DE19525281C1 - Verfahren zur Herstellung von Riboflavin mittels resistenter Mikroorganismen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 sowie Mikroorganismen- Stämme gemäß den Ansprüchen 5 bis 8.

Das Vitamin B₂, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin-B₂-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten u.ä. Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme eintreten. Das Vitamin B₂ hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc., eingesetzt.

Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei allerdings auch relativ kostspielige Ausgangsprodukte - wie beispielsweise D-Ribose - eingesetzt werden müssen. Daher kommt die chemische Synthese des Riboflavins nur für solche Anwendungszwecke in Betracht, für die reines Riboflavin notwendig ist, wie z. B. in der Humanmedizin.

Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavins bietet die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. So ist bekannt, daß Riboflavin beispielsweise von Ascomyceten, wie Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii, gebildet wird; aber auch Hefen, wie z. B. Candida, und Bakterien, wie Clostridium, sind zur Flavinproduktion geeignet. Die mikrobielle Herstellung des Riboflavins eignet sich insbesondere für solche Fälle, in denen eine hohe Reinheit dieser Substanz nicht erforderlich ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn das Riboflavin als Zusatz zu Futtermittelprodukten eingesetzt werden soll. In solchen Fällen bat die mikrobielle Herstellung des Riboflavins den Vorteil, daß diese Substanz in einem einstufigen Prozeß gewinnbar ist. Auch können als Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese nachwachsende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Öle, eingesetzt werden.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin zu schaffen, durch das ein erhöhter Anteil an Riboflavin gebildet wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mikroorganismen kultiviert werden, die resistent gegenüber auf die Isocitratlyase, einem wichtigen anaplerotischen Enzym beim Einsatz von pflanzlichen Ölen als Rohstoff, hemmend wirkenden Substanzen sind. Kulturen solcher Mikroorganismen-Stämme produzieren überraschenderweise einen höheren Anteil an Riboflavin als die entsprechenden Wildtyp-Stämme.

Für die Selektion von Mikroorganismen-Stämmen mit erhöhter Riboflavin-Produktion können zunächst die auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen durch Einwirkung auf das Enzym in einem spezifischen Aktivitätstest identifiziert werden. Dies kann durch Einwirkung möglicher Hemmstoffe auf eine isolierte und gereinigte Isocitratlyase oder in einem Rohextraktassay erfolgen. Derartige, als Hemmstoffe durchgetesteten Substanzen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Es zeigte sich, daß eine Reihe von Stoffwechselmetaboliten die Isocitratlyase signifikant hemmen, wie beispielsweise Phosphoenolpyruvat (PEP), 6-P-Gluconat, Maleat, insbesondere aber Itaconat und Oxalat. Werden nunmehr Riboflavin­ produzierende Mikroorganismen-Stämme in Gegenwart solcher Hemmstoffe kultiviert, zeigt sich überraschenderweise, daß die Riboflavinbildung gehemmt ist. Dies äußert sich auf Kulturplatten in der Ausbildung von Kolonien, die nicht gelb werden, sondern weiß bleiben. Mit diesem System sind daher Stämme erkennbar, die gegen eine Isocitratlyase-Hemmung resistent sind, da solche Stämme auch in Gegenwart von Hemmstoff Riboflavin bilden und daher gelb gefärbte Kolonien ausbilden. Derartige Stämme können entweder durch Spontanmutation entstehen oder indem entsprechende Mutationen durch gängige Methoden, wie beispielsweise chemisch oder durch UV-Bestrahlung, induziert werden. Es können somit Mikroorganismen-Stämme gewonnen werden, die einen erhöhten Anteil an Riboflavin in das Kulturmedium ausscheiden.

Erfindungsgemäß wird zur Kultivierung als resistenter Mikroorganismen-Stamm vorzugsweise der als Riboflavin-Produzent gut bekannte Pilz Ashbya gossypii eingesetzt. Als resistenter Stamm mit erhöhter Riboflavinbildung wurde insbesondere der bei der DSM unter der Nr. 10067 hinterlegte Ashbya gossypii-Stamm erhalten.

Ausführungsbeispiel 1. Reinigung einer Isocitratlyase (ICL)

Zur Identifizierung von auf ICL hemmend wirkenden Substanzen wurde zunächst die ICL aus Ashbya gossypii gereinigt. Die Isolierung und Reinigung des Enzyms erfolgte nach Wachstum des Pilzmycels auf Pflanzenöl. Die einzelnen Reinigungsschritte sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt: Demgemäß enthält ein typischer, aus ca. 25 g Mycel hergestellter Rohextrakt, der durch Zellaufschluß mit einer French-Press gewonnen wurde, 220 Einheiten ICL-Aktivität. Etwa 78% davon sind nach Zentrifugation bei 40 000 g gelöst im Überstand wiederzufinden. Eine anschließende fraktionierte Ammoniumsulfatfällung führt zu einer dreifachen Anreicherung des Enzyms. Nach einer Gelfiltration mit einer Sephacryl S-300 Säule wird die ICL an den Kationenaustauscher Mono S-Sepharose gebunden und mit NaCl eluiert. Das so erhaltene Präparat ist homogen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und hat eine spezifische Aktivität von 18,4 U/mg.

2. Identifizierung von ICL-Hemmstoffen

Mit dem gereinigten Enzym lassen sich in einem colorimetrischen Test (Dixon, H. und Kornberg, H.L. (1959), Biochem. J. 72, 3: Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle) Einflüsse von Substanzen auf die Aktivität messen. In Tabelle 2 und Fig. 1 sind die Effekte der getesteten Substanzen auf das Enzym zusammengefaßt bzw. dargestellt. Untersucht wurden zum einen Substanzen, die als Metaboliten in der Pilzzelle einen hemmenden Effekt auf das Enzym haben könnten. Darunter zeigten 6-P-Gluconat und Phosphoenolpyruvat die deutlichsten Hemmwirkungen mit über 50% bei einer Konzentration von 10 mM. Erheblich besser wirkten jedoch Itakonat und Oxalat, die vermutlich nicht im Stoffwechsel des Pilzes vorkommen. Bereits eine Konzentration von 1 mmol führte zu 78% bzw. 95% Hemmung.

3. Charakterisierung einer mit Itakonat selektionierten Mutante

Durch UV-Bestrahlung von isolierten Sporen des Pilzes lassen sich Mutationen im Erbmaterial erzeugen. Mit einer Strahlendosis, bei der 10-20% der eingesetzten Sporen überleben, erhält man Mutanten, die gegen eine Hemmung der Riboflavinbildung durch Itakonat resistent sind. Eine so isolierte Mutante zeigt bei Wachstum auf Sojaöl eine 25fache Riboflavinbildung im Vergleich zum Ausgangsstamm (Fig. 2). Die spezifische ICL-Aktivität ist während der Riboflavinbildungsphase um bis zu 15% erhöht (Fig. 2). Mit Antikörpern läßt sich zeigen, daß die Proteinmenge erhöht ist. Die ICL aus der Mutante zeigt das gleiche Hemmverhalten durch Itakonat wie der Ausgangsstamm.

4. Korrelation von Riboflavinbildung und spezifischer ICL- Aktivität

Einen überraschenden Hinweis auf einen kausalen Zusammenhang zwischen ICL und Riboflavinbildung liefert die Beobachtung, daß der Pilz, wenn Glucose als Substrat angeboten wird, erst nach Verbrauch der Glucose mit der Produktion beginnt. Genau dann wird auch die ICL, die zuvor durch Glucose reprimiert ist, im Rohextrakt meßbar und steigt bis zu Aktivitäten, wie sie bei Wachstum auf Öl gefunden werden, an (Fig. 3).

Claims (8)

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin durch Kultivierung von Mikroorganismen mit Resistenz gegenüber auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen durch Einwirkung auf das Enzym in einem spezifischen Aktivitätstest identifiziert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch Kultivierung von Mikroorganismen mit Resistenz gegenüber den Hemmstoffen Itakonat oder Oxalat.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung der Pilz Ashbya gossypii mit Resistenz gegenüber auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen eingesetzt wird.

5. Mikroorganismen mit Resistenz gegenüber auf die Isocitratlyase hemmend wirkenden Substanzen.

6. Mikroorganismen nach Anspruch 5 mit Resistenz gegenüber den Hemmstoffen Itakonat oder Oxalat.

7. Mikroorganismen-Stamm nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß dieser der Pilz Ashbya gossypii ist.

8. Mikroorganismen-Stamm nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch den Stamm Ashbya gossypii DSM 10067.