DE1901621A1 - Verfahren zur Herstellung von 1-Tryptophan enthaltenden Hefezellen - Google Patents

Description

K 875

Kyowa Hakko Kogyo Oo. Ltd., Tokio, Japan

Verfahren zur Herstellung von !-Tryptophan enthaltenden

Hefezellen

Zusammenfassung:

Das Verfahren zur Erzeugung von L-Tryptophan enthaltenden Hefezellen besteht darin, dass man eine kohlenwasserstoffassimilierende Hefe unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Mhrmedium kultiviert und Anthranilsäure zu dem Medium entweder zu Beginn oder während des Kultivierungsvorgangs zusetzt. Zu Hefestämmen, die verwendet werden können, gehören kohlenwasserstoffassimilierende Stämme von Candida, Torulopsis und Brettanomyces.

Beschreibung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefezellen, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan enthaltenden Hefezellen.

Es ist bekannt, dass L-Tryptophan in einer Kulturflüssigkeit durch Zugabe von Anthranilsäure zu dem Nährmedium, wenn darin Hefen in Gegenwart von Zuckerstoffen als Kohlenstoffquellen kultiviert werden, hergestellt wird.

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Es war jedoch nicht bekannt, dass L-Iryptophan in den Hefezellen erzeugt und angesammelt wird, wenn Hefen kultiviert werden, die zur Verwendung oder Assimilierung von Kohlenwasserstoffen, die dem Medium als Kohlenstoffquellen zugesetzt wurden _} "befähigt sind.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher in einem Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen, die grosse Mengen L-Tryptophan enthalten.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem billigen grosstechnischen Verfahren zur Erzeugung von L-Tryptophan enthaltenden Hefezellen, das eine hohe Produktausbeute liefert.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung von L-Tryptophan.

Perner liefert die Erfindung Hefezellen, die L-Tryptophan enthalten und die in günstiger Weise als Nahrungs- oder !Futtermittel,zur Veredlung von Nahrungs- oder Futtermitteln u. dgl. verwendet werden können.

Bei der Untersuchung von Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan-haltigen Mikroorganismenzellen in grossen Mengen unter geringem Kostenaufwand wurde nun gefunden, dass L-Tryptophan enthaltende Hefezellen in hoher Ausbeute erhalten werden können, wenn Hefen in einem Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium kultiviert werden und Anthranilsäure zu dem Medium zu beliebiger Zeit während des Kuitivierungsprozesses zugegeben wird. Auf diese Weise werden die vorstehend beschriebenen Ziele und Vorteile durch Kultivierung kohlenwasserstoffassimilierender Hefen in einem wenigstens einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Mährmedium erreicht. J₀ Erfindungsgemäss verwendbare Hefenstämme sind solche, ° die Kohlenwasserstoffe verwenden oder assimilieren können, co

co Zum Beispiel können Hefen, die zu den Genera Candida,

cn Torulopsie, Brettanomyces u. dgl. gehören, verwendet werden.

Q Zu geeigneten verwendbaren Hefestammen innerhalb dieser ^ G-enera gehören,beispielsweise, Torulopsis famata, Torulopsis -J intermedia, Candida tropicalis, Candida lipolytica, Candida mycoderma, Candida zeylanoides u. dgl«.

Entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Mhrmedium ist zur Kultivierung der erfindungsgemäss verwendeten Stämme geeignet, soweit es die wesentlichen Nährstoffe zum Wachstum des verwendeten Stamms enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt und dazu gehören Stoffe, wie z.B. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen gebraucht werden.

Da kohlenwasserstoffassimilierende Stämme erfindungsgemäss angewendet werden, werden in dem Medium als Hauptkohlenstoffquelle Kohlenwasserstoffe verwendet. Zu Kohlenwasserstoffen, die in diesem Zusammenhang eingesetzt werden, gehören beispielsweise geradkettige und verzweigtkettige Paraffine (Alkane), wie beispielsweise n-Pentan, n-öctan, n-Decan, n-Dodecan, n-Hexadecan, Isopentan, Isooctan u.dgl., Oycloparaffine, wie z.B. Oyclohexan und Cyclooctan geradkettige und verzweigtkettige Olefine, wie beispielsweise Penten-2, Hexen-1, Octen-1, Octen-2 u. dgl., Gycloolefine, wie z.B. Cyclohexen, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Benzol, o-Xylol , p-Xylol u. dgl. und Gemische davon und gemischte Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Kerosin, Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle, Roherdöl u.dgl..

Es können auch gelinge Mengen anderer Kohlenstoffquellen in dem Medium verwendet werden. Zu diesen gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse u. dgl., oder irgendwelche anderen geeigneten Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure u. dgl.. Diese Stoffe können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen

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wie z.B. Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumehlorid, Aramoniumeulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat u. dgl· oder natürliche Stickstoff enthaltende Substanzen, wie z.B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Oaseinhydrolysate, Casaminosäure, gelöste Fischsubstanz, Reiskleieextrakt u. dgl. verwendet werden. Diese Substanzen können wiederum entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinkeulfat und dergleichen.

Es sollten auch Nährstoffe, die wesentlich für das Wachstum des speziellen verwendeten Stamms sind,dem Medium zugesetzt werden und dazu gehören beispielsweise Vitamine, wie z.B. Biotin, Thiamin, Pantothensäure, p-Aminobenzoesäure, Nikotinsäure u. dgl. und verschiedene Arten von Aminosäuren, wie z.B. Glutaminsäure und dergleichen.

Als Teil der Erfindung wird Anthranilsäure dem Medium zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Kultivierungsvorgangs zugesetzt. Sie Anthranilsäure kann somit beim Einsetzen oder bei Beginn der Kultivierung oder während des Mittelpunktes der Kultivierung,nachdem die Stämme beträchtlich gewachsen sind, zugesetzt werden. Ferner kann die gesamte Anthranilsäure auf ein/tfmal,oder sie kann intermittierend je nach Wunsch, gemäss den benten Ergebnissen, zugesetzt werden. Die Anthranilsäuremenge, die dem Medium zuzusetzen ist, kann je nach dem besonderen Stamm und den angewendeten Kultivierungsbedingungen variieren. Vorzugsweise wird Anthranilsäure zu dem Medium jedoch im allgemeinen in einem Konzentrationsbereiöfa. von etwa 20 mg/l bis 5 g/l zugegeben.

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Die Fermentation oder Kultivierung des Mikroorganismus wird unter aeroben Bedingungen, wie beispielsweise, aerobes Schütteln der Kultur oder Bewegen und Belüften einer Submerskultur bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 10° - 50⁰O und bei einem pH-Wert von beispielsweise etwa 2 bis 9 durchgeführt. Nach etwa 2 bis 10-tägiger Kultivierung unter diesen B_ftdingungen^ werden grosse Mengen !-Tryptophan enthaltende Hefezellen erhalten. Das !-!Tryptophan kann dann aus den Zellen durch übliche Massnahmen, wie beispielsweise Extraktion od. dgl. gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu begrenzen. Palis nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel

Candida tropicalis KY5O14 ATOO 20175,Candida arborea KY5O15 ATCC 20176 und Candida lipolytica KY5O34 ATCC 8661 werden jeweils in einem Empfmedium, das 2 # Sorbit, 1 $> Fleischextrakt, 0,5 $> Hefeextrakt, 1 # Pepton und 0,3 f> Natriumchlorid enthält, unter aerobem Schütteln während 24 Stunden bei 3O⁰O zur Herstellung einer Impfkultur kultiviert. Die so erhaltenen Impfkultüren werden jeweils in Erlenmeyer-Kolben eingeimpft, die jeweils 20 ml eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:

5 $> n-Alkangemisch (0.J₂-C...) 2 i> ()

0,2 56 2

0,2 ?6 Ba₂HPO₄.

0,1 96 MgSO₄ ·7Η₂0

0,001 $> FeSO. · 7H₉O

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0,001 £

0,001 $> 0,5 56

1 g/l

MhSO₄*

Hefeextrakt Maisquellflüssigkeit CaOO,

Anthranilsäure

Der pH-Wert des Fermentationsmediums beträgt 6,5.

Die Fermentation wird unter aerobem Schütteln der Kultur während 72 Stunden bei 30⁰C durchgeführt. Die erhaltenen Zellen werden dann aus der Kulturflüssigkeit abzentrifugiert,und das freie !-Tryptophan in den Zellen wird mit heissem Wasser extrahiert. Das L-Tryptbphan in der extrahierten Lösung wird durch biologische Prüfung bestimmt und der freie Tryptophangehalt pro Gewicht an Trockenzellen berechnet. Die ErgeMsse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Ferner ist in der Tabelle als Vergleich die Ausbeute an Zellen und die bei Kultivierung der gleichen Hefen unter den gleichen Bedingungen, jedoch in einem Fermentationsmedium, das keine Anthranilsäure enthält, erhaltenen Ergebnisse wiedergegeben.

Tabelle

Verwendete
Hefe

Zugabe von

Anthranil säure (g/l)

Ausbeute an Zellen (Trockengewicht) (mg/ml)

Freies

Ir-Tryptophan in 1 g Zellen (mg/g)

Candida
tropicalie
KY5014 ATCC
20175

1
keine

31.0 33.8

2.50 0.95

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Tabelle (Fortsetzung)

Verwendete
Hefe

Zugabe von

Anthranil säure (g/l)

Ausbeute an Zellen (Trocken-

?ewicht) mg/ml)

!Freies L-Tryptophan in 1 s Zellen (mg/g)

Candida
arborea
KI5O15
ATGO 20176

Candida
lipolytioa

KT5034
ATCC 8661

keine

1
keine

39,4 45,0

28,2 33,8

1,27 0,30

0,64 0,15

Die vorstehend beschriebene Erfindung kann in verschiedener Weise variiert werden. Derartige Variationen weichen nicht vom Rahmen der Erfindung ab und fallen sämtlich in den Bereich der Erfindung.

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Claims (13)

Patent an sprüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-iDryptophan enthaltenden Hefezellen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine kohlenwasserstoffassimilierende Hefe unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen, einen Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch von Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquelle und Anthranilsäure enthaltenden Nährmedium kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen zu einem Genus der Gruppe Candida, !Dorulopsis oder Brettanomyces gehört.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 10 bis 50⁰O und bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 9 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Nährmedium verwendet, das. etwa 20 mg/l bis 5 g/l Anthranilsäure enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Anthranilsäure zu dem Nährmedium zu Beginn der Kultivierung zugibt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Anthranilsäure zu dem Nährmedium nach Einleitung der Kultivierung zusetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltenen Hefezellen aus der Kulturflüssigkeit Za₅/ entfernt werden -afd/. * *A*s

8. Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan enthaltenden Hefezellen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine kohlenwasserstoffassimilierende Hefe, die zu einem Genus der Gruppe Candida, Torulopsis oder Brettanomyces

gehört

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unter aeroben Beindungen hei einer Temperatur von etwa 10° his 5O⁰O und einem pH-Wert von etwa 2 his 9 in einem wässrigen Hährmedium, das einen Kohlenwasserstoff oder ein ßemisoh von Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquelle und Anthranilsäure enthält,kultiviert.

9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium etwa 20 mg/1 his 5 g/l Anthranilsäure enthält. _f

10. Verfahren nach Anspruch^; dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Candida tropicalis ASCC 20175 verwendet. ρ

11. Verfahren nach Anspruch^ dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Candida arhorea ATCC 20176 verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch Jr^ dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Candida lipolytica ATCC 8661 verwendet. *

13. Verfahren nach Anspruch Jsi dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Hefezellen aus der Kulturflüssigkeit entfernt nd a-. <j ^ j

14· Verfahren nach Anspruch,J»f dadurch gekennzeichnetf dass als Kohlenwasserstoff ein Normal-Alkan verwendet wird,

15· Verfahren nach Anspruch jf, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoff Kerosin verwendet wird.

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