandlung von Erythrocyten in Citratpuffer mit Glyoxal in Citratpuffer
robe 1 Aldehvd R Aldehvd
1 1 (Glyoxal) 0,1
2 1 (Glyoxal) 0,1
3 1 (Glyoxal) 0,1
4 5 (Glyoxal) 0,1
5 5 (Glyoxal) 0,5
6 5 (Glyoxal) 0,5
7 5 (Glyoxal) 0,5
8 3 (Glyoxal) 0,5
9 3 (Glyoxal) 0,3
10 3 (Glyoxal) 0,3
11 3 ,2 (Formaldehyd) 0,32
12 ,2 (Formaldehyd) 0,32
Die zweite Fixierstufe wird gemäß Beispiel 2 mit den in Tabelle IV angegebenen Aldehyden in den angegebenen Mengen durchgeführt.
25
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Probe
Tabelle IV % Aldehyd
g Aldehyd pro 0,8 ml Erythrocytenvolumen
0,11
0,54
0,1
0,5
0,11
0,54
0,1
0,5
0,3
0,32
0,32
0,3
Die Proben 1 bis 4 sowie 9 und 10 zeigten spezifische Reak tionen mit dem Hepatitis B Oberflächenantigen nach der in Beispiel 3 beschriebenen Methode. Sie ergaben keine Reaktionen mit der Kontrollprobe und den bekannten negativen Seren.
1=1 Gx. 1,1 Form.
2 = 1 Gx. 5,4 Form.
3 = 1 Gx. 1 Gx.
4 = 1 Gx 5 Gx.
5 = 5 Gx. 1,1 Form.
6=5 Gx. 5,4 Form.
7 = 5 Gx. 1 Gx.
8=5 Gx. 5 Gx.
9 = 3 Gx. 3 Gx.
10 = 3 Gx. 3,2 Form.
11 = 3, 2 Form. 3,2 Form.
12 = 3, 2 Form. 3 Gx.
20 Die Proben 5 bis 8 ergaben unspezifische Reaktionen mit dem Hepatitis B Oberflächenantigen in den negativen Serumproben.
Die Proben 11 und 12 ergaben keine spezifische Reaktion mit 25 positiven Hepatitis B Oberflächenantigen enthaltenden Seren. Sie sind deshalb ungeeignet.
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Claims (12)

  1. Patentansprüche
    ( 1 .J Verfahren zur Herstellung stabilisierter Erythrocyten,
    dadurch gekennzeichnet, daß man a) Erythrocyten in einem wäßrigen Medium mit 0,1 bis 0,4 g Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte Erythrocyten behandelt und
    b) die behandelten Erythrocyten in einem wäßrigen Medium mit mindestens 0,1 g Formaldehyd oder Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte behandelte Erythrocyten zusammenbringt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe a) und b) ein wäßriges Medium mit einem
    für Erythrocyten verträglichen osmotischen Druck verwendet.
    15
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe a) und b) eine hypertonische Natriumcitratlösung verwendet.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe a) 18 bis 24 Stunden bei 18 bis 25° C durchführt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe b) 18 bis 24 Stunden bei 18 bis 250C durchführt.
    709838/0919
    271U89
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) die Erythrozyten mit einer wäßrigen Formaldehyd- oder Glyoxallösung behandelt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) die behandelten Erythrocyten mit 0,1 bis 0,6 g Formaldehyd oder Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte behandelte Erythrocyten zusammenbringt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe a) erhaltenen behandelten Erythrocyten aus dem wäßrigen Medium abtrennt und vor der Behandlung in Stufe b) wäscht.
  9. 9· Verfahren zur Herstellung von stabilisierten Erythrocyten zur Verwendung im passiven Hämagglutinationstest mit Hepatitis-associiertem Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man
    (1) eine hypertonische wäßrige Suspension humaner Erythro-
    cyten mit 4,5 bis 5 Gev/ichtsprozent/Volumen Na tr ium ei trat mit
    (2) einer wäßrigen Glyoxallösung mit 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen Natriumeitrat in einer Menge von 0,1 bis 0,4 g Glyoxal pro 0,8 ml konzentrierte
    25 Erythrocyten zusammenbringt,
    (3) die mit Glyoxal behandelten Erythrocyten aus der Suspension abtrennt,
    709838/0919
    Γ . 271Η89 ι
    - aer -
    - I.
    (4) mit den behandelten Erythrocyten eine zweite hypertonische wäßrige Suspension mit 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/ Volumen Natriumeitrat herstellt und
    (5) diese zweite hypertonische wäßrige Suspension aus behandelten Erythrocyten mit einer wäßrigen Lösung von Glyoxal
    oder Formaldehyd mit 4,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumen Natriumeitrat in einer Menge von 0,1 bis 0,6 g Glyoxal oder Formaldehyd pro 0,8 ml konzentrierte behandelte Erythrocyten zusammenbringt.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, daß man die erste und zweite Behandlungsstufe bei 18 bis 250C durchführt.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste und zweite Behandlungsstufe 18 bis 24 Stunden durchführt.
  12. 12. Verwendung der gemäß Anspruch 1 bis 11 hergestellten stabilisierten Erythrocyten als Indikator zur Durchführung von Antigen-Antikörper-Reaktionen.
    709838/0919
DE19772711489 1976-03-16 1977-03-16 Verfahren zur herstellung von stabilisierten erythrocyten und ihre verwendung als indikator zur durchfuehrung von antigen-antikoerper-reaktionen Withdrawn DE2711489A1 (de)

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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2828235C2 (de) * 1978-06-28 1980-04-17 Kernforschungsanlage Juelich Gmbh, 5170 Juelich Verfahren und Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer Roh-Enzym-Lösung
US4202665A (en) * 1978-11-06 1980-05-13 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University A Division Of Yeshiva University Detection of hepatitis B surface antigen
JPS566161A (en) * 1979-06-28 1981-01-22 Seikagaku Kogyo Co Ltd Erythropoietin sensitized latex
JPS59192961A (ja) * 1983-04-15 1984-11-01 Green Cross Corp:The 血液凝固第「じ」因子測定用試薬
US4939096A (en) * 1986-09-10 1990-07-03 Idexx, Corp. Method and apparatus for assaying whole blood
US5759774A (en) * 1988-05-18 1998-06-02 Cobe Laboratories, Inc. Method of detecting circulating antibody types using dried or lyophilized cells
US5008202A (en) * 1988-11-29 1991-04-16 Sequoia Turner Corporation Blood diluent for red blood cell analysis
WO1992006696A1 (en) * 1990-10-11 1992-04-30 Innovatsionno-Venchurnaya Firma 'chernovitsky Gorodskoi Tsentr Nauchno-Tekhnicheskogo Tvorchestva Molodezhi 'ort' Method for obtaining bioactive preparation from blood
US5998483A (en) * 1991-09-20 1999-12-07 Camiener; Gerald W. Glyoxal-containing preservative compositions
EP0627879A1 (de) * 1991-09-20 1994-12-14 CAMIENER, Gerald, W. Verfahren und zusammensetzungen mit einer aldehydstabilisierenden lösung
US5401625A (en) * 1993-06-24 1995-03-28 E. K. Industries, Inc. Histological composition for light microscopy
JP6300352B2 (ja) * 2014-03-31 2018-03-28 シーシーアイ株式会社 中性脂肪濃度測定用の標準物質組成物およびその製造方法
EP4025048A2 (de) * 2019-09-05 2022-07-13 Hemanext Inc. Verfahren zur konservierung von erythrozytenreagenz unter verwendung von kohlenmonoxid

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL126572C (de) * 1966-03-24
GB1244344A (en) * 1967-11-13 1971-08-25 Abbott Lab Hemagglutination testing procedure employing stabilized and potentiated erythrocytes and a method for their preparation
US3553310A (en) * 1967-12-28 1971-01-05 Miles Lab Immunologically reactive particles
US3708572A (en) * 1969-03-26 1973-01-02 Baxter Laboratories Inc Infectious mononucleosis diagnostic reagent and method
JPS5010374B1 (de) * 1969-11-10 1975-04-21
GB1392181A (en) * 1971-04-16 1975-04-30 Rech Et Dapplications Soc Gen Fixation of nitrogenous materials

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