DE1767912A1

DE1767912A1 - Verfahren zur Herstellung hochreiner Maltose

Info

Publication number: DE1767912A1
Application number: DE19681767912
Authority: DE
Inventors: Mamoru Akaiwa Hirao; Kazuo Masuda; Masakazu Mitsuhashi; Makoto Shiosaka; Kaname Sugimoto; Yasuyuki Yokobabayashi; Mihihiko Yoshida; Shokichi Yuen
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1967-06-30
Filing date: 1968-07-01
Publication date: 1971-09-30
Also published as: GB1232645A; NL158548B; US3795584A; CH529837A; NL6808220A; DE1767912B2; IT1050155B; FR1569499A; CA965362A

Description

u. LU
ouö Minchen 2 2

Hayashibara AG. 28. Juni 1968

Okayama / Japan SJ/Hu

hao 7012

Verfahren zur Herstellung hochreiner Maltose

■ i

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Maltose hoher Reinheit durch Verflüssigung von Stärke und anschließende enzymatische Verzuckerung.

Bisher gewann man Maltose aus Stärke durch Verflüssigung beispielsweise mittels Beta-Amylase und nach Zusatz von Malz durch Verzuckerung unter Einwirkung der Malz-Amylase, d.h. einem Gemisch von Alpha- und Beta-Amylase. Die verzukkerte Lösung erhielt aber höchstens 70% reine Maltose, selbst wenn die Menge an Beta-Amylase durch Anwendung von Malz mit

or
einem recht hohen Gehalt an Beta-Amylase vermehrt war.

Das Aufarbeiten einer derart verzuckerten Lösung ist äußerst schwierig, da eine Reinigung durch Rekristallisation nicht erfolgen kann, Deshalb wird das Erzeugnis in der Regel entweder durch fraktionierte Ausfällung mit Alkohol oder durch Rekristallisation eines Derivats raffiniert. Jedoch kann sogar die beste der im Handel befindlichen Maltose nicht bis

109840/0486

zu einer Reinheit von über etwa 95% raffiniert werden; sie enthält vielmehr Dextrine, Malz-Triose, Glucose und andere Verunreinigungen.

-Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe "besteht in der Entwicklung eines einfachen und wirksamen Verfahrens zur Herstellung von Maltose hoher Reinheit durch fc Verzuckerung verflüssigter Stärke mit Beta-Amylase. Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch eine Verzuckerung mit Beta-Amylase in Gegenwart der Enzyme Alpha-1,6-Glucosidasen, die bekanntlich bei der Spaltung der^-1,6-glucosidischen Bindungen im Amylopektin der Stärke spezifisch mitzuwirken befähigt sind, eine Maltose hoher Reinheit erzeugt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise verflüssigte und auf den p„-tfert w von etwa 6 eingestellte Stärke mittels Beta-Amylase oder einem Gemisch von Beta- und Alpha-Amylase in Gegenwart einer oder mehrerer Arten von Alpha-1,6-Glycosidasen verzuckert.

Die Verflüssigung der Stärke kann mit Säure, einem amylolytischen Enzym wie Alpha-Amylase oder durch Hitzegölatinierung erfolgen.

Alpha-1,6-Glucosidasen bewirken, wie gesagt, die Spaltung der alpha-1,6-glycosidischen Bindung am Ve rzweigungspunkt

109840/0486

der; Amylopektin« der .Jjärke zu einer ieradkettenstnxktur v.'ie Amylose, die nicii durch Be ta-Amy läse leicht zerlegen 1-1..U» Iiierdurch wird das Verzuckerungsvermögen der verflüs-3ijl/i;i o^Ileke .axt Hilfe von Beta-Ainyl-oe verbessert, ohne daß '-'-i- Dcr-rtrir ra±\i einer alpha-ijö-giucosidisclien VmmBlndang uar'-^;clrt>i'--ibu. Aiiderersei-cc wird die Erzeugung von Kebe.ipro-hinten v;ie II :lz-xriose und Glukose durch Benutzung vo ; veiifl'issigter Stärke mit einen niedrigen D.E.-'iert ge-7or allem durch di.a Zusammenwirken vorgen=rinnter ile.iäuird eine Ilaltoselösung hoher Hciixlieit gev/onaen.

-Alpii-j-1,i&lucosidaseii schließen erstens die Pulluianase ein, 3ie rait iiilfe des 3akterieiist3rnmes Aerobacter aerogenes gemäß Patentanmeldung P 17 67 654··9 gewonnen v/ird, Zeitens gehört zu den -ilpha—1,6-Glycosidasen i.-aich die Iso-Amylase, die mittels Bakterien des Pseudomonasstammes, mit Pseudonon^s amyloder-juaosa gemäS Patentanmeldung P 17 67 633« b gev.'innbar ist,

Die Verwendung eines Gemisches verschiedener Arten von Alpha 1_f6-Glucosidasen statt nur einer einzigen Art bewirkt einen erhöhten Maltose-Ertrag. Die verstärkte Erzeugung an Maltose durch gleichzeitige Verwendung verschiedener Alpha-1,6-Glucosidase—Arten ist besonders auf da■ verschiedene Spaltungsvermögen der Pullulanase und der Iso-Amylase zurückzuführen»

109δΑ0/0Α86

^ß*D original 4

Wenn eine aus verflüssigter Stärke mit Beta-Amylase und Alpha-1,6~Glucosidase gewonnene verzuckerte Lösung in gewohnter Weise gereinigt wird» machen äußerst kleine Mengen an hochmolekularen Dextrinen die Reinigung mit einem lonenaustauscherharz sehr schwierig und ergeben leicht ein trübes Produkt. Diese Erscheinung wird durch Zusatz von Alpha-Amy-1εse während der Verzuckerung behoben»

Die Aktivität der anwandten Enzyme wurde wie folgt bestimmt:

(a) Bestimmung der Aktivität der Alpha-1,6-Glucosidase :

Eine Reaktionslösung, bestehend aus

Enzymlösung 1 ml

1%iger Lösung twesr löslicher klebriger Reisstärke 5 ml

0,5 M-Essigsäure-Pufferlösung vom p„ 6 1 ml,

läßt man bei 4-0⁰G 30 min reagieren. 0,5 ml des Reaktionsgemisches und 0,5 ml einer 0,01 M-Jodlösung werden zu 15 ml v/asser zugegeben. Nach 15 min wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 610 mü bestimmt und die enzymatische Aktivität für eine Änderung von 0,1 zu 10 Einheiten angenommen.

(b) Bestimmung der Aktivität von Beta-Amylase :

Eine Mischlösung, bestehend aus

iVöiger löslicher Stärke 5 ml

0,1 M-Essigsäure-Pufferlösung 4· ml

Enzymlösung 1 ml

109840/0486

BAD ORIGINAL

läßt man bei 40⁰O 30 min reagieren. Der so erhaltene reduzierende Zucker wird als Glucose gewertet; wenn er 10 mg Maltose enthält, wird er als eine Einheit gewertet.

(c) Bestimmung der Aktivität der Alpha-Amylase:

Diese wird in Übereinstimmung mit Abschnitt II-12-1a auf Seite 88 der "Analysis Methods of Starch Sugar in- · dustry" (herausgegeben von der Society for leehnical Research of Starch Sugars) ermittelt.

I" ".:.;]. η: .".}ιΓ'-·ΐΓθ."τ/1οη Υοιυ.nclic-n *·:ογΊγ.γ. ~\i - :H":cl? ■'.'.:· :r..?i:n—

Versuch 1 : V/irkung der Pullulanase-Mitverwendung. "-' -'^r1-^r; ^-'^---■"■■.~r.:

Ein 10%iger wässriger Stärkebrei aus Süßkartoffeln wird mittels Alpha-Amylase bis zu einem Dextrose-Äquivalent (D.E_e) von 2,7 verflüssigt und hierauf auf zweierlei Weise bei 45°C in 16 h verzuckert :

Lösung (AJl f unter Anwendung von 25 Einheiten Beta-Amylase g je g Stärke j

Lösung (ß); unter Benutzung von

25 Einheiten Beta-Amylase und

10 Einheiten Pullulanase
je g Stärke.

Die Zusammensitzung der in den erhaltenen verzuckerten Losungen enthaltenden feststoffe sind in Tabelle I wiedergegeben. !

109840/0486

BAD ORIGINAL

Aus dieser ist ersichtlich, daß bei Anwendung von Beta-Amylase für sich allein der Maltosegehalt der verzuckerten Lösung (A) nur 69,6^£/o beträgt, während derjenige bei Kitverwendung von Pullulanase (Lösung B) 90% übersteigt.

Tabelle .	Maltose	Glucose	Malz-Triose	Dextrin	>
	69,6 90,4	1,1 0,4 ;	5,5	25,7 7,9
Lösung			Ii Wirkung des Alpha-Amylase-Zusatzes«
A B
Versuch c
E

Es werden aus verflüssigter Stärke folgende zwei Vergleichslösungen mit einem Zuckergehalt von 39,4$ bereitet:

Lösung (G): durch Verzuckerung mit Beta-Amjlase und Pullulanase j

Lösung (D); durch Verzuckerung mit Beta~A»jlase_t Pullulanase und Alpha-Ämylase.

Beide Lösungen wurden mit Ionenaustauschharz gereinigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt· Wie hieraus zu ersehen, läßt sich die Lösung (0) mit Ionenaustauschharz beinahe überhaupt nicht reinigen, wogegen sich die Lösung (D) leicht reinigen läßt.

109840/0486

BAD ORIGINAL

Tabelle II

Lösung

starke Säure / mittelstarke

Base Zweibett-Vorbehandlung

starke Säure / starke Base Gemischtbett-Behandlung

Smaliger Durchgang des Lösungsvolumens auf Basis des sauren Harzvolumens

Kolonne 5 χ. Λ0 cm , ■

20maliger Durchgang des Lösungsvolumens auf Basis sauren Harzvolumens

kolonne 1 χ 1O^ cm/' " ^T ".·"

2maliger Durchgang des Lösung svolumens auf Basis des Harzvolumens/pTT 5» 7

Kolonne 8 χ 1CK cm

4-Omaliger Durchgang des Lösungsvolumens auf Basis des Harzvolumens/pjT 5*0 Kolonne 1 χ 1Ck cm

Versuch 3: Wirkung eines Gemisches von Alpha-ijö-G-lycosidaseii.

Bei jedem Versuch verzuckerte man eine gelatinierte Lösung mit einem Gehalt von 2% Süßkartoffel-Stärke bei 45°C in 64 h mittels der gleichen Enaymmenge, wobei die in Lösung E verwendete Fullulanasemenge der in Lösung F benutzten vereinten Menge an Pullulanase und Iso-Amylase gleich war. Die Ergebnisse, d.h. die unterschiedlich hohe Maltoseausbeute, ist aus Tabelle III zu ersehen.

108840/0486

BAD ORfG.'NAL

Tlbelle III

... _	Enzym gemisch	ph	Zusammensetzung in %	Maltose	Glucose	Malz-Triose	Dextrin
	Jrullula- na3G Be ta-	6,0	93,0	0,6	5,1	V
E	Auylase
	M.lui,-
F			95,1	ο,;;.	4,0	ο, ν

Versuoh 4: Wirkung verschiedener Stärken.

Breie mit je 2-/Ό verschiedener Stärken vjerden durch eine 5 min. lange Druckbehandlung bei 130⁰C verflüssigt. Die ötärkekonaeatr.-_:tion bei Anwendung von v/achshaltiger Maisstärke kann bis zu ~f/o gesteigert v/erden. Die erhaltenen Flüssigkeiten verzukkert man in 16 h bei 45°C unter Zusatz von 100 Einheiten Beta-Amylase
20 Einheiten Pullulanase und

5 Einheiten Alpha-Amylase.
Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle IV wiedergegeben.

1 0 9 8 A 0 / 0 k 8 6

BAD ORIGINAL Tabelle XV

otärkeart	iiüiylolyse- grad DoE, in '/j	Zusammensetzung in /■>	li.^:.lL'Ose	Glucose	Malz-Jrlose	iJexcrin
Karbolfei- starke Maisstärke •jachshaliige Haisstärke	59,55 59,97 63,3ö	91, d 92,3 92,G	1,1 1,7 2,2	4,3 3,3	3,1 1,7 1,9

>/io -ins dieser zn ersehen, verändern eich der Verzuckerung sgrt.d und die Reinheit isr ;^e./innbaran Maltose je nach, dor Arb des .jl;ärkerü:..."üc.rials : v;:·chijha.ltige Haisstärka üuitin;!' axe becttn Ji'rgebnirj :;e j es ϊ ο ige η Maisstärke, Kartoffelstärke sowie löü.L.Lcihe 3üä

Yer.':u3h 5: V/irkung verschiedener Stärkekonzentrationen.

Man verflüssigt Stärkebreie laib verschiedener Konzentration von L·irtol'feljtärke unter /ori/endung von Alpha-^liaylD.se bei ernohüen Lemper-'-^turen in ^ewohuüer Weise unter JJr ick br;i 1;'O in > ;üin (i).E. ^(r/v) und vorzuckert dann jede / . r.\jiioli3misuhun^ nach /Juri'itij /όχι

25 iSinhoiben PuLluian-.üe und
7 Eirüioiton Beta-iliii^Lose

je g iitärko b'.;i einem p,j-./'.'CG /on G,ü uxui *V~> G in β ϊι. iJio biiifjse .sind in !'.-,belle ■/ ,-/.Lodergegeben. ^r.7io au 'ir.s^dien,

1 O 9 8 A O / O A ß G BAD ORIGINAL

. ο Io

ist unter den genannten Bedingungen .-.ua geeignetesten eine Konzentration des zu verflüssigenden obürkebreies von ebv/

libelle V

Stärkekon- zenbration	JJ.E.in %	_ Zusammensetzung in	Glucose	Malz-Triose	/q
10 20	56,62 55,7	Maltose	0,2 0,5	O, O G,6	Dextrin
77,7 75,4	*ac n*

Versuch 6: Wirkung des Dtärkeverflüssigungsgrades.

1'¹Ur die Verzuckerung v/irl das /erfahren gemäß Yerauah. 5 angewandt, jedoch unter Benutzung von

15 Einheiten Beta-Amyläse und

22 Einheiben Pullulanase

Je g Stärke. Aus der die Ergebnisse zeigenden Tabelle VI ersieht man, daß, je größer der VOrflüssigungsgrad, umso iiäh^r der D.E.-./erb ist, je niedriger aber der 1).E.-wert, desto honet¹ die Maltose ausbeute ist.

Tabelle VI

ükärkeverflüs-	D.E.-	Maltose	Zusamiaen	aetzung in /»	iiexb viii
sigungsgrad D»£m in /o	Endwe et	b2,0	Glucose	Malz-Triose	10,7
5,^	J'J^- ■>'	75,0	0,0	G,7	1ü,3
11, {,			O, )	13,ο
1ü,J	55,1ό	1#1	21,0

109840/0ΑΘ6

BAD ORIGINAL

...11

VdL'.; ich 7 · -Ji

unternchieJIieher

,1 ncse-Mengen

Eo >-;ird ei: xac- oü.-kartoffeln ge"ionneiior 10,'cdger otärkebroi vor.'.^il·..^. Der 7er::"ln.o .-igung s^r ad beträgt 2,5^,und die 7er-

v/ird _ ₀

oncj-:eraag bei einer.i ρ- von b,ü und 4^: C in 36 h durchgeführt, v/o^-i ;>ΰ Eirüieiueii Je :r.\-Am3luse unJ verschiedene Mangen PuI-1" . ;vu. ? ^<i " stärke benutzt v;;r.:e::., Die Er^ebnisne sind i)i iabelie VIi ^.u:?--inrj;^> η je stellte

χ·:belle

	J.I..-	Haltöse	Zusammensetzung in -,o	Ifeiz-'üriose	Dextrin
		Bi.*		6,3	7,5
η.: ο L			Glucose	6,3	5,1
1.	55,3	V^,0		13,5
2ϋ	r7,5	69,6	<v:·	3,5	25,7
200	53,9	1,0
0		1,1

Die günstige Menge an zuzugebenden Pullulanase beträgt vorzugsviexGe et^T.;a 20 Einheiten je g Stärke j größerer Zusatz; hat eine unerv.'üiiacliüs .i/irkung auf die Verzuckeraiigavirkung der Beta.-Ainylase,

7ersuch o: -/ix^kung unterschiedlicher Beta-Amylase-Mengene

κ/enii man zur Verzuckerung

20 Einheiten Pullul-uiase und 5 Einlieiten Alpha-Amylose

109840/0486

...12

sowie verschiedene Mengen Beta-Amylase je g Stärke anwendet und im übrigen gemäß Versuch 5 verfährt, werden die aus Tabelle VIII zu ersehenden Ergebnisse erhaltene

Tabelle VIII

Einheiten	Verzuckerungs	DpE.-	Zusammensetzung ir	Glucose	Malz- Trio se	Dextrin
ßeta- Amylase	dauer h	Endwert %	Maltose	0,5	11,0	15,5
20	5	53,7	75,0	2,2	12,2	6,7
20	12	57,6	78,9	1,6	11,8	3,3
20	24	59,51	83,3	1,4	13,1	3,0
20	46	60,0	82,5	1,1	9,0	10,3
60	6	55,5	79,6	2,2	9,0	6,0
60	12	59,5	02,8	2,0	8,4	2,5
60	24	61,3	87,1	2,2	7,0	2,5
60	46	61,9	88,3

Obwohl die Erzeugung der Maltose entsprechend der beigegebenen Beta-Amylase-Menge zunimmt, ist es vom technischen Standpunkt zweckmäßig, 30 bis 60 Beta-Amylaee-Einheiten je g Stärke zu verwenden; die Verzuckerungszeit beträgt etwa 46 h.

9840/0486

...13

BAD ORIGINAL

Versuch 9 : Wirkung des Zeitpunkts der Alpha-Amylase-Zugabe.

Die Menge der während der Verzuckerung hinzuzufügenden Alpha-Amylase ist begrenzt, da sie, lediglich zur Zersetzung des restlichen Dextrins bestimmt ist. Gewöhnlich sind für diesen Zweck 5 Einheiten Alpha-Amylase je g Stärke ausreichend j eine größere Zugabe kann die Reinheit der Maltose verschlechtern. Den Einfluß des Zeitpunkts der Alpha-Amylase-Zugabe zeigt die Tabelle IX, aus der zu ersehen ist, daß eine Zugabe während der Verzuckerung die besten Ergebnisse lie-

zu
fert; jedoch würde eine Vspäte Zugabe die beabsichtigte l/ir-

kung nicht eintreten lassen.

Tabelle IX

Zeitpunkt	ί/.-Ει· —	Zusammensetzung in %	Maltose	Glucose	Malz-Triose	Dextrin
der Alpha- Ämylase- Zugabe	Endwert %	87,3	1,4	9,1	2,2
anfangs	62,82	87,3	2,2	7,4	3,1
6 h später	62,80	88,2	1,3	7,1	3,4
12 h später	62,80	£9,ö	1,4		2,9
24· h später	62,90

Fo ·,. ■ /.

ffn- ^:' ' ' "J- ■■ L) '■

Beispiel 1;

11 T» r {

iOO g Maisstärke v/erden mit 4500 ml kochendem ,•/asser gelatiniert. Die Erhaltene wässrige Dispersion unterwirft man für

ORIGINAL

109840/0486

!5 min einem Druck bei 130⁰O, kühlt dann auf 45°C ab und stellt den p^-Wert auf 6,0 ein. Nach Zugabe von 100 Einheiten Beta-Amylase und
20 Einheiten eines Pullulanase-aussalzenden Enzyms

(beschrieben in der Patentanmeldung P 17 67 654-·9) je g Stärke wird die Mischung in 4-8 h bei 45⁰C verzuckert. Die verzuckerte Lösung wird dann in gewohnter Weise erhitzt* ^ filtriert, konzentriert und durch Entfärbung gereinigt. Nach Eindampfen bis auf einen Wassergehalt von 15$ erhält man farblose Kristalle« Die Analyse der Trockenbestandteile ergibt$ daß eine aus 93,0% Maltose, 1,5% Glucose, 4,0% Malz-Trio se und 1,5% anderen Bestandteilen bestehende hochreine Maltose gewonnen ist,

Beispiel 2: f.

100 g wachshaltiger Maisstärke werden gemäß Beispiel 1 gelatiniert und nach Zusatz von

100 Einheiten Beta-Amyläse und

20 Einheiten Pullulanase
je g Stärke bei 45°C 10 h und nach Zugabe von 5 Einheiten

Alpha-Amylase je g Stärke/45 h verzuckert. Das Reaktionsgemisch wird nun gekocht, entfärbt, konzentriert und mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes auf Polystyrolgrundlage (Handelsprodukte "Amberlite" IR 120, IRA 68 oder IRA 411 der Rohm und Haas Go,) gereinigt. Nach einem weiteren Konzentrieren erhält man ein völlig festes Produkt mit einem Wassergehalt

109840/0486

BAD ORIGINAL

von 13%· Die Analyse der 'frockenbestandteile ergibt einen Gehalt von 93»5% Maltose. Die 70%ig^e Lösung kristallisiert unter Bildung von Mikrokristallen. Durch Fraktionierung der Kristalle gewinnt man Maltose mit einer Reinheit von 96 bis

Beispiel 3:

100 Q wachshaltiger Maisstärke werden nach Gelatinieren ge- λ mais Beispiel 1 mit

25 Einheiten Beta-Amyläse

20 Einheiten Pullulanase und

40 Einheiten Älpha-1,6-Glycosidase ; I. --LrI- τ:, "M^i-; mit Hilfe des Bakterienstammes Psaudomonas amyloderamosa nach Patentanmeldung P I7 67 653.8)

je g Stärke versetzt. Nach Einstellen des p_H-.fertes des Gemisches auf 5t5 verzuckert man es bei 45°C 46 h_f kocht hierauf, reinigt in üblicher v/eise mit Aktivkohle und konzentriert.

Der gewonnene Sirup enthält 13>& Wasser und kristallisiert unmittelbar. Fe st stoff ausbeute 95/& mit einem Maltosegehalt der Feststoffe von #

Beispiel 4;

Ein aus 500 g Kartoffelstärke bereiteter Brei mit etwa 30% Stärke mlüd nach Zugabe von 0,2% Alpha-Amylase (Handelsprodukt "Neospitase" der Nagase Sangyo Go.) beim p_H 6 und bei

109840/04 86 bad original

...16

38°ö bis zum ü.E.-Wert 2,7 verflüssigt. Sodann führt man den Brei durch Zusatz von heißem Waseer in eine Losung mit einem Feststoffgehalt von 10% über.

Nunmehr werden

50 Einheiten Beta-Amylase und 25 Einheiten Pullulanase

und nach 15stündigem Verzuckern "beim pjr-Wert 6 und bei 45⁰O 5 Einheiten der obigen/Amylase Je g Stärke zugegeben. Die Gesamtdauer der Verzuckerung beträgt 48 h. Das Reaktionsgemisch wird nunmehr erhitzt, filtriert, mit Aktivkohle und Ionenaustauscherharz in der gewohnten Weise gereinigt und durch Konzentrieren auf einen Wassergehalt von 15i# zum Kristallisieren gebracht. Ausbeute an Feststoff 92% mit einem Maltοsegehalt der Feststoffe von 94%.

109840/0486

BAD ORIGINAL

Claims

2TLLENTIM u. IUYKi H «OUO M JrK htm J,J 4 2b· Juni SJ/Hu hao 7012 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung hochreiner Maltose aus Stärke durch Verflüssigung und anschließende Verzuckerung mittels Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise verflüssigte und auf den p^- Wert von etwa 6 eingestellte Stärke mittelg Beta-Amylase oder einem Gemisch von Beta- und Alpha-Amyla^e in Gegenwart einer oder mehrerer Arten von Alpha-1,6-Glycosidasen verzuckert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daia

man als Alpha-1,6-Glucosidase Pullulanase oder Iso-Amylase f

verwendet.

BAD ORIGINAL

109840/0486