DE1933187B2

DE1933187B2 - Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure

Info

Publication number: DE1933187B2
Application number: DE19691933187
Authority: DE
Inventors: D Johnson; E Richardson; J Roubie; H Silvestri; R Smith
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1968-07-01
Filing date: 1969-06-30
Publication date: 1979-10-18
Also published as: SE372274B; DE1933187A1; ES389293A1; YU166369A; DE1933187C3; JPS5235679B1; JPS5432793B1; FR2012122A1; YU149477A; NL145900B; BE735502A; CH534695A; ES369029A1; DK143030B; NL7208266A; DK143030C; NL6910055A; YU35449B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure durch Isolierung von Cephalosporin C aus einer Fermentationsbrühe und Deacylierung.

7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) ist ein sehr wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung einer Vielzahl halbsynthetischer antibakterieller Cephalosporansäuremittel. Wegen der Unmöglichkeit der Totalsynthese von 7-ACA in großem Maßstab erfolgt deren Herstellung in technischem Maßstab durch chemischen Abbau natürlich vorkommender Cephalosporansäuren, beispielsweise durch chemischen Abbau von Cephalosporin C, das durch Gärung erzeugt wird. Die Hauptmenge der 7-ACA wird aus Cephalosporin C hergestellt, vgl. US-PS 30 93 638.

In der FR-PS 13 94 820 ist zwar beschrieben, daß man zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure auch Cephalosporin C in Form seines Natriumsalzes mit dem Chlorameisensäurebenzylester umsetzen kann, wobei man das N-Carbobenzoxy-cephalosporin C erhält, das dann nach Umsetzung zum Dibenzylester hydrolysiert wird, diese Arbeitsweise setzt jedoch voraus, daß das Cephalosporin C bereits in reiner Form vorliegt.

Die Herstellung von 7-ACA durch derzeit verfügbare Methoden ist von der Gärung bis zu der chemischen Aufspaltung des Cephalosporin C mit Schwierigkeiten behaftet. Niedrige Ausbeuten an 7-ACA haben bisher den Einzug dieser Verbindung in die Antibiotika-Therapie erschwert.

Cephalosporin C ist durch eine Aminosäurefunktion in der Seitenkette charakterisiert. Die Aminosäure liegt in Form eines Zwitterions in wäßriger Lösung vor und ist als solche in Wasser sehr gut löslich. Wegen der stark ionischen Natur ist es äußerst schwierig, die Verbindung durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturbrühe abzutrennen. Die derzeit nach der US-PS 30 94 527 geübte Abtrennmethode besteht in der Adsorption des rohen Cephalosporin C aus der Kulturbrühe auf ein geeignetes Adsorptionsmittel, beispielsweise Aktivkohle oder ein Ionenaustauscherharz, worauf sich eine 6.' Eluierung, Konzentrierung und Ausfällung am isoelektrischen Punkt oder Salzbildung anschließt. Der geringe Wirkungsgrad, der mit der Kompliziertheit einer jeden Stufe dieses Verfahrens einhergeht erschwert die Herstellung der 7-Aminocephalosporansäure.

Die Hauptmenge der 7-ACA wird durch partielle Zersetzung von Cephalosporin C oder dessen Derivaten durch chemische Methoden hergestellt (vgL die US-Patentschriften 31 24 576, 31 88 311 und 32 34 223).

Bei der Durchführung der meisten bekannten Methoden werden Ausbeuten erzielt, die für eine Durchführung in technischem Maßstab zu niedrig sind. Ferner muß bei der Durchführung dieser Methoden als Ausgangsmaterial eine gereinigte Form von Cephalosporin C verwendet werden, die schwierig zu erhalten ist

Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art bereitzustellen, bei dem unter Vermeidung der Nachteile des Standes der Technik gute Ausbeuten an 7-ACA erhalten werden, ohne daß das in der Kulturbrühe enthaltene Ausgangs-Cephalosporin C aufwendigen Reinigungsoperationen unterzogen werden muß.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine von gegebenenfalls enthaltenem Cephalosporin N in an sich bekannter Weise befreite, filtrierte Cephalosporin C-haltige Kulturbrühe bei einem pH-Wert von 7 bis 9 und einer Temperatur unterhalb 4O⁰C mit wenigstens 2 Mol eines Isocyanates der allgemeinen Formel

R-N=C=O

oder eines Halogenformiats der allgemeinen Formel

X—CO-OR

worin

R eine niedrige Alkylgruppe oder eine Gruppe der allgemeinen Formel

-(CH₂),

darstellt, wobei η eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, falls der Rest B in der nachstehenden allgemeinen Formel für —OR steht, und 0 bis 6 bedeutet, falls B für -NHR steht, und die Substituenten R2 und R3, die gleich oder verschieden sind, Wasserstoff-, Chlor-, Bromoder Fluoratome, Nitrogruppen, niedrige Alkyl- oder niedrige Alkoxygruppen bedeuten, und
X für ein Chlor-, Brom- oder Jodatom steht,

pro Mol Cephalosporin C umsetzt, die Reaktionsmischung mittels eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert von 1 bis 3 extrahiert, das erhaltene Produkt gegebenenfalls in ein Metall- oder Aminsalz überführt, und

b) die in Stufe a) erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel

H OH

I Ii I s

MO₂C- C—(CH,)₃—C— Ν—ι {*} O

ι Μ ^(|

NH O=J N J—CH,—O—C—CH₃

I Y

C=O

CO₂M

worin B eine Gruppe der allgemeinen Formel -NHR oder —OR ist, und M ein Wasserstoff a torn oder ein Metall- oder Aminkation ist, in an sich bekannter Weise mit einer Silylverbindung der allgemeinen Formeln IV oder V

R₄

Si

R₄ NH

\l
Si

IV₄ 1

(HN
I /
Si

(IV)

R₄/

oder

R₆-Si-X
R₇

(V)

worin Rs, Rb und R7 ein Wasserstoff- oder Haiogenatom, eine Niedrigalkyl-, Halogen-(niedrig)-alkyl- oder Phenylgruppe bedeuten und wenigstens einer der Substituenten R5, R6 und R7 eine andere Bedeutung als ein Halogen- oder Wasserstoffatom hat, R4 eine Niedrigalkylgruppe darstellt, m 1 oder 2 ist und X für ein Haiogenatom oder

— N

steht, wobei Rs ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe ist und R9

R₅

R₇

darstellt,

oder einem Trialkylsilylacetamid oder bis-Trialkylsilylacetamid unter wasserfreien Bedingungen in Gegenwart eines tertiären Amins in einem inerten Lösungsmittel umsetzt, den erhaltenen Silylester mit wenigstens Mol Phosphorpentachlorid pro Mol des Silylesters in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines tertiären Amins bei einer Temperatur unterhalb O⁰C reagieren läßt, darauf das erhaltene Iminohalogenid unter wasserfreien Bedingungen mit einem Alkohol bei Temperaturen zwischen ungefähr -40° bis -7O⁰C umsetzt, den erhaltenen Iminoether dann unter sauren Bedingungen der Hydrolyse oder Alkoholyse unterwirft und die gebildete /-Aminocephalosporansäure nach Einstellen des pH-Werts der Mischung auf den isoelektrischen Punkt durch Filtrieren abtrennt.

Bei der Stufe a) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man wenigstens 2 Mol dec Acylierungsmittels pro Mol Cephalosporin C, vorzugsweise 2 bis 10 Mol Acylierungsmitte! pro Mol Cephalosporin C, insbesondere 5 bis 8 MoI, z. B. ungefähr 6 Mol Acylierungsmittel pro Mol Cephalosporin C. Besonders günstig ist ein pH von ungefähr 8 und eine Temperatur zwischen -5 und 20⁰C, z.B. 0 bis 15°C, insbesondere

30 0 bis 5°C.

In Stufe a) extrahiert man nach der Umsetzung mit dem Isocyanat oder Halogenforrniat unter Verwendung eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, wie beispielsweise Methylisobutylketon, Chloroform, Methylenchlorid, Dichloräthan, Butanol oder Äthylacetat, wobei es jedoch besonders günstig ist. Methylisobutylketon einzusetzen, wenn B für —OR steht, und n-Butanol, wenn B für -NHR steht, wobei es besonders günstig ist, die Extraktion bei einem pH von ungefähr 2 durchzuführen.

Unter dem Begriff »(niedrig)Alkyl« soll erfindungsgemäß eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen verstanden werden, beispielsweise Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl oder n-Pentyl, wobei Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl und Isobutyl bevorzugt werden. Unter »(niedrig)Alkoxy« und »Halogen(niedrig)alkyl« sollen ebenfalls Gruppen verstanden werden, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten.

Die Gärung des Schimmelpilzes, der als Cephalosporium bekannt ist, oder eines Mt'tanten dieses Schimmelpilzes erzeugt eine Mischung von Verbindungen, wobei Cephalosporin C überwiegt und kleinere Mengen an Cephalosporin N (nunmehr als ein Penicillin bekannt) vorliegen. Cephalosporin C ist säurestabil, während dies bei Cephalosporin N nicht der Fall ist. Daher ist es vor der Umsetzung der Kulturbrühe mit einem Halogenformiat in situ eventuell ebenfalls erzeugtes Cephalosporin N zu zerstören. Dies erfolgt

bo durch Ansäuern auf einen pH von ungefähr 2 unter Verwendung einer Mineralsäure, wie beispielsweise Ci.lorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, worauf sich eine Inkubationsperiode von 2 bis 20 Stunden anschließt. Die Kulturbrühe kann vor oder nach der Ansäuerung oder Inkubation filtriert werden.

Anschließend an diese Stufe wird die Filtrat-Kultur-

brühe. welche das Cephalosporin C enthält, auf einen dH von 7 bis 9 eingestellt. Die DH-Einstellune erfolet

durch Zugabe einer Alkalibase, wie beispielsweise Natrium- oder Kaliumhydroxid.

Das Volumen der hergestellten Brühe wird durch die Zugabe von Aceton ungefähr um 25% erhöht. Das Acylierungsmittel wird dieser Lösung unter Rühren zugesetzt, und zwar in einer Menge von wenigstens 2 und vorzugsweise 2 bis 10 Mol des Acylierungsmittels pro Mol Cephalosporin C (die Konzentration der Brühe wird im voraus bestimmt). Der pH wird während der langsamen Zugabe konstant gehalten, und zwar auch noch während einer Zeitspanne von wenigstens 30 Minuten nach der Zugabe. Die Temperatur der Brühs wird während dieser Zeit unterhalb 4C¹C und vorzugsweise bei 0 bis I5°C gehalten. Die Reaktion ist gewöhnlich 1 Stunde nach erfolgter Zugabe beendet.

Ein halbes Volumen eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels wird zugesetzt, zweckmäßig Methylisobutylketon (MIBK), falls das Mittel ein Halogenformiat (z. B. ein Chlorformiat, beispielsweise Isobutylchlorformiat) ist, und n-Butanol, falls das Mittel ein Isocyanat ist. Der pH wird auf 1 bis 3 und vorzugsweise 2 eingestellt. Die Mischung wird gerührt, worauf die organische Lösungsmittelphase, welche das Cephalosporin C-Derivat III enthält, gesammelt wird.

Die organische Lösung wird im Vakuum auf ungefähr '/3 ihres ursprünglichen Volumens bei einer Temperatur von nicht mehr als 40° C konzentriert. Das Konzentrat wird auf ungefähr 20 bis 30° C abgekühlt, worauf das Natriumsalz des Cephalosporin-Derivats III durch Zugabe eines leichten Überschusses an Natrium-2-äthylhexanoat, aufgelöst in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise MIBK oder n-Butanol, ausgefällt wird. Die Mischung wird 3 bis 4 Stunden lang auf 0 bis 5⁰C abgekühlt, worauf das feste Natriumsalz des Derivats III durch Filtrieren gesammelt wird. Der Filterkuchen wird mit kaltem MIBK, anschließend mit η-Hexan, gewaschen. Das Produkt wird im Vakuum bei ungefähr 25⁰C getrocknet.

In Stufe b) verwendet man günstigerweise Dimethyldichiorsilan oder Trimethylchlorsilan. Beim tertiären Amin kann es sich beispielsweise um Triethylamin, Dimethylanilin, Chinolin, Lutidin oder Pyridin handeln. Als inertes Lösungsmittel kann man Methylenchlorid, Dichloräthan, Chloroform, Tetrachloräthan, Nitromethan, Benzol oder Diäthyläther nennen.

Bei der Umsetzung mit Phosphorpentachlorid arbeitet man beispielsweise mit einem Molverhältnis von 2 oder mehr Mol, z. B. 2 bis 3 oder 4 Mol, des Halogenierungsmittels pro Mol Silylester, wobei jedoch vorzugsweise ungefähr 2 Mol eingesetzt werden, unter wasserfreien Bedingungen in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Methylenchlorid, Dichloräthan, Chloroform, Tetrachloräthan, Nitromethan oder Diäthyläther, in Gegenwart eines Säure-desaktivierenden tertiären Amins, bei dem es sich z. B. um Triäthylamin, Trimethylamin, Dimethylanilin, Chinolin, Lutidin oder Pyridin handeln kann, bei Temperaturen unterhalb 0⁰C, z.B. bei -10 bis -6O⁰C jedoch günstigerweise im Temperaturbereich von —40 bis —60° C Hierbei erhält man das entsprechende Iminohalogenid in Lösung.

Dann vermischt man die Lösung des Iminohalogenids mit einem Alkohol, bei dem es sich beispielsweise um einen aliphatischen Alkohol mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder einem Phenylalkylalkohol mit 1 bis 7 Alkylkohlenstoffatomen handeln kann. Hierbei erhält man den entsprechenden Iminoäther in Lösung.

Darauf vermischt man die Lösung des Iminoäthers unter sauren Bedingungen mit Wasser oder einem Alkohol, insbesondere einem aliphatischen Alkohol, oder,einer Mischung aus einem Alkohol und Wasser, um die 7-Aminocephalosporansäure zu gewinnen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden in überraschender Weise sowohl unter Laboratoriumsbedingungen als auch in technischem Maßstab hohe Ausbeuten erzielt. Die Ausbeuten, die in der Größenordnung von 50 bis 70% liegen können, werden der Verwendung von Silylestern an den Carboxylgruppen der Verbindungen der allgemeinen Formel III zugeschrieben. Die Silylester können ohne Produktverlust hergestellt und.erneut zu der Säure hydrolysiert werden. Der Einsatz von Silylestern vereinfacht das Verfahren, da der Silylester gleichzeitig mit der Aufspaltung der Doppelbindung der Iminogruppe hydrolysiert, so daß es überflüssig wird, die 4-Carbonsäureester, welche bei der Durchführung der bisher bekannten Verfahren auftraten, in einer getrennten Stufe abzuspalten.

Salze von Verbindungen der allgemeinen Formel III, die eingesetzt werden können, sind beispielsweise Alkali- und Erdalkalisalze, wie beispielsweise Kalium-, Natrium-, Calcium- und Aluminiumsalze. In Frage kommen ferner Ammonium- und Aminsalze, vorzugsweise Salze tertiärer Amine, wie beispielsweise Salze vor. Triäthylamin, Dibenzylamin, Trimethylamin, N-Methylmorpholin, Pyridin, N-Benzyl-^-phenäthylamin, 1-Ephenamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, Dihydroabietylamin sowie N-(niedrig)-Alkylpiperidinen, wie beispielsweise N-Äthylpiperidin. Salze tertiärer Amine werden bevorzugt.

Die Menge des eingesetzten Säure-desaktivierenden Amins ist vorzugsweise eine solche Menge, welche ungefähr 75% der gesamten Säuremenge äquivalent ist, die bei der Durchführung des Verfahrens durch das Halogenierungsmittel und die Halogensilanverbindung, welche mit der Verbindung III reagieren, erzeugt wird.

Silylverbindungen der allgemeinen Formel IV und V, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind beispielsweise folgende:

Trimethylchlorsilan,

Hexamethyldisilazan,

Triäthylchlorsilan,

Methyltrichlorsilan,

Dimethyldichlorsilan,

Triäthylbromsälan,

Tri-n-propylchlorsilan,

Brommethyldimethylchlorsilan,

Tri-n-butylchlorsilan,

Methyldiäthylchlorsilan,

Dimethyläthylchlorsilan,

Phenyldimethylbromsflan,

Benzylmethyläthylchlorsilan,

Phenyläthylmethylchlorsilan,

Triphenylchlorsilan,

Triphenylfluorsilan,

Tri-o-tolylchlorsilan,

Tri-p-dimethylaminophenylchlorsilan,

N-Äthyltriäthylsilylamin,

Hexaäthyldisilazan,

Triphenylsilylamin,

Tri-n-propylsilylamin,

Tetraäthyldimethyldisilazan,

Tetramethyldiäthyldisilazan,

Tetramethyldiphenyldisilazan,

Hexaphenyldisilazan und

Hexa-p-tolyldisilazan.

Die gleiche Wirkung wird durch Hexaalkylcyclotrisilazane oder Octaalkylcyclotetrasilazane erzielt. Andere geeignete Sicherungsmittel sind ein Trialkylsilylacetamid und ein bis-Trialkylsilylacetamid.

Eine sehr bedeutsame Stufe zur Erzielung der erfindungsgemäßen hohen Ausbeuten ist die Bildung des Iminoäthers durch Umsetzung des Iminohalogenids unter wasserfreien Bedingungen mit einem primären oder sekundären Alkohol bei Temperaturen zwischen ungefähr —40 bis -70⁰C. Temperaturen von mehr als -4O⁰C haben eine erhebliche Ausbeuteverschlechterung zur Folge.

Alkohole, die sich zur Herstellung der Iminoäther aus den Iminohalogeniden verwenden lassen, sind primäre und sekundäre Alkohole der allgemeinen Formel R10OH, wobei Rio für (A) Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Amylalkohol oder Decanol, (B) Phenylalkyl mit 1 bis 7 Alkylkohlenstoffatomen, wie beispielsweise Benzylalkohol oder 2-Phenyläthanol-l,(C) Cycloalkyl, wie beispielsweise Cyclohexylalkohol, (D) Hydroxyalkyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise wenigstens 3 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise 1,6-Hexandiol, (E) Alkoxyalkyl mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise 2-Methoxyäthanol, 2-Isopropoxyäthanol, 2-Butoxyäthanol, (F) Aryloxyalkyl mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen in der aliphatischen Kette, wie beispielsweise 2-p-Chlorphenoxyäthanol, (G) Araloxyalkyl mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen in der aliphatischen Kette, wie beispielsweise 2-(p-Methoxybenzyloxy)-äthanol oder (H) Hydroxyalkoxyalkyl mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Diglykol, steht. Mischungen dieser Alkohole sind ebenfalls zur Bildung der Iminoäther geeignet.

Nach der Bildung des Iminoäthers aus dem Iminohalogenid muß die Iminobildung zur Gewinnung der 7-ACA aufgespalten werden. Dies erfolgt durch milde Hydrolyse oder Alkoholyse. Ist die Menge des Säuredesaktivierenden tertiären Amins, das zur Durchführung des Verfahrens verwendet wird, geringer als die Säuremenge, welche durch die Silylierung und Halogenierung erzeugt wird, dann erfolgt die Spaltung wahrscheinlich gleichzeitig mit der Beendigung der Bildung des Iminoäthers. War jedoch die Menge des Säure-desaktivierenden Amins größer als die erzeugte Säuremenge, dann erfordert die Spaltungsstufe die sorgfältige Zugabe einer solchen H+ -Menge, welche zur Bewirkung der Spaltung erforderlich ist.

Die 7-ACA wird aus der Reaktionsmischung in der Weise abgetrennt, daß der pH der Mischung auf den isoelektrischen Punkt oder auf einen Wert in der Nähe des isoelektrischen Punktes von 7-ACA eingestellt wird, worauf die 7-ACA auskristallisiert und durch Filtration gesammelt wird.

Zur Erzielung optimaler Ausbeuten an 7-ACA ist es vorzuziehen, hohe Reaktantenkonzentrationen einzusetzen. Beispielsweise werden zur Herstellung der SiIyI-ester 20 bis 30% und vorzugsweise 25 Ge\v.-% der Verbindung III in einem inerten organischen Lösungsmittel suspendiert. Das Silan wird vorzugsweise in einem Überschuß eingesetzt, d. h. in einem Überschuß von 10 bis 60% über der theoretischen Menge.

Ein Molekül des Cephalosporin C-Derivats III besitzt zwei reaktionsfähige Carboxylgruppen, welche Silylester zu bilden vermögen. Daher ist zur Durchführung der Silylierungsreaktion 1 Mol der Verbindung III zwei Äquivalentgewichten gleich.

Wird daher die Verbindung III mit Dichloridmethylsilan behandelt, dann wird ein Molekül der Verbindung III (zwei Äquivalentgewichte) mit wenigstens einem Molekül (zwei Äquivalentgewichten) Dichlordimethylsilan behandelt. Wird die Verbindung III mit Chlortrimethylsilan behandelt, dann wird in ähnlicher Weise ein Molekül der Verbindung III (zwei Äquivalentgewichte) mit wenigstens zwei Molekülen (zwei Äquivalentgewichten) Chlortrimethylsilan behandelt. Das Verhältnis der Äquivalente des Silylierungsmittels zur Verbindung III kann z. B. 1:1 betragen, es kann aber auch beispielsweise im Bereich von 12:1 und 2 :1 liegen.

Dies ermöglicht die Verwendung von Lösungsmitteln, welche nicht absolut trocken sind, da Spurenmengen an Wasser durch Umsetzung mit überschüssigem Silylierungsmittel entfernt werden. Natürlich hängt die Menge der erforderlichen Silanverbindung davon ab, ob eine oder beide Carboxylgruppen der Verbindung III für die Silylesterbildung zur Verfügung stehen. Das Reaktionsschema wird nachstehend angegeben:

Reaktionsschema H OH

HO₂C-C—(CH₂I₃-C—N-

12

NH C=O O
CH₂ CH

/ \ CH₃ CH₃

O=!

N y—CH₂-O-C-CH₃

CO₂Na

[Base]

(CH₃J₂-SiCl₂

(CH₃)->Si

i \

OH OH

Il I Il I

—0—C — C—(CH₂J₃-C-N-

(CH₃J₂Si.

NH

C=O I ο

CH₂ CH

/ \ CH₃ CH₃

O H

O=!

N J—CH₂-O-C-CH₃ KJ

PCl₅

Cl

—0—C—C—(CH₂J₃-C=N-NH C=O O CH₂ CH

/ \ CH₃ CH₃

O=¹

N J-CH₂-O-C-CH₃

c—ο—

R₁₀OH Η®

H₂N

O=I N J— CH₂-O-C-CH₃

CO₂H

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

13 14

Beispiel I

a) »In situ«-HerstelIung von Nalrium-N-carbisobutoxycephalosporin C

O H

HO₂C-C-(CH₂I₃-C-N

NH C=O

CH₂

CH

/ \ CH₃ CH₃

O
N J-CH₂-O-C-CH₃

CO₁Na

29001 der ganzen Kulturbrühe, welche Cephalosporin C enthält, werden mit 108 kg eines Filtrierhilfsmittels und 300 ml einer Silikonantischaumzubereitung vermischt und anschließend bei einem pH von 6,9 und einer Temperatur von 10⁰C filtriert.

Dann wird der filtrierten Brühe eine solche Menge Oxalsäure zugesetzt, die ausreicht, den pH auf 3,1 einzustellen. Anschließend wird der pH durch Zugabe von 30%iger Schwefelsäure auf 2 einreguliert. Dann werden 54 kg eines frischen Filtrierhilfsmittels zugesetzt, worauf die Mischung filtriert wird. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wird mit '/2 Volumen Methylisobutylketon (MIBK) bei pH 2 extrahiert, dann werden die Phasen getrennt und die MIBK-Phase verworfen.

Der extrahierten Brühe wird ¹A Volumen Aceton zugesetzt, worauf der pH mit einer Natriumhydroxidlösung auf 7,85 eingestellt wird. 2 kg Isobutylchlorformiat pro 10001 der filtrierten Brühe werden langsam unter Rühren zugesetzt (molares Verhältnis von 5,9 Mol Isobutylchlorformiat pro Mol Cephalosporin C). Der pH wird durch Zugabe von 15%igem Natriumhydroxid konstant auf 7,8 bis 8,0 gehalten. Während der Zugabe wird die Temperatur zwischen 0 und 1O⁰C gehalten. Das Rühren wird so lange fortgesetzt, bis der pH ohne Zugabe von weiterem Natrium hydroxid konstant bleibt, was ungefähr 2 Stunden dauert.

Der pH wird durch Zugabe von 3O°/oiger Schwefelsäure auf 2 eingestellt, worauf die acylierte Brühe mit '/2 Volumen MIBK extrahiert wird. Die MIBK-Phase wird mit Wasser gewaschen und anschließend bei 36° C im Vakuum auf ungefähr V3 des Ausgangsvolumens konzentriert Der Wassergehalt des Konzentrats beträgt 0,2% (Karl Fischer).

Das Konzentrat wird abgekühlt, worauf eine Lösung von Natriumäthylhexanoat in MIBK bis zu einem pH von 4,8 zugesetzt wird. Das Natriumsalz von N-Carbisobutoxycephalosporin C fällt aus und wird durch Filtration gesammelt Der Niederschlag wird mit MIBK gewaschen, erneut in Petroläther aufgeschlämmt filtriert und in einem Vakuumofen bei 40 bis 6O⁰C getrocknet Dabei fallen 7,2 kg des Produktes an. Eine Untersuchung der verbrauchten Brühe ergibt, daß die Menge des noch vorhandenen Cephalosporin C weniger als 1% beträgt Das gesammelte Produkt enthält ungefähr 42 bis 50% reines Natrium-N-carbisobutoxycephalosporin C Das Produkt besitzt eine solche Reinheit, daß es anschließend zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure eingesetzt -werden kann.

b) Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure

13,5 g Natrium-N-carbisobutoxycephalosporin C, das wie vorstehend beschrieben hergestellt worden ist, 45 ml Methylenchlorid, 3,0 ml Dimethylanilin und jo 3,67 ml Triethylamin werden zusammen vermischt. Dann werden 6,2 ml Dichlordimethylsilan unter Rühren bei einer Temperatur von 28° C zugesetzt Die Lösung wird 40 Minuten lang gerührt Die Lösung wird anschließend auf -6O⁰C abgekühlt, worauf 12,0 g Phosphorpentachlorid, gelöst in 1OO ml Methylenchlorid, zugesetzt werden. Weitere 11,0 ml Dimethylanilin werden zugesetzt, wobei die Reaktionstemperatur unterhalb — 40⁰C gehalten wird. Die Temperatur wird nach 2 Stunden auf —73°C abgesenkt, worauf eine Mischung 4<i aus 60 ml Methanol und 2,5 ml Dimethylanilin, abgekühlt auf —78° C, langsam zugesetzt wird. Die Temperatur steigt auf —45° C an. Die Mischung wird gerührt und erneut auf —50° C abgekühlt Nach 2 Stunden werden 55 ml Wasser, erhitzt auf +90⁰C, zugesetzt. D;e Temperatur steigt auf +3° C. Die Mischung wird in einem Eisbad gekühlt und 4 Minuten lang gerührt. 22 ml Ammoniumhydroxid werden während einer Zeitspanne von 8 Minuten zur Einstellung eines pH von 3,7 zugesetzt. Die Mischung wird einige Stunden gerührt und anschließend filtriert. Der Niederschlag wird gewaschen und mit 50 ml Methylenchlorid, dann mit 40 ml Wasser, anschließend mit 50 ml Methanol und schließlich mit 50 ml Aceton gewaschen. Der Feststoff wird getrocknet wobei 2,25 g einer 92£%igen 7-ACA anfallen.

Beispiel 2

a) »In situ«-Herstellung von Natrium-N-carbisobutoxycephalosporin C

Die in Beispiel 1 beschriebene Methode wird wiederholt, wobei ein Molverhältnis Isobutylchlorformiat: Cephalosporin C von 4,5 :1 anstelle des 5ß : 1-Molverhältnisses eingehalten wird. Dabei werden 10,4 kg des Produktes erhalten. Eine Untersuchung der verbrauchten Brühe ergibt nach der Extraktion, daß weniger als 14% Cephalosporin C vorliegen.

t6

b) Herstellung von /-Arc-inocephalosporansäure

13,5 g Natrium-N-carbisobutoxycephalosporin C, hergestellt wie unter a) beschrieben, 50 ml Mithylenchlorid, 3 ml Dimethylanilin und 3,67 ml Triäthylamin werden miteinander vermischt. 6.2 ml Dichlordimethylsilan werden unter Rühren bei einer Temperatur von .";5 bis 29° C zugesetzt. Die Lösung wird 30 Minuten lang gerührt und anschließend auf —60° C abgekühlt Dann werden 12,0 g PCh in 100 ml Methylenchlorid zugesetzt. Die Temperatur wird während einer Zeitspanne von 2 Stunden auf —40° C gehalten. Die Lösung wird auf —73°C abgekühlt, worauf eine Lösung aus 60 ml Methanol und 2,5 ml Dimethylanilin, abgekühlt auf — 7b°C, zugesetzt wird. Die Temperatur steigt auf -46⁰C an. Die Temperatur wird während einer Zeitspanne von 2 Stunden zwischen —45 und —50°C gehalten. 55 ml Wasser, erwärmt auf 95° C, werden unter Rühren zugesetzt. Die Temperatur steigt auf — 5°C an. Nach 4minütigem Rühren (pH 0,2) werden während einer Zeitspanne von 7 Minuten 22 ml NH4OH zur Einstellung eines pH von 3,8 zugesetzt. Das Rühren wird einige Tage lang unter Abkühlen fortgesetzt. Die ausgefallene 7-ACA wird durch Filtrieren gesammelt und mit 50 ml Methylenchlorid, 40 ml Wasser, 50 ml Methanol und anschließend 50 ml Aceton gewaschen. Der getrocknete Feststoff wiegt 2,3 g und besteht zu 95,4% aus 7-ACA.

Beispiel 3

a) »Insitu«-Herstellung von Natrium-N-carbäthoxycephalosporin C

Die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, wobei anstelle des Molverhältnisses von Isobutylchlorformiat: Cephalosporin C von 5,9 :1 ein Molverhältnis von 7,0 :1 Äthylchlorformiat pro Mol Cephalosporin C eingehalten wird. Dabei wird Natrium-N-carbäthoxycephalosporin C erzeugt.

b) 7-ACA aus Natrium-N-carbäthoxycephalosporin C

12,0 g Natrium-N-carbäthoxycephalosporin C, 45 ml Methylenchlorid, 3,47 ml Triäthylamin und 7,0 ml N,N-Dimethylanilin werden in einen 500-ml-Kolben gegeben. Die Aufschlämmung wird gerührt, worauf 4,75 ml Dichlordimethylsiisn tropfenweise bei 25 bis 28⁰C zugesetzt werden. Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von 45 Minuten bei ungeführ 25° C gehalten. Die Reaktion wird auf — 6O⁰C abgekühlt, worauf 10,8 g PCh (0,052 Mol) in 100 ml Methylenchlorid in einer solchen Geschwindigkeit zugesetzt werden, daß die Temperatur unterhalb —40" C gehalten wird. Dann werden 11,7 ml Ν,Ν-Dimethylanilin zugesetzt, wobei die Temperatur auf —40⁰C gehalten wird. Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von 2 Stunden auf -40° C gehalten. Dann wird auf -73° C abgekühlt, worauf 60 ml Methanol, die 2,36 ml N.N-Dimethylanilin enthalten, mit einer Temperatur von —78° C schnell der Reaktion zugesetzt werden. Die Temperatur steigt auf -43° C an. Dann wird auf -50° C abgekühlt und die Temperatur während einer Zeitspanne von 2 Stu; den auf diesem Wert gehalten. 45 ml Wasser mit einer Temperatur von +65⁰C werden zu-

2", gesetzt, worauf auf +5⁰C erwärmt und 4 Minuten lang gerührt wird. Der pH beträgt ungefähr 0,10 ml konzentriertes Ammoniak werden tropfenweise während einer Zeitspanne von ungefähr 6 Minuten (pH = 1,6) zugesetzt. Die Temperatur wird mit einem Eisbad bei 0 bis

jo +5°C gehalten. 5 g Ammoniumcarbonat in 10 ml Wasser werden der Hydrolysemischung (pH =3,0) zugesetzt. Der pH wird anschließend mit 3,0 ml Ammoniak auf 3,8 eingestellt. Die Kristallisationsmischung wird 2 Stunden lang in einem Eisbad gerührt und über Nacht

j3 16 Stunden lang in Eis gehalten. Die Kristalle werden abfiltriert und mit Methylenchlorid, 20 ml Wasser, 50 ml Methanol und mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 3,72 g ( = 58,2%).

Beispiel 4 a) »In situ«-Herstellung von N-fN'-ButylcarbamoyO-cephalosporin C

H OH

I Il I

— C—(CH,)₃—C—N-

NH O=*

C=O

NH

(CH₂).,

CH₃

29001 der ganzen Kulturbrühe, welche Cephalosporin C enthält, werden mit 108 kg eines Filtrierhilfsmittels und 300 ml eines Silikon-Antischäumungsmiuels vermischt und anschließend bei einem pH von 6,9 und einer Temperatur von 10°C filtriert.

Dann wird eine Menge Oxalsäure zugesetzt, die ausreicht, den pH der filtrierten Brühe auf 3,1 einzustellen. Anschließend wird der pH durch die Zugabe von 30%iger Schwefelsäure auf 2 eingestellt. Dann werden 54 kg eines frischen Filterhilfsmittels zugesetzt, worauf

N J— CH₂-O-C-CH₃
CO₂Na

die Mischung filtriert wird. Das auf diese Weise erhalbo tene Filtrat wird bei pH 2 mit '/2 Volumen Methylisobutylketon (MlBK) extrahiert, worauf die Phasen getrennt werden. Die MIBK-Phase wird verworfen.

Der extrahierten Brühe wird 'Λ Volumen Aceton zugesetzt, worauf der pH mit einer Natriumhydroxidb¹) lösung auf 7,85 eingestellt wird. 2 kg n-Butylisocyanat pro 10001 Brühe werden langsam unter Rühren zugesetzt (Molverhältnis von ungefähr 6,1 Mol n-Butylisocyan. i pro Mol Cephalosporin C).

909 542/23

Der pH wird durch Zugabe von 15%igem Natriumhydroxid konstant auf 7,8 bis 8,0 gehalten, während die Temperatur während der Zugabe auf 0 bis 10°C einreguliert wird. Das Rühren wird ohne weitere Natriumhydroxidzugabe solange fortgesetzt bis der pH konstant bleibt Dies erfordert eine Zeitspanne von ungefähr 2 Stunden.

Der pH wird mit 30%iger Schwefelsäure auf 2 eingestellt worauf die acylierte Brühe mit ³A Volumina n-Butanol extrahiert wird. Die Butanolphase wird mit Wasser gewaschen und anschließend bei 36° C im Vakuum auf ungefähr die Hälfte des Ausgangsvolumens konzentriert Der Wassergehalt des Konzentrats ist vernachlässigbar.

Das Konzentrat wird abgekühlt worauf eine Lösung 15 aus Natriumäthylhexanoat in n-Butanol bis auf pH 4,8 zugesetzt wird. Das Natriumsalz von N-(N'-Butylcarbamoyl)-cephalosporin C fällt aus und wird durch Filtrieren gesammelt. Der Niederschlag wird mit Butanol gewaschen, erneut in Petroläther aufgeschlämmt, mit 20 Aceton gewaschen, filtriert und in einem Vakuumofen bei 40 bis 6O⁰C getrocknet. Dabei wird das Produkt erhalten. Eine Untersuchung der verbrauchten Brühe zeigt, daß weniger als 15% Cephalosporin C vorliegen. Das Produkt besitzt eine Reinheit, welche für die an- 25 schließende Herstellung von 7-ACA ausreicht. Es stellt Berechnet:

sich heraus, daß die Disäure vorliegt. gefunden:

Analyse C₂,H₃₀N₄O₉S - H₂O:
Ber.: C 47,36, H 6,06, N 10,54, S . H2O 3,38;
gef.: C 47,85, H 6,52, N 10,54, S 6,45, H2O 3,48.

b) Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure

13,4 g Natrium-N-fN'-butylcarbamoylJ-cephalosporan C, 45 ml Methylenchlorid, 1,0 ml Dimethylanilin und js 3,67 ml Triethylamin werden miteinander vermischt. Dann werden bei einer Temperatur von 25 bis 28°C 5,0 ml Dichlordimethylsilan unter Rühren zugesetzt. Die Lösung wird 30 Minuten gerührt. Die Lösung wird anschließend auf -60°C abgekühlt, worauf 11,5g ₄₍₎ Phosphorpentachlorid, gelöst in 100 ml Methylenchlorid, zugesetzt werden. Dabei wird die Reaktionstemperatur unterhalb -40° C gehalten. Weitere 12,4 ml N,N-Dimethylani!in in 10 ml Methylenchlorid werden zugesetzt. Die Temperatur wird 2 Stunden lang unterhalb -40° C gehalten und dann auf -73° C abgesenkt. Dann wird eine Mischung aus 60 ml Methanol und 2,5 ml Dimethylanilin, abgekühlt auf -78°C, langsam zugesetzt. Die Temperatur steigt auf —47°C an. Die Mischung wird gerührt und erneut auf —50°C abgekühlt. Nach 2 Stunden werden 55 ml Wasser, erhitzt auf +95°C, zugesetzt. Die Temperatur steigt auf +5°C an. Die Mischung wird in einem Eisbad abgekühlt und 4 Minuten lang gerührt. Der pH liegt unterhalb 0,1. Dann werden im Verlauf von 5 Minuten 21,5 ml Ammoniumhydroxid zur Einstellung eines pH von 3,8 zugesetzt Die Mischung wird einige Stunden lang gerührt, worauf filtriert wird. Der Niederschlag wird gesammelt und mit 25 ml Methylenchlorid, dann mit 25 ml Wasser, anschließend mit 50 ml Methanol und abschließend mit 50 ml Aceton gewaschen. Der Feststoff wird getrocknet Dabei werden 4,05 g einer 93,7%igen 7-ACA erhalten.

Beispiel 5

a) »In situ«-Herstellung von Natrium-N-(N'-phenylcarbamoyl)-cephalosporin C

Die in Beispiel 4a) beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, wobei anstelle des Molverhältnisses von n-Butylisocyanat: Cephalosporin C von 6,1:1 ein 7 :1-Molverhältnis (Phenylisocyanat) eingehalten wird. Dabei wird ein Produkt erhalten, das sich in zufriedenstellender Weise zu 7-ACA spalten läßt. Eine Untersuchung der verbrauchten Brühe nach der Extraktion zeigt, daß weniger als 15% Cephalosporin C vorliegen. Es wird als Disäure ermittelt.

Analyse C₂₃H₂₆N₄O₉S:

C 51,68, H 4,90, N 10,48, S 6,00;
C 51,63, H 5,27, N 10,62, S 6.14.

b) Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure

13,9 g Natrium-N-iN'-phenylcarbamoylJ-cephalosporin C, 45 ml Methylenchlorid, 1 ml Dimethylanilin und 3,67 ml Triethylamin werden miteinander vermischt. Dann werden 5,5 ml Dichlordimethylsilan unter Rühren bei einer Temperatur von 25 bis 28° C zugesetzt. Die Aufschlämmung wird 75 Minuten lang gerührt, worauf auf -60° C abgekühlt wird. Dann werden 12,0 g PCl₅ in 100 ml Methylenchlorid zugesetzt Weitere 11,0 ml Dimethylanilin in 10 ml Methylenchlorid werden zugegeben. Die Temperatur wird 2 Stunden bei -40° C gehalten. Die Lösung wird auf -75⁰C abgekühlt, worauf eine Lösung von 60 ml Methanol und 2,5 ml Dimethylanilin, abgekühlt auf -78°C, zugesetzt wird. Die Temperatur steigt auf — 52°C an. Die Temperatur wird 2 Stunden zwischen —45 und -50°C gehalten. Dann werden 50 ml Wasser, erwärmt auf 95⁰C, unter Rühren zugesetzt. Die Temperatur steigt auf +5° C an. Nach 4minütigem Rühren (pH 0,0) werden während 8 Minuten 22 ml NH₄OH zur Einstellung eines pH von 3,7 zugesetzt. Die Aufschlämmung wird einige Tage unter Abkühlen gerührt. Die ausgefallene 7-ACA wird durch Filtrieren gesammelt und mit 50 ml Methylenchlorid, 40 ml Wasser, 50 ml Methanol und 50 ml Aceton gewaschen.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Hers:ellung von 7-Aminocephalosporansäure durch Isolierung von Cephalosporin C aus einer Fermentationsbrühe und Deacylierung, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine von gegebenenfalls enthaltenem Cephalosporin N in an sich bekannter Weise befreite, filtrierte Cephalosporin-C-haltige Kulturbrühe bei einem pH-Wert von 7 bis 9 und einer Temperatur unterhalb 40° C mit wenigstens 2 Mol eines Isocyanates der allgemeinen Formel

R-N=C=O

worin

15

oder eines Halogenformiats der allgemeinen Formel

X—CO—OR

R eine niedrige Alkylgruppe oder eine

25

Gruppe der allgemeinen Formel

-(CH₂),

darstellt, wobei η eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, falls der Rest B in der nachstehenden allgemeinen Formel für —OR steht, und 0 bis 6 bedeutet, falls B für -NHR steht, und die Substituenten R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sind. Wasserstoff-, Chlor-, Brom- oder Fluoratome, Nitrogruppen, niedrige Alkyl- oder niedrige Alkoxygruppen bedeuten, und
X für ein Chlor-, Brom- oder Jodatom steht,

pro Mol Cephalosporin C umsetzt, die Reaktionsmischung mittels eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert von 1 bis 3 extrahiert, das erhaltene Produkt gegebenenfalls in ein Metalloder Aminsalz überführt, und
b) die in Stufe a) erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel

N >-CH₂—O-C—CH₃

CO₂M

worin

B eine Gruppe der allgemeinen Formel -NHR oder —OR ist, und M ein Wasserstoff atom oder ein Metall- oder Aminkation ist, in an sich bekannter Weise mit einer Silylverbindung der allgemeinen Formeln IV oder V

R*

Si

R₄ NH N HN RA \ i
Si
/ \ I /
Si /
R₄ \ R₄

(IV)

oder

R₅

U,—Si—X
I
R₇

45

50

55

bO

(V)

65

worin R5. R₆ und R₇ ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Niedrigalkyl-, Halogen-(niedrig)-alkyl- oder Phenylgruppe bedeuten und wenigstens einer der Substituenten R5, Rt und R7 eine andere Bedeutung als ein Halogenoder Wasserstoffatom hat, R4 eine Niedrigalkylgruppe darstellt, m 1 oder 2 ist und X für ein Halogenatom oder

—Ν

R₉

steht, wobei Re ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe ist und R9

R₅

Rh-Si—
R₇

darstellt, oder mit einem Triylkylsilylacetamid oder bis-Trialkylsilylacetamid unter wasserfreien

Bedingungen in Gegenwart eines tertiären Amins in einem inerten Lösungsmittel umsetzt, den erhaltenen Silylester mit wenigstens 1 Mol Phosphorpentachlorid pro Mol des Silylesters in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines tertiären Amins bei einer Temperatur unterhalb 0⁰C reagieren läßt, darauf das erhaltene lminohalogenid unter wasserfreien Bedingungen mit einem Alkohol bei Temperaturen zwischen ungefähr —40° bis -70° C umsetzt, den erhaltenen Iminoäther dann unter sauren Bedingungen der Hydrolyse oder Alkoholyse unterwirft und die gebildete 7-Aminocephalosporansäure nach Einstellen des pH-Werts der Mischung auf den isoelekirischen Punkt durch Filtrieren abtrenn L