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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Partikel
auf Acrylsäurebasis
zum Zweck der Aufreinigung biologischer Substanzen.
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Im Bereich der Biowissenschaften
werden in zunehmendem Maße
magnetische Polymerpartikel für
die Analyse, Diagnostik oder Aufreinigung von Zellen und Biomolekülen wie
Antikörpern
oder anderen Proteinen, Nukleinsäuren
und anderen Biopolymeren eingesetzt.
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Bei diesen sogenannten Magnetbeads
handelt es sich um ein aus einer Polymerhülle bestehendes, vorzugsweise
perlförmiges
Partikel mit einer Teilchengröße von 1
bis 100 μm,
in das ein magnetisches Kolloid oder eine mikro- bzw. nanopartikuläre magnetische
Substanz (z.B. Magnetit) eingekapselt ist und so dem Polymerteilchen
magnetische Eigenschaften verleiht. Zur Auftrennung von Biomolekülen oder
Zellen können
bestimmte Liganden („Fängermoleküle") an
die Polymerhülle
chemisch gekoppelt werden, die die Biomoleküle oder Zellen selektiv zu binden
vermögen.
Durch magnetische Separation, im einfachsten Fall durch Anlegen
eines Handmagneten an das Reaktionsgefäß, können die betreffenden Zielsubstanzen
aus dem Substanzgemisch abgetrennt und analysiert werden.
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Die Verwendung magnetischer Polymerpartikel
bietet gegenüber
den klassischen chromatographischen Trennverfahren zwei entscheidende
Vorteile:
- a) Man arbeitet in einer Suspension,
wodurch eine Reaktionskinetik ähnlich
der einer homogenen Lösung
gegeben ist,
- b) der Trennvorgang gegenüber
den herkömmlichen
Verfahren wird um den Faktor 10 bis 100 verkürzt. Ferner kann bei der Nukleinsäure-Auftrennung
der zeitaufwendige Zentrifugationsschritt gänzlich umgangen werden.
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In der PCT Anmeldung WO 99/62079
werden magnetische Nanopartikel mit einer Teilchengröße <0,3 μm beschrieben,
die durch Beschichten eines magnetischen Oxids mit einem chelatierenden Stabilisator
wie Gelatine, Polyethylenimin, Polyaminen, Dextran, Chitosan, Polylysin,
Polyvinylpyrrolidon oder Proteinen gewonnen werden. Ein Einsatz dieser
Teilchen in der Nukleinsäure-Aufreinigung ist nicht
möglich.
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Magnetische Eisen-Dextran Mikropartikel sind
in der U.S. Patentschrift 4,452,773 beschrieben. Durch Mischen einer
Fe(II)- und Fe(III)-Salzlösung
in Gegenwart einer definierten Menge Dextran und anschließende Zugabe
von Alkali werden 30-40 nm große,
kolloidale Eisenoxid-Teilchen gewonnen, an die Dextran adsorbiert
ist. Ein ähnliches
Verfahren liegt der PCT Anmeldung WO 90/07380 zugrunde. Es werden
Fe(II)- und Fe(III)-Salzlösungen
unter Zugabe von Dextran bei 40°C
behandelt und anschließend
mit NaOH titriert, aufgrund dessen superparamagnetische Partikel
mit einer Größe von 40-100
nm erhalten werden. Der Nachteil beider Verfahren im Hinblick auf
rasche und einfache Abtrennung besteht darin, daß aufgrund der Feinheit der
Partikel eine Separation nur mittels eines hochgradienten Magnetfeldes
(„Hiugh
Gradient Magnetic Field") möglich
ist. Ein hochgradientes Magnetfeld wird durch eine mit Stahlwolle
dicht-gepackte Säule
erzeugt, die sich zwischen den Polschuhen zweier starker Elektro- bzw.
Handmagnete befindet. Die Trennung der Teilchen erfolgt durch Hindurchleiten
der Suspension durch die gefüllte
Trennsäule.
Eine Abtrennung solcher Kolloide ist mittels herkömmlicher
Handmagnete nicht möglich.
Grundsätzliche
experimentelle Unterschiede zu der herkömmlichen Chromatographietechnik
bestehen somit kaum. (Erschwerend für den Nachweis dieser Magnetpartikel
ist ferner der Umstand, daß die
Teilchen unter dem Lichtmikroskop nicht mehr sichtbar sind.
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Die U.S. Patentschrift 4,647,447
beschreibt die Herstellung ferromagnetischer Partikel für die NMR-Diagnostik.
Hierbei wird entweder von Fe(II)/Fe(III)-Salzlösungen oder direkt von mikropartikulären Ferriten
ausgegangen, die in Gegenwart eines Komplexbildners wie z.B. Serum
Albumin, Polysacchariden, Dextran oder Dextrin zu Magnetsuspensionen
umgesetzt werden.
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Aus der U.S. Patentschrift 4,070,246
ist ein mit p-Aminobenzoesäure
und einem Aldehyd unter Zugabe eines ferromagnetischen Pulvers umgesetztes
Produkt bekannt, mit dem jedoch eine Nukleinsäure-Aufreinigung nicht möglich ist.
Die Herstellung definierter perlförmiger Partikel, wie sie für diagnostische
Tests erforderlich sind, ist mit diesem Verfahren ebenfalls nicht
durchführbar. Ähnliches
gilt auch für die
in den U.S. Patentschriften 4,106,448, 4,136,683 und 4,735,796 beschriebenen
Verfahren zur Herstellung von Dextran eingekapselten magnetischen
Partikeln für
die Diagnostik und die Tumortherapie.
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Serum Albumin-, Polypeptid- oder
Polysaccharid-beschichtete superparamagnetische Eisenoxid-Partikel,
die als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik eingesetzt werden können, sind
in dem U.S. Patent 4,827,945 beschrieben.
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Die Herstellungen von Eisenoxiden
durch Ausfällen
von Eisensalzen in Gegenwart von Dextranen oder Polyglutaraldehyden
gehen aus den U.S. Patenten 2,870,740 und 4,267,234 hervor.
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Allen vorgenannten Verfahren und
Produkten ist gemeinsam, daß die
ferromagnetischen oder superparamagnetischen Partikel erst durch
Ausfällen einer
Fe-Salzlösung, die
ein bestimmtes molares Verhältnis
von Fe(II) und Fe(III)-Salzen voraussetzt, in Gegenwart eines Komplexbildners
bzw. Beschichtungsagens hergestellt werden.
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Die Synthese magnetischer Albumin-
oder Protein-beschichteter Mikropartikel für die Virus- und Zell-Separation
sowie für
diagnostische Tests ist Gegenstand der U.S. Patente 4,345,588; 4,169,804; 4,115,534;
4,230,685; 4,247,406 und 4,357,259.
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Definierte perl- bzw. kugelförmige Partikel, lassen
sich mit den vorgenannten Verfahren nicht herstellen. Die Abtrennung
der magnetischen Fraktionen ist darüber hinaus mittels einfacher
Handmagnete, wie sie für
schnelle Separationsprozesse erforderlich ist, nicht möglich.
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Perlförmige Magnetpartikel sind aus
den U.S. Patenten 4,861,705 bekannt. Es werden Agarose-Polyaldehyd-Komposit-Partikel
durch Suspension der Polymerphase in einer Öl-Phase gewonnen. Die Polymerpartikel
weisen eine Teilchengröße von 40-1000 μm auf.
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Kugelförmige Partikel aus Polyacrylaten oder
Polystyrol werden in dem U.S. Patent 4,654,267 beschrieben, die
mittels Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Anschließend werden
die Teilchen in einer organischen Phase unter definierten Bedingungen
gequollen. Es folgt eine Inkubation der Polymerpartikel in einer
Eisen-Salzlösung,
die, nachdem sie in die Teilchen diffundiert ist, mittels Ammoniak
zu superparamagnetischen Eisenoxiden oxidiert werden. Das Verfahren
liefert perlförmige
Partikel mit Korngrößen zwischen
0.5 und 20 μm.
Das Verfahren ist technisch sehr aufwendig. Neben der Verwendung hochtoxischer
Substanzen beträgt
der Zeitaufwand für
die Präparation
der Grundmatrix 10-30 Stunden. Ferner bedarf es zusätzlicher
Nitro-, Nitroso- oder Amino-Gruppen,
die durch einen zusätzlichen
Präparationsschritt
in die Polymermatrix eingeführt
wird, um eine ausreichende Adsorption der Fe-Salze zu gewährleisten.
Der entscheidende Nachteil der dort beschriebenen Partikel liegt
in dem Grundpolymeren Polystyrol begründet. Polystyrol stellt ein äußerst hydrophobes
Material dar, das im Kontakt mit Proteinlösungen oder anderen Biomolekülen stark
zur unspezifischen Adsorption neigt, ein Phänomen, das besonders bei Separationsprozessen
nachteilig ist. Ein Einsatz der dort beschriebenen Partikel in der
Nukleinsäure-Aufreinigung
ist nicht möglich.
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In der PCT Anmeldung W092/22201 (identisch
mit DEOS 38 36 475 A1) werden Polystyrol Partikel beschrieben, die
in einem Zweischrittverfahren auf ein Magnetkolloid aufpolymerisiert
werden. Perlförmige
Partikel mit eindeutigen Kolloideinschlüssen sind nicht möglich. Das
Verfahren stellt einen zeit- (> 20
Std.) und arbeitsaufwendigen Prozess dar. Die Verwendung als DNA-Adsorber
ist nicht möglich.
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Gegenstand des französischen
Patentes No. 79 21 343/2463 807 sind Polystyrol-Beads, an die u.a.
anti-DNA Antikörper
oder Enzyme gekoppelt werden. Es wird eine Öl-in-Wasser-Dispersionspolymerisation
verwendet, die bei 90°C über mehrere Stunden
hinweg stattfindet und zu relativ großen Partikeln führt: >0,2 mm. Eine DNA Abtrennung
ist mit diesen Trägern
nicht möglich.
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In dem U.S. Patent 4,157, 323 werden Acrylat-Beads
für die
Zellseparation und -markierung beschrieben. Aufgrund der Feinheit
der Magnetpartikel (30-200 nm) können
diese Partikel nicht in routinemäßigen (automatisierten)
Separationen eingesetzt werden. Das Verfahren erfordert aufwendige Synthesebedingungen:
100 °C Synthesetemperatur, Argon-Atmosphäre, Gamma-Bestrahlung.
Eine DNA-Separationen ist nicht möglich.
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Die PCT Anmeldung WO 90/15666 beinhaltet
die Herstellung magnetischer Partikel, die durch Zucker- oder Vinylpolymere
stabilisiert (eingekapselt) werden. Das Verfahren erfordert aufwendige
Vernetzungsschritte mit z.B. Epichlorhydrin (extrem giftig) oder
Dibrompropanol.
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Polystyrol Komposit-Partikel (keine
perlförmigen
Teilchen) sind Gegenstand des U.S. Patentes 5,834,121. Eine eindeutige
Einkapselung des Magnetkolloids ist bei diesem Verfahren nicht möglich. Das
Kolloid liegt vielmehr auf der Oberfläche der Partikel auf. Dadurch
scheiden Anwendungen in der PCR sowie in der Nukleinsäure Separation
von vornherein aus. Das Verfahren findet unter Stickstoff-Atmosphäre bei 65-90°C über einen
Zeitraum von 24 Std. statt.
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Hua und Quian, J. Mater. Sci, Vol
36, 2001, 731 beschreiben Na-Polyacrylat Hydrogele, die mit Hilfe
der „reversed-phase"
Suspensions-Polymerisation unter Anwendung von Gammastrahlen hergestellt
werden. Zur Herstellung dieser Teilchen ist eine Gamma-Strahlen-Quelle
vonnöten.
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Die Präparation perlförmiger Polyacrylat-Partikel
(Hydroxyethyl-methacrylat, Methacrylsäure) unter Zuhilfenahme speziell
synthetisierter Polymethylmethacrlyate und Polystyrole als Stabilisatoren
werden von Takahashi et al. (J. Polymer Sci., Vol. 34, 1996, pp
175) beschrieben. Die Polymerisation findet in Toluol bei 70-75°C über einen
Zeitraum von 8 Stunden hinweg unter Stickstoff-Atmosphäre statt.
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Eine weiteres Verfahren zur Herstellung
von Polyhydroxymethylmethacnlat-Mikropartikeln,
die für die
Metall-Chelat-Affinitäts-Chromatographie
einsetzbar sind, wird von Denizli et al. (Colloids and Surfaces,
Vol. 174, 2000, pp 307) beschrieben. Die Synthese findet über einen
Zeitraum von 24 Stunden bei 65°C
statt.
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Ein Fällungspolymerisat aus Acrylamid,
Methylenbis-Acrylamid und Methacrylsäure, das als Kernpartikel für die weitere
Polymerisation mit Styrol benutzt wird, ist von Kawaguchi et al.
(Polym. Int. Vol. 30, 1993, pp 225) beschrieben worden.
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Hirayama et al. (J. Chromatogr. A,
Vol. 676, 1994, pp 267) beschreiben die Synthese perlförmiger Mikropartikel
auf der Basis von N,Ndimethylaminopropylacrylamid für die Endotoxin
Adsorption. Die Synthesen finden bei 80°C über einen Zeitraum von 12 Stunden
statt. Die Teilchen weisen einen Durchmesser von >50 μm auf.
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Alle vorgenannten Verfahren auf Polyacrylat oder
Polystyrol-Basis stellen sehr zeitaufwendige Präparationstechniken dar, die
bis zu 24 Stunden dauern. Die Herstellung magnetischer Partikel,
die für
die Nukleinsäure-Aufreinigung
geeig net wären, sind
mit den Verfahren sowie den Produkten aus dem Stand der Technik
nicht realisierbar.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es daher, magnetische, perl- bzw. kugelförmige Mikropartikel bereitzustellen,
die für
die Abtrennung biologischer Substanzen, insbesondere für die Abtrennung von
Biopolymeren geeignet sind und die die Nachteile der aus dem Stand
der Technik bekannten Verfahren und Produkte, beispielsweise in
Bezug auf Herstellungsaufwand, Partikelgeometrie, magnetisches Separationsverhalten,
Korngröße, Funktionalität und Trenneigenschaften
vermeiden.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zur Herstellung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Partikel
auf Acrylsäurebasis zur
Aufreinigung biologischer Substanzen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
eine Mischung umfassend
- a) mindestens ein polares,
vorzugsweise ionisches, besonders bevorzugt kationisches Acrylat-Monomer,
- b) mindestens einen Vernetzer mit mindestens zwei nicht konjugierten,
e thylenisch ungesättigten
Doppelbindungen,
- c) gegebenenfalls mindestens ein zusätzliches, copolymerisierbares
was serunlösliches
monoethylenisch ungesättigtes
Monomer,
- d) mindestens einen Polymerisationsinitiator,
- e) mindestens eine magnetische Komponente sowie
- f) gegebenenfalls weitere Bestandteile
in einer mit
Wasser nicht mischbaren organischen Phase suspendiert und zu perlförmigen Polymerpartikeln
radikalisch vernetzt.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
sind unter „biologischen
Substanzen" insbesondere eukaryotische oder prokaryotische Zellen,
Viren, Biopolymere (Nukleinsäuren
wie DNA, RNA, PNA und Antikörper
sowie andere Proteine und Proteinfragmente), sonstige Biomoleküle (z. B.
Zucker) und auch chemisch modifizierte oder natürlich vorkommenden biologischen
Substanzen nachemp fundene Verbindungen zu verstehen, beispielsweise
durch Anlagerung von Polyethylenglykol modifizierte Proteine, oder
Nukleinsäuren,
die vollständig
(alle Nukleotide) oder teilweise (nur einige Nukleotide) modifiziert
sind (Nukleinsäurederivate),
beispielsweise durch:
- – Veränderung der Internucleosidbrücken: Austausch
von Phosphodiestern gegen Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphorothioate oder
Hydroxylamine;
- – Veränderung
der Zuckerkomponenten: Austausch der Ribose gegen diverse Hexo-
bzw. Pentopyranosen oder 3'-5'-carbocyclisch verbrückte Derivate
der 2'-Deoxyribose (Steffens R & Leumann
CJ (1997) Tricyclo-DNA: A phosphodiester-backbone based DNA analog
exhiubiting strong comlementary base-pairing properties. J. Am.
Chem. Soc. 119, 11548-11549);
- – Austausch
des Strangrückgrats:
Austausch der Polyesterketten auf Basis von Zucker-Phosphat-Einheiten
gegen Carboxamidketten auf Basis von Aminosäurederivaten wie N-(2-Aminoethyl)-glycin-Einheiten.
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Erfindungsgemäß einsetzbare Monomere a) sind
beispielsweise Acrylsäure,
Methacrylsäure, Acrylamid,
Methacrylamid, Dimethylaminoethylacrylat, Diethylamino-ethylacrylat,
Dimethylaminoneopentylacrylat und Dimethylaminoethylmethacrylat, Dimethylaminopropylacrylat,
Dimethylaminoneopentylacrylat und Dimethylaminoneopentylmethacrylat. Die
basischen Acrylate und Methacrylate werden vorzugsweise in Form
ihrer Salze mit starken Mineralsäuren,
Sulfonsäuren
oder Carbonsäuren
oder in quaternisierter Form verwendet.
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Weitere geeignete Monomere a) sind
Sulfoethylacrylat, Sulfoethylmethacrylat, Sulfopropylacrylat, Sulfopropylmethacrylat,
2-Hydroxy-3-methacryloxypropylsulfonsäure und 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure.
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Die Säuregruppen der vorgenannten
Säuren können entweder
in nicht neutralisierter Form oder in partiell bzw. bis zu 100%
neutralisierter Form bei der Polymerisation eingesetzt werden.
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Bevorzugte Monomere der Gruppe a)
sind Acrylsäure,
Methacrylsäure,
Acrylamid, Methacrylamid, Acrylamidopropansulfonsäure und
insbesondere Metha crylsäure-2-dimethylaminoethylester,
Acrylsäure-[2-(dimethylamino)-ethylester],
Acrylsäure-[3-(dimethylamino)-propylester]
oder Methacrylsäure-2-diethylaminoethylester
sowie Mischungen dieser Monomere.
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Diese Monomeren können in jedem beliebigen Verhältnis miteinander
copolymerisiert werden, wobei besonders bevorzugt partiell neutralisierte Säuren verwendet
werden. Bevorzugte Monomergemische a) sind Acrylsäure und/oder
Methacrylsäure; (Meth)acrylsäure/Ester
der (Meth)acrylsäure
mit C1 bis C4-Alkanolen,
z. B. n-Butylacrylat. Die (Meth)acrylsäure kann dabei teilweise oder
vollständig
als Salz vorliegen. Weitere bevorzugt verwendete Monomergemische
a) sind z. B. Acrylsäure
und/oder Alkaliacrylat/Methacrylsäure, Acrylsäure/Alkaliacrylat, Acrylsäure und/oder
Alkaliacrylat/Acrylamidopropansulfonsäure, Acrylsäure und/oder Alkaliacrylat/Acrylamid,
Acrylamid/Dimethylaminoethylacrylatmethochlorid.
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Die Monomere a) werden in einer Menge
von 10 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise von 20 bis 90 Gew.-%, insbesondere
von 30 bis 90 Gew.-%, bezogen auf die eingesetzte Monomergesamtmenge
eingesetzt.
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Zur Herstellung vernetzter Polymerisate
enthält
die Mischung wenigstens einen Vernetzen b) mit mindestens zwei nicht
konjugierten, ethylenisch ungesättigten
Doppelbindungen.
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Geeignete Vernetzen sind beispielsweise N,N'-Methylenbisacrylamid,
Polyethylenglykoldiacrylate und Polyethylenglykoldimethacrylate,
die sich jeweils von Polyethylenglykolen eines Molekulargewichts
von 120 bis 8500, vorzugsweise 400 bis 2000, ableiten, Trimethylolpropantriacrylat,
Trimethylolpropantrimethacrylat, Ethylenglykoldiacrylat, Propylenglykoldiacrylat,
Butandioldiacrylat, Hexandioldiacrylat, Hexandioldimethacrylat,
Diacrylate und Dimethacrylate von Blockcopolymerisaten aus Ethylenoxid
und Propylenoxid, zweifach bzw. dreifach mit Acrylsäure oder
Methacrylsäure
veresterte mehrwertige Alkohole, wie Glycerin oder Pentaerythrit,
Triallylamin, Tetraallylethylendiamin, Divinylbenzol, Diallylphthalat,
Polyethylenglykoldivinylether von Polyethylenglykolen eines Molekulargewichts
von 126 bis 4000, Trimethylolpropandiallylether, Butandioldivinylether,
Pentaerythrittriallylether und/oder Divinylethylenharnstoff.
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Vorzugsweise setzt man wasserlösliche Vernetzer
ein, z. B. 1,1,1,-Tris(hydroxymethyl)propantriacrylat, 3-(acryloyloxy)-2-hydroxypropylmethacrylat, Methacrylsäureallylester,
Acrylsäuevinylester N,N'-Methylen-bisacrylamid,
Polyethylenglykoldiacrylate und Polyethylenglykoldimethacrylate,
die sich von Additionsprodukten von 2 bis 400 Mol Ethylenoxid an
1 Mol eines Diols oder Polyols ableiten, Vinylether von Additionsprodukten
von 2 bis 400 Mol Ethylenoxid an 1 Mol eines Diols oder Polyols,
Ethylenglykoldiacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat oder Triacrylate
und Trimethacrylate von Additionsprodukten von 6 bis 20 Mol Ethylenoxid
an ein Mol Glycerin, Pentaerythrittriallylether und/oder Divinylharnstoff.
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Als Vernetzer b) sind außerdem Verbindungen
geeignet, die mindestens eine polymerisierbare ethylenisch ungesättigte Gruppe
und mindestens eine weitere funktionelle Gruppe enthalten. Die funktionelle
Gruppe dieser Vernetzer muß in
der Lage sein, mit den funktionellen Gruppen, im wesentlichen den
Carboxylgruppen oder Sulfonsäuregruppen
der Monomeren a) zu reagieren. Geeignete funktionelle Gruppen sind
z. B. Hydroxyl-, Amino-, Epoxi-, Isocyanat-, Ester-, Amid- und Aziridinogruppen.
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Als Vernetzer b) kommen außerdem solche Verbindungen
in Betracht, die mindestens zwei der vorgenannten funktionellen
Gruppen tragen, die mit Carboxyl- und Sulfonsäuregruppen der Monomeren a)
reagieren können.
Beispiele für
solche Vernetzer b) sind Ethylenglykol, Diethylenglykol, Triethylenglykol,
Tetraethylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin, Polyglycerin, Propylenglykol
Diethanolamin, Triethanolamin, Polypropylenglykol, Blockcopolymerisate aus
Ethylenoxid und Propylenoxid, Sorbitanfettsäureester, ethoxylierte Sorbitanfettsäureester,
Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Polyvinylalkohol, Sorbit, Polyglycidylether
wie Ethylenglykoldiglycidylether, Polyethylenglykoldiglycidylether,
Glycerindigly cidylether, Glycerinpolyglycidylether, Diglycerinpolyglycidylether,
Polyglycerinpolyglycidylether, Sorbitpolyglycidylether, Pentaerythritpolyglycidylether,
Propylenglykoldiglycidylether und Polypropylenglykoldiglycidylether,
Polyaziridinverbindungen wie 2,2-Bishydroxymethylbutanoltris[3-(I-aziridinyl)propionat],
1,6-Hexamethylen-diethylenharnstoff,
Diphenylmethan-bis-4,4'-N,N'-diethylenharnstoff, Halogenepoxyverbindungen
wie Epichlorhydrin und a-Methylfluorhydrin, Polyisocyanate wie 2,4-Toluylendiisocyanat und
Hexamethylendiisocyanat, Alkylencarbonate wie 1,3-Dioxolan-2-on
und 4-Methyl-1,3-dioxolan-2-on, polyquaternäre Amine wie Kondensationsprodukte von
Dimethylamin mit Epichlorhydrin, Homo- und Copolymere von Diallyldimethylammoniumchlorid
sowie Homo- und Copolymerisate von Dimethylaminoethyl(meth)acrylat,
die gegebenenfalls mit beispielsweise Methylchlorid quaterniert
sind.
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Weitere geeignete Vernetzer b) sind
polyvalente Metallionen, die in der Lage sind, ionische Vernetzungen
auszubilden. Beispiele für
solche Vernetzer sind Magnesium-, Calcium-, Barium- und Aluminiumionen.
Diese Vernetzen werden beispielsweise als Hydroxide, Carbonate oder
Hydrogencarbonate der wäßrigen polymerisierbaren
Lösung
zugesetzt.
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Weitere geeignete Vernetzen sind
multifunktionelle Basen, die ebenfalls in der Lage sind, ionische
Vernetzungen auszubilden, beispielsweise Polyamine oder deren quaternierte
Salze. Beispiele für Polyamine
sind Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin,
Pentaethylenhexamin und Polyethylenimine sowie Polyvinylamine mit
Molmassen von jeweils bis zu 4000000.
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Die vorgenannten Vernetzer b) können einzeln
oder in Mischungen verwendet werden.
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Die Monomeren b) werden in einer
Menge von 0,01 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise von 0,1 bis 30 Gew.-%,
insbesondere von 0,5 bis 20 Gew.-%, bevorzugt von 0.5 bis 15 Gew.-%,
besonders bevorzugt von 0.5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Monomergesamtmenge,
eingesetzt. Für
die Herstellung hochporöser
Träger
(Porenweite >50 nm)
werden in der Regel Vernetzerkonzentrationen zwischen 0,5 und 1 Gew.%
eingesetzt.
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Erfindungsgemäß geeignete Monomere c) sind
solche monoethylenisch ungesättigte
Monomere, die mit den Monomeren a) und b) copolymerisierbar sind.
Hierzu gehören
beispielsweise die Amide und Nitrile von monoethylenisch ungesättigten
Carbonsäuren,
z. B. Acrylamid, Methacrylamid und N-Vinylformamid, Acrylnitril
und Methacrylnitril, Dialkyldiallylammoniumhalogenide wie Dimethyldiallylammoniumchlorid,
Diethyldiallylammoniumchlorid, Allylpiperidiniumbromid, N-Vinylimidazole
wie z. B. N-Vinylimidazol, 1-Vinyl-2-methylimidazol und N-Vinylimidazoline
wie N-Vinylimidazolin, 1-Vinyl-2-methylimidazolin, 1-Vinyl-2-ethylimidazolin
oder 1-Vinyl-2-propylimidazolin, die gegebenenfalls in Form der
freien Basen, in quaternisierter Form oder als Salz bei der Polymerisation
eingesetzt werden können.
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Außerdem eignen sich Dialkylaminoalkylacrylate
und Dialkylaminoalkylmethacrylate, Dimethylaminoethylacrylat, Dimethylaminoethylmethacrylat,
Diethylaminoethylacrylat und Diethylaminoethylmethacrylat. Die basischen
Ester werden vorzugsweise in quaternisierter Form oder als Salz
eingesetzt.
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Weitere geeignete Verbindungen c)
sind beispielsweise Vinylester von gesättigten C1- bis C4-Carbonsäuren wie
Vinylformiat, Vinylacetat oder Vinylpropionat, Alkylvinylether mit
mindestens 2 C-Atomen in der Alkylgruppe, wie z.B. Ethylvinylether oder
Butylvinylether, Ester von monoethylenisch ungesättigten C3- bis C6-Carbonsäuren, z.
B. Ester aus einwertigen C1- bis C18-Alkoholen und Acrylsäure wie
z. B. Methylacrylat, Ethylacrylat, Propylacrylat, Isopropylacrylat,
n-Butylacrylat, Isobutylacrylat, Hexylacrylat, 2-Ethylhexylacrylat,
Stearylacrylat, die entsprechenden Ester der Methacrylsäure, Fumarsäure oder
Maleinsäure,
Halbester von Maleinsäure, z.B.
Maleinsäuremonomethylester
und Hydroxyalkylester der genannten monoethylenisch ungesättigten Carbonsäuren, z.
B. 2-Hydroxyethylacrylat,
Hydroxypropylacrylat, Hydroxybutylacrylat, Hydroxyethyl methacrylat,
Hydroxypropylmethacrylat und Hydroxybutylmethacrylat, N-Vinyllactame wie
N-Vinylpyrrolidon oder N-Vinylcaprolactam, Acrylsäure- und
Methacrylsäureester
von alkoxylierten einwertigen, gesättigten Alkoholen, z. B. von
Alkoholen mit 10 bis 25 C-Atomen, die mit 2 bis 200 Mol Ethylenoxid
und/oder Propylenoxid pro Mol Alkohol umgesetzt worden sind, sowie
Monoacrylsäureester
und Monomethacrylsäureester
von Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol, wobei die Molmassen
(MM) der Polyalkylenglykole beispielsweise bis zu 2000 betragen
können. Weiterhin
geeignete Monomere der Gruppe c) sind alkylsubstituierte Styrole
wie Ethylstyrol oder tert. Butylstyrol.
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Die Monomeren c) können auch
als binäre oder
ternäre
Mischungen bei der Copolymerisation mit den anderen Monomeren eingesetzt
werden, z. B. Mischungen aus Vinylacetat und 2-Hydroxyethylacrylat
in beliebigem Verhältnis.
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Bevorzugte Monomere c) sind 2-Hydroxyethylmethacrylat,
Acrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat, Vinylacetat,
(Meth)acrylamid, (Meth)acrylsäureester, vinylaromatische
Verbindungen und N-Vinyllactame, insbesondere N-Vinylpyrrolidon.
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Gegebenenfalls setzt man die Monomere der
Gruppe c) in Mengen von 0,5 bis 60 Gew.-%, insbesondere 0,5 bis
50 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 40 Gew.-%,
besonders bevorzugt 5 bis 30 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt
5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt zur Polymerisation gelangenden
Monomere ein.
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Als Polymerisationsinitiatoren d)
können sämtliche
unter den Polymerisationsbedingungen in Radikale zerfallende Verbindungen
eingesetzt werden, z. B. Peroxide, Hydroperoxide, Wasserstoffperoxid,
Persulfate, Azoverbindungen sowie Redoxkatalysatoren.
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Bevorzugt ist der Einsatz von wasserlöslichen
Initiatoren. In manchen Fällen
ist es vorteilhaft, Mischungen verschiedener Polymerisationsinitiatoren
zu verwen den, z. B. Mischungen aus Wasserstoffperoxid und Natrium-
oder Kaliumperoxidisulfat. Mischungen aus Wasserstoffperoxid und
Natriumperoxidisulfat können
in jedem beliebigen Verhältnis verwendet
werden.
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Geeignete organische Peroxide sind
beispielsweise Acetylacetonperoxid, Methylethylketonperoxid, tert.-Butylhydroperoxid,
Cumolhydroperoxid, tert.-Amylperpivalat, tert.-Butylperpivalat, tert.-Butylperneohexanoat,
tert.-Butyl-perisobutyrat, tert.-Butylper-2-ethylhexanoat, tert.-Butylperisononanoat,
tert.-Butylpermaleat, tert.-Butylperbenzoat, tert.-Butylper-3,5,5-tri-methylhexanoat
und tert.-Amylperneodekanoat.
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Besonders geeignete Polymerisationsinitiatoren
sind N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat
(APS), durch deren kombinierte Zugabe eine signifikante Beschleunigung
der Polymerisation erzielt werden kann.
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Die bevorzugten Konzentrationen von
TEMED und APS (40%ige wäßrige Lösung) liegen,
bezogen auf die Monomerphase, im Bereich von 1-10 Vol. % für TEMED
und 1-20% für
APS, wobei generelle eine steigende Konzentration an TEMED und APS
mit einem proportionalen Anstieg der Polymerisationsgeschwindigkeit
einhergeht.
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Überraschenderweise
konnte gezeigt werden, daß die
oben beschriebene Polymerisationsbeschleunigung nur dann eintritt,
wenn die APS Zugabe zeitlich vor der TEMED Zugabe erfolgt. Auf diese Weise
kann die Polymerisation und somit die Beadbildung innerhalb weniger
Minuten abgeschlossen werden.
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Weiterhin geeignet sind wasserlösliche Azostarter,
z. B. 2,2'-Azobis-(2-amidinopropan)dihydrochlorid,
2,2'-Azobis-(N,N'-dimethylen)iso-butyramidindihydrochlorid, 2-(Carbamoylazo)isobutyronitril, 2,2'-Azobis
[2-(2'-imidazolin-2-yl)propan-dihydrochlorid
und 4,4,-Azobis-(4-cyanovaleriansäure).
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Als Initiatoren können weiterhin Redoxkatalysatoren
verwendet werden. Redoxkatalysatoren enthalten als oxidierende Komponente
mindestens eine der oben angegebenen Perverbindungen und als reduzierende
Komponente z. B. Ascorbinsäure, Glukose,
Sorbose, Ammonium- oder Alkalimetall-hydrogensulfit, – sulfit,
-thiosulfat, -hyposulfit, -pyrosulfit oder -sulfid, Metallsalze,
wie Eisen-II-ionen
oder Silberionen oder Natriumhydroxymethylsulfoxylat.
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Vorzugsweise verwendet man als reduzierende
Komponente des Redoxkatalysators Ascorbinsäure oder Natriumsulfit. Anstelle
der oxidierenden Komponente des Redoxkatalysators kann man auch einen
oder mehrere wasserlösliche
Azostarter verwenden.
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Die genannten Polymerisationsinitiatoren werden
in üblichen
Mengen eingesetzt, die in Abhängigkeit
von dem gewünschten
Reaktionsverlauf durch den Fachmann in geeigneter Weise angepaßt werden
können.
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Erfindungsgemäß geeignete magnetische Komponenten
e) sind insbesondere Magnetkolloide oder magnetische Pulver. Als
magnetische Kolloide bzw. Magnetpulver können grundsätzlich solche ferro-, ferri-
oder superparamagnetischen Substanzen eingesetzt werden, die eine
homogene Mischung mit der Monomerphase eingehen.
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Als bevorzugte magnetische Substanz
wird Magnetit mit Partikelgrößen im Bereich
von etwa 10 nm bis etwa 600 nm, insbesondere etwa 20 bis etwa 400
nm eingesetzt. Substanzen solcher Art sind z.B. unter der Handelsbezeichnung
Bayferrox im Handel erhältlich.
Die Herstellung solcher Kolloide ist allgemeiner Stand der Technik
und wurde u.a. von Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 1991, pp61,
Reimers und Khalafalla, Br. Patent 1,439,031 oder Kondo et al., Appl.
Microbiol. Biotechnol., Vol 41, 1994, pp 99, beschrieben.
-
Die Konzentrationen der Kolloide
in der Polymerphase liegen, jeweils bezogen auf die Monomerphase,
vorzugsweise im Bereich von etwa 5 bis etwa 30 Vol. %, insbesondere
5 bis 10 Vol.-% bei den Kolloiden, die herstellungsbedingt bereits
als wäßrige Kolloide
vorliegen, und im Bereich von etwa 1 bis etwa 20 Gew.-%, insbesondere
5 bis 10 Gew.-% bei den Festsubstanzen.
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Die magnetischen Eigenschaften der
erfindungsgemäß herstellbaren
Polymerpartikel werden durch direktes Zumischen eines geeigneten
Magnetkolloids oder magnetischen Pulvers vor der Suspension zu der
Monomerphase erzielt. Durch die Möglichkeit des genauen Zudosierens
der magnetischen Substanz können
parallel damit die magnetischen Eigenschaften der Polymerpartikel
in gezielter Weise eingestellt bzw. verändert werden. Dies ist vor
allem im Hinblick auf die die Trenneffizienz determinierenden magnetischen
Attraktionskräfte
der Teilchen von ausschlaggebender Bedeutung. Dieser einfach zu variierende
Verfahrensparameter zeichnet den erfindungsgemäßen Prozess gegenüber den
meisten aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung
magnetischer Träger
eindeutig aus.
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So sind in dem im U.S. Patent 4,654,267
beschriebenen Verfahren zur Herstellung magnetischer Partikel aufwendige
Quellungsprozesse mit Eisensalzen und anschließende Oxidation zum Magnetit erforderlich,
während
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
das magnetische Kolloid in einfacher Weise der Monomerphase zugesetzt
werden kann.
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Bei der anschließenden Suspension in der organischen
Phase werden die Magnet-Kolloide dann simultan in die sich bildenden
Polymertröpfchen
eingekapselt. Diese Verfahrensweise stellt eine deutliche verfahrenstechnische
Vereinfachung gegenüber
dem vorgenannten Verfahren dar, womit auch eine erhebliche Zeitersparnis
verbunden ist.
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Die Präparationszeiten bei dem vorgenannten
Verfahren aus dem Stand der Technik betragen zwischen 10 und 30
Stunden, das erfindungsgemäße Verfahren
benötigt
hingegen lediglich etwa 5 bis 15 Minuten zur Gewinnung der funktionalisierten
Magnetpartikel.
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Um eine möglichst feindisperse, gleichmäßige Verteilung
der Magnetpartikel in dem Polymeren zu gewährleisten, ist es vorteilhaft
eine kurzzeitige Beschallung der Monomermischung mit Hilfe eines Ultraschallfingers
oder in einem entsprechenden Ultraschallbad vorzunehmen oder, beispielsweise durch
Einsatz üblicher
Homogenisatoren, hohe Scherkräfte
auf die Mischung einwirken zu lassen.
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Neben der Beschallung können den
magnetischen Pulvern auch solche Substanzen zugesetzt werden, die
emulsionsstabilisierende Eigenschaften besitzen und dadurch eine
homogenere Verteilung der Magnetsubstanzen in der Monomerphase fördern. Substanzen
dieser Art sind z.B. Poly-N-Vinylpyrrolidon, Celluloseacetat-butyrat,
Serum-Albumin, aliphatische und aromatische Sulfonsäure-Derivate, Gelatine
oder Polyethylenglykole. Die Mengen der eingesetzten Emulgatoren
liegen zumeist im Bereich von etwa 0.5 bis etwa 5 Gew.-%, bezogen
auf die eingesetzte Magnetsubstanz.
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Die homogene Verteilung der Magnetsubstanzen
in der Monomerphase läßt sich
auch fördern, indem
man beispielsweise hohe Scherkräfte
auf die Mischung einwirken läßt. Dazu
verwendet man Homogenisatoren, die dem Fachmann bekannt sind.
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Beispielhaft seien genannt:
- – Labordissolver
Dispermat, Fa. VMA-Getzmann, Reichshof, DE
- – Ultra-Turax,
Fa. Janke und Kunkel, Staufen, DE
- – Druckhomogenisator,
Fa. Gaulin, Lübeck,
DE
- – Geräte mit einem
Rotor-Stator-System, etwa
- - Dispax, Fa. Janke und Kunkel, Staufen, DE
- – Cavitron-Homogenisatoren,
Fa. v. Hagen & Funke,
Sprochhövel,
DE
- – Homogenisatoren
der Fa. Kotthoff, Essen, DE
- – Homogenisatoren
der Fa. Dorr Oliver, Grevenbroich, DE.
-
Üblicherweise
betreibt man diese Geräte
bei Drehzahlen von 1000 bis 25.000 pro Minute, bevorzugt 2000 bis
25.000 pro Minute. Weiterhin können die
hohen Scherkräfte
ebenso durch
- – Hindurchpressen der Mischung
unter hohem Druck durch einen engen Spalt oder durch Düsen kleinen
Durchmessers,
- - Kolloidmühlen,
oder
andere geeignete Homogenisatoren erzeugt werden.
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Die erfindungsgemäß hergestellten Partikel weisen
vorzugsweise eine Teilchengröße im Bereich von
etwa 1 bis etwa 50 μm,
vorzugsweise 1 bis 30 μm,
insbesondere 1 bis 20 μm
auf. Solche Teilchengrößen haben
sich im Bereich der Separationstechnologie sowohl im Hinblick auf
eine rasche magnetische Abtrennung als auch in Bezug auf maximal
verfügbare
Teilchenoberflächen,
die ausschlaggebend für
die Trennkapazität
des Trägers
sind, als optimal herausgestellt.
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Die aus dem Stand der Technik bekannten Magnetpartikel
auf Polyacrylat-Basis weisen durchweg eine Partikelgröße >50 μm, solche auf Basis von Polystyrol
eine solche von <1 μm auf.
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Teilchengrößen im Bereich von etwa 1 bis etwa
50 μm zu
erhalten, wird überraschenderweise durch
die Verwendung von Ölen,
insbesondere Mineralöl,
tierischen oder pflanzlichen Ölen
(Pflanzenölen)
als Suspensionsmedium mit einer Viskosität im Bereich von 25 bis 150
mPa·s,
insbesondere im Bereich von 30 bis 80 mPa·s (bzw. Centipoise) ermöglicht.
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Vorzugsweise wird die Monomerphase
vor der Suspension in der organischen Phase etwa 5 bis etwa 180
Sekunden vorpolymerisiert.
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Erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbare Öle sind
ausgewählt
unter
- a) Mineralölen, d. h. flüssigen Destillationsprodukten,
die aus mineralischen Rohstoffen (Erdöl, Braun- u. Steinkohlen, Holz,
Torf) gewonnen wurden und die im wesentlichen aus Gemischen von gesättigten
Kohlenwasserstoffen bestehen,
- b) Ölen
tierischen Ursprungs, insbesondere technischen Fischölen, wie
Capelinöl,
Heringsöl,
Makrelenöl,
Orange-Roughy-Öl,
Sardinenöl,
Thunfischöl
und anderen, sowie
- c) Ölen
pflanzlichen Ursprungs, insbesondere Aprikosenkernöl, Arganöl, Avocadoöl, Babassuöl, Baumwollsaatöl, Boragesamenöl, Calendulaöl, Camelinaöl, Erdnussöl, Frittieröl, Hagebuttenkernöl, Hanföl, Haselnussöl, Johannisbeersamenöl, Johanniskrautöl, Jojobaöl, Kakaobutter, Knoblauchöl, Kokosöl, Kürbiskernöl, Kukuinussöl, Leinöl, Lorbeeröl, Maiskeimmöl, Makadamianussöl, Mandelöl, Mangofett,
M.C.T.-Öl,
Mohnöl, Nachtkerzenöl, Olivenöl, Palmkernöl, Palmöl, Paranuussöl, Pekannussöl, Perillaöl, Pfirsichkernöl, Pistazienkernöl, Rain
Forest Öle,
Reiskeimöl,
Rizinusöl,
Gemischen aus Rüböl/Rapsöl, Gemischen
aus Safloröl/Distelöl, Sanddornfruchtfleischöl, Schwarzkümmelöl, Senföl, Sesamöl, Sheabutter,
Sojaöl,
Sonnenblumenöl;
Traubenkernöl,
Walnussöl
und Weizenkeimöl,
oder
Mischungen davon.
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Die Polymerisationsreaktion wird
bevorzugtermaßen
in dem Fachmann bekannter Weise entweder im Batch-Reaktor, im kontinuierlichen
Strömungsrohr,
in der Rührkesselkaskade
oder im kontinuierlichen Rührkesselreaktor
durchgeführt.
Die Kesselreaktoren haben in der chemischen Industrie dabei die
größte Bedeutung
erlangt, da sie eine sehr große
Flexibilität
bezüglich
der Betriebsbedingungen und der Betriebsweise aufweisen und an fast
alle Prozeßerfordernisse
angepaßt
werden können. Rührkesselreaktoren
eignen sich für
diskontinuierliche und kontinuierliche Betriebsweise und sie besitzen
einen weiten Einsatzbereich, der vom Laborkessel bis zum Großreaktor
reicht. Rührkesselreaktoren sind
in standardisierter Bauweise für
zahlreiche Anwendungen in verschiedensten Werkstoffen und Werkstoffkombinationen
erhältlich.
Rührkesselreaktoren
sind leicht begeh- und reinigbar und erlauben eine relativ einfache
Umstellung auf andere Polymerisationsreaktionen (s. z. B. Ullmann,
Band 3, 4. Aufl., S. 505-510).
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Neben den üblichen Kühl- und Heizeinrichtungen,
Zu- und Ableitungen für
Reaktionsedukte und -produkte weisen die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeigneten Reaktorbehälter
Rührvorrichtungen
auf, die meist aus einem über
eine Rührwelle
angetriebenen Rührer
bestehen und für
gewisse Anwendungsfälle
zudem Statoren aufweisen, die zur besseren Durchmischung als Stromstörer dienen.
Die Rührer
selbst sind an meist senkrechten Rührerachsen befestigt, welche
entweder von unten oder von oben in den im allgemeinen zylindrischen
Reaktorbehälter
hineinragen. Der zentrische Einbau von oben in den Reaktorbehälter ist
im allgemeinen bevorzugt, da die Abdichtung der Rührerwelle
relativ einfach durchgeführt
werden kann.
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Aus Ullmanns, Enzyclopedia of Industrial Chemistry,
5. Auflage, Volume B2, Kapitel 25 sind unterschiedlichste Rührer, beispielsweise
Propellerrührer,
Scheibenrührer,
Ankerrührer,
Impellerrührer, Blattrührer, MIG-Rührer, usw.
bekannt.
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Erfindungsgemäß bevorzugt wird der Suspensionsvorgang
mit Hilfe eines konventionellen Propellerrührers bewerkstelligt. Um die
gewünschten Teilchengrößen von
1 bis 30 μm
zu erhalten, werden Rührgeschwindigkeiten
zwischen 1000 und 4000 U/Min. benötigt, wobei eine direkte Proportionalität zwischen
der Rührgeschwindigkeit
und der Feinheit der Teilchen gegeben ist. So lassen sich Teilchengrößen von <10 μm durchweg
mit Rührgeschwindigkeiten
von >2000 U/Min. und
solche >10 μm mit Rührgeschwindigkeiten
von <1000-2000
U/Min. erzielen.
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Als erfindungsgemäß einsetzbare weitere Bestandteile
f) kommen insbesondere Schutzkolloide, Polymerisationsbeschleuniger
oder Emulgatoren in Betracht. Diese sind aus dem Stand der Technik bekannt
und können
durch den Fachmann je nach Bedarf der Reaktion zugesetzt werden.
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Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung
besteht in der Möglichkeit,
die gewünschten
Eigenschaften der Beads wie Molekülbindungsverhalten, magnetische
Eigenschaften, Funktionalität durch
die Zusammensetzung der Ausgangsmischung festzulegen. So wird die
Porosität
der Teilchen, die ein unmittelbarer Einflußparameter für die Biomolekül-Bindungskapazitäten darstellt,
in entscheidendem Maße
durch die Konzentration des Vernetzers b) in dem Monomeransatz festgelegt.
In der Regel enthält
der Monomeransatz zwischen 0,5 und 10 Gew.-% Vernetzeranteil, vorzugsweise
zwischen 0,5 und 2 Gew.-%. Je geringer der Vernetzeranteil im Reaktionsansatz
ist, desto größer werden
die Poren der polymerisierten Partikel.
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Dies stellt einen weiteren überraschenden Vorteil
der vorliegenden Erfindung dar, denn bei üblichen Suspensionspolymerisationsverfahren
muß man,
um eine große
innere Oberfläche
zu erzielen, einen geringen Vernetzungsgrad wählen. Durch Einlagern von Lösungsmittelmolekülen werden
die Kettenabstände
aufgeweitet und die Polymere werden sehr weich (Gel-Typen) und sind
somit mechanisch sehr instabil, was für viele Anwendungen, insbesondere
im Bereich der Separation von Biomolekülen, unerwünscht ist. Wenn größere mechanische
Stabillität
gefordert wird, benötigt
man permanent makroporöse
Polymere. Diese werden bei der üblichen Suspensionspolymerisation
durch Anwesenheit geeigneter Porenbildner (meist ein inertes Lösungsmittel)
in der dispersen Phase gebildet. Das Porogen soll ein thermodynamisch
gutes Lösungsmittel
für das
Monomer, aber ein schlechtes Lösungsmittel
für das
Polymer sein. Ein "gutes" Porogen führt zu sehr später Phasenseparation
und damit zu kleinen Poren, ein "schlechtes" Porogen führt zu früherer Phasentrennung
und großen
Poren. Aufgrund der hohen Vernetzungsgrade sind solche Polymerträger nur
sehr wenig quellbar, haben aber gute mechanische Eigenschaften.
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Im Gegensatz dazu ermöglicht das
erfindungsgemäße Verfahren
die Steuerung der Porösität direkt über die
Vernetzerkonzentration.
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Außerdem werden – im Gegensatz
zu den aus dem Stand der Technik bekannten Suspensionsphasen – für das erfindungsgemäße Verfahren
keine zusätzlichen
oberflächenaktiven
Stabilisatoren für die
organische Phase benötigt.
Dieser Umstand erleichtert die anschließenden Waschprozeduren, da beim
Entfernen der Ölphase
keine restlichen Stabilisatoren auf der Oberfläche der Beads verbleiben können.
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Die erfindungsgemäß erhaltenen Polymerpartikel
sind in Abhängigkeit
von Art und Anzahl der polaren Funktionen, die sie einpolymerisiert
enthalten, zur Aufreinigung von Biomolekülen, Mikroorganismen oder Zellen
geeignet.
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Es können jedoch auch bestimmte
Liganden („Fängermoleküle") an
die Polymerhülle
chemisch gekoppelt werden, die die Biomoleküle, Mikroorganismen oder Zellen
selektiv zu binden vermögen.
Zur Herstellung dieser Liganden werden die Polymerpartikel (nach
erfolgter Suspensionspolymerisation) vorzugsweise mit Monomeren
umgesetzt, die reaktive Gruppen enthalten. Bevorzugte Monomere mit
reaktiven Gruppen sind ausgewählt
unter Glycidylmethacrylaten, Glycidylacrylaten, Halogenalkylmethacrylaten,
Halogenalkylacrylaten, Maleinsäureanhydrid,
Acrylsäurechlorid,
Acrylsäureanhydrid,
Methacrylsäurechlorid
und Methacrylsäureanhydrid. Diese
Monomere mit reaktiven Gruppen werden vorzugsweise mit Nucleophilen
wie z.B. Aminen, im besonderen mit Polyaminen und besonders bevorzugt mit
Polyethyleniminen nachträglich
umgesetzt. Hierdurch wird eine Modifizierung der Partikeloberfläche mit
den erwünschten
Liganden bewirkt.
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Ganz besonders bevorzugt ist die
Verwendung von Monomeren, die über
alkylierende Reagenzien modifiziert werden können wie Aminoalkyl(meth)acrylate,
Hydroxyalkyl(meth)acrylate.
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Weitere voneinander unabhängige Gegenstände der
vorliegenden Erfindung sind: Perl- bzw. kugelförmige magnetische Partikel
auf Acrylsäurebasis
zur Aufreinigung biologischer Substanzen, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
sowie die Verwendung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Parti kel
auf Acrylsäurebasis,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhalten wurden, zur Aufreinigung biologischer Substanzen.
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Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung,
ohne sie jedoch darauf einzuschränkent.
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Beispiel 1
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10 ml einer wäßrigen Mischung bestehend aus
Acrylamid und N,N'-Methylenbisacrylamid
(34:1) werden mit 10 ml 2-Dimethylaminoethylmethacrylat und 118
mg Magnetit-Kolloid (Bayferrox, Fa. Bayer) vermischt und 10 Sekunden
mit Ultraschall behandelt (500 W). Der Mischung werden sodann 2
ml 0,4 %ige Ammoniumpersulfat-Lösung
(APS) und 1 ml N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
(TEMED) zugesetzt. Nach Zugabe des TEMEDs wird der Polymeransatz
30 Sekunden vorpolymerisiert und sodann in 300 ml Pflanzenöl, Viskosität 84 Centipoise,
unter Rühren
(1500 U/Min.) für
4 Min. suspendiert. Mann läßt die Mischung
danach für
weitere 10 Min. ohne Rühren
weiter polymerisieren. Der Suspension werden ca. 100 ml Petroläther zugesetzt;
die Ölphase läßt sich
sodann durch Anlegen eines Handmagneten abtrennen. Es folgt mehrfaches
Waschen der Polymerphase mit Petroläther, Aceton und Äthanol.
Danach wird die Polymerphase mehrere Stunden in aqua dest aufbewahrt.
Es werden Polymerpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 27 μm gewonnen.
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Beispiel 2
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Ein Magnetit-Kolloid wird analog
der Vorschrift von Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechn., Vol.
41, 1994, 99-105, hergestellt. 5 ml des wäßrigen Kolloids werden für 30 Sekunden
mit einem Hochleistungsultraschallfinger (Fa. Dr. Hielscher) beschallt. Dieses
Kolloid wird sodann einer Mischung, bestehend aus 10 ml Acrylamid
(30%ige wäßrige Lösung), 2
ml 2-Hydroxyethyl-methacrylat und 1 ml N,N'-Methylenbisacrylamid
(30%ige wäßrige Lösung) und
15 ml 2-Dimethylaminoethyl-methacrylat
, zugesetzt. Nach Zugabe von 2 ml APS und 1 ml TEMED wird die Mischung
in 40 ml Pflanzenöl
(Viskosität
105 Centipoise) unter Rühren
(2200 U/Min) für
4 Minuten dispergiert.
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Danach wird die Suspension für 15 Minuten auf
60°C ohne
Rühren
aufgeheizt. Die Ölphase
wird sodann nach Absetzen der Polymerphase abdekantiert und diese
mehrfach abwechselnd analog Beispiel 1 mit Petroläther, Aceton
und Äthanol
gewaschen. Die gewonnene Fraktion wird mehrere Stunden in Wasser
aufbewahrt. Man erhält
Polymerpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 13 μm.
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Beispiel 3
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8 ml N,N'-Methylenbisacrylamid, 85
ml 2-Hydroxyethyl-methacrylat und 95 ml 2-Dimethylaminoethyl-methacrylat
werden vermischt. 8,5 g Bayferrox 318 M-Pulver (Fa. Bayer), das zuvor mit 5
ml Polyethylenglykol (Mw 400) vermischt wurden, werden der Monomermischung
zugesetzt. Die Mischung wird sodann 10 Sekunden mit einer Ultraschall-Sonotrode analog
Beispiel 2 beschallt. Es erfolgt die Zugabe von 18 ml APS. Die Mischung
wird anschließend
in 2,5 Liter Pflanzenöl
gemäß Beispiel
1 unter Rühren
(1500 U/Min) dispergiert. Nach 30 Sekunden erfolgt die Zugabe von
10 ml TEMED. Nach 3minütiger
Dispersion unter Rühren
läßt man die
Mischung weitere 15 Minuten ohne Rühren bei Raumtemperatur stehen.
Es erfolgt die Abtrennung der Ölphase.
Nach mehrmaligem Waschen mit Petroläther wird die Polymerphase mehrfach
abwechselnd mit Aceton und Äthanol nachgewaschen.
Danach wird die Polymerphase mehrere Stunden in 500 ml aqua dest
aufbewahrt. Es werden Polymerpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 22 μm gewonnen.