Ein klassisches Anwendungsgebiet
der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten
ist die Fluoreszenzmikroskopie (Lit.: Pawley, „Handbook of biological confocal
Microscopy"; Plenum Press 1995). Hierbei werden bestimmte Farbstoffe
zur spezifischen Markierung von Zellteilen verwendet.
Die eingestrahlten Photonen einer
bestimmten Energie regen die Farbstoffmoleküle durch die Absorption eines
Photons aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand an. Diese
Anregung wird meist als Einphotonen-Absorption bezeichnet (1a). Die so angeregten Farbstoffmoleküle können auf
verschiedene Weise in den Grundzustand zurück gelangen. In der Fluoreszenzmikroskopie
ist der Übergang
unter Aussendung eines Fluoreszenzphotons am wichtigsten. Die Wellenlänge des
emittierten Photons ist aufgrund der Stokesverschiebung im Vergleich
zur Anregungsstrahlung generell rot verschoben, besitzt also eine
größere Wellenlänge. Die Stokesverschiebung
ermöglicht
die Trennung der Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung.
Das Fluoreszenzlicht wird mit geeigneten
dichroitischen Strahlteilern in Kombination mit Blockfiltern von
der Anregungsstrahlung abgespalten und getrennt beobachtet. Dadurch
ist die Darstellung einzelner, mit verschiedenen Farbstoffen eingefärbten Zellteilen,
möglich.
Grundsätzlich
können
jedoch auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen
sich spezifisch anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden (Mehrfachfluoreszenz).
Zur Unterscheidung, der von den einzelnen Farbstoffen ausgesendeten
Fluoreszenzsignale, werden wiederum spezielle dichroitischen Strahlteiler
verwendet.
Neben der Anregung der Farbstoffmoleküle mit einem
hochenergetischen Photon (Einphotonen-Absorption) ist auch eine
Anregung mit mehreren Photonen geringerer Energie möglich (1 b). Die
Summe der Energien der Einzelphotonen entspricht hierbei ungefähr einem
Vielfachen des hochenergetischen Photons. Diese Art der Anregung
der Farbstoffe wird als Mehrphotonen-Absorption bezeichnet (Lit.:
Corle, Kino; „Confocal
Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic
Press 1996). Die Farbstoffemission wird durch diese Art der Anregung
jedoch nicht beeinflußt,
d.h. das Emissionsspektrum erfährt
bei der Mehrphotonen-Absorption
einen negativen Stokesshift, besitzt also eine geringere Wellenlänge im Vergleich
zur Anregungsstrahlung. Die Trennung der Anregungs- von der Emissionsstrahlung
erfolgt in der gleichen Art und Weise wie bei der Einphotonen-Absorption.
Der Stand der Technik soll im folgenden
beispielhaft anhand eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopes
(LSM) erläutert
werden (2).
Ein LSM gliedert sich im wesentlichen
in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop.
Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf
DE 19702753 A1 verwiesen.
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen
Farbstoffe in einem Präparat
werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt.
Die Wahl der Anregungswellenlänge
richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden
Farbstoffe. Die Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt.
Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton,
Helium-Neon, Festkörperlaser,
Diodenlaser, TiSa-Laser etc.). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul
die Selektion der Wellenlängen
und die Einstellung der Intensität
der benötigten
Anregungswellenlänge,
z.B. durch den Einsatz eines akusto-optischen Kristalls. Anschließend gelangt
die Laserstrahlung über
eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung
wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik
und die Tubuslinse in das Präparat
fokussiert. Die Scanner rastern punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die
Pixelverweilzeiten beim Scannen über
die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde
bis zu einigen Sekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detektion)
des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht, das aus der Fokusebene
(Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden
Ebenen emittiert wird, über
die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MDB). Dieser
trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird
das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende/Pinhole)
fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten
Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile die außerhalb
des Fokus generiert wurden unterdrückt. Durch Variieren des Blendendurchmessers
kann die optische Auflösung
des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich
ein weiterer dichroitischer Blockfilter (Emissionsfilter EF) der
nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters
wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen.
Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption
erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen
in dem die Anregungsintensität
besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als
der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der
Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion
kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descanned Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer
durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt
weiterhin eine descanned Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille
des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (descanned Detektion).
In einer dreidimensional ausgedehnten
Probe wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der
entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die
Ebene der Probe (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der
Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer
optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der
Probe kann anschließend
rechnergestützt
ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden.
Das LSM ist somit zur Untersuchung
von dicken Präparaten
geeignet. Unterschiedliche Fluoreszenz-Farbstoffe zeichnen sich
durch unterschiedliche Absorptions- und Emissionsspektren aus. Die Laserlinien
zur Anregung des/der Farbstoffe werden entsprechend der Absorptionsspektren
selektiert. Auf die Emissionseigenschaften des/der Farbstoffe abgestimmte
dichroitische Filter stellen sicher, daß nur das vom jeweiligen Farbstoff
ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.
In biomedizinischen Applikationen
werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen
Farbstoffen gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen
Farbstoffe können
mit dem Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften
oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden 3a. 3a zeigt die Emissionsspektren von verschiedenen
typischen Farbstoffen. Aufgetragen ist die Intensität der Emission
in Abhängigkeit von
der Wellenlänge.
Zu erkennen ist, daß sich
die mit 1 bis 4 bezeichneten Farbstoffe in der Lage und Form ihrer
Emissionsspektren unterscheiden.
Nach dem Stand der Technik lassen
sich die nach dem Stand der Technik existierenden Methoden zu spektralen
Aufspaltung der Emissionsignale in zwei Katgorien einteilen.
A Sequentielle Datenerfassung:
- 1.) Kombination eines spektral dispersiven
Elements mit monochromatischer Detektion
- 2.) Methoden der interferometrischen Spektroskopie
- 3.) Multitracking i.e. Anderung der Anregungswellenlänge nach
Bild oder Zeilenaufnahme zur Trennung von Farbstoffen mit unterschiedlichen
Absorbtionseigenschaften (Verweis aus unsere Anmeldung)
B Parallele Datenerfassung
- 1.) Spektrale Aufspaltung der Fluoreszenzemission
mit Hilfe von Nebenfarbteilen und Emissionsfiltern
Die unter A1 und B3 beschriebenen
Verfahren werden im Laser Scanning Mikroskop LSM 510 der Firma ZEISS
angewendet Durchflußzytometer dienen
der Untersuchung und der Klassifikation von Zellen und anderen Partikeln.
Die Proben werden hierzu in einer Flüssigkeit gelöst bzw.
suspendiert und werden durch eine Kapillare gepumpt. Zur Untersuchung
der Proben wird ein Laserstrahl von der Seite in die Kapillare fokussiert.
Die Proben sind mit verschiedenen Farbstoffen oder fluoreszierenden
Biomolekülen
markiert. Gemessen wird die Fluoreszenzemisson und das gestreute
Anregungslicht. Der Stand der Technik ist in „Flow Cytometry and Sorting",
Second Edition, M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, Eds. Wiley & Sons, Inc. New
York, 1990, pp 81–107
beschrieben.
Aus dem gestreuten Signal kann die
Größe der Proben
bestimmt werden. Mit Hilfe der Spektraleigenschaften der Fluoreszenz
einzelner Proben können
verschiedene Probenpartikel separiert/sortiert oder getrennt gezählt werden.
Die Sortierung der Probenpartikel erfolgt über ein elektrostatisches Feld in
verschiedene Auffangbehälter.
Die Auswertung dieser Technik erfolgt mit hilfe von Histogrammen. Diese
geben Auskunft über
die Intensitäten
der Markierungen sowie über
die Anzahl der unterschiedlich markierten Proben. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt typischerweise
einige 10–100
cm/s. Deshalb wird eine hochempfindliche Detektion benötigt. Zur Einschränkung des
Detektionsvolumens erfolgt nach dem Stand der Technik eine konfokale
Detektion.
Die Genauigkeit der Durchflußmessung
wird von verschiedenen Faktoren beeinflußt. Diese sind zum Beispiel
nicht spezifische Fluoreszenzen, Autofluoreszenzen von Zellen, Fluoreszenzen
von Optikkomponenten und Rauschen der verwendeten Detektoren.
Nachteile von
Verfahren nach dem Stand der Technik
Farbstoffe mit stark überlappenden
Anregungs und Emissionsspektren können kaum ohne Übersprechen
voneinander getrennt werden. Dieses Problem verstärkt sich
mit steigender Anzahl von zu detektierenden Fluoreszenzfarbstoffen.
Eine eindeutige Zuordnung der Emission eines Farbstoffes zu einem
Detektionskanal ist damit nicht möglich. Dies ist aber für eine korrekte
Aussage bei der Analyse von mehrfach markierten Proben zwingend
notwendig.
Weitere bei Multifluoreszenz-Aufnahmen störende bzw.
unerwünschte
Effekte sind Überlagerungen
durch Hintergrundsignale. Dies können
Reflexionen einzelner Laser an der Probe oder auch breitbandige
Autofluoreszenzsignale von Probenbestandteilen sein, die die spektralen
Signaturen der zu untersuchenden fluoreszenzmarkierten Probenstellen überlagern
und damit deren Untersuchung erschweren, teilweise sogar verhindern.
Chromosomen die mit hilfe der Multi
Color Banding Technik, der FISH Technik oder verwandten Techniken
mit bis zu 7 verschiedenen Farbstoffen markiert werden, stellen
besonderer Anforderungen an die Detektion und Trennung der einzelnen
Markierungen. Solche Proben können
nach dem Stand der Technik mit allen unter A und B aufgeführten Methoden
untersucht werden. Diese Methoden weisen folgende Nachteile auf:
B1 Bei der spektralen Aufspaltung
der Fluoreszenzemission mit Hilfe von Nebenfarbteilen und Emissionsfiltern überschneiden
sich die Emissionsspektren zunehmend mit steigender Anzahl der Farbstoffe.
Dadurch kommt es zum Übersprechen.
Eine eindeutige Zuordnung der Emission eines Farbstoffes zu einem
Detektionskanal ist damit nicht möglich.
Die Methode A3 (Multitracking) löst das Problem
nur dann, wenn sich die Anregungsspektren genügend voneinander unterscheiden.
Dies ist jedoch bei der Verwendung mehrerer Farbstoffe nicht gegeben.
Die Methoden A1 (Kombination eines
spektral dispersiven Elements mit monochromatischer Detektion) und
A2 (Interferometrischen Spektroskopie) sind für sich genommen ebenfalls nicht
in der Lage das Problem der überlappenden
Emissionsspekteen zu lösen.
Sie eignen sich jedoch zur Erfassung der spektralen Information
an einem Probenpunkt.
Die Kombination der Methoden A1 und
A2 mit einem mathematischen Algorithmus zur Entmischung überlappender
Spektren eignet sich prinzipiell zur Lösung des beschriebenen Problems
(Schäfer Anmeldung?
ASI Anmeldung). Nachteilig bei beiden Verfahren ist die geringere
Effizienz im Vergleich zur unten beschriebenen Erfindung. Im Verfahren
A1 wird zu Detektionszeitintervall jeweils nur ein schmales spektrales
Band detektiert. Zur Erfassung eines Spektrums sind mehrere aufeinanderfolgende
Messungen notwendig. Dadurch reduziert sich das Signal zu Rausch
Verhältnis
der Messung. Des weiteren werden durch die mehrfache Beleuchtung
der Proben mit Anregungslicht die Fluoreszenzfarbstoffe und die
Proben selbst (z.B. durch phototoxische Prozesse) geschädigt.
Bei Interferometrischen Methoden
(A2) ist die Detektionseffizienz aufgrund theoretischer Überlegungen
auf 50% reduziert (Zitat!). Um aus den Rohdaten Spektren zu erhalten
ist hier eine Fourier Transformation erforderlich. Dabei werden
die Daten typischerweise einer Digital Fourier Transformation (DFT) oder
bei einer Anzahl von 2n Datenpunkten, einer
Fast Fourier Transformation (FFT) unterzogen. Für diese Berechnungen ist ein
nicht unerheblicher Rechenaufwand erforderlich.
Hintergrund des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist eine spektral aufgespaltete Detektion der Fluoreszenz. Dazu
wird das Emissionslicht im Scanmodul oder im Mikroskop (bei Mehrphotonen-Absorption)
mit Hilfe eines Elementes zur Trennung der Anregungsstrahlung von
der detektierten Strahlung wie dem Hauptfarbteiler (Main Dichroic
Beam Splitter; MDB) oder einem AOTF gemäß
DE 19859314 A1 oder gemäß
DE 19842288 vom Anregungslicht
abgespalten. Bei Durchlichtanordnungen kann ein derartiges Element
auch völlig
entfallen. Ein Blockschaltbild der nun folgenden Detektoreinheit
ist in
4 dargestellt.
Das Licht der Probe L wird nun mit Hilfe von einer abbildenden Optik
PO bei konfokaler Detektion durch eine Blende (Pinhole) PH fokussiert, wodurch
Fluoreszenz, die außerhalb
des Fokus entstand, unterdrückt
wird. Bei einer nichtdescannten Detektion entfällt die Blende. Das Licht wird
nun mit Hilfe eines winkeldispersiven Elements D1 in seine Spektralanteile
zerlegt. Als winkeldispersive Elemente kommen Prismen, Gitter und
beispielsweise akusto optische Elemente in Frage. Das vom dispersiven Element
in seine spektralen Komponenten aufgespaltete Licht wird im Anschluß auf einen
Zeilendetektor DE abgebildet. Dieser Zeilendetektor DE mißt also
das Emissionssignal in Abhängigkeit
von der Wellenlänge
und wandelt dies in elektrische Signale S um. Zusätzlich kann
der Detektionseinheit noch ein Linienfilter zur Unterdrückung der
Anregungswellenlängen
vorgeschaltet werden. Verschiedene Varianten sind in
5 dargestellt. (Filterrad
+ Blende in
5 ergänzen)
Eine mögliche Ausführungsform des optischen Strahlenganges
der in 4 im Blockschaltbild
gezeigten Detektoreinheit ist in 5 dargestellt.
Der Aufbau beschreibt im wesentlichen einen Czerny-Turner Aufbau.
Bei einer konfokalen Detektion wird das Licht L der Probe mit der
Pinholeoptik PO durch die konfokale Blende PH fokussiert. Bei einer nicht
descanned Detektion im Falle einer Mehrphotonen-Absorption kann
diese Blende entfallen. Der erste abbildende Spiegel S2 kollimiert
das Fluoreszenzlicht. Anschließend
trifft das Licht auf ein Liniengitter G, beispielsweise ein Gitter
mit einer Linienzahl von 651 Linien pro mm. Das Gitter beugt das
Licht entsprechend seiner Wellenlänge in verschiedene Richtungen.
Der zweite abbildende Spiegel S1 fokussiert die einzelnen spektral
aufgespaltenen Wellenlängenanteile
auf die entsprechenden Kanäle
des Zeilendetektors DE. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines
Zeilen-Sekundärelektronenvervielfachers
z.B. Hamamatsu N7260. Der Detektor besitzt 32 Kanäle und eine
hohe Empfindlichkeit. Der freie Spektralbereich der oben beschriebenen
Ausführungsform
beträgt
etwa 350 nm. Der freie Spektralbereich wird in dieser Anordnung
gleichmäßig auf
die 32 Kanäle
des Zeilendetektors verteilt, wodurch sich eine Auflösung von
etwa 10 nm ergibt. Somit ist diese Anordnung nur bedingt zur Spektroskopie
geeignet. Jedoch ist ihr Einsatz in einem bildgebenden System vorteilhaft,
da das Signal pro Detektionskanal aufgrund des relativ breiten detektierten
Spektralbandes noch relativ groß ist.
Eine Verschiebung des freien Spektralbereiches kann zusätzlich durch
eine Verdrehung um DP beispielsweise des Gitters erfolgen.
In den oben beschriebenen Ausführungsformen)
detektiert jeder Einzelkanal des Detektors DE ein Spektralband des
Emissionsspektrums mit einer spektralen Breite von ca. 10 nm. Für jeden
Probenpunkt wird die Summe der Spektralkomponenten der einzelnen
Farbstoffe, die sich an dem gerade gemessenen Probenpunkt befinden,
aufgezeichnet.
Eine Anordnung zum Auslesen der Einzelkanäle des Detektors
DE ist in 6 schematisch
dargestellt. Hierbei wird der an den Anoden eines Mehrkanal-PMT
(Detektor DE) fließende
Strom, jeweils durch den ersten Amplifier A (als Strom-Spannungswandler
geschaltet) in eine Spannung gewandelt und verstärkt. Die Spannung wird einem
Integrator 1 zugeführt
der über
eine entsprechende Zeit (z.B. Pixelverweilzeit) das Signal integriert.
Zur schnelleren Auswertung kann dem
Integrator 1 ein Komparator K nachgeschaltet werden, der
als einfacher Komparator eine Schaltschwelle hat, die bei Überschreitung
ein digitales Ausgangssignal erzeugt oder der als Fensterkomparator
ausgebildet ist und dann ein digitales Ausgangssignal bildet, wenn
sich das Eingangssignal zwischen der oberen und unteren Schaltschwelle
befindet oder wenn das Eingangssignal außerhalb (unter oder über) den Schaltschwellen
liegt. Die Anordnung des Komparators bzw. des Fensterkomparators
kann sowohl vor dem Integrator als auch danach erfolgen. Schaltungsanordnungen
ohne Integrator (so genannter Verstärker-Mode) sind ebenfalls denkbar. Bei der
Anordnung im Verstärker-Mode
ist weiterhin der Komparator K auch nach entsprechender Pegelanpassung
vorhanden. Der Ausgang des Komparators K dient als Steuersignal
für ein
Switch-Register SR, das direkt die aktiven Kanäle schaltet (online) oder der Zustand
wird dem Computer über
eine zusätzliche Verbindung
V mitgeteilt, um eine individuelle Auswahl der aktiven Kanäle zu treffen
(oft-line). Das Ausgangssignal des switch-Registers SR wird direkt
einem weiteren Verstärker
A1 zur Pegelanpassung, für die
nachfolgende A/D-Wandlung AD zugeführt. Die AD gewandelten Werte,
d.h. das in jedem Bildpunkt gemessene spektral aufgelöste Fluoreszenzsignal der
Probe wird über
eine geeignete Datenleitung an einen Rechner (PC oder Digital-Signal-Prozessor DSP)
zur Datenverarbeitung übertragen.
Aus den einzelnen spektral aufgelöst gemessenen Bildpunkten werden
im Anschluß je
nach Scanmode Lambda Stacks (spektrale Verteilung pro Probenpunkt,
gemessen mit den Detektionskanälen
mit dispersiver Aufspaltung der detektierten Strahlung, abgelegt
in Speicherelementen unter Zuordnung zu mindestens einer zusätzlichen
Koordinate: Bildpunkt [Koordinaten x, y] und/oder Z und/oder Meßzeit t)
mit
den zusätzlichen
Koordinaten x, y, z, Zeit und Lebensdauer gebildet, wobei
- – X
und Y durch SC abgerastert wird;
- – Z
beispielsweise durch eine Verschiebung des Präparats entlang der optischen
Achse erfolgt;
- – Zeit:
die Datenaufnahme zu verschiedenen Zeiten erfolgt;
- – Lebensdauer:
die Datenaufnahme zeitaufgelöst innerhalb
der Fluoreszenzlebensdauer erfolgt.
Zur Vermeidung von Artefakten ist
es bei einer Fluoreszenzmessung sinnvoll, von der Probe gestreutes
Anregungslicht zu unterdrücken
oder zumindest so stark abzuschwächen,
dass seine Intensität kleiner
als oder in der gleichen Größenordnung
wie das Emissionsmaximum ist. Hierzu kann der oben beschriebene
zusätzliche
Linienfilter oder ein entsprechend optimierter Hauptfarbteiler (MDB)
zur optischen Abschwächung
verwendet werden. Alternativ kann auch ein AOTF als Hauptfarbteiler
verwendet werden, wie in
DE
19859314 A1 oder
DE
19842288 A1 beschrieben. Da die spektrale Breite der Anregungslaserstrahlung
sehr viel kleiner als die vom Einzelkanal detektierte Bandbreite
ist, kann die rückgestreute
bzw. reflektierte Anregungsstrahlung auch durch ein gezieltes Ausschalten
des entsprechenden Einzelkanals mit dem in
6 dargestellten SR erfolgen. Trifft die
Anregungswellenlänge
auf zwei Detektionskanäle,
so kann durch eine Verdrehung des Gitters, eine Verschiebung des
Zeilendetektor oder eine Verkippung von S1 oder S2 in
5 die Anregungslinie so
verschoben werden, dass sie nur auf einen Detektionskanal fällt.
In den beiden oben beschriebenen
Anordnungen wurde vorzugsweise eine Integratorschaltung zur Detektion
der Einzelkanalsignale verwendet. Uneingeschränkt kann jedoch auch eine Photonenzählung in
den Einzelkanälen
erfolgen. Die gezählten Photonen
können
anschließend
addiert werden. Vorzugsweise würde
hierfür
eine APD (Avalanche Photodioden) – Zeile als Detektor verwendet
werden.
Im folgenden werden verschiedene
Methoden zur Darstellung der Informationen der Probe, d.h. der Lambda
Stacks beschrieben.
Durch oben beschriebenes Verfahren
zur Aufnahme von Lambda Stacks erhält man einen Stapel von x-y-Bildern,
die die Fluoreszenz-Intensitätswerte
aus benachbarten, sehr schmalen Wellenlängenbereichen enthalten. Komplexere
Daten erhält man
durch die Kombination der Aufnahme dieser Lambda Stacks mit z-Stapeln
oder/und Zeitserien.
Die Aufbereitung dieser Daten für kann in verschiedener
Weise erfolgen:
a) Lambda-Maximum-Projektion Hier
wird ein Graustufen-Bild aus dem Lambda Stack erzeugt, indem für jede x-y-Pixel-Position über die
Wellenlängenbereiche
der maximale Intensitätswert
ermittelt wird, der die Helligkeit des entsprechenden Pixels des
Projektionsbildes definiert.
b) Lambda-Coded-Projektion
Hierbei wird wie bei a) eine Lambda-Maximum-Projektion
berechnet und jedes Pixel mit der Farbe versehen wird, die der mittleren
Wellenlänge des
Wellenlängenbereiches
entspricht, aus dem das hellste Pixel des Lambda Stacks stammt.
c) Galerie-Ansicht für einen
einfachen Lambda Stack (xy)
Hier werden die Einzelbilder des
Lambda Stacks zumindest teilweise in einer Serie dargestellt. Hierbei
kann zusätzlich
für jedes
Bild die mittlere Wellenlänge
des Bereichs, in dem die Intensitäten aufgenommen wurden, angezeigt
werden.
d) Galerie-Ansicht für komplexere
Lambda Stacks
Werden xy-Lambda Stacks über z oder/und über die
Zeit aufgenommen, so können
Schieber verwendet werden, um in der Galerie die jeweilige Serie einer
z-Ebene oder eines Zeitpunktes anzeigen zu lassen. In einer anderen
Form können
alle xy-Bilder der Aufnahme gleichzeitig dargestellt werden, indem die
spektral unterschiedlichen Bilder in Zeilen und die zeitlich bzw.
in z-Ebene unterschiedlichen
Bilder in Spalten dargestellt werden. Es kann zwischen folgenden
Galerie-Ansichten gewählt
werden: xy, xy-z, xy-t, xy-z, y-t, xy-z-t; wobei man mittels Schiebern durch
die jeweils nicht genannte Dimension blättern kann.
Die Kombination von Lambda-Max oder Lambda-Coded-Projektionen
mit der Gallerie-Ansicht in Zeilen und Spalten ermöglicht die
simultane Darstellung von xy-z-t-Informationen.
e) Orthogonalschnitte durch
Lambda Stacks
Diese Darstellung zeigt eine selektierte
Ebene eines Lambda Stacks mit jeweils einer horizontalen und vertikalen
Markierungslinie, die frei positionierbar sind. An diesen Linien
wird der Lambda Stack durchschnitten und das entstehende Schnittbild
neben (y-Schnitt) und über
(x-Schnitt) die Ebene projiziert. Eine Pseudo-Echtfarbkodierung
kann optional durchgeführt
werden. Hierbei wird jedem Wellenlängenbereich seine entsprechende
Spektralfarbe zugeordnet. Durch Überlagerung
der einzelnen Farbanteile in einem Bild entsteht ein farbgetreues
Abbild der Probe.
Definition von
Referenzspektren über
ROIs
Referenzspektren sind z.B. die Emissionsspektren
einzelner Farbstoffe in Reinstform oder unter Probenbedingungen,
d.h. im Lösungsmittel
gelöst bzw.
gebunden an Probenstrukturen in einzelnen diskreten Regionen der
zu untersuchenden Probe. Die Auswahl Bildbereiche zur Generierung
von Referenzspektren kann über
die Definition von Regionen des Interesses (Regions of Interest
ROI) mit den folgenden Verfahren erfolgen.
Lambda Stacks beinhalten für jedes
Pixel zusätzlich
die spektrale Information. 7a zeigt schematisch
eine Verteilung von verschiedener ROIs (ROI 1–4) in einem LSM-Bild, die
beispielsweise verschieden angefärbte
Regionen einer Probe repräsentieren.
In 7b sind typische
zugehörige
Emissionsspektren 1–4
mit ihren Anregungswellenlängen (L1–L4) dargestellt.
Die Einstellung der ROIs durch den Nutzer kann beispielsweise wie
folgt geschehen: Nach der Aufnahme eines Lambda Stacks unter Verwendung
aller oder der meisten zum Anregen der Farbstoffe in den einzelnen
ROI-s notwendigen Anregungslinien können Summenkanäle zwischen
den einzelnen Anregungslaserlinien gebildet werden (L1 bis L2, L2
bis L3, L3 bis L4 und L4 gemäß 6 bis zur maximalen Emissionswellenlänge). Diese
Summenkanäle
entsprechen Teilen der Fluoreszenzbänder der einzelnen Farbstoffe.
Weiterhin erfolgt eine gleichzeitige Summation der Signale verschiedener Farbstoffe
in gleichen Summenkanälen
aufgrund der starken Überlagerung.
Diese Summenkanäle
werden im Anschluß farbkodiert
in verschiedenen Bildkanälen
abgelegt und miteinander überlagert
dargestellt. Aufgrund der verschiedenen lokalen Farbmischungen in
den Bildkanälen
können
die verschiedenen ROIs durch den Nutzer oder durch automatische Mustererkennung
lokalisiert werden.
In einem 2. Verfahren zur Einstellung
der verschiedenen ROIs erfolgt eine Vermessung des Fluoreszenzschwerpunktes
(DE 10033180 A1 ).
Hierzu werden im Detektor alle Einzelkanäle, die mit Anregungslaserlinien
bestrahlt werden abgeschalten. Jede ROI besitzt aufgrund der veränderten
Emissionseigenschaften der jeweils verwendeten Farbstoffe einen
charakteristischen Fluoreszenzschwerpunkt.
Somit können die verschiedenen ROIs
durch die Lage des charakteristischen Farbschwerpunktes unterschieden
und getrennt sichtbar gemacht werden.
Zur Sichtbarmachung der spektralen
Signaturen beliebig ausgewählter
Probenstellen kann der Benutzer die ROI-Funktion einsetzen (ROI:
Region Of Interest; s. 8).
Hierbei werden mit einem Zeichenwerkzeug 3 (z. B. Polygon,
Ellipse oder geschlossener Spline) ein Bereich (in 8 ROI 1 und ROI 2)
aufgenommenen Probe im Bild 2 markiert und der Graph der entsprechenden
spektralen Signatur graphisch (Diagramm 1) durch Mittelwertbildung
der im ROI eingeschlossenen x-y-Pixel für jeden ?-Ebene des Lambda
Stacks ermittelt .
Prinzipiell können mehrere Spektralsignaturen
verschiedener ausgewählter
Probenstellen gleichzeitig dargestellt werden, entweder in einem gemeinsamen
oder in getrennten Diagrammen 1.
Die visualisierten Spektralsignaturen 1 geben
Aufschluss über
die spektrale Verteilung der Fluoreszenzemission in den gewählten Probenstellen.
Bei Darstellung mehrerer Spektralsignaturen verschiedener
ROIs kann beispielsweise ermittelt werden, ob die Emissionsspektren
der verwendeten Farbstoffe sich signifikant überlagern.
Die Spektralsignaturen der verschiedenen ROIs
können
wie in 9 gezeigt zur
Erzeugung eines farbkodierten Mehrkanalbildes (Bedienelement „Extract
to Channels", 8 Nr.
4 dienen. Es können
mit Hilfe der Spektralsignaturen Wellenlängenbereiche ausgewählt (9a: ROI 1 bis 5) und
die Intensitätswerte
der entsprechenden Ebenen des Lambda Stacks z. B. durch Summation
oder Mittelwertbildung über
die entsprechenden Wellenlängenbereiche
für jeden
Bildpunkt zusammengefaßt
werden, um so ein Mehrkanalbild (9b)
zu erzeugen, wobei jeder Bildkanal einen Farbstoff repräsentiert (Ch
1 bis CH 5)).
Zusätzlich können diese Einstellung zur elektronischen
Summation (siehe 6)
der Einzelkanäle
verwendet werden („Extract
to Hardware", Abb. 8 Nr. 6. Anschließend können Mehrkanalbilder mit den
entsprechenden Einstellungen direkt gescannt werden.
Für
eine spätere
Wiederverwendung können die
spektralen Signaturen einzelner ROIs, d.h. einzelner Farbstoffe
in ihrer spezifischen Umgebung in einer Spektral-Datenbank (8 Nr. 7) gespeichert werden,
wobei zusätzlich
zu den Daten der Graphen auch die für die Aufnahme des Lambda Stacks
spezifischen Parameter, wie verwendete Laserlinien, Intensitäten, Filterkonfigurationen
(MDB, NFT, EF) und Einstellung des Detektors (Verstärkung, Integrationszeit,
Pinholeposition und -durchmessen), sowie zusätzliche Kommentare zur Umgebung/Präparation des
zu untersuchenden Präparates
gespeichert werden können.
Bei einer Aufnahme von Lambda Stacks über einen
Zeitraum können
Spektralsignaturen zu verschiedenen Zeitpunkten ermittelt und in
einer Serie zusammengefaßt
werden. Im Anschluß können diese
Daten in einer 3D-Darstellung,
z.B. entsprechend 10 visualisiert
und die zeitliche Änderung der
Spektralsignaturen in verschiedenen ROIs vermittelt werden. Diese
Darstellung kann vorteilhaft bei der Auswertung von Experimenten
wie FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) oder FRAP (Fluorescence
Recovery After Photobleaching) mit zwei oder mehr Fluoreszenzfarbstoffen
gleichzeitig eingesetzt werden (s. 10).
Dargestellt in Teilbild b ist das Fluoreszenzsignal (Intensity)
in Abhängigkeit
von der Wellenlänge
(wavelength) und dem Zeitpunkt (time). Man erkennt, dass das Signal
im Wellenlängenbereich
von 530 nm bis 560 nm mit der Zeit zunimmt. Eine weitere Darstellungsform
ist in 13a gezeigt. Dargestellt sind
die spektralen Einzelkanäle
zu verschieden Zeitpunkten. Jedes Teilbild repräsentiert hierbei beispielsweise
einen Wellenlängenbereich
von 10 nm.
Algorithmen zur Analyse, z.B. zur
selektiven Darstellung der Beiträger
einzelner Farbstoffe zum gesamten von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzsignal
werden im folgenden beschrieben. Die Analyse kann quantitativ oder
qualitativ erfolgen. Bei einer quantitativen Analyse wird pro Bildpunkt
der Beitrag (d.h. die Konzentration) jedes einzelnen Farbstoffs zum
gesamten von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzsignal berechnet.
Zum Einsatz kommen Algorithmen wie z.B. eine lineare Entmischungsanalyse (Lit.:
Lansford, et al.; Journal of Biomedical Optics 6 (3), 311–318, (July
2001)). Zur Analyse werden so genannte Referenzspektren benötigt. Diese
beschreiben das Fluoreszenzspektrum eines einzelnen Farbstoffs.
Die Genauigkeit der Ergebnisse hängt entscheidend
von der Genauigkeit der Referenzspektren ab. Deshalb erfolgt erfindungsgemäß in einem
Verfahren die Aufnahme der Referenzspektren simultan während der
Untersuchung des Präparats (s.u.).
Die Beiträge
der jeweiligen Farbstoffe werden in verschiedene Bildkanäle eingeordnet,
wobei jedem Bildkanal eine spezifische Farbe zugeordnet wird. Die
Helligkeit der Farbe wird durch die Größe des Beitrags bestimmt. Im
Anschluß können die
einzelnen Bildkanäle überlagert
in einem Bild dargestellt werden und es entsteht ein farbkodiertes
Bild (s. o. Lambda coded).
Bei einer qualitativen Analyse erfolgt
eine Klassifizierung, d.h. jedem Bildpunkt wird jeweils nur der
Farbstoff, der den größten Beitrag
zum gesamten von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzsignals erzeugt,
zugeordnet. Die Zuordnung erfolgt wiederum in einem Bild in verschiedene
Bildkanäle,
wobei jedem Bildkanal eine spezifische Farbe zugeordnet werden kann.
Verwendet werden hierzu Algorithmen wie z.B.. eine principal component
analysis (PCA/Lit.: I.T. Joliffe, Principal Component Analysis,
Springer-Verlag, New York, 1986.). Man erhält durch diese Art von Algorithmen
eine so genannte Maskierung des Bildes (Farbstoffmaske), wobei sich
in Bereichen gleicher Farbe identische Farbstoffe befinden.
Im folgenden werden Verfahrensabläufe zur Trennung
von Farbstofffluoreszenzen erläutert.
Für
den Fall, daß die
Spektralsignaturen der selektierten ROIs jeweils nur das Emissionssignal von
genau einem der verwendeten Farbstoffe in der Probe repräsentieren
(Referenzspektren), so können diese
besonders vorteilhaft für
eine quantitative Analyse (z.B. digitale Entmischung, Abb. (Nr.
5) der Emissionssignale verwendet werden (12a). Diese
hat als Eingangsdaten den zugrundeliegenden Lambda Stack sowie die
Spektralsignaturen von n gewählten
Probenstellen (ROI), wobei n die Anzahl der in der Probe verwendeten
Farbstoffen ist. Das Ergebnis der quantitativen Analyse (z.B. Entmischung) ist
ein Bild aus n einzelnen Bildkanälen,
die jeweils nur die Information der Emissionssignale von einem Farbstoff
enthalten.
Eine weitere Vorgehensweise zur quantitativen
Analyse (z.B. digitalen Entmischung) der Emissionssignale verwendet
als Eingangsdaten einen Lambda Stack und dazu Referenzspektren,
die zuvor in einer Spektren-Datenbank
gespeichert wurden (12b). Diese Referenzspektren
können
einem Experiment (Kalibriermessung) entstammen, bei dem eine Probe
(oder spezifische Regionen) mit jeweils nur genau einem Fluoreszenzfarbstoft
markiert wurde. Diese Vorgehensweise ist beispielsweise erforderlich,
wenn die Farbstoffe im eigentlichen Experiment überwiegend ko-lokalisieren
und so nicht für jeden
Farbstoff eine Probenstelle mit reinem Emissionssignal, ohne spektrales Übersprechen
einer anderen Emission, gefunden werden, d.h. kein ROI eingezeichnet
kann.
Zusätzlich können die Referenzspektren aus der
Datenbank vor Aufnahme des Lambda Stacks durch den Nutzer ausgewählt werden
und während der
Akquisition sofort eine quantitative Analyse (z.B. digitale Entmischung)
des Lambda Stacks durchgeführt
werden. Als Ergebnis wird das n-kanalige Bild auf dem Bildschirm
angezeigt. Eine speicherintensive Zwischenspeicherung der Lambda
Stack-Daten kann hierbei entfallen.
In einem weiteren in 11 schematisch dargestellten Verfahren
werden quantitativ analysierte Datensätze (farbkodiertes Bild) und
die Referenzspektren entsprechend der Anzahl der Farbstoffe auf einem
Datenträger
anstatt des Lambda Stacks abgelegt. Dies hat den Vorteil, dass die
Größe des Datensatzes
ohne gravierenden Verlust an Signalinformation gespeichert werden
kann. Wird beispielsweise ein Lambda Stack mit 32 Einzelkanälen in 512x512
Bildpunkten und 8 bit detektiert so beträgt die Größe des Bildstapels ca. 16 Megabyte.
Durch Speicherung des farbkodierten Bildes verringert sich die Größe des Datensatzes
um einen Faktor 32 auf ca. 0.5 Megabyte zuzüglich der Referenzspektren.
Die Anzahl der Datenpunkte in den Referenzspektren beträgt 32 multipliziert
mit der Anzahl der Farbstoffe. Aus den abgelegten Daten (Referenzspektren)
und farbkodierten Bild kann im Anschluß im Computer wieder der Lambda
Stack berechnet werden. Die Berechnung erfolgt im einfachsten Falle
durch eine Multiplikation der Referenzspektren mit den jeweiligen
Bildkanälen
des farbkodierten Bilds. Eine Datenreduktion ist insbesondere bei
der Aufnahme von so genannten Zeitserien oder von Zeitserien mit
dreidimensionaler Bildinformation nötig.
In einem weiteren Verfahren, dessen
Ablaufschema in 12C dargestellt ist
erfolgt ausgehend vom Lambda Stack im ersten Schritt eine qualitative Analyse.
Durch diese Analyse können
zum einen Bereiche im Präparat
aufgesucht werden, in denen sich gleiche Farbstoffe räumlich verteilt
befinden. Zum anderen können
automatisch ohne Eingriff des Nutzers die für die anschließende quantitative
Analyse benötigten
Referenzspektren generiert werden. Für die qualitative Analyse z.B.
PCA sind keine zusätzlichen Eingangsparameter
außer
dem Lambda Stack nötig. Die
so gewonnenen Referenzspektren und der Lambda Stack dienen im Anschluß als Eingangsparameter
für eine
quantitative Analyse deren Ergebnis wiederum eine farbkodiertes
Bild ist.
In einem weiteren Verfahren nach 12D erfolgt eine eingeschränkte qualitative
Analyse des Lambda Stacks. Bei der eingeschränkten qualitativen Analyse
werden nur Spektren zugelassen, die vorher durch den Nutzer definiert
worden sind und z.B. in einer Farbstoftdatenbank abgelegt wurden.
Der Algorithmus sucht aus diesen vordefinierten Farbstoffspektren
die Exemplare (d.h. Farbstoffe) heraus, die am besten zu dem spektral
aufgelöst
gemessenen Fluoreszenzsignal passen und definiert somit wiederum
die Referenzspektren. Die so gewonnenen Referenzspektren und der
Lambda Stack dienen im Anschluß als
Eingangsparameter für
eine quantitative Analyse deren Ergebnis wiederum eine farbkodiertes
Bild ist.
Eine weitere Anwendung der oben beschriebenen
Verfahren besteht in der Separierung von Signalen, die für jeweilige
Untersuchung nicht von Interesse sind bzw. ihre Analyse stören. Dies
können
z.B. Hintergrundlicht, Autofluoreszenzen, rückgestreutes Anregungslicht
oder Raumlicht sein. Wird zunächst die
spektrale Verteilung dieser Signale in nicht weiter angefärbten Kontroll-Präparationen
(Autofluoreszenz, rückgestreutes
Anregungslicht) oder in Abwesenheit der Präparate (Hintergrundlicht, Raumlicht) ermittelt,
können
die erhaltenen Spektren wie die Referenzspektren der zu untersuchenden
Farbstoffe in die lineare Entmischungsanalyse mit einbezogen werden
(12 und 13). Nach Entmischung werden sie damit
einem separaten Bildkanal zugewiesen und von den zu untersuchenden
Signalen getrennt, die damit gesondert betrachtet werden können.
Zusammenfassende Begriffserklärungen:
λ-stack
spektrale
Verteilung pro Bildpunkt, gemessen mit den Detektionskanälen mit
dispersiver Aufspaltung der detektierten Strahlung, abgelegt in
Speicherelementen unter Zuordnung zu mindestens einer zusätzlichen
(Bildpunkt) Koordinaten x, y und/oder Z und/oder Meßzeit t
Quantitative Analyse
Pro Bildpunkt wird der Beitrag (der
Anteil) jeder Spektralsignatur zum gesamten von der Probe kommenden
Signal (z.B. Fluoreszenzsignal) berechnet (Entmischungsverfahren).
Die Berechnung erfolgt anhand von Referenzspektren, die das Spektrum
der einzelnen Spektralsignaturen (z.B. Farbstoffe) charakterisieren
und in einer Datenbank abgespeichert, aus dem Bild generiert (ROI)
oder durch qualitative Analyse (PCA) generiert wurden sind.
Bildkanäle
Jedem gewählten Spektralbereich wird
eine Farbe bei der bildlichen Darstellung der Probe zugeordnet (Falschfarbendarstellung),
wobei die Intensität
der Farbe dem Beitrag des Farbstoffs/Spektralsignatur entspricht,
gemessen wird beispielsweise in mehreren Detektionskanälen durch
entsprechende Filter.
Ein farbkodiertes Bild (Mischbild)
entsteht durch bildliche Darstellung mehrerer Farben überlagert,
wenn in einem Probenbereich mehrere Spektralsignaturen/Farbstoffe
enthalten sind:
Qualitative Analyse
Jedem Bildpunkt wird die Spektralsignatur/Farbstoff
zugeordnet, der den größten Beitrag
des gesamten von der Probe kommenden Signals erzeugt.
Farbstoffmaske:
Spektralsignaturen/Farbstoffe an
verschiedenen Orten werden mit unterschiedlichen Farben dargestellt,
wobei die Intensität
jeweils gleichmäßig ist.
ROI:
Vom Nutzer ausgesuchte und markierte
Regionen , wobei durch qualitative Analyse Gebiete gleiche Spektralsignaturen/Farbstoffe
auch automatisch aufgesucht und markiert werden können
Anwendungen der beschriebenen Detektionsmethode
zur Identifikation von spektralen Signaturen mehrfach markierter
Objekte.
1) Herstellung der Proben
In einem ersten Schritt werden die
zu untersuchenden Proben gemäß ihrer
spezifischen Eigenschaften mit mehreren Farbstoffen markiert. Bei
den Proben kann es sich z.B um Chromosomen handeln, die mithilfe
der FISH (Fluorescence in situ Hybridisation) Technik gefärbt wurden.
Ebenso können
Zellen oder Gewebe mit Fluoreszenztechniken (z.B. Immuncyto- und
Immunhistochemische Färbungen)
gefärbt
werden. Durch diese Färbetechniken
werden die biologisch relevanten Informationen der Proben codiert.
2) Informationsgehalt der
Proben
Im einfachsten Fall handelt es sich
aus Sicht des Detektionssystems um eine räumlich eindimensionale Probe
(z.B. Durchflußzytometer).
Dabei ist die in der Probe enthaltene Information alleine durch
die anteilige Kombination unterschiedlicher Farbstoffe codiert (14). Bei der dargestellten
Färbung
wurden die Strukturmerkmale S1, S2 und S3 mit den Farbstoffen A,
B und C markiert. Farbstoffe können anhand
ihrer charakteristischen Absorptions- oder Emissionsspektren unterschieden
werden. Die Identifikation eines Spektrums (Spektrale Signatur)
gestattet damit einen Rückschluß auf das
Vorhandensein eines bestimmten Strukturmerkmals.
Die zu untersuchenden Proben unterscheiden
sich bezüglich
des Vorkommens der oben genannten Strukturmerkmale. Je nach Vorkommen
der Kombinationen der Strukturmerkmale können Probenklassen definiert
werden. Durch die Kombination der Markierungen werden die einzelnen
Probenklassen unterschiedlich spektral kodiert.
Verwendet man zur Detektion Systeme,
die eine zwei- oder dreidimensionale Ortsauflösung erlauben, erhöht sich
der detektierbare Informationsgehalt beträchtlich. Die Anzahl möglicher
Klassen steigt dadurch, daß Strukturmerkmale
der Probe an unterschiedlichen Orten auftreten können. Die (15) zeigt
eine zwei -dimensionale Probe bei der drei unterschiedliche Strukturen
markiert wurden. Der Einfachheit halber wurden hier nur die Markierungen,
jedoch nicht die Strukturen selbst dargestellt. Probenklassen können nun
durch die zwei- bzw. dreidimensionale Anordnung der verschiedenen
Kombinationen der Strukturmerkmale definiert werden. Wird berücksichtigt,
daß die
unterschiedlichen Markierungen mit unterschiedlichen Intensitäten (Konzentrationen der
Strukturen auf Probenebene) auftreten können, ergibt sich ein weiterer
Parameter der zur Klassifizierung herangezogen werden kann.
3) Detektion und Klassifizierung
Die Proben werden hier vorteilhaft
im 7 Schritten untersucht und ausgewertet
Schritt 1
Aufnahme von
Lambda Stacks
Die Proben werden mit oben beschriebenen (Verweis)
Detektor untersucht. Dabei entstehen aus den einzelnen spektral
aufgelöst
gemessenen Bildpunkten Lambda Stacks. d.h. spektrale Verteilungen pro
Probenpunkt, abgelegt in Speicherelementen unter Zuordnung zu mindestens
einer zusätzlichen
Koordinate: Bildpunkt [Koordinaten x, y] und/oder Z und/oder Meßzeit t.
Schritt 2
Erfassung der Referenzspektren
der verwendeten Farbstoffe unter Probenbedingungen
Referenzspektren sind z.B. die Emissionsspektren
einzelner Farbstoffe unter Probenbedingungen, d.h. im Lösungsmittel
gelöst,
bzw. gebunden an Strukturen. Sie werden anhand von Lambda Stacks definiert.
Dies sind spektrale Verteilungen pro Probenpunkt, abgelegt in Speicherelementen
unter Zuordnung zu mindestens einer zusätzlichen Koordinate: Bildpunkt
[Koordinaten x, y] und/oder Z und/oder Meßzeit t.
Im wesentlichen können hierzu drei Verfahren
eingesetzt werden. Zum einen können
die Referenzspektren von Proben gewonnen werden die mit jeweils
nur einem Farbstoff markiert wurden. Jede Probe liefert dabei nur
ein Spektrum. Die so gewonnenen können in einer spektralen Referenz Datenbank
zur weiteren Verwendung abgelegt werden. Dieses Verfahren kann insbesondere
bei der Durchflußzytometrie,
der Laser Scanning Mikroskopie, der Total Internal Reflection Fluorescence
Microscopy (TIRF) und der Nahfeld Mikroskopie angewendet werden.
Zum anderen ist es möglich mehrfach
markierte (Referenz) Proben zur Gewinnung von Referenzspektren zu
verwenden, wenn es möglich
ist Probenbereiche zu definieren, die jeweils nur mit einem Farbstoff
markiert sind.
Die Auswahl solcher Bereiche zur
Generierung von Referenzspektren kann über die Definition von Regionen
des Interesses (wie oben beschrieben) erfolgen. Die Definitition
solcher Regionen kann auch durch Algorithmen zur automatisierten
Erkennung von zwei- oder dreidimensionalen Objekten erfolgen. Diese
Herangehensweise ist bei Systemen anwendbar die ortsaufgelöste Probeninformationen
erfassen. Dazu zählen
z.B. die Laser Scanning Mikroskopie die Total Internat Reflection
Fluorescence Microscopy (TIRF) und die Nahfeld Mikroskopie.
Eine dritte Möglichkeit zur Erzeugung der Referenzspektren
ist die Principle Component Analysis (PCA). Dabei werden Lambda
Stacks von mehrfach markierten (Referenz) Proben mit dem oben beschriebenen
Detektor aufgenommen. Die Anwendung der PCA auf diese Daten liefert
die Referenzspektren.
Schritt
Objekterkennung (20A)
Einsatz bildanalytischer Verfahren
(Binärisierung,
Segmentierung) zur Selektion der zu untersuchenden Elemente der
Probe (Zellen, Zellbestandteile z.B. Tumorzellen, Chromosomen- in 16A schematisch dargestellt). Farblich
markierte runde Tumorzellen werden beispielsweise anhand ihrer Form
selektiert.
Sollen mehrdimensionale Objekte erkannt werden
können
Projektionen in Systeme mit weniger Dimensionen notwendig werden.
So kann ein Chromosom CR 3D mit einer drei-dimensionalen Ausdehnung
im Zellkern, zuerst als zusammenhängendes Objekt definiert und
anschließend
zur weiteren Analyse in ein zweidimensionales Bild projiziert werden (16B). Die in 16 dargestellten unterschiedlichen geometrischen
Formen Dreieck, Kreis, Quadrat) entsprechen unterschiedlichen Mackern.
Schritt 4
Entmischung (20B, C)
Ziel dieses Schrittes ist es Mehrkanalbilder von
mehrfach markierten Proben zu erzeugen. Dabei ist es von entscheidender
Bedeutung, daß es
mit diesem Verfahren möglich
ist, das gesamte Emissionssignal eines dieser Farbstoffe genau einem
Falschfarbkanal zuzuordnen. Die Emissionsignale können dabei
stark überlappen.
Zur Erzeugung der Mehrkanalbilder können zwei Verfahren angewendet
werden:
- 1.) Gibt es in der zu untersuchenden
Probe Bereiche B1, B2, B3 in 17,
die jeweils nur mit einem Farbstoff markiert sind kann die Probe
selbst zur Generierung der Referenzspektren (siehe oben) verwendet
werden. Auf der Basis der so definierten Referenzspektren kann durch
Anwendung der Linearen Entmischung (Lit.: Lansford, et al.; Journal
of Biomedical Optics 6 (3), 311–318, (July
2001) auf den Lambda Stack der Probe das Mehrkanalbild erzeugt werden.
- 2.) Lassen sich in der Probe keine Bereiche definieren, die
jeweils nur mit einem Farbstoff markiert sind (18), können Referenzproben die mit
jeweils einem Farbstoff markiert wurden zur Erzeugung der Referenzspektren
verwendet werden. Die so definierten Referenzspektren werden wie
oben-beschrieben in einer spektralen Referenzdatenbank gespeichert
und zur Linearen Entmischung der Proben Daten (Lambda Stacks) verwendet.
Im Ergebnis ensteht ein falschfarbencodiertes Mehrkanalbild 3.)
Störende
Hintergrundsignale (z.B. Autofluoreszenzenz und Streulicht) können ebenfalls
spektral charakterisiert werden. Das heißt, auch dem Hintergrund Signal wird
ein Referenzspektrum zugeordnet. Wird das Referenzspektrum des Hintergrundsignals
bei der linearen Entmischung berücksichtigt,
erhält
man ein falschfarbencodiertes Mehrkanalbild bei dem ein Kanal das
Hintergrundsignal repräsentiert. Durch
Ausblenden des Hintergrundkanals kann man das Mehrkanalbild Hintergrund
korrigieren. Alternativ können
zusätzliche
Informationen über die
Probe aus dem Hintergrundsignal gewonnen werden.
- 4.) Alternativ zur Linearen Entmischung können Mehrkanalbilder aus den
Lambdastacks auch durch die Principle Component Analysis (PCA) gewonnen
werden.
Die so gewonnenen Mehrkanalfalschfarben Bilder
enthalten alle oben beschriebenen Informationen der Probe. Damit
Rückschlüsse über die
Verteilung der Strukturmerkmale in der Probe möglich.
Schritt 5 Objektanalyse
(16 und 20C)
Hier werden die zuvor definierten
Objekte bezüglich
der Verteilung der Srukturmerkmale untersucht. Dafür werden
die Intensitäten
der Falschfarbkanäle
(siehe Schritt 4) an verschiedenen Orten der Objekte gemessen. Diese
Orte werden derart ausgewählt,
daß sie
den gewünschten
Informationsgehalt der Probe repräsentieren.
Schritt 6 Klassifizierung
Ziel der Klassifizierung ist es,
Proben anhand der Verteilung ihrer Strukturmerkmale zu unterscheiden
und verschiedenen Klassen zuzuordnen. Ein Klasse wird definiert
durch das Vorkommen einer bestimmten Kombination von Strukturmerkmalen
in der Probe.
Zur Klassifizierung wird zusätzlich zur
spektralen Information mindestens eine weitere Koordinate (Bildpunkt
[Koordinaten x,y] und/oder Z und/oder Zeit t) verwendet.
Zur Definition von Klassen kann zum
Beispiel ein Scatter-Diagramm verwendet werden. In 19 ist das Scatterdiagramm eines Zweikanal
Fluoreszenzbildes dargestellt. Die beiden Achsen repräsentieren
die Fluoreszenzintensitäten
der Bildkanäle. Die
Häufigkeit
mit der ein Pixel der Bildes einer Koordinate des Scatter-Diagramms
zugeordnet wird , kann farbcodiert dargestellt werden (blau: wenig
Pixel, rot viele Pixel).
Im folgenden wird anhand eines zweifachmarkierten
Fluoreszenzprobe gezeigt, wie eine Klasssifizierung mit Hilfe von
Scatterdiagrammen vorgenommen werden kann. Zuerst werden Referenzproben
untersucht, die jeweils nur Elemente einer Klasse enthalten. Von
den Zweikanalbildern dieser Proben werden zweidimensionale Scatter
Diagramme berechnet. Jede Dimension entspricht repräsentiert,
die Fluorszenzintensität
eines Farbstoffes. Nun können
im Scatter Diagramm über
Fenster des Interesses (F1) Intensitätsbereiche der Typen:
F1
Intensität Farbstoff:
A 30–50%,
Intensität
des Farbstoffs B: 0–10%
F2
Intensität Farbstoff:
A 50–100%,
Intensität
des Farbstoffs B: 30–100%
etc. definiert werden. Dabei werden solche Fls, oder Kombinationen
von Fls definiert, die Klassenspezifische Eigenschaften der Proben
repräsentieren.
Im nächsten Schritt werden die Zweikanalfluoreszenzbilder
der zu untersuchenden Proben aufgenommen. Von diesen Bildern werden
Scatter Diagramme berechnet. Diese Diagramme werden mit hilfte der
zuvor definierten Fls der Referenz Scatterdiagramme ausgewertet.
Es ist vorteilhaft, die dargestellte
Vorgehensweise auf mehr als zwei Dimensionen auszudehnen. Diese
Dimensionen können
spektrale, räumliche oder
dynamische Probeneigenschaften repräsentieren.
Die Klassifizierung kann zur Analyse
von Daten verwendet werden, die mit bildgebenden und analytischen
Mikroskopiesystemen erfasst wurden. Die Mikroskopsysteme sind bildgebende
Systeme wie Laser-Scanning-Mikroskope
zur dreidimensionalen Untersuchung von biologischen Präparaten, Scanning-Nahfeld-Mikroskope
zur hochaufgelösten Untersuchung
von Oberflächen
und Fluoreszenzkorrelations-Mikroskope zur quantitativen Bestimmung von
Molekülkonzentrationen
und Diffusionseigenschaften.
Die Klassifizierung kann in weiteren
auf Fluoreszenzdetektion basierenden Verfahren, wie in Systemen
zum Screenen von Wirkstoffen und zur Durchflußzytometrie angewendet werden.
Bei durchflußzytometrischen
Verfahren können
die Proben (z.B. menschliche Zellen) nach der Klassifizierung noch
physikalisch voneinander getrennt werden.
Natürlich sind auch Fragestellungen
denkbar bei denen eine Klassifizierung der Proben nicht nötig ist.
Schritt 7 Auswertung
Durch die Klassifizierung erhält man Klassen durch
die Probeneigenschaften oder Kombinationen von Probeneigenschaften
abgebildet werden.
Bei der Auswertung können verschiedene Fragestellungen
auftreten. So kann es von Interesse sein, ob sich eine Probe einer
bekannten Klasse zuordnen lässt
oder nicht. Lassen sich die Proben den Klassen zuordnen, möchte man
in der Regel wissen, wieviele Proben einer Klasse zuzuordnen sind.
Dies Information lässt
sich auf unterschiedliche Weise darstellen.
Vorzugsweise werden dazu Histogramme verwendet
(siehe 20D).
Im dargestellten Diagramm ist die
unterschiedliche Häufigkeit
der Zuordnung zu bestimmten Klassen dargestellt.
20 stellt
im Übrigen
eine Zusammenfassung der geschilderten Verfahrensschritte dar.
Die Erfindung betrifft insbesondere
die Identifizierung von ( vorzugsweise ) dreidimensionalen Objekten
anhand ihrer räumlichen
Ausdehnung und spektralen Signatur.
Die räumliche Ausdehnung kann über Bildverarbeitung
z.B. aus der Kontrastanalyse aus einem Detektionskanal ermittelt
werden. Gleichzeitig liegen über
die gewählte
Detektionsanordnung zu jedem Bildpunkt die lambda- Stacks vor.
Hier ist die wellenlängenabhängige Intensitätsverteilung
pro Bildpunkt selektiv, d.h. für
ausgewählte
Wellenlängen
oder Wellenlängenbereiche,
ermittelbar.
Überlappende
Signale von Fluorophoren können
durch "unmixing" anhand von Referenzspektren getrennt werden.
Die Vorteile der optischen und elektronischen
Anordnung (parallele Aquise von Daten, keine Fouriertransformation
wie bei interferometrischen Anordnungen erforderlich, Schnelligkeit)
führen
zu einer neuen Qualität
bei Screening Verfahren und der Untersuchung insbesondere lebender
Proben Zellwachstum) , bei der Beobachtung schnell ablaufender Prozesse,
z.B. Formänderungen
von Nervenzellen, Änderung
Ionenkonzentrationen). So können u.a.
Tumorzellen anhand ihrer Form erkannt , spektral klassifiziert und
auf ihre Fluoreszenzeigenschaften untersucht werden. Geknickte Chromosomen können beispielsweise
vorteilhaft gesucht, identifiziert und zur spektralen Auswertung
gestreckt werden. Hier kann es sich bei den zu untersuchenden Proben
um Chromosomen handeln , die mithilfe einer FISH-Technologie (z.B.
Multi Color Banding) gefärbt wurden.
Die untersuchten Zellen, Gewebe oder Organismen können Immuncytologisch
oder Immunhistochemisch gefärbt
werden Die oben geschilderten Verfahren sind zur zur medizinischen
Diagnose und/oder Therapie, zur Umweltdiagnose (z.B. Wasser, Boden,
Luft) mit Hilfe lebender Indikatoren, zur Diagnose von Tumoren,
zur Diagnose und Reinigung von Knochenmarkszellen und zur Anwendung
in einem Durchflußzytometer
oder einem optischen Nahfeldmikroskop geeignet.