DE2717817C2

DE2717817C2 - Analytisches Element

Info

Publication number: DE2717817C2
Application number: DE2717817A
Authority: DE
Inventors: Charles A. Brockport N.Y. Goffe; Royden Nelson Pittsford N.Y. Rand; Tai Wing Rochester N.Y. Wu
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1976-04-26
Filing date: 1977-04-21
Publication date: 1986-06-05
Also published as: FR2366567B1; SE425332B; US4050898A; GB1582153A; FR2366567A1; CH619782A5; DE2717817A1; CA1069419A; SE7704710L; JPS52131786A

Description

_]5 - _v 0(C₂₂O)_nH

worin bedeuten:

R einer· ^Ikylrest mit 1 bis 9 C-Atomen und
π eine Zahl von 1 bis 70.

3. Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung der angegebenen Formel enthält, die 9 bis 40 Ethoxyeinheiten aufweist.

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element für die quantitative Bestimmung eines in einer proteinhaltigen wäßrigen Flüssigkeit gelösten Analyten mit einer Reagenzschicht und einer über dieser angeordneten isotropporösen Ausbreitschicht aus einem nichtfaserigen wasserresistenten »Blush-Polymeren« oder einem mikrokristallinen kolloidalen natürlichen oder synthetischen Polymeren und gegebenenfalls einem Pigment, sowie gegebenenfalls einem strahliKigsdurciilässigen Schichtträger, auf dem die Ausbreitschicht mit einem Gehalt an einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung und die Reagenzschicht aufgetragen sind.

Es ist allgemein bekannt, für lie quantitative Bestimmung eines in einer wäßrigen Flüssigkeit gelösten Analyten analytische Elemente mit einer Reagenzschicht und einer über dieser angeordneten Ausbreitschicht für die gleichförmige Verteilung der auf das Element aufgebrachten Flüssigkeitsprobe zu verwenden.

So sind z. B. aus der BE-PS 8 01 742 und der inhaltsgleichen DE-OS 23 32 760 analytische Elemente für die quantitative spektrophotometrische Analyse einer Flüssigkeit bekannt, die aufweisen:

1. einen für Flüssigkeiten impermeablen, lichtdurchlässigen Schichtträger, der auf einer seiner beiden Seiten mindestens eine Reagenzschicht mit einem Reagenz aufweist, das durch Reaktion mit einem Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit eine Farbveränderung innerhalb der Reagenzschicht bewirkt, und

2. eine poröse Schicht oder einen porösen Schichtverband, die bzw. der (a) auf der dem Schichtträger abgewandten Seite der Reagenzschicht angeordnet sind, (b) für den die farbbildende Reaktion mit dem Reagenz eingehenden Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit durchlässig sind und (c) die aufgebrachte Flüssigkeit derart lateral ausbreitet, daß ein konstantes Volumen Flüssigkeit pro Flächeneinheit aufgenommen wird und auf die Reagenzschicht gelangt.

Ein weiteres mehrschichtiges analytisches Element fü/ die Analyse von Flüssigkeiten, bestehend aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger und mehreren hierauf aufgetragenen Schichten, von denen mindestens eine eine Reagenzschicht ist und eine weitere Schicht eine Verteilerschicht, ist aus der DE-OS 25 32 918 bekannt.

Aus der DE-OS 25 12 586 ist weiterhin ein speziell für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehalts von Flüssigkeiten ausgebildetes analytisches Element mit

(1} einem für Flüssigkeiten impermeablen, für Strahlungsenergie durchlässigen Schichtträger,

(2) einer Reagenzschicht auf einer Seite des Schichtträgers mit einer in einem Bindemittel dispergierten Substanz mit Cholesterin-Oxidase-Aktivität und

(3) mindestens einer über der Reagenzschicht angeordneten Schicht aus einem porösen, für das Cholesterin der Flüssigkeit durchlässigen Medium, das die Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch konstantes Volumen der Flüssigkeil auf eine Flächeneinheit der Reagenzsehieht auftrifft, bekannt, bei dem die Reagenzschicht oder eine über der Reagenzsehieht angeordnete Schicht aus einem porösen, für das Cholesterin durchlässigen Medium eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und eine Protease enthält.

Es ist ferner bekannt, zur Herstellung mehrschichtiger analytischer Elemente des beschriebenen Typs oberfliichenaktive Verbindungen einzusetzen. Aus der Literaturstelle Research Disclosure, Oktober 1974, S. 54 ist es

z. B. bekannt, bei der Herstellung der analytischen Elemente oberflächenaktive Verbindungen als Beschichtungshilfsmittel zu verwenden. Nach den Angaben der BE-PS 8 01 742 und DE-OS 23 32 760 z. B. können der Ausbreitschicht eines analytischen Elements aber auch sehr geringe bzw. geringe Mengen einer oberflächcnakli-

ven Verbindung zugesetzt werden, um den Ausbreitprozeß der dem Element zugeführten zu analysierenden Flüssigkeit zu beschleunigen. Die in einem Beispiel der BE-PS 8 01 742 und in einem Beispiel der DE-OS 23 32 760 angegebenen Menge an oberflächenaktiver Verbindung errechnet sich zu 0,0049 Gew.-%. Auch nach den Angaben der DE-OS 25 12 586 kann es vorteilhaft sein, eine vergleichsweise sehr geringe Menge an einer oberflächenaktiven Verbindung in die Ausbreitschicht einzuarbeiten.

Aus der DE-OS 25 12 586 und der Literaturstelle Research Disclosure Oktober 74, S. 54 ist es auch bekannt, im Falle mehrschichtiger analytischer Elemente für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehalts von Flüssigkeiten der Reagenzschicht 0,5 bis 5 g/m² einer oberflächenaktiven Verbindung zuzusetzen, um die Oxidation von freiem Cholesterin durch das Oxidase-Enzym zu gewährleisten. Bei den aus der DE-OS 25 12 586 bekannten Elementen kann schließlich auch die Ausbreitschicht eine vergleichsweise hohe Konzentration an oberflächen- ίο aktiver Verbindung enthalten, um in der zu analysierenden Flüssigkeit vorhandene Cholesterinester-Lipoproteinkomplexe aufzuspalten. Die Tatsache, daß Cholesterin in Wasser unlöslich ist, im Serum mit Lipoproteinen Komplexe bildet und diese Komplexe durch Verwendung von oberflächenaktiven Verbindungen aufgespalten werden können, ergibt sich z. B. aus der DE-OS 27 17 817.

Bei der Verwendung von analytischen Elementen des aus der BE-PS 8 01 742 und der DE-OS 23 32 760 bekannten Typs zur Bestimmung von wasserlöslichen Analyten in Proteine enthaltenen Flüssigkeiten hat sich nun jedoch gezeigt, daß die Analyseergebnisse stark von der Proteinkonzentration beeinflußt werden können und daß oftmals Analysenergebnisse erhalten werden, die nicht den tatsächlichen Konzentrationen der vorhandenen, zu bestimmenden Analyten entsprechen. Es wird angenommen, daß eine erhöhte Proteinkonzentration in der zu untersuchenden Flüssigkeit zu einer Behinderung der Transportgeschwindigkeit und der T^nsportweite der Flüssigkeit und des Analyten innerhalb der Ausbreitschicht und der Geschwindigkeit eines solchen Transportes durch die Ausbreitschicht führen kann.

Aufgabe der Erfindung war es, einen Weg aufzufinden, der es ermöglicht, mit einem analytischen Element des aus der BE-PS 8 Ot 742 und DE-OS 23 32 760 bekannten Typs in wäßrigen, Proteine enthaltenden Flüssigkeiten gelöste Analyte sicher zu bestimmen, ohne daß Störungen durch die Proteine erfolgen.

Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, daß man in die Ausbreitschicht der analytischen Elemente 1 bis 15 Gew.-°/o einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung einarbeitet.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein analytisches Element, wie es in den Ansprüchen gekennzeichnet ist Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß durch Einarbeiten einer vergleichsweise hohen Konzentration an nicht-ionogener oberflächenaktiver Substanz in die Ausbreitschicht durch Proteine verursachte Störungen eliminiert werden können und daß ein schneller und vollständiger Transport des zu bestimmenden wasserlöslichen Analyten von der Ausbreitschicht in die Reagenzschicht erfolgt.

Ein analytisches Element nach der Erfindung eignet sich in besonders vorteilhafter Weise für die Analyse von Proteine enthaltenden wäßrigen biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Blutserum und Urin.

Ein erfindungsgemäßes Element weist mit der Reagenz- und der Ausbreitschicht mindestens zwei übereinander angeordnete Schichten auf, welche eine quantitative, meßbare Veränderung als Folge des Vorhandenseins eines Analyten, gelöst in einer Protein enthaltenden Flüssigkeit, die auf das Element aufgebracht wurde, liefern. Die zu analysierende Flüssigkeit kann dabei auf die Gesamtoberfläche des Elementes aufgebracht werden od?r lokal, z. B. in Form eines Kontakttüpfels oder eines freien Tropfens.

Die Ausbreitschicht und die Reagenzschicht befinden sich unter den Bedingungen ihrer Verwendung in Slrömungskontakt miteinander.

Die in der Ausbreitschicht enthaltene oberflächenaktive Verbindung bewirkt offensichtlich eine Normalisierung des Transportes der aufgebrachten Proteine enthaltenden Flüssigkeitsprobe und ihrer gelösten Komponenten innerhalb der Ausbreitschicht. Unter »Normalisierung« ist dabei zu verstehen, daß die Ausbreitschicht vom wäßrigen Lösiingsmittelmedium und den gelösien Komponenten von verschiedenen angewandten Proben gleichmäßig durchdrungen wird, ungeachtet eines verschiedenen Proteingehaltes verschiedener Proben. Leicht zu bestimmende Indices für ein derartiges Verhalten sind die Geschwindigkeit, mit welcher analytische Ergebnisse produziert werden, und der maximale Durchmesser des farbigen Tüpfels oder Fleckens oder anderer analytischer Ergebnisse, die in den Elementen erzeugt werden. In vorteilhafter Weise führt eine Normalisierung der Ausbreitung zu praktisch äquivalenten Geschwindigkeiten, mit denen Testergebnisse erzielt werden, sowie zu Tüpfel-Durchmessern, die um nicht mehr als etwa 10% innerhalb des angezogenen Bereiches einer Proben-Proteinkonzentration voneinander abweichen. Eine Tüpfel-Größenveränderung von weniger als etwa ± 5% hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen.

Im Falle von menschlichem Serum beispielsweise liegt die Proteinkonzentration normalerweise bei etwa 6 bis 8 Gew.-%. Die Konzentration an Proteinen kann jedoch beispielsweise auch b;s zu 12 Gew.-% im Falle eines Serums betragen, das einem stark dehydratisierten Körper entnommen wurde.

Die Schichten eines erfindungsgemäßen Elementes können auf einem Schichtträger angeordnet sein, der strahlungsdurchlässig ist. Unter »strahlungsdurchlässig« sind Schichtträger und andere Schichten eines analytischen Elementes zu verstehen, die einen wirksamen Durchtritt elektromagnetischer Strahlung ermöglichen, die benutzt wird, um ein analytisches, im Element produziertes Ergebnis zu bestimmen. Vorteilhafte, strahlungsdurchlässige Schichtträger sind beispielsweise solche, die elektromagnetische Strahlung einer oder mehrerer Wellenlängen eines Bereiches von 200 nm bis 900 nm durchlassen und/oder meßbare Strahlung, Jie durch Radioaktivität erzeugt wird.

Weist ein erfindungsgemäßes Element einen Schichtträger auf, so befindet sich die Reagenzschicht zwischen .Schichtträger und Ausbreitschicht.

Die Aiisbreitschich'en erfindungsgemäßer Elemente verteilen das Lösungsmittel einer aufgebrachten wäßrigen Fliissigkeitsprobe ui<d die Komponenten, die sich in der Probe befinden, einschließlich einer oder mehrerer gelöster Komponenten. Dabei wird zu jedem gegebenen Zeitpunkt eine gleichförmige Konzentration von einer

oder mehrerer ausgebreiteten Komponenten auf der Oberfläche der Ausbreitschicht, die der Reagenzschicht gegenüberliegt, erzeugt. Unter einer »Komponente« einer Flüssigkeitsprobe ist hier ein Bestandteil der Flüssigkeitsprobe zu verstehen, und zwar entweder im freien Zustand oder in Form eines chemischen Restes, der Teil einer komplexeren Komponente sein kann. Zu bemerken ist dabei, daß derartige Komponenten oder Bestundteile in der Flüssigkeit nach ihrer Aufbringung auf das Element erzeugt werden können, beispielsweise durch Ablauf chemischer Reaktionen. Die Komponente oder der Bestandteil kann somit beispielsweise ein Analyt sein oder eine Vorläuferverbindung eines Analyten oder ein Reaktionsprodukt eines Analyten. Reaktionsprodukic von Komponenten, z. B. Analyten können beispielsweise chemische Verbindungen sein, die Zerfallsprodukte oder andere Reaktionsprodukte einer Komponente darstellen wie auch andere Produkte, die sich von einer Komponente ableiten, z. B. Reaktionsprodukte, die erzeugt wurden, als Folge der enzymatischen Aktivität eines Analyten oder einer anderen Komponente.

Bei der Ausbreitschicht handelt es sich um eine isotrop-poröse nicht-faserige Schicht, d. h. eine Schicht, die nach praktisch allen Richtungen hin porös ist. Der Grad der Porosität kann dabei verschieden sein, beispielsweise aufgrund einer verschiedenen Porengröße oder eines unterschiedlichen Hohlraumgehaltes.

Die Reagenzschicht enthält mindestens einen Stoff oder eine Verbindung, die in Gegenwart einer Analyt-positiven Flüssigkeit, die auf das Element aufgebracht ist, reaktiv ist. Dieser Stoff oder diese Verbindung kann beispielsweise mit einem Analyten oder einer Vorläuferverbindung hiervon oder einem Reaktionsprodukt eines Anaiyicii Zu einer Veränderung ΐΐΠ Element fuhren.

Die Reagenzschicht ist für mindestens eine Probenkomponente permeabel, die innerhalb der Ausbreitschicht ausbreitbar ist, oder für ein Reaktionsprodukt einer solchen Komponente. Vorzugsweise weist sie eine gleichförmige oder praktisch gleichförmige Permeabilität für Substanzen auf, die innerhalb der Ausbreitschicht ausbreitbar sind.

Unter einer gleichförmigen Permeabilität einer Schicht ist eine Permeabilität zu verstehen, die derart ist. daß,

wird eine homogene Flüssigkeit gleichförmig auf die Oberfläche einer Schicht aufgetragen, identische Messungen der Konzentrationen einer solchen Flüssigkeit innerhalb der Schicht, jedoch in verschiedenen Bereichen einer Oberfläche der Schicht durchgeführt, zu praktisch gleichen Ergebnissen führen, z. B. Abweichungen von weniger als ± 10 und vorzugsweise weniger als ± 3,5%, wenn . idiometrische Messungen durch eine kleine

Öffnung von beispielsweise etwa 3 bis 10 Mikron Breite und 50 bis 100 Mikron Länge durchgeführt werden.

Erfolgen die Bestimmungen durch kontinuierliches Abtasten einer Probe mittels eines Energiestrahles und

Übertragung auf einen Schreiber, so hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wem: die Umlauf-Geschwindigkeit des Schreibers derart eingestellt wird, daß eine etwa 16fache Vergrößerung der aufgezeichneter* Spur erfolgt.

Die Zeichnungen dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.

In den Fig. 1, 2 und 3 sind integrale analytische Elemente nach der Erfindung schematisch, im Schnitt, vergrößert dargestellt. Die F i g. 4, 5, 6 und 7 stellen Diagramme dar, die analytische Ergebnisse veranschaulidien, die unter Verwendung eines Elementes, das in den später folgenden Beispielen noch näher beschrieben wird, erhalten werden. Die in Fig.4 dargestellten Ergebnisse sind die Ergebnisse eines Vergleichsversuchs, während die in den Fig. 5. 6 und 7 dargestellten Ergebnisse unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Elementes erhalten wurden.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer analytischer Elemente können die verschiedensten üblichen bekannten nicht ionogenen oberflächenaktiven Verbindungen verwendet werden. Beispiele hiervon sind in dem Buch »McCutcheon's Detergents and Emulsifiers«, 1974, nordamerikanische Ausgabe, Verlag Allured Publishing Corporation, aufgeführt.

Besonders vorteilhafte nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen zur Herstellung erfindungsgenäßer Elemente sind Alkarylpolyäther, z. B. Alkylphenoxypolyethoxyethanole. insbesondere solche der folgenden Formel I:

-0-(CH₂-CH₂-O)^H (I)

so worin bedeuter-.:

R einen Alkylrest. insbesondere mit 1 bis 9 C-Atomen und
η eine Zahl von 1 bis 70.

Beispiele geeigneter oberflächenaktiver Verbindungen dieses Typs sind die Octyl- und Nonyl-Phenoxypolyethoxyethanole der Formel I. in der R einen Oxyl- bzw. Nonylrest darstellt.

Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von oberflächenaktiven Verbindungen der angegebenen Formel erwiesen, in der R für einen Octylrest steht und π eine Zahl von 9 bis 40, vorzugsweise etwa 40 darstellt.

Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von in Wasser löslichen oberflächenaktiven Verbindungen erwiesen, doch können auch organo-lösliche Verbindungen in vorteilhafter Weise verwendet werden, und zwar insbesondere dann, wenn eine Lösung der oberflächenaktiven Verbindung in die Masse eingeführt werden kann, aus der die Ausbreitschicht hergestellt wird oder wenn die Lösung in die Schicht eingeführt werden kann.

Die oberflächenaktiven Verbindungen werden in der Ausbreitschicht in Konzentrationen von 1 bis 15 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtmenge an Feststoffen in der betreffenden Schicht angewandt- Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die oberflächenaktiven Verbindungen in der Ausbreitschicht in einer Konzentration von 1 bis 10Gew.-°/o, insbesondere 1 bis 6 Gew.-% vorliegen. Bei der Berechnung der Konzentration der oberflächenaktiven Verbindung sind bei Verwendung handelsüblicher Produkte nicht-aktive Bestandteile der Produkte zu berücksichtigen. Ausgedrückt in Konzentrationen pro Schichtträgerfläche lassen

sich besonders vorteilhafte Ergebnisse dann erhalten, wenn pro m² Schiehtträgcrflache etwa 1,0 bis etwa 6,0 g oberflächenaktive Verbindung vorliegen.

Die Art und Weise, in welcher die oberflächenaktive Verbindung die Ausbreitung normalisiert, ist noch nicht vollständig geklärt. Es wird jedoch angenommen, daß eine wirksame Menge der oberflächenaktiven Verbindung zu einer Verminderung des Hydratwassers der Proteine innerhalb einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe führt, s derart, daß eine vergleichsweise größere Menge des Wassers der Probe und des gelösten Analyten rasch in sowohl die Ausbreitschicht als auch die Rcagenzschicht einzudringen vermag. Die rasche Eindringgeschwindigkeit v'.jschleunigt dabei den Ablauf der Anzeigereaktionen und fördert die Bildung von mit der Probe benetzten Bezirken äquivalenter Größe innerhalb des Elementes.

Die Reagenzschichten der erfindungsgemäßen Elemente sind für Substanzen, die in der Ausbreitschicht ausgebreitet werden oder für Reaktionsprodukte hiervon permeabel.

Der Ausdruck »permeabel« und der Ausdruck »Permeabilität« beziehen sich dabei auf eine Permeabilität aufgrund einer vorhandenen Porosität, der Fähigkeit zu quellen oder anderer Charakteristika. Die Reagenzschichten können eine Matrix aufweisen, in der ein reaktionsfähiger Stoff verteilt ist, d. h. gelöst oder dispergiert ist. Eine Beschreibung von Reagenzschichten, die auch im Falle erfindungsgemäßer Elemente vorliegen können, findet sich beispielsweise in der US-PS 39 92 158.

Die Wahl einer Reagenzschicht-Matrix kann im Einzelfall teilweise von ihren optischen oder anderen Eigenschaften abhängen, die radiometrische Messungen beeinflussen könnten. Die Reagenzschicht soll auf jeden Fall die ins Äuge gefaßte Methode zur Bestimmung des Ergebnisses nicht stören, im Einzelfall kann es erforderlich sein. Materialien für den Aufbau der Reagenzschicht auszuwählen, die verträglich sind mit benachbarten Schichten, z. B. bei der Herstellung des Elementes durch Beschichtung bei der Herstellung des Materials.

In manchen Fällen kann es zur Erleichterung der Konzentrationsgleichförmigkeit innerhalb der Ausbreitschicht vorteilhaft sein, eine Reagenzschicht zu verwenden, die eine geringere Permeabilität aufweist als die Ausbreitschicht. Die relative Permeabilität einer Schicht läßt sich dabei nach bekannten Methoden ermitteln.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung reagiert der reaktionsfähige Stoff in der Reagenzschicht mit dem Analyten, demgegenüber das Element anspricht. In anderen Fällen kann der reaktionsfähige oder aktive Stoff mit einer Vorläuferverbindung oder einem Reaktionsprodukt eines Analyten reagieren. Unter einem »reaktionsfähigen« oder »aktiven« Stoff ist ein Stoff oder eine Verbindung zu verstehen, der bzw. die eine chemische Reaktionsfähigkeit aufweist, z. B. eine Reaktionsfähigkeit für eine Additionsreaktion, eine Protonisierung oder eine Zerfallsreaktion und dergleichen oder eine Aktivität wie im Falle der Bildung eines Enzym-SubstnuKomplexes oder eine Aktivität wie sie erzeugt wird als Ergebnis einer enzymatischen Aktion, wie auch jede andere Form oder Zusammensetzung von chemischen oder physikalischen Reaktionen, die dazu geeignet sind, innerhalb des Elementes, z. B. der Reagenzschicht die Bildung einer radiometrisch erkennbaren Veränderung zu erzeugen oder zu begünstigen, d.h. eine Veränderung, die durch geeignete Messung mit Licht oder anderer elektromagnetischer Strahlung feststellbar ist.

Bei der Herstellung einer isotrop-porösen Ausbreitschicht hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn diese Schicht ein Hohlraurrivolumcn von mindestens etwa 25% des gesamten Schiciitvolurnens aufweist, in vürieiinafter Weise kann die Schicht ein Hohlraumvolumen von 25 bis 95%. beispielsweise von 50 bis 95% aufweisen. Veränderungen im Hohlraumvolumen poröser Ausbreitschichten können in vorteilhafter Weise dazu benutzt werden, um Element-Charakteristika zu modifizieren, beispielsweise die Gesamt-Permeabilität der Ausbreitschicht oder die Zeit, die benötigt wird, um eine Probe auszubreiten. Das Hohlraumvolumen einer Schicht läßt sich steuern, beispielsweise durch Auswahl teilchenförmiger Materialien geeigneter Größe oder durch Auswahl der Lösungsmittel oder Trockenbedingungen, wenn Blush-Polymere zur Herstellung der isotrop-porösen Ausbreitschichten verwendet werden. Das Hohlraumvolumen einer Schicht läßt sich mit genügender Genauigkeit nach verschiedenen Methoden ermitteln, z. B. nach der statistischen Methode, die von Chalkley in der Zeitschrift »Journal of the National Cancer Institute«, 4,47 (1943), beschrieben wird oder durch direktes Wiegen und durch Bestimmung des Verhältnisses von tatsächlichem Gewicht der Schicht zum Gewicht an Feststoffen, das dem Volumen der Schicht entspricht. Zu bemerken ist, daß die Porengröße in jedem Fall ausreichend sein soll, um eine Ausbreitung der Probenkomponenten zu ermöglichen, die der Reagenzschicht zugeführt werden sollen.

Bei dem erfindungsgemäßen Element kann es sich um ein selbsttragendes analytisches Element handeln oder um ein Element mit einem Schichtträger. Bei Verwendung einer Schichtträgers kann dieser aus den üblicherweise zur Herstellung von analytischen Elementen des beschriebenen Typs üblicherweise verwendeten Schichtträgermaterialien bestehen.

Gegebenenfalls kann ein erfindungsgemäßes Element mehr als nur eine, d. h. zwei oder mehrere Ausbreitschichten aufweisen, in welchem Falle eine jede Schicht ein verschiedenes Verhalten bezüglich Ausbreitung und Filtereffekt zeigt. Ist des weiteren eine Verzögerung oder Beschränkung beim Transport von Substanzen innerhalb des Elementes zusätzlich zu der Verzögerung oder Behinderung, die durch die Ausbreitschichten bewirkt wird, erforderlich, so kann eine Filter- oder Dialysierschicht im Element untergebracht werden.

Gegebenenfalls kann es des weiteren vorteilhaft sein im Element eine oder mehrere reflektierende Schichten unterzubringen, gegebenenfalls absorptiv gegenüber der zur Bestimmung des analytischen Ergebnisses verwen- ω deten Strahlung, z. B. zur Erleichterung der Bestimmung des analytischen Ergebnisses durch Reflexions-Radiometrie, z. B. Reflexions-Photometrie oder ein ähnliches Bestimmungsverfahren. Eine solche Reflexion läßt sich beispielsweise durch eine Schicht erreichen, die beispielsweise auch als Ausbreitschicht wirkt oder durch Verwendung einer zusätzlichen Schicht, die keine weitere zusätzliche Funktion in der Schicht haben kann. Zur Herstellung derartiger reflektierender Schichten können übliche bekannte Pigmente verwendet werden, z. B. 65 |

Titandioxid, Zinkoxid und Bariumsulfat.

Blush-Polymere können auch zur Herstellung reflektierender Schichten verwendet werden. So können bei- I

spielsweise Pigmente enthaltende Ausbreitschichten für diesen Zweck geeignet sein wie auch aus Blush-Polyme-

ren aufgebaute Schichten, die gleichzeitig die Funktion von Ausbreitschichf en haben.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können aus Blush-Polymeren aufgebaute Schichten zusätzlich ein Pigment enthalten, um die Ausbreitung und/oder Reflexion zu steigern. Die Pigmentmenge, die in einer Schicht gemeinsam mit einem Blush-Polymeren untergebracht werden kann, kann sehr verschieden sein. 5 Vorzugsweise werden etwa 0,2 bis 10 Gew.-Teile Pigment pro Gew.-Teil Blush-Polymer verwendet, insbesondere etwa 2 bis 6 Gew.-Teile Pigment pro Gew.-Teil Blush-Polymer.

Des weiteren kann es vorteilhaft sein, in Schichten eines erfindungsgemäßen Elementes Stoffe oder Verbindungen unterzubringen, die durch chemische Reaktion oder durch andere Weise Verbindungen oder Stoffe inaktiv machen können, welche sich bei der angewandten analytischen Bestimmungsmethode nachteilig auswirlo ken könnten.

Zur Erleichterung einer in einem erfindungsgemäßen Element bewirkten Veränderung, beispielsweise einer

Farbveränderung, einer Veränderung der optischen Dichte oder der Fluoreszenz kann es vorteilhaft sein eine Schicht zu verwenden, welche die Aufgabe hat, Reaktionsprodukte von anderen Stoffen oder Verbindungen, deren relative Anwesenheit oder Abwesenheit das analytische Ergebnis kennzeichnet, aufzunehmen. Eine solche

15 Schicht, die auch als Registrierschicht bezeichnet werden kann, steht in vorteilhafter Weise in Strömungskontakt mit einer Reagenzschicht und kann gegebenenfalls von einer Reagenzschicht durch eine reflektierende und/oder opake Schicht getrennt sein, um die Ermittlung des analytischen Ergebnisses durch verschiedene radiometrische Methoden zu erleichtern. In vorteilhafter Weise sind derartige Registrierschichten strahlungsdurchlässig, in

~ vorteilhafter Weise werden sie unter Verwendung von hydrophilen (Coiioiueii iiergesieiii, wie sie auch zur

] 20 Herstellung der Reagenzschichten benutzt werden. Werden im Element Farbstoffe erzeugt, so kann die Regi-

ί· strierschicht Beizmittel für die Farbstoffe enthalten, wie sie üblicherweise zur Herstellung farbphotographischer

ρ Filme und Papiere verwendet werden.

,Ji Erfindungsgemäße analytische Elemente können zur Durchführung der verschiedensten chemischen Analy-

I; sen verwendet werden, und zwar nicht nur auf dem Gebiete der klinischen Chemie, sondern vielmehr ganz

•| 25 allgemein auf dem Gebiet der chemischen Forschung sowie in Laboratorien, die den Ablauf chemischer Prozcs-

I se überwachen. In besonders vorteilhafter Weise eignen sie sich für die Durchführung klinischer Testverfahren,

'3 und zwar für die Untersuchung von Körperflüssigkeiten, z. B. Blut, Blutserum und Urin, da hierbei oftmals

jj wiederholte Untersuchungen erforderlich sind und die Untersuchungsergebnisse oftmals kurz nach dem die

-f Proben entnommen wurden, vorliegen müssen.

^Vi 30 Im Falle der Analyse von Blut mittels eines analytischen Elementes nach der Erfindung können die Blutkör-

i'i perchen zunächst vom Serum abgetrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, worauf das Serum auf ein

erfindungsgemäßes Element aufgebracht werden kann. Eine derartige Abtrennung der Blutkörperchen ist ■■' jedoch nicht erforderlich, und zwar insbesondere dann nicht, wenn spektrophotometrische Reflexionsmcthoden

ν angewandt werden, um das Reaktionsprodukt im Element zu bestimmen, da Blut auf das Element aufgetragen

P 35 werden kann, in welchem Falle die Blutkörperchen durch eine Filterschicht abgetrennt werden. Die Gegenwart

ι dieser Blutkörperchen im Element stört die spektrometrische Analyse nicht, sofern nach der Reflexionsmethode

5? mit Licht gearbeitet wird, das durch den Schichtträger und eine Registrierschicht gelangt, und von einer

:'v strahlungs-blockierenden Schicht oder einer anderen reflektierenden Schicht reflektiert wird, wobei die Blutkör-

U perchen die anzeigende Strahlung nicht beeinträchtigen. Ein besonders wesentlicher Vorteil eines erfindungsge-

5 40 mäßen integralen analytischen Elementes ist darin zu sehen, daß es für die Analyse vor. sowohl Blutserum als ί · auch Blut verwendet werden kann, ohne daß es dabei erforderlich ist in einer besonderen Verfah.ensstufe ;! Bestandteile des zu untersuchenden Materials zu entfernen.

i; Je nach der im Einzelfalle durchzuführenden Analyse können die verschiedensten Elemente hergestellt

Γ werden. Des weiteren können die Elemente in verschiedener Form vorliegen, beispielsweise in Form von

6 45 Bändern und Streifen einer jeden gewünschten Breite, in Form von Blättern oder in Form von vergleichsweise f kleinen Streifen oder Chips. Des weiteren ist es möglich Elemente derart zu gestalten, daß sie für die Durchfühii rung von nur einem wie auch mehreren Testen eines Typs oder verschiedener Typen geeignet sind. Im letzleren

Fall kann es vorteilhaft sein auf einen gemeinsamen Schichtträger ein oder mehrere Streifen oder Abschnitte ':.: aufzutragen, von denen ein jeder gegebenenfalls eine andere Zusammensetzung hat, unter Bildung eines zusam-

g 50 mengesetzten Elementes, das für die Durchführung einer Mehrzahl oder Vielzahl von Testen geeignet ist.

|i Bei den in der Zeichnung dargestellten Elementen handelt es sich um Beispiele erfindungsgemäßer Elemente.

U Das in Fig. 1 dargestellte analytische Element besteht aus einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger 10,

[;; auf dem aufgetragen sind:

f| eine Reagenzschicht 12, eine reflektierende Schicht 14, die einen geeigneten Hintergrund für die Ermittlung

§t 55 analytischer Ergebnisse liefert, beispeilsweise durch Reflexions-Spektrophotometrie, eine Filterschicht 16 und

■g eine Proben-Ausbreitschicht 18 aus einem Blush-Polymeren.

I Die Bestimmung kann durch den Schichtträger erfolgen, sofern dieser für die zur Bestimmung verwendete

;|j Wellenlänge durchlässig ist. Die Reagenzschicht 12 kann aus einer Lösung oder Dispersion von einem oder

I mehreren Testreagenzien in einem Bindemittel, z. B. Gelatine bestehen, wohingegen die Schichten 14 und 16 aus

I 60 Blush-Polymeren aufgebaut und isotrop-porös sein können und/oder eine Porengröße aufweisen können, die für

Sj die spezielle Funktion, die eine jede Schicht zu erfüllen hat, erforderlich ist. Die Ausbreitschicht 18 und die

^ Reagenzschicht 12 stehen in Strömungskontakt miteinander.

I Das in F i g. 2 dargestellte analytische Element nach der Erfindung besteht aus einem Schichtträger 20 mit

I einer hierauf aufgetragenen Reagenzschicht 22 in Strömungskontakt mit einer Ausbreitschicht 24, die zugfeich

>Ψ 65 die Funktion einer Filterschächt ausüben kann und des v/eiteren einen geeigneten reflektierenden Hintergrund

für reflexions-spektrometrische Bestimmurvgsmethoden durch den Träger 20 hindurch liefern kann. Alternativ kann die Schicht 24 auch derart beschaffen sein, daß sie nicht-reflektierend wirkt, in welchem Falle die Bestimmung des analytischen Ergebnisses nach dem Transmissionsverfahren erfolgen kann. Die Schicht 24 ist eine

isotrop-poröse Blush-Polymerschicht, die auf die Schicht 22 aufgetragen oder auflaminiert worden sein kann.

Das in Fig. 3 dargestellte erfindungsgemäße Element besteht aus einem Schichtträger 30, einer Reagenzschicht 32. einer Dialysierschicht 34, die aus einer semipermeablen Membran gebildet sein kann und einer Ausbreitschicht 36 aus einer isotrop-porösen Biusli-Polymerschicht, welche die Funktion des Ausbreitens und Abfilterns ausüben kann und die des weiteren einen geeigneten Hintergrund für reflexions-spektrophoUimotrisehe Methoden durch den Schichtträger 30 hindurch liefern kann. Die Ausbreitschicht 36 und die Reagenzschicht 32 stehen in Strömungskontakt miteinander.

Die erfindungsgemäßen Elemente können im Rahmen analytischer Verfahren verwendet werden, wie sie beispielsweise näher in der US-PS 39 92 158 beschrieben werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.

Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)

Zunächst wi-rde zu Vergleichszwecken ein analytisches Element aus einem transparenten Polyethylenterephth;ilai-Schichtträger hergestellt. Auf den Schichtträger wurde zunächst eine Reagenzschicht aufgetragen, die nach dem Auftrocknen der Schicht jeweils pro m² Schichtträgerfläche enthielt:

Gelatine 21,5 g/m²

1-Naphtholsulfonsäure, Natriumsalz 1,08 g/m²

4-Aminoantipyrin 0,54 g/m²

Glyzemin 2,15 g/m²

Peroxidase 7000 Einheiten/m²

Glucoseoxidase 6900 Einheiten/m²

oberflächenaktive Verbindung*) 0,39 g/m²

Auf die Reagenzschicht wurde dann eine Ausbreitschicht aufgetragen, die nach dem Auftrocknen folgende Zusammensetzung hatte:

Celluloseacetat (Blush-Polywer) 6,6 g/m²

Titandioxid 46,0 g/m²

Polyurethan-Elastomer (Handelprodukt Estane57l5,

Hersteller B.F. Goodrich Comp. USA) 1,38 g/m²

Auf einen ersten Abschnitt des hergestellten Elementes wurden 10 μΐ einer 400 mg-% Lösung von Glucose in Wasser aufgetüpfelt. Auf einen zweiten Abschnitt des Elementes wurden 10μ1 einer 400 mg-% Lösung von Glucose in einem handelsüblichen Serumsatz**) aufgetüpfelt.

·) Verwendet wurde ein p-Isononylphenoxypolyglycidolether mit lOGlycidoleinheiten.

**) Verwendet wurde ein standardisierter Serumersatz, standardisiert für 14 Bestandteile in für Erwachsene durchschnittlichen Konzentrationen. Das Produkt war im Handel in Form eines lyophilisierien Pulvers. Hersteller General Diagnostics, Division of Warner-Lambert Company, USA. erhältlich. Wurde das Pulver nach den Anweisungen der Herstellerin in deionisiertem Wasser gelöst, so enthielt es 81 mg-% Glucose, 4,1 g-°/o Albumin und 3.0 g-% Gesamt-Globuline.

Die Reflexionsdichte des farbigen Farbstofftüpfels, der in der Reagenzschicht des Elementes erzeugt wurde, wurde 8 Minuten lang überwacht, in welcher Zeit der Elementabschnitt auf einer Temperatur von 37° C gehalten wurde. Die Überwachung erfolgte mittels eines Densitometer bei einer Wellenlänge von 510 nm. Die Ausbreitschicht lieferte einen reflektierenden Hintergrund für die Densitometerbestimmungen. Nach einer Inkubationszeit von 8 Minuten wurden die Durchmesser der farbigen Tüpfel gemessen. Mindestens zwei weitere Sätze von Proben wurden in entsprechender Weise getüpfelt und analysiert, und zwar wurde sowohl wiederum die Rcflcxionsdichte als auch die Tüpfelgröße bestimmt. Es zeigte sich, daß in jedem Falle die Geschwindigkeit der Farbstoffbildung, bestimmt als Dr, im Falle der Elemente größer war, auf die keine Proteine enthaltende wäßrige Glucoselösung aufgetüpfelt wurde. Des weiteren zeigte sich, daß die Farbtüpfeldurchmesser der Elemente, auf die die wäßrige Glucoselösung aufgetüpfelt worden war, um ungefähr 20% größer waren als die Durchmesser der Farbtüpfel, die erzeugt wurden, wenn zum Tüpfeln der standardisierte Serumersatz verwendet wurde.

F i g. 4 ist eine graphische Darstellung der Dichte innerhalb des angegebenen 8 Minuten Zeitraumes, erhalten bei Verwendung einer wäßrigen Glucoselösung und einer standardisierten Serumlösung wie in diesem Beispiel ^5d beschrieben.

Beispiel 2

Es wurden weitere Elemente des in Beispiel 1 beschriebenen Aufbaues hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß die Ausbreitschicht zusätzlich 3,2 g/m² (5,6%) einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung, nämlich Octylphenoxypolyethoxyethanol mit ungefähr 9 bis 10 Ethoxyeinheiten enthielt.

Auf Abschnitte des hergestellten Elementes wurden die in Beispiel 1 beschriebenen Lösungen aufgetüpfelt, worauf die Elemente analysiert wurden. Es zeigte sich, daß der Unterschied in den Tüpfel-Dichten der Elemente, auf die eine wäßrige Glucoselösung aufgetüpfelt wurde, und der Elemente, auf die standardisierte Serumlösung aufgetüpfelt wurde, beträchtlich weniger voneinander abwichen als im Falle der in Beispiel 1 beschriebenen Elemente. Des weiteren zeigte sich, daß die Farbstoff-Tüpfel-Durchmesser zwischen den Tüpfeln, die mit der Glucoselösung erzeugt wurden und den Tüpfeln, die mii der standardisierten Serumlösuns erzeugt wurden, nur

um etwa 8% voneinander abwichen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem Diagramm der F i g. 5 dargestellt

Beispiel 3
5

Es wurden weitere analytische Elemente wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt mit der Ausnahme jedoch.

daß die in Beispiel 2 verwendete oberflächenaktive Verbindung diesmal in einer Konzentration von 6,4 g/m² (103%) in der Ausbreitschicht verwendet wurde. Die in diesem Falle erzeugten Dichten der Tüpfel waren vergleichbar mit den Tüpfel-Dichten, die im Falle des Beispieles 2 erhalten wurden. Die erhaltenen Ergebnisse

ίο sind in dem Diagramm der F i g. 6 graphisch dargestellt

Die Durchmesser der Tüpfel, die mit einer wäßrigen Glucoselösung erzeugt wurden und der Tüpfel, die mit einer standardisierten Serumlösung erzielt wurden, wichen um nur etwa 9% voneinander ab.

Beispiel 4

15

Es wurde ein weiteres analytisches Element wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß diesmal die Ausbreitschicht die oberflächenaktive Verbindung in einer Schichtstärke von 12,88 g/m² (19,0%) enthielt Die im vorliegenden Falle erzielten Tüpfel-Dichten waren einander etwas weniger ähnlich als die Tüpfel-Dichten, die im Falle der Beispiele 2 und 3 erhalten wurden. Die im Falle dieses Beispiels erzielten Ergebnisse sind in dem Diagramm der F i g. 7 graphisch dargestellt Die Farbtüpfel-Durchmesser der durch Auftüpfeln einer wäßrigen Glucoselösung und einer standardisierten Serumlösung erzielten Tüpfel wichen urn etwa 12% voneinander ab. Durch einige Irregularitäten in den Tüpfelkanten wurde diese Bestimmung jedoch etwas erschwert

Beispiele 5 bis 12

Vorteilhafte Ergebnisse wurden des weiteren unter Verwendung von Alkylphenoxypolyethoxyelhanolen mit sowohl längeren als auch kürzeren Poiyethoxykettenlängen im Vergleich zu der in den Beispielen 1 bis 4 verwendeten Verbindung erzielt Dies zeigen die folgenden Versuche. Zunächst wurden weitere Elemente nach folgendem Verfahren hergestellt:

Zu Vergleichszwecken (Beispiel 5) wurde ein transparenter Polyethylenterephthalatschichtträger mit einer Reagenzschicht beschichtet, die nach dem Auftrocknen folgende Zusammensetzung hatte:

Gelatine 21,52 g/m²

Oleyläther von Polyethylenglykol 0,646 g/m²

oberflächenaktive Verbindung gemäß Beispiel 5 038? g/m²

Glucoseoxidase 6886 Einheiten/m²

Peroxidase 6994 Einheiten/m²

Glyzerin 2,152 g/m²

7-Hydroxy-l-naphthol 0,656 g/m²

4-Aminoantipyrin · HCI 0,635 g/m²

S^-Dimethylcyclohexandion-l^ 0,215 g/m²

Auf die Reagenzschicht wurde als Haft- oder Zwischenschicht eine Schicht aus 0323 g/m² Poly-N-isopropylacrylamid aufgetragen.

Auf diese Schicht wurde nunmehr eine Ausbreitschicht aufgetragen, die nach dem Auftrocknen bestand aus:

TiO₂ 55,73 g/m²
Celluloseacetat (Blush-Polymer) 7,8 g/m²

so Polyurethan-Elastomer 2,29 g/m²

Oleyläther des Polyäthylenglykols 0,78 g/m²

Auf einen ersten Abschnitt des hergestellten Elementes wurden 10 μΐ einer 400 mg-% Lösung von Glucose in Wasser aufgetüpfelt. Auf einen zweiten Abschnitt des Elementes wurden 10 μΙ einer 400 mg-% Lösung von Glucose in der in Beispiel 1 beschriebenen standardisierten Serumlösung aufgetüpfelt. Ermittelt wurden Ausbreitzeit Tüpfel-Bereichverhältnis und Tüpfel-Qualität Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Es wurden dann des weiteren sechs weitere Sätze von Elementen (Beispiele 6 bis 12) hergestellt, wobei sich diese Elemente von dem Element des Beispieles 5 lediglich dadurch unterschieden, daß die Ausbreitschichtcn verschiedene nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen enthielten. Bei den verwendeten oberflächenaktiven Verbindungen handelte es sich um Octylphenoxypolyäthoxyäthanole wie in den Beispielen 2 bis 4 beschrieben, mit der im folgenden angegebenen Anzahl von Äthoxyeinheiten:

65

Tabelle 1 Beispiel

Menge, Gew.-%

Polyoxyethylenkettenlänge, π

4,1% (2,87 g/m²) 4,1% (2,87 g/m²) 4,1% (2,87 g/m²) 4,1% (2,87 g/m²) 4,1% (2,87 g/m²) 4,1% (2,87 g/m²) 23% (2,01 g/m²)

7-8

9-10 12-13 30 40

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt. Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß in jedem Falle im Vergleich zu dem Vergleichsversuch, Ausbreitzeit und Tüpfel-Bereichverhältnis verbessert wurden. (Die Ausbreitzeit ist um so besser um so geringer der angegebene Wert ist; das 15 Tüpfel-Bereichsverhältnis ist um so besser, um so näher es dem Werte 1,0 liegt)

Tabelle II Beispiel

Ausbreitzeit wäßrige Lösung

Serum

Tüpfel-Bereichverhaltnis Serum/wäßrige Lösung

Tüpfel-Qualität*) wäßrige Lösung

Serum

5 (Vergleich)	7.2	9,1	0,726
6	33	63	0,795
7	2,6	5,1	0,881
8	2,4	4,6	0301
9	2,1	4,0	0,855
10	2,2	4,4	0,896
11	1,8	3,2	0,910
1?	2,0	34	0,881
*) 0 = nicht sichtbar.
1 = mäßig.
X = guu
3 = sehr gut.



4 = ausgezeichnet

1	2
2	1
1	1
2	1
1	2
2	2
2	3
2·)	3

Beispiel

Das in Beispiel 12 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei jedoch diesmal die oberflächenaktive Verbindung in Konzentrationen von 2,01 g/m² (23 Gew.-%), 2,85 g/m² (4 Gew.-%) und 3,4 g/m² (5 Gew.-%) verwendet wurde und die Glucose in einer Konzentration von 800 mg-%.

Es zeigte sich, daß im Falle des Elementes mit 4 Gew.-% oberflächenaktiver Verbindung die beste Tüpfel-Qualität erzielt wurde. Alle übrigen Ergebnisse stimmten im wesentlichen mit den Ergebnissen überein, die in Tabelle Il für Beispiel 12 angegeben wurden.

Beispiel

Das in Beispiel 12 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme jedoch, daß diesmal ein Ociylphenoxypolyethoxyethanol mit einer Polyoxyethylenkettenlänge, n, von etwa 70 verwendet wurde. Es wurden entsprechende Ergebnisse wie in Beispiel 12 angegeben erhalten.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Analytisches Element für die quantitative Bestimmung eines in einer proteinhaltigen wäßrigen Flüssigkeit gelösten Analyten mit einer Reagenzschicht und einer über dieser angeordneten isotrop-porösen Ausbreitschicht aus einem nicht-faserigen wasserresistenten »Blush-Polymeren« oder einem mikrokristallinen kolloidalen natürlichen oder synthetischen Polymeren und gegebenenfalls einem Pigment, sowie gegebenenfalls einem strahlungsdurchlässigen Schichtträger, auf dem die Ausbreitschicht mit einem Gehalt an einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung und die Reagenzschicht aufgetragen sind, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt der Ausbreitschicht an der nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung 1 bis 15 Gew.-% beträgt

2. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine nicht-ionogene Verbindung der folgenden Formel enthält: