CN103270154A - 一种从节图霉属菌种获得漆酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从新真菌菌株节图霉属菌种MTCC 5479制备漆酶的方法，所述漆酶对于多种应用有用，例如流出物中的纺织品染料降解、或掺入粗斜纹棉布织物中的靛青染料的漂白和一般而言的生物除污，例如一些污染物和异生物质的降解。漆酶的应用还体现于烘焙、酿造和酿酒工业，化学制品的合成，燃料电池的阴极制作中。

Description

一种从节图霉属菌种获得漆酶的方法
技术领域
本发明涉及一种从节图霉属菌种（Arthrographis sp.）MTCC5479[保藏日期：2009年6月5日；保藏单位：微生物典型培养物保藏和基因银行(Microbial Type Culture Collection and Gene Bank)MTCC]获得漆酶的方法及其应用。 
背景技术
漆酶（苯二醇：氧氧化还原酶EC1.10.3.2）是多酚氧化酶且属于称为多铜氧化酶的一群酶。漆酶具有一个1型铜原子，其显示在600nm处的光吸收且对该酶赋予蓝色。除了一个1型铜原子外，漆酶的每个酶分子具有一个2型和两个3型铜原子。伴随底物的氧化，漆酶催化分子氧的四电子还原而成为水[1]。 
在1883年首次报道了漆酶在日本漆树（Rhusvernicifera）中出现。后来发现该酶在属于担子菌纲（Basidiomycetes）称为‘白腐真菌’的真菌中出现。它包括伞菌属（Agaricus）、黑蛋巢菌属（Cyathus）、香菰属（Lentinus）、白腐菌属（Phlebia）、革耳属（Panus）、侧耳菌属（Pleurotus）和槐耳菌属（Trametes）。属于子囊菌纲（Ascomycetes）的少数真菌例如弯孢霉属（Curvularia）、禾顶囊壳属（Gaeumannomyces）、缘螺属（Marginella）和黑果球粉衣（Melanocarpus）也产生漆酶[2]。 
由于漆酶能够氧化一系列异生化合物，所以漆酶是经济上重要的酶。漆酶显示出广泛底物特异性，且可以催化氧化多酚、甲氧基取代苯酚、氨基苯酚及其衍生物[3]。漆酶催化多种氧化反应，这在造纸和纸浆工业[4]、食品和饮料工业[5]、生物除污[6]、生物传感器[7,8]、和生物燃料电池[9]中是有用的。纯化漆酶的经济可用性是在工业中使用漆酶的重要因素[5]。属于担子菌纲的白腐真菌是漆酶的主要来源。然而，由这些真菌产生的漆酶的细胞外水平很低[10]。担子菌纲的漆酶在重组宿主中的克隆和表达受诸如不同密码子使用、缺少伴侣分子和翻译后修饰的问题困扰[11]。漆酶的比活性取决于漆酶的氧化还原电位。在重组宿主中产生的漆酶趋于具有比其通过野生株产生的对应物更低的氧化还原电 位[12]。因此，探索具有更高漆酶得率的新漆酶产生菌株的微生物多样性以及具有更高比活性和更高氧化还原电位的漆酶是重要的。如果，此类漆酶的产生者是来自真菌的子囊菌纲，那么来自此类真菌的漆酶基因也可以优选在真菌宿主例如毕赤酵母属（Pichia）或曲霉菌属（Aspergillus）中克隆并有效表达以用于其大规模生产。 
美国专利第7,927,849B2号已公开了一种从梭孢壳属（Thielavia）菌种产生漆酶的方法[13]。在专利文件中报道的所获得的最高活性在六天内是20nkatalml-1。该酶使用ABTS作为底物的比活性是1020nkatl/mg。 
本申请寻求公开一种产生具有高比活性和得率的漆酶的方法。该漆酶通过属于子囊菌纲的真菌菌株产生。根据本文公开的方法通过新真菌产生的漆酶可以应用于在不同应用领域中多种漆酶催化的生物化学反应，例如废水中的纺织品染料的降解、用于漂白粗斜纹棉布的处理、返沾色的去除和一般而言的生物除污，例如一些污染物如聚芳烃（PAH）和异生物质的降解。漆酶还应用于烘焙、酿造和酿酒工业中，化学制品的合成中，燃料电池阴极的制作中。 
发明内容
发明目的 
本发明的目的是提供一种从节图霉属菌种MTCC5479获得漆酶的方法。 
发明概述 
相应地，本发明提供了一种从节图霉属菌种MTCC5479获得漆酶的方法（图1和2）。新漆酶由属于节图霉属的生产菌株分泌到培养基内。在30℃，使用在50mMMcIlvain缓冲液，pH4.0中的1mMABTS，在本文描述的条件下测定时，酶的得率是9-14IUml-1或150-250nktalml-1（图3）。通过节图霉属菌种产生的细胞外漆酶可以容易地从培养滤液中分离且纯化。该酶在3-8的宽pH范围中是有活性的。然而，对于多种常见底物，例如2,2'联氮双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸酯（ABTS）、愈创木酚、2-甲氧基苯酚（愈创木酚）、2,6二甲氧基苯酚（DMP）、丁香醛连氮和靛青，最适pH位于3-6的范围中。该酶在25℃-70℃的范围中是有活性的；然而，对于多种底物，该酶的最适温度在40℃-50℃的范围中。如通过SDS-PAGE测定的，该酶的分子量是约63kDa（图4和5）。该酶通过 MALDI-ToF测定的分子量是58.33kDa（图6）。如通过等电聚焦测定的，该酶的等电点（pI）是约3.5（图7）。该酶的N末端氨基酸序列是Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp-Leu-Thr-Ile-Ser-Asn-Ala-Glu-Val。节图霉属漆酶在30℃对在50mM McIlvain缓冲液，pH4.0中的1mMABTS的比活性是347IUmg-1（5784nkatalmg-1）。在30℃使用在50mMMcIlvain缓冲液，pH5.5中的0.02mM丁香醛连氮（syringaldazine）作为底物，通过动力学方法测量的节图霉属漆酶的比活性是6380IUmg-1（10635nkatalmg-1）。该酶可以有效降解属于蒽醌组、偶氮组、三芳基甲烷组、二氨吖嗪组和活性染料的多种纺织品染料。在特异性介质例如1-羟基苯并***、紫尿酸、丁香酸甲酯和乙酰丁香酮的存在下，染料的降解率显著增强。靛青（瓮蓝）的降解要求乙酰丁香酮或2,2'联氮双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸酯（ABTS）作为氧化还原介质。该酶还可以应用于食品工业中、酿造和酿酒工业中、造纸和纸浆工业中、化学制品的合成中、和用于燃料电池的阴极制作，以及已知的该漆酶应用的场合。 
在介质例如乙酰丁香酮（4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮）和2,2'联氮双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸酯（ABTS）的存在下，节图霉属漆酶能够氧化靛青染料（瓮蓝）。节图霉属漆酶的这种性质可以用于处理粗斜纹棉布以获得在粗斜纹棉布上的褪色效应，或去除通过石洗（stonewashing）过程引起的粗斜纹棉布的返沾色。在该过程中使用不同介质可以造成不同级别的漂白效应。粗斜纹棉布通过漆酶的漂白是次氯酸盐方法的所需的备选方法，因为它提供生态利益并且它不减弱织物强度。 
在本发明的一个实施方案中提供了一种从节图霉属菌种MTCC5479菌株获得漆酶的方法，其包括： 
a.如本文所描述在无菌液体培养基中使节图霉属菌种MTCC5479菌株生长； 
b.用步骤a中获得的菌株接种含有生产培养基的烧瓶； 
c.使步骤b中获得的培养基在30℃下在旋转振荡器上以约180rpm的速度温育接近72小时； 
d.在72小时后，用二甲苯胺0.00001-0.0001%（v/v），CuSO4.5H2O，0.0025-0.025%（w/v）或100μΜ-1000μΜ诱导步骤c中获得的培养物； 
e.使步骤d中获得的培养物在接近30℃温育约12-15天； 
f.取出步骤e中获得的培养物，并且通过以接近8000X g离心接近10分钟，使分泌到培养基内的漆酶与细胞团分离； 
g.通过本文描述的方法浓缩并纯化步骤f中获得的酶。 
在本发明的另一个实施方案中，其中漆酶的得率范围为9-14IU/ml。 
在本发明的另一个实施方案中，其中漆酶的特征在于具有： 
I.通过SDS-PAGE方法，测得接近63kDa，或通过MALDI-ToF方法测得接近58.33的分子量； 
II.约3.5的pI； 
III.在30℃对在50mMMcIlvain缓冲液，pH4.0中的1mMABTS的比活性是接近347IU mg-1或5784nkatalmg-1，在30℃使用在50mMMcIlvain缓冲液，pH5.5中的0.02mM丁香醛连氮作为底物，比活性为6380IU mg-1或10635nkatalmg-1； 
IV.具有Seq ID.No.l的N末端氨基酸序列。 
在本发明的另一个实施方案中，其中该酶在pH2.5-8.5、优选在pH3-5.5起作用。 
在本发明的另外一个实施方案中，其中该酶在温度30-70℃、优选在温度35-50℃在染料降解处理中是有效的。 
在本发明的另外一个实施方案中，其中在与惰性物质或盐掺和或混合以增加其贮存期限之后，酶制剂为液体、粉末或颗粒的形式。 
在本发明的另外一个实施方案中，其中该酶对于降解以单独或混合物形式的纺织品染料是有用的，所述纺织品染料包括偶氮、蒽醌、三苯基甲烷、靛青、三嗪和二氨吖嗪的一组染料。 
在本发明的另外一个实施方案中，其中漆酶从节图霉属菌种中分离，并且用于去除污点、用于漂白浆料、用于处理纤维使其增白、用于动物毛发包括羊毛着色、用于处理废水中的一种或多种纺织品染料、用于燃料电池中的阴极制作、用于基于苯酚单体聚合的涂层和粘着剂的配制等。 
附图说明
附图和表简述： 
图1.在YPD琼脂上的节图霉属菌种MTCC5479菌落； 
图2.节图霉属菌种MTCC5479（1000X）的微观形态； 
图3.关于节图霉属菌种的酶活性谱； 
图4.在漆酶纯化中的分析步骤； 
图5.通过SDS-PAGE估计节图霉属漆酶的分子量。使用的分子量标记是磷酸化酶b（97kDa）、牛血清白蛋白（67kDa）、卵白蛋白（45kDa）和碳酸酐酶（30kDa）； 
图6.节图霉属漆酶的MALDI-ToF分析； 
图7.节图霉属漆酶的等电聚焦； 
图8.用于轻褪色效应的粗斜纹棉布漂白； 
图9.用于重褪色效应的粗斜纹棉布漂白； 
图10.用于去除返沾色的粗斜纹棉布的节图霉属漆酶处理。 
节图霉属菌种（Arthrographis sp.）MTCC5479：保藏日期：2009年6月5日；保藏单位：微生物典型培养物保藏和基因银行(Microbial Type Culture Collection and Gene Bank)MTCC 
具体实施方式
发明详述 
下述实施例作为本发明的举例说明给出，并且因此不应解释为限制本发明的范围。 
实施例 
实施例1 
由真菌节图霉属菌种MTCC5479菌株产生漆酶。 
通过在包含下述成分的无菌液体培养基中使节图霉属菌株生长来产生漆酶： 
Figure BDA00002837044500051
使真菌菌株节图霉属菌种MTCC5479在酵母、蛋白胨和右旋糖（YPD）琼脂平板上生长，并且温育6-7天。通过用无菌环刮擦琼脂平板的表面从平板中收集菌丝团和孢子，并且接种到含有100ml YPD培养基的500ml烧瓶内，并且在30℃温育3天。获得的细胞团用作接种物，以接种含有500ml生产培养基的10个烧瓶。含有接种的生产培养基的烧瓶在30℃在旋转振荡器上以180rpm的速度温育72小时。在72小时后，加入二甲苯胺0.00001-0.0001%（v/v），CuSO4.5H2O，0.0025-0.025%（w/v）或100μΜ-1000μΜ作为诱导物，用于漆酶生产。将生产烧瓶在静止条件下在30℃进一步温育。如实施例3中所述，通过每24小时间隔取出培养物和测定培养上清液来监控酶合成的开始和进展。 
在30℃温育约12-15天后达到酶活性的峰后，使分泌到培养基内的漆酶与细胞团分离。获得的细胞外酶活性在9-14IU ml-1培养肉汤的范围中（图3）。 
尽管在摇瓶中证实了来自节图霉属漆酶的漆酶生产，但对用于漆酶生产的其他合适容器，例如托盘或发酵罐，微生物发酵领域的技术人员也可以根据这个目的而选用。 
实施例2 
从节图霉属菌种培养上清液中分离和纯化漆酶。 
通过以8000Xg离心10分钟，使真菌菌丝团与培养肉汤分离。使用30kDMWCO大小的超滤膜，将获得的上清液（4.1L）浓缩约20倍。 
将超滤液（180ml）装载到使用50mM乙酸钠缓冲液在pH5.5平衡的Q-琼脂糖柱（40ml）上，并且使用在相同缓冲液中的500mM氯化钠的0-50%线性梯度洗脱。将活性馏分合并且通过100%饱和的硫酸铵沉淀。将沉淀物装载到SephacrylS-200柱（200ml）上，并且通过在50mM乙酸钠缓冲液中的0.15MNaCl洗脱。将活性馏分合并且通过测定酶的分子量、等电点、比活性和其他性质进行分析。 
实施例3 
使用2,2'联氮双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸酯（ABTS）作为生色底物的漆酶活性测定[10] 
通过终点分光光度法测量漆酶活性。关于测定的条件如下给出。测定在分光光度计（Analytica Jena SPECORD600）的温度控制的比色室（cuvettechamber）中进行。 
Figure BDA00002837044500071
计算基于ABTS的氧化阳离子的消光系数，36mM-1cm-1。一单位的酶活性定义为在这些条件下氧化1μΜABTS/分钟的酶量。 
实施例4 
使用生色底物丁香醛连氮的漆酶活性测定。 
通过动力学分光光度测量法测量漆酶活性。关于测定的条件如下给出。测定在分光光度计（AnalyticaJenaSPECORD600）的温度控制的比色室中进行。 
Figure BDA00002837044500072
计算基于ΔA（t4-t3），氧化的丁香醛连氮的消光系数ε530nm，65mM-1cm-1。一单位的酶活性定义为在这些条件下氧化1μΜ丁香醛连氮/分钟的酶量。 
实施例5 
在酶制剂中的蛋白质估计。 
使用Bradford试剂（B-6916，Sigma chemicals，USA）和已知浓度的牛血清白蛋白溶液作为蛋白质标准，根据Bradford的方法估计酶制剂的蛋白质含量。 
实施例6 
来自节图霉属漆酶的纯化漆酶的比活性估计。 
纯化的酶制剂的比活性用国际单位/毫克蛋白质IU mg-1来确定。酶活性按实施例3和4中给出的方法进行测量。蛋白质含量按实施例5中给出的方法进行估计。就得到的SI单位nkatal而言，其比活性可以通过将国际单位乘以因子16.67进行计算。 
实施例7 
酶用于染料降解的应用。 
将下述染料以50mg/L的浓度溶解于50mMMcIlvaine缓冲液（柠檬酸盐-磷酸盐）缓冲液中。这些染料包括属于偶氮组、蒽醌组、吖啶组、二氨吖嗪组和活性染料的染料。将20ml染料溶液放进100ml体积的烧瓶中。 
1.亮蓝 
2.汽巴蓝 
3.结晶紫 
4.玫瑰红 
5.赤藓红 
6.吖啶橙 
7.孔雀绿 
8.中性红 
9.雷马素亮蓝（Remazolbrilliantblue） 
10.溴酚蓝 
11.刚果红 
12.甲基红 
13.棉蓝（酸性蓝） 
14.罗丹明B 
将超滤液形式的粗制酶加入染料溶液中，使其最终酶活性约为100单位/mL。同样设置再一组染料溶液。在第二组中，将一种介质分子——羟基苯并***（HOBT）加入至5.0mM的浓度。 
将烧瓶在30℃温育。在温育12小时和24小时后估计残留染料含量。 
含有介质1-HOBT的烧瓶显示在12小时内吖啶橙、亮蓝、汽巴蓝、玫瑰红、赤藓红、孔雀绿、中性红、溴酚蓝、雷马素亮蓝、结晶紫、刚果红、罗丹明B和棉蓝的超过90%脱色。 
在24小时内，在其中未加入介质（HOBT）的烧瓶中观察到吖啶橙、亮蓝、汽巴蓝、玫瑰红、赤藓红、孔雀绿、中性红、雷马素亮蓝、刚果红的90%降解。 
来自节图霉属菌种的漆酶用于降解纺织品染料的应用并不限于上文列出的染料数目。上文实验仅证实节图霉属漆酶降解属于不同组的纺织品染料的多功能性。对漆酶的应用和漆酶引发的反应中的不同介质熟悉的技术人员，也可以将来自节图霉属菌种的酶应用于降解除了本文提及外的染料。该酶还可以应用于下述场合：在合适的反应器中，染料和酶可以发生接触，从而达到降解染料的目的。 
实施例8 
用节图霉属漆酶处理粗斜纹棉布使其漂白，以便获得褪色的外观。 
脱浆粗斜纹棉布料片得自Rossari Biotech India Pvt.Ltd，Mumbai，印度。将该布料用自来水冲洗且切割成约1平方英寸样片（干重约800-900mg）。将粗斜纹棉布样片浸入含有25ml pH3.0的McIlvaine缓冲液的100ml锥形瓶中。将氧化还原介质乙酰丁香酮（4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮）和2,2'联氮双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸酯（ABTS）分别以1-5mg ml-1的浓度加入两个烧瓶中。ABTS以干燥粉末加入，而乙酰丁香酮以在乙醇中的溶液（50mg/ml）加入。使烧瓶中的粗斜纹棉布样片吸取缓冲液和介质5分钟。将节图霉属漆酶25IU加入每个烧瓶中，以便引发反应。将烧瓶在旋转振荡器中以45℃、180rpm速度温育。在60分钟后，从烧瓶中取出粗斜纹棉布样片，用自来水冲洗并且浸入含有与先前所述相同数量的新鲜缓冲液和介质的烧瓶中。加入酶（25U）并在45℃、180rpm的速度下再温育90分钟。在90分钟结束时，从烧瓶中取出粗斜纹棉布样片，用水清洗，使用熨平的滤纸印干。将结果拍照（图8，9）。 
实施例9 
通过节图霉属漆酶处理石头洗涤的粗斜纹棉布用以去除返沾色。 
石头洗涤的粗斜纹棉布织物得自当地市场。将粗斜纹棉布织物切割成约1平方英寸。将石头洗涤的（干重约800-900.mg）粗斜纹棉布样片浸入100ml锥 形瓶中所含有的25mlMcIlvaine缓冲液，pH3.0中。将氧化还原介质乙酰丁香酮（4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮）和2,2'联氮双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸酯（ABTS）分别以1-5mgml-1的浓度加入两个烧瓶中。ABTS以干燥粉末加入，而乙酰丁香酮以在乙醇中的溶液（50mg/ml）加入。使烧瓶中的粗斜纹棉布样片吸取缓冲液和介质5分钟。将节图霉属漆酶25IU加入每个烧瓶中，以便起始反应。将烧瓶在旋转振荡器中以45℃、180rpm速度温育。在90分钟后，将粗斜纹棉布样片用水清洗，使用熨平的滤纸印干。将结果拍照（图10）。 
8和9中给出的实施例证实节图霉属漆酶在漂白粗斜纹棉布用于获得褪色外观效应或增强石头洗涤的粗斜纹棉布中的对比度中的功效。然而，熟悉漆酶进行漂白的技术人员也可以将来自节图霉属漆酶的漆酶应用于处理由粗斜纹棉布织物制成的衣服。 
实施例10 
漆酶在O-琼脂糖上的固定。 
如实施例2中所述的通过离子交换色谱法部分纯化的酶针对50mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲液pH6.0透析。使用Amicon离心超滤装置，将酶溶液浓缩以减少其体积。浓缩的酶溶液具有1200IU/ml的活性。将Q-琼脂糖装进柱中，并且在pH6.0平衡，并且随后转移到25ml烧瓶内。将含有1220Uml-1的20ml漆酶浓缩液加入在pH6.0平衡的2mlQ-琼脂糖中，并且使其与Q-琼脂糖结合30分钟。通过过滤使未结合的酶穿过Whatman1号滤纸而从Q-琼脂糖中去除。将在其上吸附了酶的琼脂糖悬浮于含有1mM1,3-丙亚胺的缓冲液pH6.0中，并且在室温温育1小时。在1小时后，将1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDGE）加入悬液中，并且通过将管倒转数次混合。1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDGE）的数量可以为0.05mM-10mM的范围。随后将悬液维持在室温过夜，并且随后用柠檬酸盐磷酸盐缓冲液pH4.0洗涤。随后将琼脂糖悬浮于含有1mM甘氨酰甘氨酸的磷酸盐缓冲液pH6.0中，并且在室温温育6小时。在该封闭游离环氧乙烷基团的处理后，将悬液再次用50mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲液pH4.0洗涤。固定化的漆酶制剂的最终活性是10,000IUgm-1。 
实施例11 
固定化漆酶用于从葡萄汁和葡萄酒中去除酚类化合物的用途。 
来自节图霉属菌株的固定化漆酶用于澄清葡萄汁和葡萄酒的用途 
葡萄汁通过捣碎当地可买到的葡萄进行制备。通过以10,000Xg离心10分钟获得约100ml澄清的葡萄汁。葡萄汁的pH是约3.5。将根据实施例10中给出的方法固定在Q-琼脂糖上的2000单位漆酶加入30ml葡萄汁中，并且维持在15℃共48小时。葡萄汁随后以1000xg旋转2分钟用于回收固定化酶，并且随后以10,000rpm离心10分钟用于沉淀形成的酚类化合物。使用鞣酸作为标准，通过Denis法估计葡萄汁中的起始和残留酚类化合物。漆酶处理导致酚类化合物含量减少5.8倍。允许当地可买到的葡萄的葡萄汁使用其自身菌群发酵。通过以1000Xg旋转澄清发酵的葡萄酒。将2000单位的固定漆酶加入葡萄酒中，并且使其在15℃静置48小时。 
随后首先将葡萄酒通过Whatman1号滤纸且随后通过0.5微米滤器过滤。使用鞣酸作为模型酚类化合物，通过Denis法测定起始和残留酚类化合物含量。通过漆酶处理，酚类化合物含量的减少是3倍。 
发明优点 
1.节图霉属菌株产生的漆酶不被足量的葡萄糖或氮所抑制。 
2.漆酶的生产处于液面下发酵以及固态培养的状态。 
3.产生的漆酶是细胞外的，具有10,000-20,000IU/升培养上清液的高得率，并且可以从培养上清液中容易地纯化。 
4.产生的漆酶在染料降解中提供广泛的特异性。无细胞酶能够降解属于不同染料组的染料，例如偶氮染料、三苯基甲烷染料、活性染料、蒽醌染料、二氨吖嗪染料和吖啶染料。 
5.此类不同染料组通过单一细胞外漆酶的降解迄今为止仍未见有报道。 
6.当ABTS用作用于粗斜纹棉布漂白的介质时，粗斜纹棉布的节图霉属漆酶处理能够在粗斜纹棉布上产生重度褪色的外观。这提供了一种使用次氯酸盐处理在粗斜纹棉布上产生重度褪色的外观的备选方法。 
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Claims (8)

1.一种从节图霉属菌种MTCC5479菌株中分离漆酶的方法，其包括：
a.如本文所描述使节图霉属菌种MTCC5479菌株在无菌液体培养基中生长；
b.用步骤a中获得的菌株接种含有生产培养基的烧瓶；
c.使步骤b中获得的培养基30℃下在旋转振荡器上以约180rpm的速度温育接近72小时；
d.在72小时后，用二甲苯胺0.00001-0.0001%（v/v），CuSO4.5H2O，0.0025-0.025%（w/v）或100μΜ-1000μΜ诱导步骤c中获得的培养物；
e.使步骤d中获得的培养物在接近30℃温育约12-15天；
f.取出步骤e中获得的培养物，并且通过以接近8000Xg离心接近10分钟，使分泌到培养基内的漆酶与细胞团分离；
g.通过本文描述的方法浓缩且纯化步骤f中获得的酶。
2.如权利要求1中所述的方法，其中，所述漆酶的得率范围为9-14IU/ml。
3.通过如权利要求1-2中要求的方法产生的漆酶，其特征在于，具有：
I.通过SDS-PAGE测得接近63kDa，或通过MALDI-ToF方法测得58.33kDa的分子量；
II.约3.5的pI；
III.在30℃，针对在50mMMcIlvain缓冲液，pH4.0中的1mMABTS的比活性是接近347IUmg-1或5784nkatalmg-1，以及，在30℃，使用在50mMMcIlvain缓冲液，pH5.5中的0.02mM丁香醛连氮，比活性为6380IUmg-1或10635nkatalmg-1；
IV.具有Seq Id.No.l的N末端氨基酸序列。
4.如权利要求3中所述的漆酶，其中，所述酶在pH2.5-8.5、优选在pH3-5.5起作用。
5.如权利要求3中所述的漆酶，其中，所述酶在温度30-70℃、优选在温度35-50℃在染料降解处理中是有效的。
6.如权利要求3中所述的漆酶，其中，在与惰性物质或盐掺和或者混合以增加其贮存期限之后，所述的酶制剂为液体、粉末或颗粒的形式。
7.如权利要求3中所述的漆酶，其对于降解以单独或混合物形式的纺织品染料有用，所述纺织品染料包括偶氮、三苯基甲烷、靛青、红色（erythroid）的一组染料。
8.如权利要求3中要求的漆酶，其对于去除污点、对于漂白浆料、对于处理纤维用以增白、对于动物毛发包括羊毛着色、对于处理废水中的一种或多种纺织品染料、对于燃料电池中的阴极制作、对于基于苯酚单体聚合而成的涂料和粘着剂配制是有用的，其中，漆酶具有令人满意的应用。
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