DE1418452A1

DE1418452A1 - Verfahren zur Herstellung von neuen Derivaten von basischen,wasserloeslichen Antibiotica

Info

Publication number: DE1418452A1
Application number: DE19591418452
Authority: DE
Inventors: Sumio Umezawa
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1958-12-12
Filing date: 1959-12-11
Publication date: 1968-10-24
Also published as: FR435M; DK118502B; CH421384A; GB933702A

Description

Patent-Ingenieur Hamburg-Af ton a Jttir«*.tober-SlraSe21 ■ Zu Akts. P 14 18 452» 2 Zur Offenlegung "bestimmte Unterlagen

Anmelder; Sumio U m eζ a w a

25, Kita-4-chome, Toyotama, ETerimaku Tokio, Japan

"Verfahren zur Herstellung von neuen Derivaten von basischen, wasserlöslichen Antibiotiea"

Me Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Derivaten von "basischen, wasserlöslichen Antibiotiea. Zu der S-ruppe basischer, wasserlöslicher Antibiotiea, die mehrere Aminogruppen enthält, gehören Kanamycin, Neomycine'und dgl. Diese Antibiotiea sind gegen M. tuberculosis wirksam und weisen ein breites antibakterielles Spektrum auf. Bei seinem Studium der Struktur des Kanamycins, das kürzlich praktische Bedeutung erlangt hat, stellte der Erfinder fest, dass dieses Antibioticum gegen chemische Behandlung sehr stabil ist. Die Stabilität legte '"die Modifikationsmöglichkeiten basischer, wasserlöslicher Antibiotiea in der Hoffnung nahe, Derivate au entdecken* die eine niedrigere loxizität und die gleichen oder höhere Aktivitäten als die Antibiotics selbst aufweisen. Der Erfinder hat daher XTnt'ersuchungen angestellt, mn. neue Derivate der oben erwähnten Antibiotioa herzustellen.

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Neue Unferfagen (Art 7 § t Abs.* Nr. l SalzS des Änderungsges. ν. 4 9.196$.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen hat der Erfinder kürzlich neue Derivate künstlich hergestellt, nämlich N-Methansulfonate der /basischen, wasserlöslichen Antibiotioa, und dabei festgestellt, dass die neuen Derivate eine viel geringere Toxizität als die ursprünglichen Antibiotica und starke antibakterielle Aktivitäten von nahezu dem gleichen Grad wie die ursprünglichen Antibiotica aufweisen.

(remäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von neuen weniger giftigen Derivaten von freie Aminogruppen enthaltenden, basischen, wasserlöslichen Antibiotica geschaffen, das sich dadurch auszeichnet, dass Methansulf onsäuregrupp en in die Aminogruppen dieser Antibiotica mittels der Reaktion, zwischen den Antibiotica und mehreren, Methansulfonsäuregruppen substituierbaren Verbindungen eingeführt werden.

Wenn freie .Aminogruppen enthaltende, basische, wasserlösliche Antibiotica mit Hydroxymethansulfonat (oder Formaldehyd und Bisulfit) in wässeriger lösung zur Reaktion gebracht werden, können neue Derivate der Antibiotica, nämlich K~Methansulfonate (I) entsprechend der Reaktion nach folgender Reaktionsformel (1) gewonnen werden? .

-) C-HH₉ t HOOHpSO Fa f _ .

-J G-NHOH₂SO₅Na + H₂O—— (1)

-(D

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Wenn Kanamycin mit Natriumhydroxymethansulfonat (oder mit Formaldehyd und Natriumbisulf it) in wässeriger Lösung zur Reaktion gebracht wird, können neue Derivate, nämlich STatriumkanamycin-N-methansulfonate (ll), entsprechend der Reaktion nach folgender Reaktionsformel (2) gewonnen Werdens

Kanamycin + nHOOHgSOJtfs 7·

E(HH.OHg.SO JJa)_n + ZiH₂O;- (2)

(II)

in der K den sich durch die Entfernung von (UfH₂) ^{aus dem} Kanamycinmolekül ergebenden Restteil darstellten =1-4.

Durch Einstellen des Molverhältnisses des Katriumhydroxymethansulfonats auf Kanamycin sollen die oben erwähnten, η = 1 -4 entsprechenden Derivate als Hauptprodukte gewonnen werden. Wenn vier Mole oder zwei Mole natriumhydroxymethansulfonat' mit einem Mol Kanamycin zur Reaktion gebracht werden, ist das gewonnene Hauptprodukt Tetra-Katriumkanamycin-tetra-li-methansulfonat bzw. Di-Hatciumkanamycln-di-S'-methansulfonat, wie aus Beispiel 1 oder 3 hervorgeht. Es wurde festgestellt, dass anstelle des Hatriumhydroxymethansulfönats die gleichmolare Mischung des Formaldehyde und Natriumbisulfits ein nützliches Reagens zur Herstellung der oben erwähnten 2f~Methansulfonatderivate des Kanamycins ist, wie aus Beispiel 2 ersichtlich»

Die Hydrolyse des oben erwähnten Tetra-Uatriumkanamycin-

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tetra-N-methansulfonats mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure macht !Formaldehyd in einer annehmbaren Ausbeute frei, wobei sich ergibt, dass das Derivat ein N-Methansulfonat ist. Dies kann durch Elementarahalysen und die Bestimmung des infraroten Spektrums des Derivats bestätigt werden.

Wenn Kanamycinmonosulfat mit zwei Mol Natriumhydroxymethansulfonat in wässeriger Lösung zur Reaktion gebracht wird, kann ein neues Derivat, nämlich Di-Natriumkanamyein-di-N-methansulfonatsulfat (III), bei folgender Reaktion (3) gewonnen werden:

C₁₈H₅₆O₁₁F₄-H₂SO + 2HO.CH .SO₅Na ->

₅₂₂₅₁H₂SO₄ + 2H₂O (III) (3)

Die Hydrolyse der Verbindung (ΙΙΓ) mit verdünnter Chlorwasserstoff säure macht Formaldehyd in einer annehmbaren Ausbeute frei, wobei sich ergibt, dass das Derivat ein N-Methansulfonat ist. Dies kann durch Elementaranalysen und die Bestimmung des infraroten Absorptionsspektrums des Derivates bestätigt werden, wie aus Beispiel 4 ersichtlich.

Da das Kanamycinmonosulfat leicht kristallisationsfähig ist und daher das wichtigste Salz ist, das zur Reinigung des Kanamycins bei der handelsüblichen Herstellung verwendet werden kann, ist die Herstellung der Verbindung (ill) durch die oben erwähnte Reaktion bei der handelsüblichen Herstellung des Kanamycin-N-methansulfonats besonders vorteilhaft,

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Wenn eine wässerige Suspension von Kanamycinlauge mit zwei Mol Schwefeldioxyd und dann mit Paraformaldehyd zur Reaktion gebracht wird, kann ein neues Derivat, nämlich Kanamycin-di-N-, methansulfonsäure (IV),. bei folgender Reaktion (4) gewonnen werden: ' ·

C-, _OH, JJ, 0«., + 2H_nSO, + 2HCHO P

O₁₈H₂₈O₁₁ (NH+)₂(NH.0H₂.S0₅)₂ + 2HgO —— (4) (IV)

Die Hydrolyse der Verbindung (IV) mit verdünnter Chlorwasserstoff säure macht Formaldehyd in einer annehmbaren Ausbeute frei, wobei sich ergibt, dass das Derivat ein ΪΓ-Methansulfonat ist« Das neue Derivat wird als ein Innensalz oder Zwitterion angesehen, und kann durch die Formel IV in der Reaktionsformel (4) dargestellt werden. Dies kann durch die Bestimmung des infraroten Absorptionsspektrums des Derivats bestätigt werden (Beispiel 5).

Venn eine wässerige Suspension von Kanamycinlauge mit einem Mol Schwefeldioxyd und einem Mol Formaldehyd (oder einer berechneten Menge von Paraformaldehyd) zur Reaktion gebracht wird und dann die sich ergebende Lösung von Kanamycin-mono-lT-methan-' sulf onsäure mit drei Mol Iiatriumhyd:oxymethansulfonat an Ort und Stelle umgesetzt wird, kann ein neues Derivat, nämlich 2ri-Uatriums'ζ der Kanamycin-tetra-N-methansulfonsäure (V), bei folgender Reaktion (5) gewonnen werden:

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°18^H36Vi1 ^{+ H}2^S03 ^{+ HCH}°— *

C₁₀H-JiUO₁₁ (NH. OH₉. SO,H) +H₀O

3 OHCHpSO-Na V

G₁OH_9nO₁₁(NH^H₉. SO-Na)-(NH. CH₉* SO-H) +

(V) — -> (5)

Analysenergebnisse und die Bestimmung des infraroten Absorptionsspektrum des Derivats (5) weisen nach, dass das Derivat ein Methansulf onat des Kanamycins ist, wie aus Beispiel β hervorgeht.

Es wurde festgestellt, dass Kanamycin-N-methansulfonat, beispielsweise das Derivat nach der Formel (i), durch die Reaktion von Hydroxymethansulfonat mit kanamycinschwachem Säure« salz, beispielsweise Kanamycinkarbonat, gewonnen werden, kann. Wenn eine wässerige Lösung von Kanamycinkarbonat und Natriumhydroxymethansulfonat erhitzt wird, wird eine Kohlendioxydentwicklung beobachtet und es kann Natriumkanamycin-N-methansulfonat gewonnen werden. Durch die Reaktionen von Kanamyoinkarbonat mit vier Mol Natriumhydroxymethansulf onat kann Tetra-Natriumkanamyointetra-N-methansulfonat gewonnen werden, wobei das Derivat η » 4 in der Formel (II) entspricht, wie aus Beispiel 7 ersichtlich. Die Reaktion des Kanamycinkarbonats mit quantitativen Mengen von Formaldehyd und Natriumbisulf it. ergibt ebenfalls ■/', ietra-Natriximkanamycin-tetra-N-methansulfonat, wie im Beispiel 8 beschrieben. . ."

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C--

Als Ergebnis weiterer Untersuchungen hat der Erfinder festgestellt, dass die oben beschriebene N-Methansulfonierung allgemein nützlich ist, um weniger giftige Derivate aus mehrere Aminogruppen enthaltenden, basischen, wasserlöslichen Antibiotica herzustellen. Wenn, als ein weiteres Beispiel, Neomycin (Fradiomyoin) mit Natriumhydroxymethansulfonat (oder mit Formaldehyd und Bisulfit) durch ein ähnliches Verfahren, wie es bei der Herstellung des Natriumkanamycin-N-methansulfonats angewendet wurde, zur Reaktion gebracht wird, kann ein neues Derivat, nämlich Natriumneomyein-N«methansulfonat, gewonnen werden. Es wurde festgestellt, dass auch das Neomycinderivat viel weniger giftig als das Neomycin selbst ist und starke antibakterielle Aktivitäten aufweist, wie aus Tabelle 3 ersichtlich.

Neomycin ist häufig aus zwei Neomycinarten zusammengesetzt, nämlich Neomycin B und C, die Stereoisomere mit der gleichen Molekular-Formel Op-zH.gN O.j, sind und sechs Aminogruppen· enthalten. Die Struktur des Neomycins ist teilweise bekannt. Da aber über seine bestimmte Struktur noch Unklarheit herrscht, kann die Struktur des durch N-Methansulfonierung des Neomycins gewonnenen Produkts nicht dargestellt werden. Der Erfinder hat jedoch durch Elementaranalysen, Hydrolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure und Bestimmung des infraroten Absorptionsspektrums des Derivats festgestellt, dass das Derivat des Neomycins N-Methansulfonat gewesen ist.

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Wenn Neomycinlauge mit Hydroxymethansulfonat zur Reaktion gebracht wird, kann ein neues Derivat gewonnen werden, wie in Beispiel 9 "b e schrieb en, das als Hexanatriumneomycin-hexa-N-· methansulfonat angesehen wird. Die Hydrolyse des Produkts mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure maclt Formaldehyd in einer annehmbaren Ausbeute frei, wobei sich ergibt,- dass das Derivat ein N-Methansulfonat ist. Die Bestimmung des infraroten Spektrums des Produkts ergibt charakteristische Absorptionen von N-Methansulfonat.

Das gleiche Derivat, Natriumneomycin-JSk-methansulfonat, kann durch die Reaktion von Natriumhydroxymethansulfonat mit neomycinschwachem Säuresalz, beispielsweise Neomycinkarbonat, gewonnen werden, wie aus Beispiel 10 ersichtlich. Die Reaktion des Neomycinkarbonats mit quantitativen Mengen von Formaldehyd und Bisulfit ergibt ebenfalls Natriumneomycin-N-methansulfonat, wie im Beispiel 11 beschrieben.

Ausserdem wurde festgestellt, dass Kanamycin-N-methansulfonat oder Neomycin-N-methansulfonat von Kanamycin bzw. Neomycin mittels Papierchromatographie mit 0.4 $> Ammoniumchloridlösung abgeleitet werden kann; Kanamycin oder Neomycin verbleibt am ursprünglichen Punkt (Rf = 0), während die N-Methansulfonatderivate des Kanamycins oder Neomycins sich mit dem Lösungsmittel bewegen. Durch die Verwendung der Papierchromatographie wurde festgestellt, dass Kanamycin oder Neomycin durch den Natriumtyp der Kationenaustauschharze, beispielsweise IRC-50, adsorbiert wird, während

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mm Q mm '

die Methansulfonatderivate durch den gleichen Austauscher nicht adsorbiert werden. Daher können die N-Methansulfonatderivate mittels dieses IonenaustäUschverfahrens von Kanamycin- oder Neomycinlauge befreit werden.

Der Erfinder hat festgestellt, dass alle oben beschriebenen N-Methansulfonate des Kanamycins und Neomycins eine starke antibakterielle Aktivität aufweisen und viel weniger giftig als die ursprünglichen Antibiotica sind. iEetra-Natriumkanamyointetra-N-rmethansulfonat weist eine geringere loxizität als ein achtzehntel und jedes Di-Natriumkanamycin-di-N-methansulfonatsulfat und jede Kanamycin-di-N-methansulfonsäüre. eine niedrigere Toxizität als ein dreizehntel.der Toxizität des Kanamyoinmonosulfats auf; sie bewirken hohe Blutspiegel und haben therapeutische Wirkungen bei lebenden. Nat riumne omycin-N-me.thansulf onat hat ebenfalls bakteriostatische Wirkungen und weist eine geringere loxizität als ein achtzigstel der Toxizität des Neojaycinsulfats auf.

Die Bestimmung der bakteriostatischen Aktivität der oben beschriebenen N-Methansulfonatderivate des Kanamycins oder Neomycins drei Stunden nach ihrer Zugabe zu Medien, in die Staphylokokken nach einem Zylinderplattenschnellverfahren oder nephelometrisohem Verfahren eingeimpft wurden, ergab, dass alle oben beschriebenen N-Methansulfonate schon in dem frühen Stadium."-der Inkubation bakteriostatische Aktivitäten in dem gleichen

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Masse wie nach, einer Inkubationszeit von vierundzwanzig Stunden \ aufweisen. Das Ergebnis besagt, dass die N-Methansulfonate selbst bakteriostatiseh und bakterizid sind und dass eine Abscheidungsmöglichkeit ursprünglicher Antibiotica durch Hydrolyse in einer Lösung, die bakteriostatische Wirkungen haben kann, .nicht besteht..

Obwohl die oben beschriebenen N-MethansuIfonate'durch Säurewirkung oder Erhitzung ursprüngliche Antibiotica freigeben, wurde eine Zersetzung innerhalb von 2 bis 3 Stunden in einer Pufferlösung kaum beobachtet. Pharmakologische Untersuchungen des Umsatzes der N-MethansuIfonatderivate in die ursprünglichen Antibiotica nach der Injektion bei Kaninchen bestätigten, dass während der Dauer des höchsten Blutspiegels kein Umsatz, in die ursprünglichen Antibiotica erfolgte, wohl aber danach beobachtet wurde. Somit ist bewiesen, dass die N-Methansulfonatderivate weniger giftig und von praktischer Verwendbarkeit sind.

Auf Grund der oben beschriebenen Ergebnisse wird die Ansicht vertreten, dass ähnliche Derivate anderer basischer, wasserlöslicher Antibiotica bakteriostatisohe Wirkungen habe, eine geringere ioxizität aufweisen und die Möglichkeit der praktischen Verwendung bieten.
Beispiel 1 ι " ·.

Herstellung von Tetra-Fatriumkanamyoin-tetra-N-methansulfonat

Eine Mischung von 3.6 g Kanamycin, 4.0 g Natriumhydroxymethansulfonat und 4.0 cc Wasser wurde auf einem Wasserbad unter Rühren 2 Stunden lang erhitzt und dann auf Zimmertemperatur

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gekühlt. Der Lösung wurden 500 cc Methanol zugegeben, worauf sich sogleich ein viskoses Produkt niederschlug, das sich "beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelte. Ausbeute 4 g. Das Pulver wurde in 9 cc Wasser gelöst und der lösung zum fraktionierten Ausfällen Methanol zugegeben. Die Hauptfraktion war ein sehr wasserlösliches, farbloses kristallines Pulver; Schmelzpunkt ungefähr 202⁰O, Das Produkt wurde bei ungefähr 105⁰O unter Vakuum getrocknet und analysiert. Die Elementaranalyse ergab, dass die Hauptfraktion Tetra-Natriumkanamyein-tefcra-N-methansulfanat ist, was dem Pail η « der oben erwähnten Formel (II) ent^richt.

Anal. Pestgestellt: 0,28.10; H,4.415 N,6.15} 3,12.90;

a, 9.49.$

Berechnet für C₂₂H₄₀O₂₃F₄S₄Ua₄: _0>27.8₃.

H,4.25; F,5.95; S,13.5t; Na,9.70 /0

j^O = + 65° (c = 1, Wasser).

Hydrolyse mit verdünnter fluorwasserstoffsäure line Probe von 0.2 g des oben beschriebenen Kanamycinderivats wurde in 3.0 cc 2N Ohlorwasserstoffsäure und 5.0 cc Wasser gelöst und die Lösung auf einem Wasserbad fünfzehn Minuten lang erhitzt. Die Lösung wurde auf Zimmertemperatur gekühlt und mit 1N Natriumhydroxyd neutrasiliert* Der neutralisierte: Lösung wurde eine Mischung von 150 mg Dimedon, 0.5 cc Wasser und 1 cc Methanol zugesetzt, um farblose Pormaldehydmethonnadeln

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zu ergeben; Ausbeute 124 mg, Schmelzpunkt 184-187°C Durch Umkristallisation wurde der Schmelzpunkt auf 19O⁰O erhöht. Die Mischschmelzpunktbestimmung mit einer authentischen Probe von Formaldehydmethon (Schmelzpunkt 19O⁰C) ergab keine Senkung Das Ergebnis zeigte, dass das oben erwähnte Derivat das N-Methansulfonat des Kanamycins ist. .

Infrarotes Absorptionsspektrum:

Die Maximalabsorptionen des oben erwähnten Derivats lagen bei 3400 cm""¹ (breit, OH, ITH), 1650 cm"¹ (Kennwert des Methansulfonats), 1200 cm" und 1040 cm"" (Kennwert des Sulfonate), wodurch erwiesen ist, dass das Derivat das N—Methansulfonat des Kanamycins ist.

Toxizität und antibakterielle Aktivitäten:

Die Toxizität und die antibakteriellen Aktivitäten des Tetra-Natriumkanamycin-tetra-H-methansulfonats sind denen des Kanamycinmonosulfats in Tabelle 1 vergleichsweise gegenübergestellt.

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Tabelle 1

loxizität und antxbakterielles Spektrum von Tetra-Natrium kanamycin-tetra-F-methansulfonat und Kanamyoinmono sulfat

	ι Minimale inhibitor!sehe Konzentration	Kanamycinmono- sulfat
Versu ons organiamen	mcg/cc	0.6
M. pyogenes var. aureus 209-P	Tetra-Fatriumkana- mycin-t e±ra-JT-me- thansulfonat	1.25
B. änthracis	3.13	0.6
B. subtilis	3.13	5.0
E. coli	1.56	5.0
. E. ooli streptomycin- fast	6.25 '	1.25
K. pneumoniae	6.25	10.0.
Pr. vulgaris OX-1 9	3.13	25
Ps. aeruginosa	12.5	■5.0
Sh. flexneri	50	5.0
Sh. dyesenteriae	6.25	5.0
Sh. sonnei	6.25	5.0
S. parätyphi A	6.25	5.0
S* parätyphi B	3.13	2.5
S. enteritidis	6.25	2.5
S. typhosa	6.25	0.5
M. phlei	3.13	2.0
M. tuberculosis	6.25	2.5
M. 607	3.13	2.5
M. 607 streptomycin- fast .	1.56	0.75
C. diphteriae	1.56	.' 313 mg./kg.
Toxizität "bei Mäusen durch intravenöse Inj ektion LD 50	1.56
>55OO mg./kg.

Nach Aga:

lattenverfahren
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Ferner wurde beslätigt, dass das Kanamycinderivat gegen die Infektion von Mäusen mit M. pyogenes und S. typhosa wirksam ist. Beispiel 2; - ·

Herstellung von Tetra~Natriumkanamycin-tetra~IilHnethan8ulfonat

Eine Mischung von 3.0 g Natriumbisulf it und 3.2 g wässeriger lormalinlösung (35 $>) wurde gut verrührt. Der Lösung wurden 5.0 g Kanamycin und 4.5 cc Wasser zugegeben und die Lösung wurde auf einem Wasserbad 1.5 Stunden.-lang erhitzt und auf Zimmertemperatur gekühlt. Der Lösung wurden 250 cc Methanol zugegeben, um ein viskoses Präzipitat zu erhalten, das sich beim Zerreiben mit einem Grlasstab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute 7.0 g. Das Pulver wurde in Wasser gelöst und durch Zugeben von Methanol fraktioniert ausgefällt. Das Hauptprodukt war 3?.etra-Uatriumkanamycin—tetra-N-methansulfonat, wie im Beispiel 1 beschrieben. Beispiel 3:

Herstellung von Di-Natriumkanamycin->di~N-methansulfonat

Eine Mischung von 3.6 g (0.0074 Mol) Kanamycin, 2,26g (0.015 Mol) Uatriumhydroxymethansulfonai/ und 4,6 cc Wasser wurde auf einem Wasserbad 1.5 Stunden lang erhitzt und dann auf Zimmertemperatur gekühlt. Der Lösung wurden 300 cc Methanol zugegeben, um ein viskoses Produkt auszufällen, das sich bald in einen pulverförmigen festen Stoff verwandelte; Ausbeute 2.82 g (53 $) · Dieser Stoff wurde in 1 2 cc Wasser gelöst und durch Zugeben von

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Methanol fraktioniert ausgefällt. Alle vier Fraktionen waren hygroskopische Pulver. Die """usbeute an der zweiten Fraktion betrug 400mg. Die Elementaranalyse ergab, dass die Fraktion Di-Hatriumkanamycin-di-N-nethansulfonat ist und dem Fall η = 2 der oben erwähnten Formel (II) entspricht.

Anal. Festgestellt-: 0,32,72; H,5;41; N,7.15; S,9.07;

Ka,5.71 <fo_t

Berechnet für O₂₀H₃₈O₁₇N S₃Fa₂: 0,33.46;

H,5.34; N,7.81; S,8.94; STa,6.42 fo Beispiel 4t

Herstellung von D-inatsäiankanamyoin-di-H-methansulfonatsulfat

Eine Mischung vom 3.0 g Kanamycinmonosulfat und 3.04 g Uatriumhydroxymethansulfonat in 4 cc Wasser wurde auf einem Wasserbad 1.3 Stunden laiqg dem Rückfluss ausgesetzt, Uta eine hellgelbe Lösung zu ergeben. Der kalten Lösung wurden 180 cc Methanol zugesetzt, um ein viskoses Präzipitat zu erhalten, das sich beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute 5.5 g. Das Produkt wurde in 22 cc Wasser gelöst und gefiltert, um unlösliche Stoffspuren zu entfernen. Dem Filtrat wurden 25 cc Methanol zugegeben und die Mischung wurde zwecks Ausfällens eines viskosen Produkts stehen gelassen, das durch Dekantieren abgetrennt und durch Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelt wurde;

Ausbeute 2.1 g,fö<J¹⁸'⁵ = +83.0° (c = 2, Wasser).

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Es zerschmolz mit Zersetzung unscharf über 206⁰C.

Bei der Elernentaranalyse der Probe, die "bei ungefähr 105⁰C im Vakuum getrocknet wurde, wurden die folgenden Ergebnisse erzielt, wobei sich das Produkt als Di-Natriumkanamycin~di-N-methansulfonatsulfat erweist.

Anal. Pest-gestellt: 0,28.75; H,5.11; N,6.25; S,11.68;

Na,5.69 fo.

Berechnet für G₁₈H₅₂N₂O₁₁(NHCH₂SO Na)₂.H₂SO₄:

C,29.45; H,4.91; N,6.87; S,11.78; Na, 5.64 $

Hydrolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure

Eine Probe von 0.2 g der oben erwähnten Probe wurde in 3.0 cc 2N Chlorwasserstoffsäure und 5 cc Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf einem Wasserbad fünfzehn Minuten lang erhitzt, auf Zimmertemperatur gekühlt und mit -1N Natriumhydroxyd neutralisiert. Der Lösung wurde eine Mischung vom 200 mg Dimedon, 0.5 cc Wasser und 1 cc Methanol zugegeben und die Lösung wurde erhitzt und dann gekühlt, um farblose HOrmaldehyddimedonnadeln zu ergeben; Ausbeute 92 mg, Schmelzpunkt 184-7°C.'Durch Um-. kristallisation wurde der Schmelzpunkt auf 19O⁰C erhöht. Die Mischschmelzpunktbestimmung mit einer authentischen Probe ergab keine Senkung.

Infrarotes Absorptionsspektrum:

Starke Absorptionen des oben beschriebenen Derivats lagen

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bei 3400 cm"¹ (breit, OH, HH), 1630 cm"¹ (Kennwert des Hy-

—1 —

droxymethansulfanats)» 1200 - 1110 cm (SO- ), wodurch erwiesen ist, dass das Derivat K-Methansulfonat ist» Toxizität und antihakterielle Aktivität: -

Das Di-Uatriumkanamycin-di-N-methansulfonatsulfat wies viel weniger Toxizität als Kanamycin selbst und eine starke antibakterielle iküvität auf, wie aus Tabelle 2 ersichtlich, ferner wurde bestätigt, dass das Derivat gegen die Infektion von Mäusen mit M* pyogenes und S. typhosa wirksam ist.

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Tabelle 2

Antibakterielle Aktivität und Toxizität von Di-Natriumkanamycin-di-N-me thansulfonat sulfat im Vergleich mit Kanamycinmonosulfat

Versuchsorganismen	Minimale inhibitorische Konzentration mcg/cc	Kanamyc inmono- sulfat
M. pyogenes var. aureus 209-P	Di-Natriumkanamy- cin-di-N-methan sulfonat sulfat	0.6
S. anthracis	0.78-1.56	1.25
B. subtilis	0.39-0.78	0.6
E. coli	0.39-0.78	5.0
E. coli streptomycin- fast	6.25	5.0
K. pneumoniae	3.I-6.25	Ί.25
Sh. flexneri	3.I-6.25	5.0
Sh. sonnei	6.25-12.5	5.0
S. typhosa	6.25-12.5	2.5
S. paratyphi A	3.1	5.0
S. paratyphi B	3.1	5.0
S. enteritidis	6.25-12.5	2.5
M. tuberculosis	6.25	2.0
M. 607	1.5	2.5
M. 607 streptomycin- fast	1.5	2.5 '.
Toxizität bei Mäusen	1.5
durch intravenöse Injek
tion
^LD50		300 mg/kg " ■ _- ■
>*t000 mg/kg

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Beispiel 5: Herstellung von Kanamycin-di-N-methansulfonsäure

In eine Suspension von 4.85 g (0.01 Mol) freier Kanamycinlauge in 5 cc Wasser wurde Schwefeldioxyd gegeben, bis die berechnete Menge von Schwefeldioxyd (1.28 g) absorbiert worden war. Der pH-Wert der sich ergebenden viskosen Lösung lag bei 6.6. Der Lösung wurden 0.60 g Paraformäldehyd (oder 2.0 g 30#iger PormalinlÖsung) zugegeben und die Lösung wurde bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang stehen gelassen. Der pH-Wert der sich ergebenden Lösung betrug 7.2-7.3· Die Lösung wurde in 4θ cc Äthanol gegossen, worauf sich ein viskoses Produkt niederschlug, das durch Zerreiben mit einem Glasstab kristallisierte. Das Produkt wurde wieder in 10 cc Wasser gelöst und nach Filtration durch Zugeben von 50 cc Äthanol ausgefällt. Die Ausbeute an bei ungefähr 50° C getrocknetem kristallinem 'Pulver betrug 6.32 g (94 %). Die Elementaranalyse ergab, dass das Produkt ein Innensalz der Kanamycin-di-N-methansulfonsäure ist.

Anal. Pestgestellt: 0,34.90; H,6".23; N,8.O6; S,8.96 % ' Berechnet für C₁₈H₂₈Q₁

fei}²⁰ -

0,34.78; H,6.13; N,8.11; S,9.53 - ⁺¹°3° (ö = ²» Wasser).

Hydrolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure; Eine Probe von 0.2 g des oben erwähnten Kanamycinderivats ' wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert j um

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Formaldehyd freizumachen, das in der gleichen Weise_a wie im vorhergehenden Beispiel 1 oder 3 beschrieben, als Formaldehydmethon (110 mg) isoliert wurde. Das Ergebnis zeigte, dass das oben erwähnte Produkt die N-Methansulfonsäure des Kanamycins ist. .

Infrarotes Absorptionsspektrum;

Die Maximalabsorptionen des oben beschriebenen Derivats lagen bei 3350 cm"¹ (breit, OH, NH), I630 cm"¹ (Kennwert des MethansulfonatS-), 1525 cm"¹ (NHp, II70 cm"¹ und 1030 cm"¹ (Kennwert der Sulfonsäure), wodurch erwiesen ist, dass das Derivat die N-Methansulfonsäure des Kanamycins ist.

Toxizität und antibakterielle Aktivität:

Das Innensalz der Kanamycin-di-N-methansulfonsäure wies eine Wirksamkeit von 710 U/mg, ausgedrückt in Kanamycineinheit, gegen M. pyogenes var. aureus 209-P auf und bei der Injektion bei Mäusen auf intravenösem Wege betrug LD₅₀- des Innensalzes 3500, mg/kg. Beispiel 6:

Herstellung von Trinatriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat '

In eine Suspension von 4.85 g (0.01 Mol) Kanamycinlauge in 10 cc Wasser wurde Schwefeldioxyd gegeben, bis die berechnete Menge von Schwefeldioxyd (0.64 g, 0.01 Mol) absorbiert worden war und der Lösung wurden 0.30 g Paraformaldehyd (oder 1.0 g 30#iger Formalinlösung) zugegeben. Die sich ergebende Lösung wurde nach halbstündigem Stehen bei Zimmertemperatur mit

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4.56 g (0.03 Mol) Natriumhydroxymethansulfonat gemischt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der pH-Wert der sich ergebenden Lösung betrug 7.0. Die Lösung wurde in 50 cc Äthanol gegossen, worauf sich ein viskoses Produkt niederschlug, das durch Zerreiben mit einem Glasstab kristallisierte. Das Produkt wurde wieder in 1.0 cc Wasser gelöst und nach Filtration durch Zugeben von 50 cc Äthanol ausgefällt; die Ausbeute an bei ungefähr 50° C getrocknetem kristallinem Pulver betrug 8.8 g (95 %)* Die Elementaranalyse ergab, dass das Produkt Trinatrium-kanamycintetra-N-methansulfonat ist.

Anal. Festgestellt: 0,28.69; H,4.76; N,5.89; S,13.4;

Na, 7.02 %
Berechnet· für C₁oH^oO..(NH.CH₉S0,Na),(NH.CH_PS0,H):

0,28.51; H,4U6; N,6.05; S,13.85;

Na, 7.44 %

18 ■ * . '

_D = +73.3 (c = 2, Wasser).

Die Bestimmung des infraroten Absorptionsspektrums des oben

beschriebenen Derivats ergab Maximalabsorptionen bei 3400 cm (breit), 1635 - 1645 cm"¹, 1150 - 1200 cm"¹, 1020 - 1050 cm"¹, wodurch erwiesen ist, dass das Derivat ein N-Methansulfonat des Kanamycins ist.

Das Tri-Natriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat wies eine Wirksamkeit von 461 U/mg, ausgedrückt in Kanamycineinheit, gegen M. pyogenes var. aureus 209-P auf. Der pH-Wert einer Lösung ■ von 1.0 g des Produkts in 5 cc Wasser betrug 6.9, wodurch die ■

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Zweckraässigkeit und praktische Verwendbarkeit des Derivats für Injektionen nahegelegt wird.
Beispiel 7:

Herstellung von Tetra-Natriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat Eine Mischung von 4.5 g Kanamycinmonosulfat und 3.0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde ungefähr 2 Stunden lang verrührt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um Bariumsulfat auszufällen, das durch Filtration entfernt wurde. Das Piltrat, eine Lösung von Kanamycinkarbonat, wurde bei ungefähr 45° C unter Vacuum auf ein Volumen von ungefähr 10 cc konzentriert und 4.0 g Natriumhydroxymethansulfonat wurden zugegeben, Die sich ergebende Mischung wurde auf einem Wasserbad 2 Stunden lang erhitzt, als die Entwicklung von Kohlendioxyd beobachtet wurde. Aus der resultierenden Lösung wurde, durch Zugeben von· Methanol in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, Tetra-Natriumkariamycin-tetra-N-methansulfonat isoliert. Die analysierte Probe wurde durch fraktioniertes Ausfällen aus einer wässerigen Lösung des Produkts durch Zugeben von Methanol gewonnen.

Anal. Pestgestellt: C,28.10; H,4,4l; N,6.15; S,12.72;

Na, 9.60 %
Berechnet für C₁₈H₂₈O₁₁(NHCH₂SO₃Na)₁₁: 0,27.83;

H,4.25; N,5.95; S,13.51; Na, 9-70 %.

Das infrarote Absorptionsspektrum des Produkts konnte dem des im Beispiel 1 beschriebenen Tetra-Natriumkanamycin-tetra-N-methansulfonats vollständig überlagert werden.

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• . - 23 ·

Beispiel 8;

Herstellung von Tetra-Natriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat Eine Mischung von 4.5 g Kanamycinmonosulfat und 3.0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde ungefähr 2 Stunden lang verrührt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um Bariumsulfat auszufällen, das durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat, eine Lösung von Kanamycinkarbonat, wurde bei ungefähr 45° C unter Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 cc konzentriert, in das eine gut verrührte Lösung von 3-0 g Natriumbisulfit und 3.2 g wässerige Formalinlösung (35 %) hinzugegeben wurde und die Lösung wurde auf einem Wasserbad 1.3 Stunden lang erhitzt. Der auf Zimmertemperatur gekühlten Lösung wurden 300 cc Methanol zugegeben, um an viskoses Präzipitat zu erhalten, das sich beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute 4.0 g. Fraktioniertes Ausfällen aus einer wässerigen Lösung des Produkts durch Zugeben von Methanol ergab Tetra-Natriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat. Beispiel 9:

Herstellung von Natriumneomycin-N-methansulfonat Das Sulfat der in diesem Versuch verwendeten Neomycinprobe wies eine Wirksamkeit von 640 mcg/mg auf. Durch Papierchromatographie mit wassergesättigtem, 2 % p-toluolsulfonsaurem Butanol wurde festgestellt, dass die Probe hauptsächlich Neomycin B und eine kleine Menge von Neomycin C enthält.

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Eine Mischung von 4.3 g (0.007 Mol) Neomycin, 6.4 g (0.048 Mol) Natriumhydroxymethansulfonat wurde in 6 cc Wasser gelöst, auf einem Wasserbad unter Rühren 2 Stunden lang erhitzt und auf Zimmertemperatur gekühlt. Der Lösung wurden 60 cc Methanol zugegeben, worauf sich sofort ein viskoses Produkt niederschlug, das sich beim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute 8.5 g· Eine Probe von Ϊ.0 g des Pulvers wurde in 25 cc Wasser gelöst und durch Zugeben von Methanol fraktioniert ausgefällt. Die in der folgenden Tabelle aufgeführten Hauptfraktionen, F₂ und F^,, sind farblose,

kristalline Pulver; F₃

¹² =

= +28.5 (O = 2, Wasser).

Zugegebenes Methanol (cc)	Fraktionen	Gewicht der Fraktionen (g)
48	F₁	1.6
14	F₂	2.3
18	^P3	1.3
12	^P4	O.34
28	F₅	0.3
40	F	0.1

Die Ergebnisse der Elementaranalyse der Fraktionen zeigten, dass das gewonnene Hauptprodukt Hexa-N-methansulfonat des Neomycins war.

Anal. F₂: Festgestellt: C,24.3; H,4.1; N,5.7; S,13-7;

Na, 10.7 % Festgestellt: 0,25.7; H,3.9; N,5.9; S,13.9;

" Na, 10.5 %

Berechnet für C₂₃H₁₁₀O₁₃N₆(CH₂SO₃Na)₆: C,26.6; H,4.0; N,6.4; S,l4.7; Na, 10.5 %.

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Hydrolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure:

Eine Probe von 0.2 g des oben erwähnten Neomycinderivats wurde in 3 cc 2N Chlorwasserstoffsäure und 5 cc Wasser gelöst. Die lösung wurde auf einem Wasserbad fünfzehn Minuten lang erhitzt, auf Zimmertemperatur gekühlt und mit 1N Natriumhydroxyd neutralisiert. Der neutralisierten Lösung wurde eine Mischung von 270 mg Dimedon, 1 cc Wasser und 2 cc Methanol zugegeben, um farblose Formaldehydmethonnadeln zu erhalten; Ausbeute 186 mg, Schmelzpunkt 184-188⁰C. Durch Umkristallisieren wurde der Schmelzpunkt auf 19O⁰C erhöht. Die Misohschmelzpunktbestimmung mit einer authentischen Probe von Formaldehydmethon (Schmelzpunkt 190 C) ergab keine Senkung. Das Ergebnis zeigte, dass das Derivat das N-Methansulfonat des Neomycins ist.

Infrarotes Absorptionsspektrum:

Die Maximalabsorption des Neomyoinderivats lag bei 1170 - 1210 cm ~ (SOZ) und die Absorptionslosigkeit bei nahe 1590 cm" (M₂), wodurch erwiesen ist, dass das Derivat N-Methansulfonat des Neomycins ist.

3?oxizität und antibakterielle Aktivitäten:

Das NatrJbiinuieomycin-N-methansulfanat wies viel weniger

Toxizität als Neomycin selbst und starke antibakterielle Aktivitäten auf, wie aus labelle 3 ersichtlich. Die !Doxizität des Derivats bei Mäusen durch intravenöse Injektion betrug ungefähr ein achtzigste! der des Neomycins selbst.

Tabelle 3 ·

Toxizität und antibakterielle Aktivitäten* von Natriumneomyoin. -N-methansulf onat im Vergleich mit Neomycin sulfat

Versuchsorganismen	Minimale inhibitorisehe Konzentration mcg/oo	Neomyoinsülfat	*
M. pyοgenes var. aureus 209-P B. anthraeis B. subtilis E. ooli E. coli streptomycin- fast K. pneumoniae Pr. vulgaris OX-19 Ps. aeruginosa Sh. flexneri Sh. dysenteriae Sh. sonnei S. paratyphi A S. paratyphi B S. enteritidis S. typhoaa M. phlei ' M. tuberculosis M. 607 M. 607 streptomycin- fast	Hat rätmne omy cin- N-methansuifonat	1.56 1.56 1 .56 3.13 3.13 3.13 3.13 ^200 3.13 3.13 3.13 3.13 3.13 3.13 5.13 1.56 2.5 1.56 1.56
Toxissit&t bei Mäusen • duroh intravenöse Injektion ^M50	3.13 1.56 • 1.56 25.0 25.0 12.5 25.0 >200 50 50 50 1.2.5 50 12.5 12.5 3.13 5.0 3.13 3.13	50 mg/kg
> 3500 mg/kg

Nach Agarverdünnungsverfahren

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Ferner wurde bestätigt, dass das Neomyoinderivat gegen die Infektion von Mäusen mit M. pyogenes und S. typhosa wirksam ist. .

Beispiel· 10t

Herstellung von Natriumneomyoin-N-methansulfonat

Eine Mischung von 6.4 g Neomyoinsulfat und 9.0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde mehrere Stunden iang verrührt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um Bariumsulfat auszu fällen, das durch Filtration entfernt wurde. Das" Mit rat, eine Lösung von Neoinycinkarbonat, wurde bei ungefähr 45°C unter Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 cc konzentriert und 6.4 g Natriumhydroxymethansulfonat wurden zugegeben. Die sich ergebende Mischung wurde auf einem. Wasserbad 2 Stunden lang erhitzt, wobei inzwischen die Entwicklung von Kohlendioxyd beobachtet wurde. Aus der resultierenden Lösung wurde durch Zugeben von Methanol in "der gleichen Weise, wie im Beispiel 8 beschrieben, Watrium-N-methansulfonat isoliert.

Anal. I₂: Pestgestelltί 0,24.25; H,3.93; N,5.67; S,15,58;

Fa,10.70 ic *~: lestgestellt: 0,24.82; H,4.09; N,5w71j.S,14.84;

Ua, 10.20 io.

Berechnet für 0 H₅₄O (NH.CH .SO Na)₆: 0,26,56;·

H,3.97; N,6.41; S,14.66; Na, 10.53

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Es wurde festgestellt, dass das infrarote A'bsorptionsspektrum des Produkts F, dem des im Beispiel 9 Tdeschriebenen. Produkts vollständig lila er lagert werden kann. Beispiel 11.: -.

Herstellung von Hatriumneomycin^U^methanaulfonat

Eine Mischung von 6.5 g Neomycinsulfat und 9.0 g kohlensaurem Barium in Wasser wurde ,2 Stunden lang verrührt und "bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um Bariumsulfat auszufällen, das durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat, eine Losung von ÜTeomycinkarbonat, wurde "bei ungefähr 45⁰C unter Vakuum auf ein Yolumen von ungefähr 10 cc konzentriert und eine gut verrührte lösung von 4.1 g Formalin (35 Υ°) und 5g Natriumbisulf it hinzugegeben. Die lösung wurde auf einem Wasserbad 2 Stunden lang erhitzt. Der in Eiswasser gekühlten lösung wurden ungefähr 100 cc Methanol zugesetzt, um ein viskoses Produkt auszufällen, das sich heim Zerreiben mit einem Glasstab in ein kristallines Pulver verwandelte; Ausbeute 8.2 g. Fraktioniertes Ausfällen aus einer wässerigen Lösung dee Produkts durch Zugeben von Methanol ergab ein N-MethansuTfaiatderivat, das mit dem im Beispiel 9 im Zusammenhang mit der Bestimmung des infraroten Absorptionsspektrum beschriebenem Produkt als identisch angesehen wird.

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Claims

Pat e η t a η s ρ r ti c h e

1 . Ueue, weniger toxische Derivate "basischer, wasserlöslicher Antibiotica. ·
2. Neue, weniger toxische Derivate des Kanamycins.
3. Neue, weniger toxische Derivate des neomycins.
4. Heue, weniger toxische K^--MethansuIfonate von basischen, wasserlöslichen Antibiotica.
5. Neue, weniger toxische N-Methansulfonate des Kanamycins.
6. Neue, weniger toxische N-Methansulfonate des Neomycins.
7. Tetra-Natriumkanamycin-tetra-N-methansulfonat.
8. Di-Natrlmkanamycin-di-lT-methansulfonat.
9.. Kanamycin-di-H-methansulfonsäure.
10. .Tri-Katriumkanamycin-tetra-IT-methansulfonat.
11. Natriumneomycin-H-methansulfonat» .
12. Verfahren zur Herstellung von weniger toxischer JST~ Methansulfonaten von basischen, wasserlöslichen Antibiotic», dadurch gekennzeichnet, dass ein freie Aminogruppen enthaltendes,

;basischen, wasserlösliches Antibioticum mit Hydroxymethansulfonat zur Reaktion gebracht wird.
13. Verfahren zur Herstellung von if-Methansulfonaten von basischen, wasserlöslichen Antibiotica, dadurch gekennzeichnet, dass ein freie Aminogruppen enthaltendes, basisches, wasserlösliches Antibioticum mit !formaldehyd und Bisulfit zur Reaktion gebracht wird.

Unterlagen (Art. ?§ Τ 'Abs.* Nr. 1 Satz 3 des" Äncferungsges. v. 4 ?.

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14. Verfahren zur Herstellung von N-Methansulfonaten von basischen, wasserlöslichen Antibiotica, dadurch gekennzeichnet, dass ein freie Aminogruppen enthaltendes,' basisches, wasserlösliches Antibioticum zunächst mit Schwefeldioxyd und dann mit Paraformaldehyd (oder IOrmalin) zur Reaktion gebracht wird.
15. Verfahren zur Herstellung von N-Methansulfonaten von basischen, Wasserlöslichen Antibioticä, dadurch gekennzeichnet, dass ein freie Aminogruppen enthaltendes, basisches, wasserlösliches Antibioticum zunächst mit Schwefeldioxyd und Paraformaldehyd (oder Formalin) und dann mit Hydroxymethanaulfonat zur Reaktion gebracht wird.
16. Verfahren zur Herstellung von H-Methansulfonaten von basischen, wasserlöslichen Antibiotica naoh Patentansprüchen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass anstelle einer freien Lauge des wasserlöslichen Antibioticum dessen Salz mit einer schwachen Säure, beispielsweise Karbonat, verwendet wird. ^

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