DE1617748A1

DE1617748A1 - Rheuma-Diagnostikum

Info

Publication number: DE1617748A1
Application number: DE19661617748
Authority: DE
Inventors: Guenther Prof Dr Wilhelm
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1966-08-06
Filing date: 1966-08-06
Publication date: 1971-04-08
Also published as: NL6710785A; BE702378A; US3574818A; GB1192576A; SE331158B

Description

Rheuma-Diagnostikum

Es ist bekannt, daß beim Rheumatismus verua,, der vorwiegend durch Streptokokken-Infektion auegelöst wird, Antikörper gegen Streptokokkensubstanzen im Serum nachgewiesen werden können. In der klinischen Diagnostik hat sich lediglich die Bestimmung des Antistreptolysisi-Titexs bewährte Die hierbei nachgewiesenen Antikörper* stehen jedoch in keinem Zusammenhang mit dem Rheumatismus yexus· Si® zeigen, lediglich eine . Immunisierung gegen das-'.Str«ptolyein &®r St^pto-kokken an« Die Reaktion ist infolgedeseep uaspo&ifiseia und erfordert außerdem als in-vitro-Töst ®±ne mnfw©na±g® und zeitraubend®

©i» Diagaostikwiä "g©£uiad©m_e das iasbesosidere Nachweis «Sos rfeeiiSBisfeisehssB Fiebers-

Es-wurde

ist .g©k©3m«

fiolalt-as

1 S / 1

- 2 - Fw 5128 A

etwa 259 mu aufweist und eine Wanderungsge.schwindigkeit von 4,5 bis 6 cm/2 Std. in der Papierelektrophorese (Veronal-¹ ,. puffer 0,1 MpH 8,6 _t n V/cm, 22°C) zeigt.

ί . .■■'■■. _v. , ·

* . Das Diagnostikuin besteht vorzugsweise aus einer Lösung von aus Streptokokken gewonnenen Nucleoproteid in Wasser • bzw. wasserhaltigen Lösungen, z.B. physiologischer Kochsalzlösung und anderen von der Haut reaktionslos bzw. mit nur sehr geringer Reaktion verträglichen Lösungsmitteln und Lösungsmittelgemischen. Diese Lösungen bzw. Lösungsmittelgemische können wiederum in Form geeigneter Dispersionen, z.B. von Öl-in-Wasser- bzw. Wasser-in-Öl-Emulsionen angewendet werden, wobei weitere Substanzen, wie sie bei derartigen Zubereitungen eingesetzt werden, verwendet werden können. Solche sind auch Niehtlöser wie z.B. Fette und Öle sowie emulgierende bzw. dispergierende wirkende Substanzen vom Typ der Emulgatoren bzw. Schutzkolloide organischer und anorganischer Natur. Auch können weiter Substanzen, die vjblich_ey_wei_se bei Herstellung solcher Zubereitungen ver- ' wendet werden z.B. Puffer, Stabilisatoren usw. zugesetzt werden.

Der Gehalt an dem Nucleoproteid in diesen Zubereitungen liegt

— 7 >-4

gewöhnlich zwischen IO und 10 g %_% bezogen auf die Gesamtzubereitung, jedoch kann dieser Gehalt in Spezial.fällen unter- oder überschritten werden. Im Falle eines besonders hohen Immunisierungsgrades wird eine höhere, im Falle eines relativ niedrigeren Immunisierungegrades wird ein· nied—rigere Konzentration ausreichend sein· Als besonders geeignete Konzentratio
anzusehen

zentration ist ein Bereich zwischen 10** ' g % bis ΙΟ"'* g %

Das «rfindungäsgamäß® Diagnostikum gestattet es, Rheumatismus verus durch einen sehr ®infaeSie» Isutraeutantest nachzuweiaen. J® ssaöh Art der Zubereitung kams d&& Diagnostikum als Iirstracutan oder

t 0 9 8 1 S / 1 8 4

- 3 - Fw 5128 _A

Beim Intracutantest werden z.B. 0,1 ecm der Testlösung streng intracutan injiziert. Es entsteht bei positivem Ausfall des Testes eine Rötung und Infiltration. Das Diagnostikum führt zu einer Hautreaktion vom Tuberkulintyp, Als günstig für die Ablesung der Reaktion hat sich z.B. ein Zeitintervall von 48 Stunden nach Anlegen des Testes ergeben. Der Test kann auch als Percutanprobe durch Einreiben eines erbsengroßen Stückes einer Salbenzuber*i.tung des Nucleoproteide als Pflasterprobe ähnlichen den Variationen der Tuberkolinprobe durchgeführt werden. Im Sertun sind homorale Antikörper bei entsprechenden Patienten gegen das beschriebene Nucleoproteid in den verschiedenen Immunreaktionen wie z.B. Onchterlony-Test, Immunelektrophorese usw. nachweisbar. Der Gehalt des Serums ist meist jedoch so gering, daß die Gamma-Globulinfraktion zunächst konzentriert werden muß»

Die einfache Handhabung des Intracutantestes, die es jedem Arzt auch ohne Laboratorium ermöglicht+ den Test durchzuführen, läßt diesen Test als überlegen erscheinen.

Das erfindungsgemäß als wirksame Substanz in dem Diagnostik kum eingesetzte Nucleoproteid wird aus Streptokokken vorzugsweise solchen der Gruppe A und C gewonnen. ■

ί ·

- J

Die Abtrennung des Nucleoproteide a^u.8 dem Extrakt kann durch eine Kombination von Zentrifugieren und Behandeln mit proteinfällenden Salzen bzw. Salzlösungen unter schiedlicler · Konzentration oder durch Extraktion mit geeigneten Lösungen¹, bzw» Verfahren der Elektrophorese, Gegenstromverteilung, Chromatographie usw.' sowie von Kombinationen dieser Verfahren untereinander vorgenommen werden.

Eine sehr zweckmäßige IsolierungswAise für das Nucleoproteid besteht darin, daß man Streptokokken mit der doppelten Menge Wasser oder wasserhaltigen Lösungen(bezogen auf das Streptokokkengewicht) homogenisiert und den Extrakt durch eine der üblichen Abtrennungsmethoden, z.B. Zentrifugieren, isoliert.

TO 9 815/1848

- k - Fy j.12,8 _A 161/748

Daran anschließend stellt man das Homogenat auf einen hohen Salzgehalt, z.B. um 40 % Ammonsulfat ein und trennt hierdurch eine Vorfraktion ab, die verworfen wird. Nach Abtrennung der Vörfraktion wirdcfer Salzgehalt erhöht, z.B. auf etwa 70 % Ammonsulfat. Hierbei fällt ein Niederschlag aus, den man z.B. durch Zentrifugieren abtrennt und ihn in wässriger oder wasserhaltiger Lösung gegen Wasser oder eine wasserhaltige Lösung dialysiert. Man überführt die dialysierte Lösung entweder als solche oder nach Trocknung in einen Puffer um pH 7 ,und gibt die Lösung auf einen basischen Austauscher, z.B. DCAE-Zellulose. Die Säule wird mit einem Puffer von pH solange gewaschen, bis das Eluat einen pH-Wert von 3 erreicht hat. Danach wird dem Puffer ein Salz, z.B.- NaCJ in einer* Konzentration von etwa 3 % zugesetzt. Eine Vorfraktion wird verworfen und die nachfolgende Hauptfraktion aufgefangen. Zur Entfernung des Kochsalzes und der Puffersubstanζon wird das Eluat dialysiert, z.B. gegen dest. Wasser. Dir Looting kann sodann über Blaugel getrocknet werden.

Das erf indungsgernäß eingesetzte Nticleoproteid i st durch ein IF£-Maximum von etwa 259 tau. charakterisiert und 7;eigt bei der/elektrophorese (Veronalpuffer 0,1 M_fpII 0,6, 11 V/cm) eine Wanderungsgeschwindigkeit von 4,5 - 6cm/2 Std. Weitere Reaktionen shd Schwarzfärbung mit Amidoschwarz 10 b, Phosphatfärbung nach Waid vrnd Morgan. Anfärbung auf Calcium nach Pollard und Mc Omie, Lipidanfärbung nach Si*alm und Anfärhing auf Purine nach Michel und Haberler. Bei der alkalischen und sauren Hydrolyse werden in'bekannter Weise Adenin, Cytosin, Guanin und Uracil nachgewiesen. Nach Partridge wird -iibose ermittelt. An Aminsosäuren sind nach der Methode .von Doso und Caputo bisher Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, · Alanin, Serin, Threonin, Valin und Leucin nachzuweisen.

Das Nucleoproteid führt auch in höheren Verdünnungen bei Zugabe zu Τχ-opokoIlagenlösungen zur Bildung von kollagenen Fibrillen.

BAD ORiGlINAL 109815/1848

- 5 > ;.. Fw gi2;8

Das.Nucleoproteid bindet sich ausgezeichnet an ein Serumprotein des Menschen. Dies ist sowohl im Oüchertlony-Test und in der Immunelefctrophorese nachweisbar.

Es reagiert außerdem mit hochgereinigtem menschlichen Gamma-■ Globulin.. Diese Hüaktion ist ebenfalls gut in der Immune l.ektr ο phorese und im Ouchterlony-Test nachweisbar.

Das Nucleoproteid ist in Wasser sehr gut -löslich, unlöslich in Alkohol, Äther und Chloroform. ,

Das neue erfindungsgemäß herstellbare Diagnostüsum stellt ein wertvolles, bisher unbekanntes Hilfsmittel in der ärztlichen Diagnostik dar. Es ermöglicht es überraschenderweise, mittels einer äußerst einfachen Methodik den Nachweis für das Vorliegen einer rheumatischen Erkrankung zu ι führen,. Das bedeutet elften erheblichen Fortschritt. E» war aifcht t vorauszusehen, daß das erfindungsgemäß eingesetzte'Nucleoproteid eine'derartige Testreaktion ergeben würde.

100815/1848

/6

- δ -* Fw 5128 A

161774a

Beispiel: -, ·

50 g getrocknete Streptokokken werden mit 1OO ml dest. Wasser im ßtter-Homogen!sator homgeiiisiert. Das Iioinogenat Λγ-ird anschließend 3 Stunden bei Zimmertemperatur mechanisch gerührt und darauf 15 Minuten bei 5OOO ITbidrehimgen zentrifugiert. BAe überstehende Lösung; wird ini Wasserbad auf 80 C erhitzt und nach Abkühlen OtLt Ammonsulfat bei kO % (g/Vo lumen) eine Vbrfraktion aus ΐΐτι-spezifischein Material gefällt, 12 Stunden ijn ,Kühlschrank bei +4°C gehalten und damn ±5 Minuten bei 500O Umdrehungeii zentrifugiert. In der erhaltenen !»ösung wird der Ammonsulfatgehalt auf 7O % erhöht, die Fällung viederim 12 Stunden im Kühlschrank bei + 4°C gehalten und erneut 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen zentrifaägiert. Der Niederschlag xvdLx-d in Wasser aufgenommen und zweimal 2% Stunden,gegen Aqua dest. dxalysiert. Nach dieser Zeit können mit Bariumchlorid keine Sitlfatiouen mehr nachgewiesen werden. Bie dialysierte Lösung wird daraufhin über Blaugel getrocknet«

Zur weiteren Reinigung wird DEAE-Zallulose {Firma Serva Nr. 12 113 PA) verwendet. Bazu -»«Tuen. 12 g des Aitstauschers in 590 ecm Michaelispuffer von pH 7,0 suspendiert, nach 45

Minuten die überstehende X.ösung dekantiert und. mit dem auspendle Austauscher eine Säule vom JO ml Inhalt gefüllt· O»5 g der Steptokokkensubs tanz werden in 10 ml Puffer hei pH 7 Ό gel&t, die schwache Trübung dureM 15-minütiges,Zentrifugieren bei 20 000 Umdrehungen entfernt land auf die AustataDliersäule gegeben. Die Säule wird mit Puffer von pH 3,0 solange gewaschen, bis das Eluat eisen pH>¥ert von J₁O erreicht hat. Danach wird mit dem gleichen Puffer, dem J % NaCl zugesetzt worden sind, desorbiert. Bie ersten 20 ml des Eluates werden verworfen, die folgenden ®O ml w&ru*n aufgefangen und 2h Stunden gegen dest· ^&amms· bei 4 C dialysieirt. Nach dieser Zeit können keine ChI#ifiassem taahr nachgewieeen werden· Die Suspension wird daraufhin iHfoex*. Blaug·! getrocknet.

BAD ORIGINAL

109815/1848

/7

Claims

- 7 - Rtc 5128 a

Γ ATENTANSPIUiCIiE ;

• -■■-:■'■ ί*%* "-■■" .. . . ' *■---;■■ - ·

ι . llheuma-Diagnostikum, gekennzeichnet durch einen Gehalt an, Nucleoproteide das int UV-Spektrum ein Maximum bei \ etwa 259 ö^i aufweist und eine elektrophoretische

Iv'ander-ungsgeschwindigkeit iron. 4,5 - 6 cm/2 Std.(Verönalpuirer 0,111; pH 8,6 ,11 V/cm) besitzt.
2. Verfaliren sur Herstellung eines DiagnostikuBss gemäß 'Anspruch" 1, dadurch gekennzeichnet, daß man -Strptokoklcen mit H'asser oder wasserhaltigen Gemischen homogenisiert, den Extrakt isoliert, daraus durch Einstellen der Lösung auf einen, hohen Salzgehalt eine. Vorfraktion abtrennt, danach durch'weiteres Erhöhen des Salzgehaltes die Hauptfraktion ausfällt, den Kiederschlag abtrennt, in "Wasser löst, dialysiert und gegebenenfalls trocknet, in einem PuTfer ,wieder auflöst, an einer basischen Ionenaustauschersäule adsorbiert, nach Waschen des Austauschers durch Elution mit einer gepufferten Salzlosung zunächst die unspezifischen Verbindungen desorbiert und sodann durch Fortsetzen der Elution das Nucleoproteid νου» Austauscher abtrennt, das Eluat dialysiert , und trocknet.

3« Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Abtrennung der Vorfraktion von der Hauptfraktion/Ammonsulfat lösungen sind. verwendeten Salzlösungen

t
.VI«'

109815/184 8