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Verfahren zur Herstellung von Ribotiden und Desoxyribotiden von 5-Fluoruracil
Die Erfindung betrifft- ein Verfahren zur Herstellung von neuen Ribotiden und Desoxyribotiden
von 5-Fluoruracil und deren Salzen mit pharmazeutisch verwendbaren Basen, insbesondere
das 5-Fluoruridinphosphat und das 2'-Desoxy-5-fluoruridinphosphat, sowie Salze dieser
Verbindungen. Der Ausdruck »Phosphat« ist bei der Beschreibung der vorliegenden-
:Erfindung in weitem Sinne zu verstehen. Er soll einen Ester des Phosphors bezeichnpn,
worin der Säureteil des Esters von einer Säure des Phosphors abgeleitet ist, welche
nur Wasserstoff, Sauerstoff und Phosphor enthält und worin der Phosphor fünfwertig
und über ein Sauerstoffatom mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man ein 5-Fluoruracü-N-ribosid
bzw. -N-desoxyribösid; z. B. 5-Fluoruridin =oder 2'-Desoxy-5-fluoruridin.unter Ausschluß
von Wasser mit Phosphorsäuremonochlorid oder Phosphorsäuredichlorid oder.einer Mischung
dieser beiden Stöffe in Gegenwart' 'einer tertiären organischen Base, -z. $. Pyridin,
Chinolin, bei Zimmertemperatur oder leicht erhöhter Temperatur umsetzt und die gewünschten
Nucleotide chromatographisch abtrennt. Die Reaktionsdauer hängt im allgemeinen vom
Verhältnis des verwendeten °Monozum.Dichlorid der Phosphorsäure ab. Bei Verwendung
von im wesentlichen reinen PhosphorsäuredichIorid ist die kürzeste Reaktionsdauer
:erforderlich. Die .längste Reaktionsdauer ist notwendig, wenn man im wesentlichen
reines Phosphorsäuremonochlorid verwendet. Eine mittlere Reaktionsdauer ist dann
nötig, wenn -man ein Gemisch dieser beiden Stoffe. anwendet. '.
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Als Beispiele für die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen
5-Fluoruracilmononucleotide seien, die folgenden genannt: 2'-Desoxy-5-fluoruridin-5'-monophosphat,
2'-Desoxy-5-fluoruridin-3',5'-diphosphat, 5-Fluoruridin-5'-rnonophosphat, 5-Fluoruridin-5'-diphosphat,
5-Fluoruridin-5'-triphosphat.
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Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren -.er= hältlichen Nucleotide
von 5-Fluoruracil können mit pharmazeutisch verwendbaren Basen, wie AlkalimetaIlhydroxyde,
Egdalkalimetallhydroxyde, Ammoniak, nicht toxische organische Basen, z,- B. Diäthänolämin;
Morpholin,. in ihre Salze übergeführt werden.
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Die neuen 5-Flüoruracilribotide und Desoxyribotide und ihre Salze
sind germicid wirksam. Sie wirken z.$-: gegen grampositive Bakterien, wie Staphylococcus
aureus. Sie lassen sich auch als Antimetaboliten- verwenden, z. B. zur Wachstumshemmung
von Zellen, wie Lactobacillus leichmannii, wobei sie in den Nucleinsäuremetabolismus
eingreifen.
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Verfahren zur Herstellung der als Ausgangsstof% verwendeten Riboside
bzw. Desoxyriboside sind Gegenstand `der deutschen Patentschriften `@ 1083825 bzw.
1072249.. Die verfahrensgemäß benötigten Phos= pliörsäurechloride werden nach -dein
folgenden Verfahren, für das ein Schutz nicht begehrt wird; hergestellt (1) Zu 10
ml - (etwa. 0,11 Mo» frisch destilliertem Phosphoroxychlorid werden .langsam unter
Kühlung auf 25°C und gutem Rühren 20 ml (etwa 0,11 Mol) destilliertes Wasserzugesetzt.
Man läßt die Mischung hierauf etwa 15 Stunden unter sorgfältigem Ausschluß von atmosphärischer
Feuchtigkeit stehen: Das erhaltene Produkt besteht im wesentlichen aus Phosphorsäuredichlorid
(I) der Formel
(2) Zu 20 ml (etwa 0,22 Mol) frisch destilliertem Phosphoroxychlorid werden unter
gutem Rühren 8,0 ml (etwa 0;44 Mol) destilliertes Wasser zugesetzt, wobei durch
Kühlung eine Temperatur von 25°C aufrechterhalten wird. Die Mischung wird hierauf
während 15 Stunden unter Ausschluß-von atmosphärischer Feuchtigkeit stehengelassen:
Man erhält ein Produkt,
dasimwesentlichen ausPhosphorsäuremonochlorid
(II) der folgenden Formel
besteht. (3) Zu 36,6 ml (0,4 Mol) technischem, nicht redestilliertem Phosphoroxychlorid
werden langsam unter gutem Rühren und unter Kühlung auf etwa 25'C 7,2 ml (0,4 Mol)
destilliertes Wasser zugesetzt. Die Mischung wird gerührt, bis die Chlorwasserstoffentwicklung
im wesentlichen beendigt erscheint, und hierauf während etwa 15 Stunden stehengelassen.
Man erhält ein Produkt (1I1), das im wesentlichen aus Phosphorsäuremonochlorid mit
einer geringen Menge Phosphorsäuredichlorid besteht.
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In jedem der folgenden Beispiele wird das Phosphorsäurechlorid unmittelbar
nach dem vorstehend erwähnten Zeitraum von etwa 15 Stunden verwendet.
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Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen das erfindungsgemäße
Verfahren.
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Beispiel 1 50 mg 5-Fluoruridin werden in 15 ml wasserfreiem Pyridin
gelöst. Die Lösung wird mit 0,3 ml Phosphorsäurechlorid (III) (nach vorstehendem
Verfahren 3 erhalten) vermischt, wobei eine leichte Temperaturerhöhung eintritt.
Die Mischung, wird während 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Während
dieser Zeit fällt etwas Pyridinsalz als gummiartiger weißer Feststoff aus. Man setzt
zur Reaktionsmischung 10 ml Wasser und erhitzt die erhaltene Lösung in einem warmen
Wasserbad während 20 Minuten auf 60°C. Die Lösung wird hierauf auf etwa 25°C abgekühlt
und durch Zusatz von verdünnter Natronlauge auf p$ 7,2 gebracht, worauf das Pyridin
durch Abdampfen im Vakuum bis auf ein geringes Volumen entfernt wird. Der pyridinfreie
Rückstand wird mit 100 ml Wasser verdünnt, der pH-Wert mit verdünnter Natronlauge
auf 9,0 gebracht und die Reaktionsprodukte an einer unter dem Handelsnamen »Dowex
1-X4« bekannten Anionenaustauschersäule(bestehendausquerverbundenen Copolymerenvon
Styrolmit 4 % pWinylbenzol; welches als funktionelle Gruppen quaternäre Ammoniumgruppen
enthält, 1 cm - 20 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm), welche vorgängig in die
Formiatform übergeführt wurde, adsorbiert. Die Säule wird hierauf entsprechend den
Angaben in Tabelle 1 behandelt. Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel beträgt
1 ml je Minute, wobei einzelne Fraktionen von etwa 15 ml mit einer automatischen
Auffangvorrichtung gesammelt werden.
| Tabelle 1 |
| Gesamt- |
| Fraktionen Eluiermittel absorption |
| (PH 1) |
| bei 270 m[, |
| 1 bis 4 Wasser 0 |
| 5 bis 36 0,05 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf pu 6,5 |
| eingestellt 0 |
| Kolonne mit Wasser ge- |
| waschen zur Entfernung |
| der Ammoniumionen - |
| Fortsetzung Tabelle 1 |
| Gasamt- |
| Fraktionen Eluiermittel absorption |
| (PH 1) |
| bei 270 m[. |
| 37 bis 45 0,02 n-Ameisensäure 0 |
| 46 bis 73 0,5 n-Ameisensäure 0 |
| 74 bis 86 1,0 n-Ameisensäure 0 |
| 87 bis 104 2,0 n-Ameisensäure 0 |
| 105 bis 122 3,0 n-Ameisensäure 0 |
| 123 bis 142 4,0 n-Ameisensäure 0 |
| 143 bis 164 5,0 n-Ameisensäure 0 |
| 165 bis 184 7,0 n-Ameisensäure 0 |
| 185 bis 207 10,0 n-Ameisensäure 0 |
| 208 bis 248 15,0 n-Ameisensäure 0 |
| 249 bis 294 Kolonne mit Wasser ge- |
| waschen zur Entfernung |
| der überschüssigen Amei- |
| sensäure 0 |
| 295 1,0 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf p$ 6,5 |
| eingestellt 2,3 |
| 296 desgl. 146,0 |
| 297 desgl: 81,0 |
| 298 desgl. 440,0 |
| 299 desgl. 104,0 |
| 300 desgl. 50,3 |
| 301 desgl. 46,0 |
| 302 desgl. 54,5 |
| 303 desgl. 52,0 |
| 304 desgl:- 23,4 |
| 305 desgl. 19,0 |
| 306 desgl. 17,7 |
| 307 desgl. 17,5 |
| 308 desgl. 16,5 |
| 309 desgl. 14,9 |
| 310 desgl. 13,7 |
| 311 desgl. 13,5 |
| 312 desgl. 11,2 |
| 313 desgl. 10,4 |
| 314 bis 323 desgl. 70,0 |
| 324 desgl. 0 |
Die Gesamtadsorption der Fraktionen 295 bis 323 beläuft sich auf 1203,9, was eine
Ausbeute von 45,5 mg (910/, Rohausbeute) unter der Annahme von 5-Fluoruridin anzeigt.
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Die Fraktionen 296, 298 und 302, welche die Hauptfraktion von drei
verschiedenen 5-Fluoruridinphosphaten darstellen, werden vereinigt, mit Wasser auf
ein Volumen von 1000 ml verdünnt und neuerlich an einer i>Dowex 1-X4«-Anionenaustauschersäule
(1 cm - 20 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm), welche vorgängig in die Formiatform
übergeführt wird, adsorbiert. Nach
Adsorption des Materials wird
die Säule mit 100 ml Wasser gewaschen und hierauf entsprechend den Angaben in Tabelle
2 behandelt. Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel beträgt 1 ml je Minute,
wobei einzelne Fraktionen von etwa 15 ml mittels einer automatischen Auffangvorrichtung
gesammelt werden.
| Tabelle 2 |
| Gesamt- |
| Fraktionen Eluiermittel absorption |
| (pii 1) |
| bei 270 m[. |
| 1 bis 46 0,2 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf p$ 6,5 |
| eingestellt 0 |
| 47 bis 69 0,3 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf p$ 6,5 |
| eingestellt 0 |
| 70 bis 79 0,5 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf p$ 6,5 |
| eingestellt 0 |
| 80 desgl. 4,05 |
| 81 desgl. 14,50 |
| 82 desgl. 19,50 |
| 83 desgl. 22,00 |
| 84 desgl. 20,50 |
| 85 desgl. 11,70 |
| 86 desgl. 4,20 |
| 87 bis 117 desgl. 0 |
| 118 0,7 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf pn 6,5 |
| eingestellt 0 |
| 119 desgl. 7,0 |
| 120 desgl. 62,2 |
| 121 desgl. 39,2 |
| 122 desgl. 9,9 |
| 123 bis 128 desgl. 0 |
| 129 desgl. 0,3 |
| 130 desgl. 18,3 |
| 131 desgl. 11,0 |
| 132 desgl. 11,2 |
| 133 desgl. 14,8 |
| 134 desgl. 11,5 |
| 135 bis 150 desgl. 0 |
Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, werden die drei verschiedenen 5-Fluoruridinphosphate
durch die Eluierbehandlung vollständig voneinander getrennt.
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Die Fraktionen 80 bis 86, welche das erste 5-Fluoruridinphosphat enthalten,
werden vereinigt, und durch eine Säule eines mit »Dowex 50-X8« bezeichneten Kationenaustauscherharzes
(bestehend aus querverbundenen Copolymeren von Styrol mit 8 % Divinylbenzol, enthaltend
nucleare Sulfonsäuregruppen als funktionelle Gruppen, 2,5 cm - 35 cm, Maschenabstand
0,075 bis 0,15 mm), welches vorgängig in die Säureform umgewandelt wurde, fließen
gelassen. Die von Kationen freien Nucleotide werden quantitativ im wäßrigen Ausflußgut
erhalten, aus welchem man die Ameisensäure durch Verdampfung entfernt. Der Rückstand
wird mit Wasser verdünnt und die erhaltene wäßrige Lösung mit verdünnter Natronlauge
auf p$ 6,0 eingestellt. Die Lösung wird hierauf im Vakuum zur Trockne eingedampft,
der Rückstand in Äthanol aufgenommen und die Lösung abermals zur Trockne eingedampft.
Die Verdampfung mit Äthanol wird einige Male wiederholt, um das Wasser zu entfernen.
Der Rückstand wird schließlich in Äther aufgenommen, das unlösliche Produkt durch
Zentrifugieren und Dekantieren gewaschen und getrocknet. Man erhält das Natriumsalz
eines 5-Fluoruridinpolyphosphats mit den folgenden spektrophotometrischen Daten:
pH = 1: Amax = 270 m#t; E270/mg = 5,45; -'280/E280 = e816.
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pg = 4,5: @max = 268 m#t; E2.8/mg = 5,87; -'280/E280 - 0,740.
-
p$ = 8,5: im.., = 268 m#t; E26$/mg = 4,78; 8280/E280 = e829.
Dieses Salz enthält 1,5 [,Mol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm Substanz.
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In derselben Art, wie vorstehend für die Fraktionen 80 bis 86 angegeben,
werden die Fraktionen 119 bis 122, welche das zweite 5-Fluoruridinphosphat enthalten,
in die freie Säureform umgewandelt, indem man diese Fraktionen durch einen »Dowex
50-X8«-Kationenaustauscher fließen läßt; sodann wird die Säureform in die Natriumsalzform
umgewandelt. Das zweite 5-Fluoruridinpolyphosphat-natriumsalz weist die folgenden
spektrophotometrischen Daten auf p$ = 1: imax = 270 mtL; E2.o/mg = 6,68;
- -'280/-'280 = 0,834.
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p$ = 4,5: @max = 268 m#t; E218/mg = 6,90; -'280/-'280 = e837.
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PH = 8,5: Amax = 268 m£; E261/mg = 5,97; -'280/E280 - 0,872.
Dieses Salz enthält 1,7 #LMol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm Substanz.
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In derselben Art, wie vorstehend für die Fraktionen 80 bis 86 angegeben,
werden die Fraktionen 129 bis 134, welche das dritte 5-Fluoruridinphosphat enthalten,
in die freie Säureform übergeführt, indem man es durch einen »Dowex 50-X8«-Kationenaustauscher
fließen läßt, und sodann in die Natriumsalzform überführt. Das dritte 5-Fluoruridinpolyphosphatnatriumsalz
weist die folgenden spektrophotometrischen Daten auf PH = 1: Amax = 270 m#t; E2,o/mg
= 5,05; 8280/8210 = e813.
-
pg = 4,5: Am"." = 268 ml,t; E2"/mg= 5,17; 8280I8280 - 0,813.
pg
= 8,5: Amax = 268 m#t; E2"8/mg = 4,62; -'280/82B0 = e810. Dieses Salz enthält
1,7 #tMol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm Substanz.
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Jedes der drei vorstehend beschriebenen 5-Fluoruridinpolyphosphate
zeigt im Testversuch eine hohe Hemmaktivität auf das Wachstum von Lactobacillus
leichmannii.
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Beispiel 2 1,0 g 2'-Desoxy-5-fluoruridin wird in 300 ml trockenem
Pyridin gelöst. Zu der klaren Lösung werden
unter Rühren 6,0 ml
Phosphorsäurechlorid (III) zugesetzt, wobei eine leichte Temperaturerhöhung eintritt.
Die Mischung wird während einiger Stunden bei 25 bis 30°C gerührt, wobei etwas Pyridinsalz
als gummiartiger weißer Feststoff aus der Lösung ausfällt. Die Reaktionsmischung
wird hierauf mit 500 ml Wasser verdünnt, der pH-Wert mit verdünnter Natronlauge
auf 9,0 gebracht und die Lösung hierauf durch eine Säule von »Dowex 1-X4«-Anionenaustauscherharz
(3 cm - 60 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm) fließen gelassen, welches vorgängig
in die Formiatform übergeführt wurde. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, bis sie
pyridinfrei ist, und hierauf
, in der in Tabelle 3 angegebenen Weise behandelt.
Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel beträgt 3 ml je Minnte, wobei einzelne
Fraktionen von etwa 15 ml mit Hilfe einer automatischen Auffangvorrichtung gesammelt
werden.
| - Tabelle 3 |
| Gesamt- |
| ; -Fraktionen Eluiermittel absorption |
| bei 270 mg. |
| 10,05- n-Ameisensäure, ; mit |
| Ammoniak auf p-u -6,5. _ |
| .. eingestellt. - . -24 |
| 2 desgl. - 140;0 |
| .. ." 3 .. desgl. , ' 240,0 |
| ._ -. :.. 4-' -" desgl: 321,0;.--: |
| 5 desgl." 536,0 ,, . |
| 6 - desgl. 55 0 ,0 |
| -7 - desgl. 693,0 |
| 8 . desgl. - 850,0 |
| 9 ' desgl: 1875,0 |
| 10 desgl. 5950,0 |
| 11 desgl. -8560,0 |
| 12 desgl: -- . , . . 796;0 :. |
| 13: desgl. $Ö7,4- |
| .: -14.-:-- desgl. ._ " 480,0N - |
| . ..-15` .:: desgl. ' - - . 262;Ö" .:- . |
| . desgL " 52,0 _ |
| "' 17 -- desgi::., . - 0 |
| Kolonne gewaschen mit |
| ' Wasser zur Entfernung |
| der überschüssigen Am- |
| mäniumiönen, hierauf |
| _ mit 500m1 0,1 n-Amei- " |
| - sensäure, uni die Kolonne - |
| zur sauren Eluierung vor- |
| zubereiten |
| 18 bis 31 3,5 n-Ameisensäure ' 0 |
| 32- desgl. 31,5 |
| - 33 _ desgl. 51;0 |
| 34 desgl. 17,5 |
| 35 desgl. 100,0 |
| 36 desgl. 146;0 |
| 37 desgl. 197,0 |
| Fortsetzung Tabelle 3 |
| Gesamt- |
| Fraktionen Eluiermittel absorption |
| (PH 1) |
| bei 270 m#t |
| 38 3,5 n-Ameisensäure 234,0 |
| - 39 desgl. 223,0 |
| 40 desgl. 163,0 |
| 41 desgl. 115,0 |
| 42 desgl, 70,0 |
| 43 desgl. 38,2 |
| 44 desgl. 0 |
Die Fraktionen 1 bis 16 enthalten wiedergewonnenes, nicht umgesetztes -Ausgangsmaterial.
Die Fraktionen 32 bis 43, welche Nucleotide enthalten, werden vereinigt und die
Ameisensäure durch Verdampfung im Vakuum auf ein kleines. Volumen entfernt. Die
erhaltene Lösung wird durch Gefriertrocknung zur Trockne gebracht, der feste Rückstand.
in 20 ml Wasser aufgenommen und etwas unlösliches Material abfiltriert. Das Filtrat
wird mit verdünnter Natronlauge auf p$ 6,5 ge>racht, wobei sich ein Natriumsalz
der Nucleotide bildet. Nach Gefriertrocknung der Lösung erhält man 84,8 -mg eines
festen Rückständer.
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'73;5 mg dieses Rückstandes:werden in 50 ml.Wasser gelöst und in die
freie Säureform umgewandelt, indem man' die Lösung durch eine »13öwex 50-X8«-Kationenaüstauschersäule
(2,5 cm - 35 cm) in der im "Vorhergehenden Beispiel angegebenen Weise fließen -läßt.
Die freien Nucleotide werden quantitativ im wäßrigen Ausflußgut wiedergeWörinen-Dieses
wird 'gefriergetrocknet, der feste 'kiickstärld in: 15 ml Methanol gelöst, eine
geringe Menge umlösliches Material abfiltriert und das methanolische.Filtrat zur
Trockne eingedampft. Der 48,1 mg schwere feste Rückstand wird in 5-ml Methanol gelöst,
rvdräuf man 25 ml -Äther zusetzt. Der erhaltene weiße -Niederschlag wird mit Äther
durch Zentrifugieren und Dekantieren gewaschen und hierauf getrocknet. Man erhält
33,2 mg eines weißen Pulvers, welches-Im wesentlichen 2'-Deso XY'5 -fluoruridin-5'-monophosphat
enthält. Die: spektrophotometrischen Daten flir diese Verbindung sind die foleenden:
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| P. = 1: A@reax = 271 mg,; E271/Mg = 17,9; |
| - E280/2260 - 0,87, |
| Absorption/Grammatom- Phosphor = 8700. |
| pg = 13: Amax = 269 m#t; . E269/mg = 14,75; |
| - - E280/2280 = 0,184, |
| Absorption/Grammatom- Phosphor = _7200. |
Bei der Prüfung auf die Wachstumshemmung von Lactobacillus leichmannü zeigt diese
Verbindung eine selig starke Wirkeng.
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" - Beispiel 3 50 mg 2'-Desoxy-5-fluoruridin werden in 15 ml trockenem
Pyridin gelöst. Zu der klaren Lösung setzt man 0,3 ml Phosphorsäürechlorid (III).
Es tritt -eine leichte Temperaturerhöhung ein. Die Mischung wird während 18 Stunden
bei 25 bis 30°C gerührt, wobei etwas Pyridinsalz als gummiartiger weißer Feststoff
aus der Lösung ausfällt. Die Reaktionsmischung wird hierauf mit 10 ml Wasser verdünnt,
-im Wasserbad während 20 Minuten auf 80°C erhitzt, hierauf gekühlt
und
mit 50 ml Wasser verdünnt. Man stellt den pg-Wert der Lösung mit verdünnter Natronlauge
auf 7,2 ein und entfernt das Pyridin durch Vakuumdestillation. Die pyridinfreie
Lösung wird hierauf durch Zusatz von verdünnter Natronlauge auf pg 9,0 gebracht
und an einer »Dowex 1-X4«-Formiatkolonne (1 cm - 20 cm, Maschenabstand 0,075 bis
0,15 mm) adsorbiert. Die Kolonne wird mit 200 ml Wasser gewaschen und hierauf entsprechend
den Angaben in Tabelle 4 eluiert. Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel
beträgt 1 ml je Minute, wobei einzelne Fraktionen von etwa 30 ml mit Hilfe einer
automatischen Auffangvorrichtung gesammelt werden.
| Tabelle 4 |
| Gesamt- |
| Fraktionen Eluiermittel absorption |
| (PH 1) |
| bei 270 m#t |
| 1 bis 12 0,05 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf pg 6,5 |
| eingestellt 0 |
| 13 desgl. 9,5 |
| 14 desgl. 23,2 |
| 15 desgl. 41,5 |
| 16 desgl. 63,5 |
| 17 desgl. 111,0 |
| 18 desgl. 268,0 |
| 19 desgl. 720,0 |
| 20 desgl. 25,0 |
| 21 bis 33 desgl. 0 |
| 34 0,5 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf pH 6,5 |
| eingestellt 0 |
| 35 desgl. 0 |
| 36 desgl. 23,2 |
| 37 desgl. 11,0 |
| 38 desgl. 4,6 |
| 39 desgl. 9,1 |
| 40 desgl. 8,3 |
| 41 desgl. 4,6 |
| 42 desgl. 5,6 |
| 43 desgl. 9,0 |
| 44 desgl. 13,3 |
| 45 desgl. 24,8 |
| 46 desgl. 26,7 |
| 47 desgl. 36,2 |
| 48 desgl. 30,4 |
| 49 desgl. 17,0 |
| 50 desgl. 10,4 |
| 51 desgl. 8,0 |
| 52 desgl. 7,1 |
| 53 desgl. 8,4 |
| 54 desgl. 9,0 |
| 55 bis 60 desgl. 0 |
Die Fraktionen 13 bis 20 enthalten wiedergewonnenes, nicht umgesetztes Ausgangsmaterial.
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Die Fraktionen 36 bis 54, welche Nucleotide enthalten, werden vereinigt
und mit 570 ml Wasser verdünnt an einer »Dowex 1-X4«-Formiatsäule (1 cm 20 cm, Maschenabstand
0,075 bis 0,15 mm) neuerlich adsorbiert und hierauf in der Tabelle 5 angegebenen
Weise behandelt. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 1 ml je Minute, wobei Fraktionen
von etwa 15 ml mit Hilfe einer automatischen Auffangvorrichtung gesammelt werden.
Tabelle 5 (200 ml 0,05 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf pg 6,5 eingestellt, werden
durch die Kolonne laufengelassen, ohne einzelne Fraktionen zu sammeln. Das Ausflußgut
enthält kein organisches Material. Die Eluierung wird hierauf fortgesetzt, wobei
einzelne Fraktionen gesammelt werden.)
| Gesamt- |
| Fraktionen Eluiermittel absorption |
| SPA 1) |
| bei 270 ml, |
| 1 1,0 n-Ameisensäure, mit |
| Ammoniak auf pg 6,5 |
| eingestellt 0 |
| 2 desgl. 0 |
| 3 desgl. 5,0 |
| 4 desgl. 8,3 |
| 5 desgl. 23,4 |
| 6 desgl. 29,4 |
| 7 desgl. 19,4 |
| 8 desgl. 8,3 |
| 9 desgl. 7,2 |
| 10 desgl. 6,0 |
| 11 desgl. 4,5 |
| 12 desgl. 4,5 |
| 13 desgl. 4,5 |
| 14 desgl. 3,6 |
| 15 desgl. 3,6 |
| 16 desgl. 3,3 |
| 17 desgl. 3,3 |
| 18 desgl. 3,4 |
| 19 desgl. 3,4 |
| 20 desgl. 1,8 |
| 21 desgl. 1,8 |
| 22 desgl. 3,1 |
| 23 desgl. 3,1 |
| 24 desgl. 3,0 |
| 25 desgl. 3,0 |
| 26 bis 71 desgl. 0 |
Die Fraktionen 3 bis 9, welche den größten Teil der Nucleotide enthalten, werden
vereinigt und das Produkt in die freie Säureform übergeführt, indem man es durch
eine »Dowex 50-X8«-Kationenaustauschersäule (1,0 cm - 20 cm) in der im vorhergehenden
Beispiel
angegebenen Weise fließen läßt. Die freien Nucleotide werden
im Ausflußgut quantitativ wiedergewonnen.
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Das Ausflußgut wird auf etwa l0ml-im Vakuum eingedampft, um die größte
Menge der Ameisensäure zu entfernen. Hierauf setzt man 25 ml Äthanol zu und dampft
die Lösung im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird in 25 ml Äthanol aufgenommen
und abermals zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird hierauf in 40 ml
gelöst und der pH-Wert durch Zusatz von verdünnter Natronlauge auf 6,5 gebracht,
wobei sich das Natriumsalz der Nucleotide bildet. Die Lösung wird abermals im Vakuum
zur Trockne eingedampft, wobei ein fester Rückstand von 16,0 mg erhalten wird. 8
mg der Substanz werden abermals in 4,5 ml Wasser gelöst und zur Erhaltung eines
gleichmäßigen Produktes gefriergetrocknet. Man erhält 7,2 mg des Natriumsalzes von
2'-Desoxy-5-fluoruridin-3',5'-diphosphat mit den folgenden spektrophotometrischen
Daten: p$ = 1,0: Amax = 268 m,,, E2"/mg = 10,0; E280/E260 = @@g8. Es enthält
2,22 #tMol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm. Dieses Nucleotid zeigt ebenfalls
sehr ausgeprägte Aktivität in bezug auf die Wachstumshemmung von Lactobacillus leichmannii.
Beispiel 4 Zu 0,5 ml trockenem Pyridin werden 10 mg 2'-Desoxy-5-fluoruridin unter
völligem Ausschluß von atmosphärischer Feuchtigkeit zugesetzt. Man versetzt die
klare Lösung unter Rühren mit 0,03 ml Phosphorsäuredichlorid (I). Es tritt eine-
leichte Temperaturerhöhung ein, wobei man die Reaktionsmischung .durch Kühlung bei
einer Temperatur von 25'C hält. Man läßt während 10 Minuten unter sorgfältigem Ausschluß
atmosphärischer Feuchtigkeit reagieren, wobei eine geringe Menge Pyridinsalz als
weißer gummiartiger Feststoff' ausfällt. Hierauf setzt man der Reaktionsmischung
unter Kühlen 0,5 ml Wasser zu und erhält eine wasserklare Lösung. 0,01 ml dieser
Reaktionslösung, welche 0,1 mg 2'-Desoxy-5-fluoruridin entspricht, wird durch Papierchromatographie
(Whatman Nr. 1-Papier, System n-Butanol-Essigsäure-Wasser, Verhältnis 5:2:3) analysiert.
Durch Vergleich mit einer authentischen Probe im selben Chromatographiesystem wird
festgestellt, daß etwa 40 °/o der Gesamtmenge aus 2'-Desoxy-5-fluoruridin-5'-monophosphat
bestehen. Es wird auch etwa 2'-Desoxy-5-fluoruridin-3',5'-diphosphat gebildet.