DE19525281C1 - Verfahren zur Herstellung von Riboflavin mittels resistenter Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Riboflavin mittels resistenter MikroorganismenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung
von Riboflavin gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 sowie Mikroorganismen-
Stämme gemäß den Ansprüchen 5 bis 8.
Das Vitamin B₂, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier
essentiell. Bei Vitamin-B₂-Mangel treten Entzündungen der Mund- und
Rachenschleimhäute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und
Entzündungen in den Hautfalten u.ä. Hautschäden,
Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der
Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können
Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme eintreten. Das Vitamin B₂
hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als
Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz.
Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in
Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc., eingesetzt.
Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder
mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das
Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines
Endprodukt gewonnen, wobei allerdings auch relativ kostspielige
Ausgangsprodukte - wie beispielsweise D-Ribose - eingesetzt werden
müssen. Daher kommt die chemische Synthese des Riboflavins nur für
solche Anwendungszwecke in Betracht, für die reines Riboflavin
notwendig ist, wie z. B. in der Humanmedizin.
Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavins bietet
die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. So ist
bekannt, daß Riboflavin beispielsweise von Ascomyceten, wie Ashbya
gossypii oder Eremothecium ashbyii, gebildet wird; aber auch
Hefen, wie z. B. Candida, und Bakterien, wie Clostridium, sind zur
Flavinproduktion geeignet. Die mikrobielle Herstellung des
Riboflavins eignet sich insbesondere für solche Fälle, in denen
eine hohe Reinheit dieser Substanz nicht erforderlich ist. Dies
ist beispielsweise dann der Fall, wenn das Riboflavin als Zusatz
zu Futtermittelprodukten eingesetzt werden soll. In solchen Fällen
bat die mikrobielle Herstellung des Riboflavins den Vorteil, daß
diese Substanz in einem einstufigen Prozeß gewinnbar ist. Auch
können als Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese
nachwachsende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Öle,
eingesetzt werden.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur mikrobiellen
Herstellung von Riboflavin zu schaffen, durch das ein erhöhter
Anteil an Riboflavin gebildet wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß
Mikroorganismen kultiviert werden, die resistent gegenüber auf die
Isocitratlyase, einem wichtigen anaplerotischen Enzym beim Einsatz
von pflanzlichen Ölen als Rohstoff, hemmend wirkenden Substanzen
sind. Kulturen solcher Mikroorganismen-Stämme produzieren
überraschenderweise einen höheren Anteil an Riboflavin als die
entsprechenden Wildtyp-Stämme.
Für die Selektion von Mikroorganismen-Stämmen mit erhöhter
Riboflavin-Produktion können zunächst die auf die Isocitratlyase
hemmend wirkenden Substanzen durch Einwirkung auf das Enzym in
einem spezifischen Aktivitätstest identifiziert werden. Dies kann
durch Einwirkung möglicher Hemmstoffe auf eine isolierte und
gereinigte Isocitratlyase oder in einem Rohextraktassay erfolgen.
Derartige, als Hemmstoffe durchgetesteten Substanzen sind in
Tabelle 2 zusammengefaßt. Es zeigte sich, daß eine Reihe von
Stoffwechselmetaboliten die Isocitratlyase signifikant hemmen, wie
beispielsweise Phosphoenolpyruvat (PEP), 6-P-Gluconat, Maleat,
insbesondere aber Itaconat und Oxalat. Werden nunmehr Riboflavin
produzierende Mikroorganismen-Stämme in Gegenwart solcher
Hemmstoffe kultiviert, zeigt sich überraschenderweise, daß die
Riboflavinbildung gehemmt ist. Dies äußert sich auf Kulturplatten
in der Ausbildung von Kolonien, die nicht gelb werden, sondern
weiß bleiben. Mit diesem System sind daher Stämme erkennbar, die
gegen eine Isocitratlyase-Hemmung resistent sind, da solche Stämme
auch in Gegenwart von Hemmstoff Riboflavin bilden und daher gelb
gefärbte Kolonien ausbilden. Derartige Stämme können entweder
durch Spontanmutation entstehen oder indem entsprechende
Mutationen durch gängige Methoden, wie beispielsweise chemisch
oder durch UV-Bestrahlung, induziert werden. Es können somit
Mikroorganismen-Stämme gewonnen werden, die einen erhöhten Anteil
an Riboflavin in das Kulturmedium ausscheiden.
Erfindungsgemäß wird zur Kultivierung als resistenter
Mikroorganismen-Stamm vorzugsweise der als Riboflavin-Produzent
gut bekannte Pilz Ashbya gossypii eingesetzt. Als resistenter
Stamm mit erhöhter Riboflavinbildung wurde insbesondere der bei
der DSM unter der Nr. 10067 hinterlegte Ashbya gossypii-Stamm
erhalten.
Zur Identifizierung von auf ICL hemmend wirkenden Substanzen wurde
zunächst die ICL aus Ashbya gossypii gereinigt. Die Isolierung und
Reinigung des Enzyms erfolgte nach Wachstum des Pilzmycels auf
Pflanzenöl. Die einzelnen Reinigungsschritte sind in der Tabelle 1
zusammengefaßt: Demgemäß enthält ein typischer, aus ca. 25 g Mycel
hergestellter Rohextrakt, der durch Zellaufschluß mit einer
French-Press gewonnen wurde, 220 Einheiten ICL-Aktivität. Etwa 78%
davon sind nach Zentrifugation bei 40 000 g gelöst im Überstand
wiederzufinden. Eine anschließende fraktionierte
Ammoniumsulfatfällung führt zu einer dreifachen Anreicherung des
Enzyms. Nach einer Gelfiltration mit einer Sephacryl S-300 Säule
wird die ICL an den Kationenaustauscher Mono S-Sepharose gebunden
und mit NaCl eluiert. Das so erhaltene Präparat ist homogen in der
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und hat eine spezifische
Aktivität von 18,4 U/mg.
Mit dem gereinigten Enzym lassen sich in einem colorimetrischen
Test (Dixon, H. und Kornberg, H.L. (1959), Biochem. J. 72, 3:
Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle) Einflüsse
von Substanzen auf die Aktivität messen. In Tabelle 2 und Fig. 1
sind die Effekte der getesteten Substanzen auf das Enzym
zusammengefaßt bzw. dargestellt. Untersucht wurden zum einen
Substanzen, die als Metaboliten in der Pilzzelle einen hemmenden
Effekt auf das Enzym haben könnten. Darunter zeigten 6-P-Gluconat
und Phosphoenolpyruvat die deutlichsten Hemmwirkungen mit über 50%
bei einer Konzentration von 10 mM. Erheblich besser wirkten jedoch
Itakonat und Oxalat, die vermutlich nicht im Stoffwechsel des
Pilzes vorkommen. Bereits eine Konzentration von 1 mmol führte zu
78% bzw. 95% Hemmung.
Durch UV-Bestrahlung von isolierten Sporen des Pilzes lassen sich
Mutationen im Erbmaterial erzeugen. Mit einer Strahlendosis, bei
der 10-20% der eingesetzten Sporen überleben, erhält man Mutanten,
die gegen eine Hemmung der Riboflavinbildung durch Itakonat
resistent sind. Eine so isolierte Mutante zeigt bei Wachstum auf
Sojaöl eine 25fache Riboflavinbildung im Vergleich zum
Ausgangsstamm (Fig. 2). Die spezifische ICL-Aktivität ist während
der Riboflavinbildungsphase um bis zu 15% erhöht (Fig. 2). Mit
Antikörpern läßt sich zeigen, daß die Proteinmenge erhöht ist. Die
ICL aus der Mutante zeigt das gleiche Hemmverhalten durch Itakonat
wie der Ausgangsstamm.
Einen überraschenden Hinweis auf einen kausalen Zusammenhang
zwischen ICL und Riboflavinbildung liefert die Beobachtung, daß
der Pilz, wenn Glucose als Substrat angeboten wird, erst nach
Verbrauch der Glucose mit der Produktion beginnt. Genau dann wird
auch die ICL, die zuvor durch Glucose reprimiert ist, im
Rohextrakt meßbar und steigt bis zu Aktivitäten, wie sie bei
Wachstum auf Öl gefunden werden, an (Fig. 3).
Claims (8)
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin durch
Kultivierung von Mikroorganismen mit Resistenz gegenüber auf
die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen
durch Einwirkung auf das Enzym in einem spezifischen
Aktivitätstest identifiziert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
gekennzeichnet durch
Kultivierung von Mikroorganismen mit Resistenz gegenüber den
Hemmstoffen Itakonat oder Oxalat.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß zur Kultivierung der Pilz Ashbya gossypii mit Resistenz
gegenüber auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen
eingesetzt wird.
5. Mikroorganismen mit Resistenz gegenüber auf die Isocitratlyase
hemmend wirkenden Substanzen.
6. Mikroorganismen nach Anspruch 5 mit Resistenz gegenüber den
Hemmstoffen Itakonat oder Oxalat.
7. Mikroorganismen-Stamm nach Anspruch 5 oder 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß dieser der Pilz Ashbya gossypii ist.
8. Mikroorganismen-Stamm nach Anspruch 7,
gekennzeichnet durch
den Stamm Ashbya gossypii DSM 10067.
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DE10209173C1 (de) * | 2002-03-01 | 2003-04-24 | Daimler Chrysler Ag | Verfahren zum Aktualisieren von Kartendaten und Navigationssystem |
-
1995
- 1995-07-13 DE DE19525281A patent/DE19525281C1/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
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NICHTS ERMITTELT * |
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DE10209173C1 (de) * | 2002-03-01 | 2003-04-24 | Daimler Chrysler Ag | Verfahren zum Aktualisieren von Kartendaten und Navigationssystem |
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