DE112011102717T5

DE112011102717T5 - Verfahren zum Erhalten des Laccase-Enzyms von Arthrographis sp.

Info

Publication number: DE112011102717T5
Application number: DE112011102717T
Authority: DE
Inventors: Chintaman Sonawane Vijay
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2013-08-08
Also published as: BR112013003725B1; WO2012023021A1; CN103270154A; MY173024A; CN103270154B; BR112013003725A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Laccase-Enzym von dem neuen Pilzstamm Arthrographis sp. MTCC5479, das nützlich ist für verschiedene Anwendungen, wie dem Abbau von textilen Farbstoffen im Abfluss oder dem Bleichen von Indigofarbe enthalten in Jeansstoffgewebe und der biologischen Altlastensanierung im Allgemeinen, wie dem Abbau einiger Schadstoffe und Fremdstoffe. Anwendungen für die Laccase gibt es auch in der Bäckerei, Brauerei und der Weinindustrie, der Synthese von Chemikalien, der Herstellung der Elektrode für eine Brennstoffzelle.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Verfahren zum Erhalten des Laccase-Enzyms von Arthrographis sp. MTCC 5479 und Anwendungen davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Laccase (Dihydroxybenzol:Sauerstoff-Oxidoreduktase EC 1.10.3.2) ist eine Polyphenoloxidase und gehört zu einer Gruppe von Enzymen, die als Multi-Kupferoxidasen bekannt sind. Laccasen haben ein Kupferatom vom Typ 1, das eine Absorption bei 600 nm zeigt und dem Enzym eine blaube Farbe verleiht. Neben dem Kupferatom vom Typ 1 haben Laccasen pro Enzymmolekül ein Kupferatom vom Typ 2 und zwei Kupferatome vom Typ 3. Laccasen katalysieren die vier Elektronenreduktionen von molekularem Sauerstoff zu Wasser, begleitet von der Oxidation des Substrates [1].
Das Laccase-Enzym wurde zum ersten Mal im Jahre 1883 dahingehend beschrieben, dass es in dem japanischen Lackbaum Rhus vernicifera vorkommt. Später wurde festgestellt, dass das Enzym in Pilzen vorkommt, die als Weißfäuleerreger bekannt sind und zu der Klasse der Basidiomyzeten gehören. Diese umfassen die Gattungen Agaricus, Cyathus, Lentinus, Phlebia, Partus, Pleurotus und Trametes. Ein neuer Pilz, der zur Klasse der Ascomyceten wie Curvularia, Gaeumannomyces, Mauginella, und Melanocarpus gehört, produziert ebenfalls Laccase [2].
Laccase ist ein wirtschaftlich wichtiges Enzym, da es in der Lage ist, eine Vielzahl von xenobiotischen Verbindungen zu oxidieren. Die Laccase übt eine breite Substratspezifität aus und kann die Oxidation von Polyphenolen, Methoxy-substituierten Phenolen, Aminophenol und deren Derivate katalysieren [3]. Die Laccase katalysiert verschiedene Oxidationsreaktionen, die nützlich sind in der Papier- und Zellstoffindustrie [4], der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie [5], der biologischen Altlastensanierung [6], für Biosensoren [7, 8] und biologische Brennstoffzellen [9]. Die wirtschaftliche Verfügbarkeit von gereinigter Laccase ist ein wichtiger Faktor für die Verwendung von Laccase in der Industrie [5]. Die Weißfäuleerreger, die zu der Klasse der Basidiomyceten gehören, stellen die wichtigste Quelle für das Laccase-Enzym dar. Allerdings ist der extrazelluläre Spiegel des Laccase-Enzyms, das von diesen Pilzen produziert wird, niedrig [10]. Das Klonieren und Exprimieren der Laccase von Basidiomyceten in einem rekombinanten Wirt ist besetzt von Problemen, wie beispielsweise der unterschiedlichen Codonverwendung, fehlenden Chaperonen und post-translationalen Modifikationen [11]. Die spezifische Aktivität des Laccase-Enzyms hängt von dem Redoxpotential des Laccase-Enzyms ab. Laccase, die in einem rekombinanten Wirt produziert wird, tendiert dazu, ein niedrigeres Redoxpotential als ihre Gegenspieler zu haben, die in dem Wildtyp hergestellt wurden [12]. Deshalb ist es wichtig, die mikrobielle Diversität auf neue Laccase-produzierende Stämme zu erkunden, die einen höheren Laccase-Ertrag und ein Laccase-Enzym mit höher spezifischer Aktivität und einem höheren Redoxpotential aufweisen. Wenn solch ein Laccaseproduzent aus der Pilzklasse der Ascomyceten stammt, können die Laccasegene aus einem solchen Pilz vorzugsweise auch effizient in Pilzwirten, wie beispielsweise Pichia oder Aspergillus, für deren großmaßstabliche Produktion kloniert und exprimiert werden.
In dem US-Patent Nr. 7,927,849 B2 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Laccase-Enzyms von der Species Thielavia offenbart [13]. Die höchste erhaltene Aktivität, über die in dem Patentdokument berichtet wird, beträgt 20 nkatal ml^–1 innerhalb von sechs Tagen. Die spezifische Aktivität des Enzyms bei Verwendung von ABTS als Substrat beträgt 1020 nkatl/mg.
Diese Anmeldung beabsichtigt ein Verfahren zur Herstellung von Laccase-Enzym mit hoher spezifischer Aktivität und hohem Ertrag zu offenbaren. Das Laccase-Enzym wird von einem Pilzstamm produziert, der zu der Klasse der Ascomyceten gehört. Die Laccase, die von dem neuen Pilz gemäß dem hier offenbarten Verfahren produziert wird, kann für verschiedene durch die Laccase katalysierte biochemische Reaktionen in diversen Anwendungsbereichen eingesetzt werden, wie beispielsweise dem Abbau von Textilfarben in einem Abfluss, der Behandlung von Jeansstoff zum Bleichen und der Entfernung von Rückfärbungen sowie der biologischen Altlastensanierung im Allgemeinen, wie beispielsweise dem Abbau einiger Schadstoffe wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) und Xenobiotika. Anwendungen für die Laccase gibt es auch in Bäckereien, Brauereien und der Weinindustrie, in der Synthese von Chemikalien, der Fertigung der Kathode für Brennstoffzellen.
ZIELE DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Erhalten des Laccase-Enzyms von Arthrographis sp. MTCC 5479 bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalten von Laccase-Enzym von Arthrographis sp. MTCC 5479 bereit (1 und 2). Das neue Laccase-Enzym wird von dem Produzentenstamm, der zu der Gattung Arthrographis gehört, in das Medium sekretiert. Die Ausbeute des Enzyms unter den hier beschriebenen Bedingungen beträgt 9–14 IU ml^–1 oder 150–250 nktal ml^–1, wenn die Messung bei Verwendung von 1 mM ABTS in 50 mM Mcllvain-Puffer, pH 4.0 bei 30°C erfolgt (3). Die extrazelluläre Laccase, die von Arthrographis sp. produziert wird, kann einfach aus dem Kulturfiltrat isoliert und gereinigt werden. Das Enzym ist aktiv in dem breiten pH-Bereich von 3–8. Allerdings liegt für eine Vielzahl von üblichen Substraten das pH-Optimum im Bereich von 3 bis 6, wie beispielsweise für 2,2'-Azinobis-3-ethylbenzthiazol-6-sulphonat (ABTS), Guaiacol, 2-Methoxyphenol(guaiacol), 2,6 Dimethoxyphenol (DMP), Syringaldazin und Indigo. Das Enzym ist aktiv in dem Bereich von 25°C bis 70°C; allerdings liegt für eine Vielzahl von Substraten die optimale Temperatur des Enzyms in dem Bereich von 40°C bis 50°C. Das molekulare Gewicht des Enzyms liegt bei etwa 63 kDa, bestimmt durch SDS-PAGE (4 & 5). Das molekulare Gewicht des Enzyms via MALDI-ToF liegt bei 58,33 kDa (6). Der isoelektrische Punkt des Enzyms (pl), bestimmt durch isoelektrisches Fokussieren, liegt bei etwa 3,5 (7). Die N-terminale Aminosäuresequenz des Enzyms ist Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp-Leu-Thr-Ile-Ser-Asn-Ala-Glu-Val. Die spezifische Aktivität der Laccase von Arthrographis beträgt 347 IU mg^–1 (5784 nkatal mg^–1) gegen 1 mM ABTS in 50 mM Mcllvain-Puffer, pH 4,0 bei 30°C. Die spezifische Aktivität von Laccase von Arthrographis, gemessen über ein kinetisches Verfahren unter Verwendung von 0,02 mM Syrigaldazin als Substrat in 50 mM Mcllvain-Puffer pH 5,5 bei 30°C, beträgt 6380 IU mg^–1 (10635 nkatal mg^–1). Das Enzym kann wirksam verschiedene Textilfarbstoffe abbauen, die zur Anthroquinon-Gruppe, Azo-Gruppe, Triarylmethan-Gruppe, Eurhodin-Gruppe gehören, sowie reaktive Farbstoffe. In Gegenwart von spezifischen Mediatoren, wie beispielsweise 1-Hydroxybenzotriol, Violursäure, Methylsyringat und Acetosyringon, wird die Rate des Abbaus der Farbstoffe signifikant erhöht. Der Abbau von Indigo (Fassblau) erfordert Acetosyringon oder 2,2'-Azinobis-3-ethylbenzthiazol-6-sulphonat (ABTS) als einen Redoxmediator. Das Enzym kann außerdem in Anwendungen eingesetzt werden, die in der Nahrungsmittelindustrie, in der Brauerei und Weinindustrie, in der Papier- und Zellstoffindustrie, in der Synthese von Chemikalien und der Fertigung der Elektrode für die Brennstoffzelle angesiedelt sind, und dort, wo das Laccase-Enzym bekanntermaßen verwendet wurde.
Die Laccase von Arthrographis ist in der Lage, Indigofarbe (Fassblau) in Gegenwart eines Mediators, wie beispielsweise Acetosyringon (4'-Hydroxy-3',5'-Dimethoxyacetophenone) und 2,2'-Azinobis-3-ethylbenzthiazole-6-sulphonate (ABTS), zu oxidieren. Diese Eigenschaft der Laccase von Arthrographis kann für die Behandlung von Jeansstoff zur Erzielung einer Ausbleichwirkung auf dem Jeansstoff oder zur Wiederentfernung einer Färbung des Jeansstoffes, die durch den Steinwaschvorgang verursacht wurde, eingesetzt werden. Die Verwendung von verschiedenen Mediatoren in dem Vorgang kann verschiedene Grade von Bleichwirkungen hervorbringen. Das Bleichen von Jeansstoff durch die Laccase stellt eine wünschenswerte Alternative zum Verfahren mit Hypochlorit dar, denn es bietet einen ökologischen Vorteil und schwächt die Gewebestärke nicht.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhalten von Laccase-Enzym von dem Stamm Arthrographis sp. MTCC 5479 bereitgestellt, das Folgendes aufweist:

a. Wachsenlassen des Stammes Arthrographis sp. MTCC 5479 in sterilem, flüssigem Kulturmedium, wie hier beschrieben,
b. Inokulieren von Flaschen, die Produktionsmedium enthalten, mit dem in Schritt a erhaltenen Stamm,
c. Inkubieren des in Schritt b erhaltenen Mediums bei 30°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei einer Geschwindigkeit von etwa 180 rpm für annähernd 72 Stunden,
d. Induzieren der in Schritt c erhaltenen Kultur nach 72 Stunden mit Xylidin 0,00001 bis 0,0001% (v/v), CuSO₄.5H₂O, 0,0025 bis 0,025% (w/v) oder 100 μM bis 1000 μM,
se. Inkubieren der in Schritt d erhaltenen Kultur bei annähernd 30°C für etwa 12–15 Tage,
f. Entnahme der in Schritt e erhaltenen Kultur und Separieren des in das Medium ausgeschiedenen Laccase-Enzyms von der Zellmasse durch Zentrifugation bei annähernd 8000 X g für annähernd 10 Minuten,
g. Konzentrieren und Reinigen des in Schritt f erhaltenen Enzyms durch hier beschriebene Verfahren.

In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung liegt die Ausbeute des Laccase-Enzyms bei 9–14 IU/ml.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das Laccase-Enzym durch Folgendes charakterisiert:

I. Molekulargewicht von annähernd 63 kDa durch SDS-PAGE oder 58,33 durch MALDI ToF-Verfahren.
II. pl von etwa 3,5,
III. Spezifische Aktivität von annähernd 347 IU mg^–1 oder 5784 nkatal m^–1 gegen 1 mM ABTS in 50 mM Mcllvain-Puffer, pH 4,0 bei 30°C, spezifische Aktivität von 6380 IU mg^–1 oder 10635 nkatal mg^–1 bei Verwendung von 0,02 mM Syringaldazin als Substrat in 50 mM Mcllvain-Puffer, pH 5,5 bei 30°C.
IV. N-terminale Aminosäuresequenz mit Seq ID. No. 1.

In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung arbeitet das Enzym bei einem pH-Wert von 2,5 bis 8,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3 bis 5,5.
In noch einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das Enzym in einer Behandlung zum Farbstoffabbau bei Temperaturen von 30 bis 70°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 35 bis 50°C wirksam.
In noch einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung erfolgt die Präparation des Enzyms in Form einer Flüssigkeit, eines Pulvers oder Granulats nach dem Vermengen oder Mischen mit inerten Substanzen oder Salzen, um deren Haltbarkeit zu erhöhen.
In noch einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das Enzym nützlich zum Abbau von Textilfarbstoffen, einschließlich Azo, Anthraquinon, Triphenylmethan, Indigoid, Tirazin und Eurhodin-Gruppen von Farbstoffen, und zwar in Alleinform oder in einer Mischung aus diesen Farbstoffen.
In noch einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird das Laccase-Enzym von Arthrographis sp. isoliert, und ist nützlich zur Entfernung von Färbungen, zum Bleichen von Zellstoff, zur Behandlung von Fasern zum Weißen, zum Färben von Tierhaaren einschließlich Wolle, zur Behandlung von textilen Farbstoffen oder Farbstoffen in Abflüssen, zur Herstellung einer Kathode in einer Brennstoffzelle, für die Formulierungen von Beschichtungen und Klebstoffen basierend auf der Polymerisierung von phenolischen Monomeren etc.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN UND TABELLEN:
1: Kolonie von Arthrographis sp. MTCC 5479 auf YPD-Agar
2: Mikroskopische Morphologie von Arthrographis sp. MTCC 5479 (1000 X)
3: Profil der Enzymaktivität für Arthrographis sp.
4: Analyse von Schritten in der Reinigung der Laccase
5: Schätzung des molekularen Gewichts der Laccase von Arthrographis über SDS-PAGE, die verwendeten Molekulargewichtsmarker waren Phosphorylase b (97 kDA), Rinderserumalbumin (67 kDa) Ovalbumin (45 kDa) und Carbonanhydrase (30 kDa).
6: Analyse der Laccase von Arthrographis über MALDI-ToF
7: Isoelektrische Fokussierung der Laccase von Arthrographis
8: Bleichen von Jeansstoff für eine leichte Ausbleichwirkung
9: Bleichen von Jeansstoff für eine starke Ausbleichwirkung
10: Behandlung von Jeansstoff mit Laccase von Arthrographis zur Rückentfernung einer Färbung
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die folgenden Beispiele dienen den Zwecken der Illustrierung der vorliegenden Erfindung und stellen deshalb keine Begrenzung der Reichweite der vorliegenden Erfindung dar.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von Laccase von dem Pilzstamm Arthrographis sp. MTCC 5479.
Das Laccase-Enzym wurde durch Wachsenlassen des Arthrographis-Stammes in sterilem flüssigem Kulturmedium produziert, das Folgendes aufwies

Pepton 0,1 bis 2% (w/v),

Hefeextrakt 0,25 bis 0,5% (w/v),

KH₂PO₄ 0,01% bis 0,25%,

MgCl₂ 0,0001 bis 0,05% (w/v),

Glukose, separat autoklaviert 1–5% (w/v).
Der Pilzstamm Arthrographis sp. MTCC 5479 wurde auf Agarplatten mit Hefe, Pepton und Dextrose (YPD) wachsen gelassen und für 6–7 Tage inkubiert. Die Myzelmasse und Sporen wurden von der Platte eingesammelt, indem die Oberfläche der Agarplatte mit einer sterilen Schlinge abgekratzt wurde und in eine 500 ml Flasche inokuliert wurde, die 100 ml YPD-Medium enthielt, und es folgte eine Inkubation bei 30°C für drei Tage. Die erhaltene Zellmasse wurde als Inokulum verwendet, um 10 Flaschen zu inokulieren, die 500 ml Produktionsmedium enthielten. Die Flaschen, die das inokulierte Produktionsmedium enthielten, wurden bei 30°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei einer Geschwindigkeit von 180 rpm für 72 Stunden inkubiert. Nach 72 Stunden wurden für die Laccaseproduktion Xylidin 0,00001 bis 0,0001% (v/v) CuSO₄.5H₂O, 0,0025 bis 0,025% (w/v) oder 100 μM bis 1000 μM als Induktoren hinzugegeben. Die Produktionsflaschen wurden unter feststehenden Bedingungen bei 30°C weiter inkubiert. Der Beginn und das Fortschreiten der Enzymsynthese wurde überwacht, indem zu jedem 24 Stundenintervall Kultur entnommen und der Assay für den Kulturüberstand durchgeführt wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Das in das Medium ausgeschiedene Laccase-Enzym wurde von der Zellmasse separiert, nachdem das Maximum der Enzymaktivität nach etwa 12–15 Tagen der Inkubation bei 30°C erreicht war. Die erhaltene extrazelluläre Enzymaktivität liegt im Bereich von 9–14 IU ml^–1 der Kulturbrühe (3).
Obgleich die Herstellung der Laccase von Arthrographis in Schüttelflaschen demonstriert wurde, können andere geeignete Behälter für die Herstellung der Laccase von jenen Fachleuten auf dem Gebiet der mikrobiellen Fermentierung verwendet werden, wie beispielsweise Schalen oder Fermenter.
Beispiel 2
Isolierung und Reinigung der Laccase von Arthrographis sp. aus dem Kulturüberstand
Die Pilzmyzelmasse wurde von der Kulturbrühe durch Zentrifugation bei 8000 X g für 10 Minuten separiert. Der erhaltene Überstand (4,1 L) wurde etwa 20-fach konzentriert, indem eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Größe von 30 kD MWCO verwendet wurde.
Das Ultrafiltrat (180 ml) wurde auf eine Q-Sepharosesäule (40 ml) geladen, die bei einem pH 5,5 unter Verwendung von 50 mM Natriumazetatpuffer äquilibriert wurde, und unter Verwendung eines linearen Gradienten bei 0–50% von 500 mM Natriumchlorid im gleichen Puffer eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereint und mit Ammoniumsulphat bei 100%-iger Sättigung präzipitiert. Das Präzipitat wurde auf eine Sephacryl S-200-Säule (200 ml) geladen und bei 0,15 M NaCl in 50 mM Natriumazetatpuffer eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereint und zur Bestimmung des Molekulargewichts, isoelektrischen Punkts, der spezifischen Aktivität und anderen Eigenschaften des Enzyms analysiert.
Beispiel 3
Assay für die Laccase-Aktivität unter Verwendung von 2,2'-Azinobis-3-ethylbenzthiazol-6-sulphonat (ABTS) als chromogenes Substrat [10]

Die Laccase-Aktivität wurde durch ein spektrophotometrisches Endpunktverfahren gemessen. Die Bedingungen für den Assay waren jene, die unten angegeben sind. Der Assay wurde in der temperaturkontrollierten Küvettenkammer des Spektrometers (Analytica Jena SPECORD 600) durchgeführt.

Isolationspuffer	975 μl 50 mM Mcllvain-Puffer, pH 4,0,
Chromogenes Substrat	2,2'-Azinobis-3-ethylbenzthiazol-6-sulphonat (ABTS), 1 mM
Laccaselösung	25 μl (verdünnt)
Inkubationszeit	5 min
Inkubationstemperatur	30°C
Wellenlänge	420 nm
Kalkulation	Auf der Basis des Extinktionskoeffizienten des oxidierten Kations von ABTS, 36 mM^–1 cm^–1. Eine Einheit der Enzymaktiviät wurde definiert als die Menge von Enzym, die unter diesen Bedingungen 1 μM ABTS pro Minute oxidiert.

Beispiel 4
Assay für die Laccase-Aktivität unter Verwendung des chromogenen Substrates Syringaldazin

Die Laccase-Aktivität wurde mittels eines kinetischen spektrophotometrischen Verfahrens gemessen. Die Bedingungen für den Assay waren jene, die unten angegeben sind. Der Assay wurde in der temperaturkontrollierten Küvettenkammer des Spektrometers (Analytica Jena SPECORD 600) durchgeführt.

Inkubationspuffer	2745 μl 25 mM Mcllvaine-Puffer pH 5,5, enthaltend 48%
	Ethanol
Chromogenes Substrat	Syringaldazin, Stammlösung, 0,28 mM in 48% Ethanol
Syringaldazinlösung	225 μl
Laccaselösung	30 μl verdünnt
Inkubationszeit	5 min
Inkubationstemperatur	30°C
Wellenlänge	530 nm
Kalkulation	auf der Basis von Δ A (t₄ – t₃), Extinktionskoeffizient von ε₅₃₀ von oxidiertem Syringaldazin, 65 mM^–1 cm^–1. Eine Einheit der Enzymaktivität wurde definiert als die Menge an Enzym, die unter diesen Bedingungen 1 μM Syringaldazin pro Minute oxidiert.

Beispiel 5
Schätzung des Proteins in der Enzympräparation
Der Proteingehalt der Enzympräparationen wurde gemäß dem Verfahren nach Bradford unter Verwendung von Bradford-Reagenz (B-6916, Sigma Chemicals, USA) und einer Lösung mit einer bekannten Konzentration von Rinderserumalbumin als Proteinstandard geschätzt.
Beispiel 6
Schätzung der spezifischen Aktivität von gereinigter Laccase von Arthrographis-Laccase
Die spezifische Aktivität der Präparation von gereinigtem Protein wurde in Form von Internationalen Einheiten pro Milligramm Protein IU mg^–1 bestimmt. Die Enzymaktivität wurde gemessen, wie in den Beispielen 3 und 4 angegeben. Der Proteingehalt wurde geschätzt, wie in Beispiel 5 angegeben. Die spezifische Aktivität in Form von abgeleiteten SI-Einheiten nkatal kann durch Multiplizieren der Internationalen Einheiten mit dem Faktor 16,67 berechnet werden.
Beispiel 7
Anwendung des Enzyms zum Abbau von Farbstoff
Die folgenden Farbstoffe wurden in 50 mM Mcllvaine-Puffer (Citrat-Phosphat-Puffer) bei einer Konzentration von 50 mg/L gelöst. Diese Farbstoffe umfassen Farbstoffe, die zu der Azo-Gruppe, Antroquinon-Gruppe, Acridin-Gruppe, Eurhodin-Gruppe gehören und reaktiven Farbstoff. 20 ml Farbstofflösung wurden in eine Flasche mit einem Volumen von 100 ml gegeben.

1. Brilliantblau
2. Cibacronblau
3. Kristallviolett
4. Bengalrosa
5. Erythrosin
6. Acridinorange
7. Malachitgrün
8. Neutralrot
9. Remazolbrilliantblau
10. Bromphenolblau
11. Kongorot
12. Methylrot
13. Cottonblau (Azidblau)
14. Rhodamin B

Rohenzym in Form von Ultrafiltrat wurde zur Farbstofflösung hinzugegeben, um eine finale Enzymaktivität von etwa 100 Einheiten/mL zu erhalten. Ein weiteres Set von Farbstofflösung wurde ebenfalls bereitgestellt. Im zweiten Set wurde Hydroxybenzotirazol (HOBT), ein Mediatormolekül, zu der Konzentration von 5,0 mM hinzugegeben. Die Flaschen wurden bei 30°C inkubiert. Der verbleibende Farbstoffgehalt wurden nach 12-stündiger und 24-stündiger Inkubation geschätzt. Flaschen, die den Mediator 1-HOBT enthielten, zeigten innerhalb von 12 Stunden mehr als 90% Entfärbung von Acridinorange, Brilliantblau, Cibacronblau, Bengalrosa, Erythrosin, Malachitgrün, Neutralrot, Bromphenolblau, Remazolbrilliantblau, Kristallviolett, Kongorot, Rhodamin B und Cottonblau.
Innerhalb von 24 Stunden wurden in Flaschen, in denen kein Mediator (HOBT) hinzugegeben wurde, 90% Abbau von Acridinorange, Brillantblau, Cibacronblau, Bengalrosa, Erythrosin, Malachitgrün, Neutralrot, Remazolbrilliantblau, Kongorot beobachtet.
Die Anwendung von Laccase aus Arthrographis sp. zum Abbau von textilen Farbstoffen ist nicht nur auf die Anzahl der oben gelisteten Farbstoffe begrenzt. Das obige Experiment demonstriert lediglich die Vielseitigkeit der Laccase von Arthrographis, um textile Farbstoffe abzubauen, die zu verschiedenen Gruppen gehören. Das Enzym von Arthrographis sp. kann für den Abbau von anderen Farbstoffen als jene, die hier erwähnt sind, durch einen Fachmann für die Verwendung von Laccase-Enzym sowie verschiedene Mediatoren für die Reaktion, die von dem Enzym ausgeführt wird, angewendet werden. Das Enzym kann außerdem für den Zweck des Abbaus von Farbstoffen in einem geeigneten Reaktor angewendet werden, in dem das Inkontakttreten von Farbstoffen und Enzymen stattfinden kann.
Beispiel 8
Behandlung von Jeansstoff durch Laccase von Arthrographis zum Bleichen, um ein ausgeblichenes Erscheinungsbild zu erhalten
Ein Stück eines gewünschten Jeansstofftuches wurde von Rossari Biotech India Pvt. Ltd., Mumbai, Indien, erhalten. Das Tuch wurde mit Leitungswasser gewaschen und in Probenstücke von ungefähr 1 Quadratinch (Trockengewicht von etwa 800–900 mg) geschnitten. Die Probenstücke des Jeansstoffes wurden in 25 ml Mcllvaine-Puffer, pH 3,0, welches sich in konischen 100 ml Flaschen befand, eingetaucht. Die Redox-Mediatoren Acetosyringon (4'-Hydroxy-3',5'-dimethoxyacetophenon) und 2,2'-Azinobis-3-ethylbenzthiazol-6-sulphonat (ABTS) wurden separat in die beiden Flaschen bei einer Konzentration von 1–5 mg ml^–1 hinzugegeben. Das ABTS wurde als trockenes Pulver hinzugegeben, wohingegen das Acetosyringon als Lösung in Ethanol (50 mg/ml) hinzugegeben wurde. Die Probenstücke des Jeansstoffes in den Flaschen konnten den Puffer und den Mediator für 5 Minuten aufsaugen. 25 IU der Laccase von Arthrographis wurden zu jeder Flasche hinzugegeben, um die Reaktion zu initiieren. Die Flaschen wurden in einem rotierenden Schüttelgerät bei 45°C und einer Geschwindigkeit von 180 rpm inkubiert. Nach 60 min wurden die Probenstücke des Jeansstoffes aus den Flaschen entfernt, mit Leitungswasser gewaschen und in Flaschen getaucht, die frischen Puffer und Mediator in der gleichen Menge, wie zuvor angegeben, enthielten. Die Zugabe des Enzyms (25 U) erfolgte und eine Inkubation bei 45°C und einer Geschwindigkeit von 180 rpm wurde für weitere 90 min durchgeführt. Am Ende der 90 Minuten wurden die Probenstücke des Jeansstoffes aus der Flasche entfernt, mit Wasser gewaschen, trockengetupft, unter Verwendung von Filterpapier gebügelt. Die Ergebnisse wurden fotografiert (8, 9).
Beispiel 9
Behandlung von mit Steinen gewaschenem Jeansstoff durch Laccase von Arthrographis zur Entfernung von Rückfärbung
Ein mit Steinen gewaschenes Jeansstoffgewebe wurde vom lokalen Markt beschafft. Der Jeansstoff wurde in etwa 1 Quadratinch große Stücke geschnitten. Die mit Steinen gewaschenen (Trockengewicht von etwa 800–900 mg) Probenstücke des Jeansstoffes wurden in 25 ml Mcllvaine-Puffer, pH 3,0 enthalten in konischen 100 ml Flaschen, eingetaucht. Die Redox-Mediatoren Acetosyringon (4'-Hydroxy-3',5'-dimethoxyacetophenon) und 2,2'-Azinobis-3-ethylbenzthiazol-6-sulphonat (ABTS) wurden separat bei Konzentrationen von 1–5 mg ml^–1 hinzugegeben. ABTS wurde als trockenes Pulver hinzugegeben, wohingegen Acetosyringon als Lösung in Ethanol (50 mg/ml) hinzugegeben wurde. Die Probenstücke des Jeansstoffes in den Flaschen konnten den Puffer und Mediator für 5 Minuten aufsaugen. 25 IU der Laccase von Arthrographis wurden zu jeder Flasche hinzugegeben, um die Reaktion zu initiieren. Die Flaschen wurden in einem rotierenden Schüttelgerät bei 45°C und einer Geschwindigkeit von 180 rpm inkubiert. Nach 90 min wurden die Probenstücke des Jeansstoffes aus den Flaschen entfernt, mit Wasser gewaschen, trockengetupft, unter Verwendung von Filterpapier gebügelt. Die Ergebnisse wurden fotografiert (10).
Die unter 8 und 9 gegebenen Beispiele demonstrieren die Wirksamkeit der Laccase von Arthrographis zum Bleichen von Jeansstoff, um ein ausgeblichenes Erscheinungsbild als Effekt zu erhalten, oder um den Kontrast in dem mit Steinen gewaschenen Jeansstoff zu verstärken. Allerdings kann die Laccase von Arthrographis-Laccase von einem Fachmann auf dem Gebiet der Verwendung von Laccasen-Enzymen zum Bleichen auch zur Behandlung von Kleidern angewendet werden, die aus Jeansstoffgewebe hergestellt sind.
Beispiel 10
Immobilisierung von Laccase auf Q-Sepharose
Enzym, das partiell durch ein Verfahren der Ionenaustauscherchromatographie gereinigt wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde gegen 50 mM Citratphosphat-Puffer bei pH 6,0 dialysiert. Die Enzymlösung wurde konzentriert, um deren Volumen zu reduzieren, indem eine Ultrafiltrationsvorrichtung von Amicon zum Zentrifugieren verwendet wurde. Die konzentrierte Enzymlösung hatte eine Aktivität von 1200 IU pro ml. Die Q-Sepharose wurde in eine Säule gepackt und bei einem pH von 6,0 äquilibriert, und dann in eine 25 ml Flasche transferiert. 20 ml der konzentrierten Laccaselösung, enthaltend 1220 U ml^–1, wurden zu 2 ml Q-Sepharose hinzugegeben, die bei einem pH von 6,0 äquilibriert wurde, und es erfolgte eine Inkubation für 30 min, um eine Bindung zu ermöglichen. Das ungebundene Enzym wurde von der Q-Sepharose durch Filtrieren durch ein Whatman-Filterpapier Nr. 1 entfernt. Die Sepharose mit daran adsorbiertem Enzym wurde in dem Puffer mit einem pH 6,0 suspendiert, der 1 mM 1,3-Propylendiamin enthielt, und wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1 Std. wurde 1,4-Butandiol-Diglycidyl-Ether (BDDGE) in die Suspension gegeben und durch mehrfaches Invertieren des Röhrchens gemischt. Die Menge von 1,4-Butanediol-Diglycidyl-Ether (BDDGE) kann im Bereich von 0,05 mM bis 10 mM liegen. Die Suspension wurde anschließend im Raum über Nacht aufbewahrt und dann mit Citratphosphatpuffer mit einem pH 4,0 gewaschen. Die Sepharose wurde dann in Phosphatpuffer bei pH 6,0 suspendiert, der 1 mM Glycyl-Glycin enthielt, und für 6 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Behandlung zur Blockierung von freien Oxirangruppen, wurde die Suspension erneut mit 50 mM Citratpuffer mit einem pH 4,0 gewaschen. Die finale Aktivität der Präparation der immobilisierten Laccase betrug 10,000 IU gm^–1.
Beispiel 11
Verwendung von immobilisierter Laccase zur Entfernung von Phenolen aus Most und Wein
Verwendung von immobilisierter Laccase aus dem Arthrographis-Stamm zur Klärung von Most und Wein.
Durch Vermeischen von lokal verfügbaren Trauben wurde Most hergestellt. Es wurde etwa 100 ml geklärter Most durch Zentrifugation bei 10.000 X g für 10 Minuten erhalten. Der pH-Wert des Mostes betrug etwa 3,5. 2000 Einheiten des Laccase-Enzyms, immobilisiert auf Q-Sepharose gemäß dem in Beispiel 10 angegebenen Verfahren, wurden zu 30 ml Most hinzugegeben und bei 15°C für 48 Std. inkubiert. Der Most wurde dann bei 1000 X g für 2 Minuten geschleudert, um das immobilisierte Enzym zurückzugewinnen, und anschließend bei 10.000 rpm für 10 min, um die gebildeten Phenole zu präzipitieren. Die anfänglichen und verbleibenden Phenole in dem Most wurden mittels des Denis-Verfahrens geschätzt, indem Gerbsäure als Standard verwendet wurde. Die Laccasebehandlung resultierte in einer 5,8-fachen Reduzierung des Phenolgehalts.
Der Traubenmost aus lokal verfügbaren Trauben wurde unter Verwendung seiner eigenen Flora fermentiert. Der fermentierte Wein wurde durch Schleudern bei 1000 X g geklärt. 2000 Einheiten von immobilisierter Laccase wurden zu dem Wein hinzugegeben und der Ansatz wurde für 48 Std. bei 15°C stehengelassen.
Der Wein wurde dann zuerst durch Filterpapier von Whatman Nr. 1 durchfiltriert und anschließend durch einen 0,5 Mikrometerfilter. Der ursprüngliche und verbleibende Phenolgehalt wurde über das Denis-Verfahren bestimmt, indem Gerbsäure als Modellphenolverbindung verwendet wurde. Durch die Behandlung mit Laccase erfolgte eine 3-fache Reduzierung in den Phenolgehalten.
VORTEILE DER ERFINDUNG

1. Die unter Verwendung des Arthrographis-Stammes hergestellte Laccase ist nicht durch Glukose- oder Stickstoffsuffizienz reprimierbar.
2. Eine Laccaseproduktion erfolgt unter Submersfermentation sowie als Festkörperkultur.
3. Die Herstellung der Laccase erfolgt extrazellulär mit einer hohen Ausbeute von
10.000 bis 20.000 IU pro Liter des Kulturüberstandes und kann leicht aus dem Kulturüberstand gereinigt werden.
4. Die hergestellte Laccase bietet eine hohe Spezifität in dem Farbstoffabbau. Das zellfreie Enzym ist in der Lage, Farbstoffe abzubauen, die zu unterschiedlichen Farbstoffgruppen gehören, wie beispielsweise Azo-Farbstoffe, Triphenylmethan-Farbstoffe, reaktive Farbstoffe, Anthroquinon-Farbstoffe, Eurhodin-Farbstoffe und Acridin-Farbstoffe.
5. Der Abbau von solch verschiedenen Farbstoffgruppen durch eine einzige extrazelluläre Laccase wurde bislang nicht beschrieben.
6. Die Behandlung von Jeansstoff mit Laccase von Arthrographis ist in der Lage, ein stark ausgeblichenes Erscheinungsbild des Jeansstoffes zu erzeugen, wenn ABTS als ein Mediator für das Jeansstoffbleichen verwendet wird. Dies stellt eine Alternative zu der Verwendung einer Hypochloridbehandlung zur Schaffung eines stark ausgeblichenen Erscheinungsbildes von Jeansstoff dar.

Referenzen:

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 7927849 B2 [0005]

Claims

Verfahren zur Isolierung von Laccase-Enzym von dem Stamm Arthrographis sp. MTCC 5479, das Folgendes aufweist: a. Wachsenlassen des Stammes Arthrographis sp. MTCC 5479 in sterilem, flüssigem Kulturmedium, wie hier beschrieben, b. Inokulieren von Flaschen, die Produktionsmedium enthalten, mit dem in Schritt a erhaltenen Stamm, c. Inkubieren des in Schritt b erhaltenen Mediums bei 30°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei der Geschwindigkeit von etwa 180 rpm für annähernd 72 Std., d. Induzieren der in Schritt c erhaltenen Kultur nach 72 Std. mit Xylidin 0,00001 bis 0,0001% (v/v), CuSO₄.5H₂O, 0,0025 bis 0,025% (w/v) oder 100 μM bis 1000 μM, e. Inkubieren der in Schritt d erhaltenen Kultur bei annähernd 30°C für etwa 12 bis 15 Tage, f. Entnahme der in Schritt e erhaltenen Kultur und Separieren des Laccase-Enzyms, das in das Medium ausgeschieden wurde, von der Zellmasse durch Zentrifugation bei annähernd 8000 X g für annähernd 10 Minuten. g. Konzentrieren und Reinigen des in Schritt f erhaltenen Enzyms durch hier beschriebene Verfahren.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Ausbeute des Laccase-Enzyms bei 9–14 IU/ml liegt.
Laccase-Enzym hergestellt nach dem Verfahren wie in den Ansprüchen 1 bis 2 beansprucht, charakterisiert durch Folgendes: I. Molekulargewicht von annähernd 63 kDa durch SDS-PAGE oder 58,33 kDa durch MALDI-ToF-Verfahren, II. pl von etwa 3,5, III. Spezifische Aktivität von annähernd 347 IU mg^–1 oder 5784 nkatal mg^–1 gegen 1 mM ABTS in 50 mM Mcllvain-Puffer, pH 4,0 bei 30°C, und 6380 IU mg^–1 oder 10635 nkatal mg^–1 bei Verwendung von 0,02 mM Syrigaldazin in 50 mM Mcllvain-Puffer, pH 5,5 bei 30°C, IV. N-terminale Aminosäuresequenz mit Seq ID Nr. 1.
Laccase-Enzym wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das Enzym bei einem pH-Wert von 2,5 bis 8,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3 bis 5,5 arbeitet.
Laccase-Enzym wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das Enzym wirksam ist in einer Behandlung zum Farbstoffabbau bei Temperaturen von 30 bis 70°C, vorzugsweise bei Temperaturen von 35 bis 50°C.
Laccase-Enzym wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die Enzympräparation in der Form einer Flüssigkeit, eines Pulvers oder Granulats nach Vermengen oder Mischen mit inerten Substanzen oder Salzen erfolgt, um deren Haltbarkeit zu erhöhen.
Laccase-Enzym wie in Anspruch 3 beansprucht, das zum Abbau von textilen Farbstoffen nützlich ist, einschließlich Azo-, Triphenylmethan-, Indigoid-, Erythroid-Gruppen von Farbstoffen in Alleinform oder in einer Mischung aus diesen Farbstoffen.
Laccase-Enzym wie in Anspruch 3 beansprucht zur Entfernung von Färbungen, zum Bleichen von Zellstoff, zur Behandlung von Fasern zum Weißen, zum Färben von Tierhaaren einschließlich Wolle, zur Behandlung von textilen Farbstoffen oder Farbstoffen in Abflüssen, zur Herstellung einer Kathode in einer Brennstoffzelle, für Formulierungen von Beschichtungen und Klebstoffen basierend auf der Polymerisation von phenolischen Monomeren, in denen Laccase-Enzyme nützliche Anwendungen aufweisen.