DE102019117289A1 - Trägermaterial, Kitsystem und Verfahren für biologische Assays - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trägermaterial (T) umfassend mindestens eine Komponente (K), wobei die Komponente (K) adhäsiv an das Trägermaterial (T) gebunden und/oder auf dem Trägermaterial (T) immobilisiert und/oder eingetrocknet ist, wobei das Trägermaterial (T) geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente (K) aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Kitsystem (KS), die Verwendung eines Kitsystems (KS) für die Herstellung einer Antikörperlösung, sowie ein Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trägermaterial umfassend mindestens eine Komponente, wobei die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet Ist.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Trägermaterial umfassend mindestens eine Komponente, wobei das Trägermaterial aufgrund seiner physikalischen Beschaffenheit geeignet ist die Komponente unter Laborbedingungen zu Trocknen und so vor Degradation und/oder Aggregation zu schützen.
  • Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Kitsystem, umfassend ein Reaktionsgefäß und ein erfindungsgemäßes Trägermaterial, sowie die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kitsystems für die Herstellung eines Analysefluids für den Nachweis biogener Makromoleküle.
  • Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Bioassays.
  • Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer festen Matrix (z.B. einer Membran).
  • Im naturwissenschaftlichen Bereich werden häufig polymere Stoffe verwendet, deren physikalisches Kennzeichen es ist, dass sie sich in Lösungen nicht so fein verteilen wie kleinere Moleküle, d.h. nicht monodispers in der Lösung verteilt sind. Eine nicht monodisperse Lösung aus polymere Stoffen, Insbesondere aus Makromolekülen stellt ein Problem dar, da zum einen die Lagerung zur Aggregation führen kann, welche die Quantität des Stoffs in der Lösung mindert, zum anderen auch die Durchmischung zur Entnahme Scherkraft induzierte Schädigung des Stoffes hervorrufen kann, welche die Qualität des Stoffes in der Lösung mindert.
  • Da polymere Stoffe und insbesondere Makromoleküle oftmals kostenintensiv in der Herstellung und daher besonders schützenswert sind, werden solche Stoffe oftmals in Portionen kleiner Volumina oder in getrockneter Form gelagert und zur Anwendung in der Produktion und/oder der Verwendung z.B. als Nahrungsergänzungsmittel sowie als Pharmazeutikum, Diagnostikum oder Therapeutikum und/oder als Labor Analytikum dargereicht.
  • Im Labor werden Makromoleküle häufig in Bioassays und insbesondere durch. immunologische Verfahren, zum Nachweis von Analyten verwendet.
  • Bei einem Bioassay beruht der Nachweis eines Analyten auf der Affinität eines für den Analyten spezifischen Bindungspartners zu einer bestimmten Eigenschaft des Analyten (z.B. Epitop), beispielsweise Im Rahmen einer Antikörper-Antigen-Reaktion. Über ein Markierungsmolekül, das mit dem Bindungspartner verbunden ist, kann das Vorhandensein des Analyten detektiert werden. Das Ziel ist es, ein Signal des markierten Bindungspartners, dabei indirekt des Analyten, in ausreichender Stärke zu erkennen.
  • Der spezifische Bindungspartner, der an den zu detektierenden Analyten bindet, kann auch als Primärbindungspartner bezeichnet werden (z.B. ein Primärantikörper). In der Regel zeichnet sich der Primärbindungspartner durch eine hohe Spezifität und Affinität gegenüber dem Analyten, beispielsweise gegenüber einem bestimmten Epitop des Analyten aus. Dies kann auch beinhalten, dass keine Kreuzreaktionen mit ähnlichen Epitopen gezeigt werden und/oder vorliegen.
  • Immunologische Verfahren, auch Immunassays, bezeichnen eine Reihe von Verfahren in der Analytik (insbesondere der Bioanalytik) zur Erkennung und damit zum Nachweis eines Analyten durch Bindung des Analyten an einen (spezifischen) Bindungspartner.
  • Gängige Immunassays umfassen unter anderem Verfahren wie Western-Bot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunassay (RIA), Immunmarkierung, Immunhistochemie, Slot Blot und/oder Dot Blot, aber auch Lateral-Flow Immunoassays.
  • Bei einem Immunassay beruht der Nachweis eines Analyten auf der Affinität eines für den Analyten spezifischen Bindungspartners zu einer bestimmten Eigenschaft des Analyten (z.B. Epitop), beispielsweise im Rahmen einer Antikörper-Antigen-Reaktion. Über einen Marker, der mit dem Bindungspartner verbunden ist, kann das Vorhandensein des Analyten detektierbar gemacht werden. Das Ziel ist es, ein Signal des Markers, dabei indirekt des Analyten, in ausreichender Stärke zu erkennen.
  • Der spezifische Bindungspartner, der an den zu detektierenden Analyten bindet, kann auch als Primärbindungspartner bezeichnet werden (z.B. ein Primärantikörper). In der Regel zeichnet sich der Primärblndungspartner durch eine hohe Spezifität und Affinität gegenüber dem Analyten, beispielsweise gegenüber einem bestimmten Epitop des Analyten aus. Dies kann auch beinhalten, dass keine Kreuzreaktionen mit ähnlichen Epitopen gezeigt werden und/oder vorliegen.
  • In der Regel wird zwischen direkten Nachweisverfahren und indirekten Nachweisverfahren unterschieden. Bei direkten Nachweisverfahren wird der Analyt mit einem für den Analyten spezifischen Bindungspartner (Primärbindungspartner, z.B. Primärantikörper) zusammengebracht, welcher direkt mit einem Marker verbunden ist. Bei indirekten Nachweisverfahren wird in einem ersten Schritt der Analyt mit einem für den Analyten spezifischen ersten Bindungspartner (Primärbindungspartner, z.B. Primärantikörper) zusammengebracht. In einem zweiten Schritt wird ein zweiter Bindungspartner (Sekundärbindungspartner, z.B. Sekundärantikörper) verwendet, der sich gegen den ersten Bindungspartner richtet. Der zweite Bindungspartner ist mit einem Marker verbunden. Folglich kann über den markierten zweiten Bindungspartner, welcher an den ersten Bindungspartner bindet, welcher wiederum an den Analyten bindet, ein Analyt detektiert werden.
  • Üblicherweise sind bioanalytische Verfahren und vor allem immunologische Verfahren Mehrschrittverfahren, in welchen die einzelnen Komponenten des Nachweissystems einem Präparat, welches den Analyten beinhalten soll und/oder beinhaltet zugeführt werden. Aus diesem Grund sind immunologische Verfahren bzw. bioanalytische Nachweisverfahren relativ langwierig und fehleranfällig, weswegen die Verlässlichkeit der in diesen Assays bzw. Verfahren verwendeten Komponenten eine besondere Bedeutung zukommt.
  • Die beschriebenen Immunologischen Verfahren benötigen zur Durchführung zahlreiche Komponenten (beispielsweise Bindungspartner oder Markierungen), welche nicht selten temperaturempfindlich sind. In der Regel müssen eine Vielzahl der Komponenten, z.B. Antikörper, zumindest teilweise, bei Temperaturen niedriger als Raumtemperatur gelagert und/oder gehandhabt werden um stabil und/oder funktional zu bleiben und/oder gegen Proteolyse geschützt zu sein (z.B. gekühlt auf Eis, im Kühlschrank, bei 4°C bis 8°C oder niedriger als 0°C, insbesondere bei -20°C oder -80°C). Schon kaum vermeidbare Temperaturschwankungen während des Transports und/oder der Lagerung, insbesondere Temperaturerhöhungen (beispielsweise über -20°C, -80°C oder 4°C-8°C) können die Komponenten schädigen, Insbesondere sodass die Struktur und/oder Funktion der Komponenten zumindest teilweise verändert und/oder gestört ist. Besonders kritisch können auch die Entnahmen von Teilmengen der Komponenten sein, da hier neben den unweigerlichen Temperaturänderungen, insbesondere Temperaturerhöhungen, auch noch mögliche Kontaminationen mit ubiquitären Proteasen und/oder Mikroben schädigend auf die Struktur und/oder Funktion der Komponenten wirken können.
  • Beispiele derartiger empfindlicher Komponenten sind unter anderem Antikörper oder Antikörperfragmente, Oligonukleotide, DNA-Sonden, RNA-Sonden, Nukleinsäurefragmente, Aptamere, Anticaline, Lektine, Affibodies, chemische Liganden, Nanopartikel, Enzyme (insbesondere Reporterenzyme) oder Farbstoffe, insbesondere auch Fluoreszenzfarbstoffe.
  • Bisher bekannte Verfahren und Komponenten sind zwar spezifisch für bestimmte Analyten, jedoch aufgrund der Komplexität der Verfahren und der Instabilität der Komponenten fehlerempfindlich. Den Komponenten ist nicht anzusehen, ob sie in ihrer Struktur und/oder Funktion geschädigt wurden, so dass falsch negative Ergebnisse von bioanalytischen und/oder Immunologischen Verfahren, in welchen die Komponenten verwendet wurden, aufgrund geschädigter, struktur- und/oder funktionsbeeinträchtigter Komponenten zum Forschungsalltag gehören.
  • Da die gängigen bioanalytischen und/oder Immunologischen Verfahren, für die diese Komponenten benötigt werden, aufwändig sind, wäre es wünschenswert die Komponenten in stabiler Formulierung und/oder mit geringer Anfälligkeit für Struktur- und/oder Funktionsschäden zur einfachen Anwendung darzureichen. Zudem sind die gängigen bioanalytischen und/oder immunologischen Verfahren von einer langen Dauer und einer Vielzahl an Verfahrensschritten (beispielsweise mehrere Bindungsreaktionen, mehrere Waschschritte, Blockieren unspezifischer Bindungsstellen und/oder enzymatische Reaktionen) gekennzeichnet, und stellen keine praktischen Anwendungsformen dar.
  • Integrierte trockenchemische Testelemente würden die Verfahrensdurchführung erleichtern, die Fehleranfälligkeit vermindern und/oder Zeiten für das Durchführen eines immunologischen Verfahrens verkürzen.
  • Die beschriebenen empfindlichen Komponenten können getrocknet werden und sind in getrockneter Form geschützt gegen Beschädigung, z.B. durch Proteolyse, Oxidation oder Hydrolyse und/oder Instabilität und/oder Funktionsverlust. So können vor allem ansonsten temperatursensitive und auch Degradations-empfindliche Komponenten auch ohne Kühlung stabil gelagert werden.
  • Eine einfache Lösung des Problems wäre daher das Vakuumtrocknen empfindlicher Komponenten. Dieses Verfahren ist aber insofern problematisch, als dass es für jede Komponente gesondert optimiert werden muss. Kritisch ist dabei, dass sich beim Trocknen das Medium verändert, da auch die Stabilisatoren mit eingetrocknet und daher konzentriert werden. Wird dies nicht optimiert, können die Komponenten wiederum ihre Funktionalität und Stabilität durch den Trocknungsprozess verlieren. Auch die Lagerstabilität ist kritisch, da die Formulierungen in hoch konzentrierten Salzen und Hilfsstoffen hygroskopisch sind und bei Feuchtwerden (z.B. Kondenswasser, Luftfeuchtigkeit bei Probenentnahme und Lagerung) Aggregation und Degradation auftreten. So stabilisierte Komponenten neigen daher zur Aggregation, sodass eine homogene Rücklösung meist nicht erreicht wird. Es muss ein Verlust von Material in Kauf genommen werden, was insbesondere bei teuren und aufwendig hergestellten Komponenten vermieden werden soll.
  • Aus dem Stand der Technik sind bereits Trägermaterialien zur Freisetzung von Analysefluids, welche biogene analytischen Komponenten enthalten, für die Verwendung in immunologischen Verfahren bekannt.. Die Aufbringung und ggf. das Eintrocknen der Komponenten auf den Trägermaterialien ermöglichen eine besonders hohe Stabilität gegenüber degenerativen Einflüssen, wie z.B. Temperaturänderungen (insbesondere Temperaturanstiege), Änderungen (insbesondere ein Anstieg) der Luftfeuchtigkeit führen hier jedoch weiterhin zur Zersetzung der biogenen Komponenten. Neben einer verschweißten, luftdichten Verpackung ist die Zugabe von Trockensalzpäckchen erforderlich.
  • Der Erzeugung von Analysefluiden kommt das sogenannte Conjugate Pad, welches in diagnostischen immunologischen Anwendungen, wie z.B. Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA), Verwendung findet am nächsten. Das Trägermaterial des Conjugate Pad besteht zumeist aus Glasfaser oder Cellulose Faser oder auch oberflächen-modifizierter Polymerfaser. Es ist in der Regel bis zu 1cm lang, 0,5cm breit und unter 0,5mm dick. Da das hauptsächliche Kriterium der Auswahl des Trägermaterials in der geringen Proteinbindung sowie dem niedrigen Rückhaltevolumen von maximal <50µL/cm2 liegt ist die Aufnahme der Flüssigkeit auf 25µL Flüssigkeit beschränkt. Zur Vermeidung von Randeffekten werden zumeist 10 bis 15µL Konjugat, welches zumeist Nanopartikel markierte Primärantikörper beinhaltet, aufgetragen. Die Trägermaterialien werden vorbehandelt, um eine möglichst schnelle Freisetzung der Komponenten auch bei nur geringer Proben- und/oder Analytmenge zu erhalten. Die Conjugate Pads werden im Vakuum getrocknet und müssen trocken gehalten werden, um die Integrität der Komponenten zu erhalten.
  • Neben einer verschweißten, luftdichten Verpackung ist die Zugabe von Trockensalzpäckchen erforderlich. Diese Schritte sind Stand der Technik in diagnostischen, chromatographischen Anwendungen, wie Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA), welche jeweils der Diagnose eines bestimmten Analyten dienen.
  • Die US4366241B1 offenbart nicht-chromatographische Testvorrichtungen und Verfahren, die solche Vorrichtungen verwenden, für die Bestimmung von Mitgliedern eines immunologischen Paares (Mip). Die Testvorrichtung verfügt über eine immunsorbierende Zone, an der ein Mip (gegen diffuse Bewegungen) befestigt ist. Die immunsorbierende Zone dient als Eingang für die Proben- und Reagenzlösungen. In flüssigkeitsaufnehmender Beziehung, entweder direkt oder indirekt mit der immunsorbierenden Zone und normalerweise quer dazu verlaufend, befindet sich eine flüssigkeitsabsorbierende Zone, die dazu dient, Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone zu ziehen, Flüssigkeit zu speichern und dazu dienen kann, die Geschwindigkeit zu steuern, mit der die Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone gezogen wird.
  • Die EP186799A1 offenbart ein festes diagnostisches Mittel, bestehend aus mehreren Funktionsfeldern, welches zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Substanzen oder Analyten in biologischen Flüssigkeiten dient. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren unter Verwendung dieses Mittels, wobei nach Kontakt des Mittels mit der Flüssigkeit die Analyten mit spezifischen bioaffinen Bindungspartnern reagieren und mit Hilfe von Markierungsreagenzien nachgewiesen werden.
  • Ferner offenbart die EP2395921 B1 eine Vorrichtung zum Bestimmen des Vorliegens und/oder der Menge eines oder mehrerer Analyten in einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Menschen, ferner unter anderem zumindest einen Teststreifen mit einem saugfähigen Abschnitt sowie mit Reagenzien zum Bestimmen des Vorliegens und/oder der Menge eines oder mehrerer Analyten in der Probe.
  • Ferner offenbart die EP1361436 A1 mehrschichtige Reagenzteststreifen zur Quantifizierung von glykosiliertem Protein in einer flüssigen Probe sowie Verfahren zu deren Verwendung. Bei der Verwendung der Teststreifen wird eine flüssige Probe auf den Teststreifen aufgebracht und ein Signal erzeugt, mit dem der Gehalt glykosilierten Proteins in der Probe quantifiziert werden kann.
  • Die WO2018203145A1 offenbart Verfahren zur Diagnose, Forschung und zum Screening von Chemikalien in biologischen Flüssigkeiten im Zusammenhang mit der Ethylenglykolverglftung. In einigen Ausführungsformen wird eine Testvorrichtung zum Messen von Glykolat/Glykolsäure beschrieben, umfassend: einen Teststreifen, umfassend a) ein Oxidase-Enzym (z.B. Glykolatoxidase (GOX oder GAX)), das Wasserstoffperoxid erzeugt, während das Glykolat mit Luftsauerstoff oxidiert wird; b) eine Peroxidase, zum Beispiel Meerrettichperoxidase, die in der Lage ist, geeignete Substrate mit dem erzeugten Wasserstoffperoxid zu oxidieren; und c) ein geeignetes Substrat für die Peroxidase, das als Vorläufer eines Indikatorfarbstoffs dient, der photometrisch durch Reflexphotometrie oder fluorimetrisch in einem speziell für diesen Zweck konstruierten Lesegerät oder visuell gelesen werden kann.
  • Allgemein wurden die beschriebenen In-vitro Diagnostik Schnelltests für geringe Konzentrationen von Analyten In biologischen Proben entwickelt und optimiert. In den im Stand der Technik beschriebenen in-vitro-Diagnostik-Vorrichtungen und Verfahren wird eine über die für den eigentlichen Nachweis hinaus benötigte Menge an Reagenzien für die jeweiligen Teststreifen verwendet. Dies ist erforderlich, da die Anforderung der sehr hohen Fließfähigkeit durch die Größe der Reagenzien/Komponenten (z.B. Nanopartikel) limitiert ist und das geringe Volumen der zu analysierenden Probe das Herauslösen der Komponenten/Reagenzien aus dem Trägermaterial und/oder Filter erschwert. Diese Zusammensetzung der Schnelltests ist für die diagnostische Anwendung, bei der es um die Detektion kleinster Mengen eines Analyten aus biologischen Proben geht, optimiert. Die präzise hergestellten Reagenzien/Komponenten werden aufgrund ihrer Hochwertigkeit und des Bedarfs der gleichmäßigen Verteilung der eher geringen Mengen zumeist aufwändig auf das für das jeweilige Verfahren, z.B. LFIA, optimierte Trägermaterial aufgebracht und im Vakuum getrocknet. Die Trägermaterialien, insbesondere Teststreifen, werden dann in für die entsprechende Diagnostik individuell angefertigten Gehäuse eingebaut und dort verwendet.
  • Derartige Verfahren sind für die wissenschaftliche Anwendung nicht geeignet, in Anwendungen im Laboralltag der Forschung im Bereich der Lebenswissenschaften (Biologie, Medizin, Biomedizin, Pharmazie, Biochemie, Chemie, Molekularbiologie, Biophysik, Bioinformatik, Humanbiologie, Forensik, Agrarwissenschaft, Agrartechnologle, Ernährungswissenschaft, Lebensmittelforschung, etc.), wie beispielsweise der Detektion eines Analyten, Insbesondere eines Proteins mittels eines Immunassays, stellen sich andere Anforderungen. In der Regel werden hier variable Mengen mehrerer Proben, jeweils mindestens einen Analyten umfassend, parallel analysiert. Dabei ist der Analyt auf einer Fläche wesentlich größer als die der aus dem Stand der Technik bekannten Teststreifen immobilisiert. Zur Benetzung der Gesamtfläche wird daher eine große Menge von Reagenzien/Komponenten in großem Volumen benötigt (Milliliter). Die aus dem Stand der Technik bekannten Trägermaterialien und/oder Verfahren sind zudem in der Regel nur auf die Detektion/Diagnose einen einzigen Analyten ausgelegt und daher sehr unflexibel in ihrer Anwendung.
  • Würden nach dem Stand der Technik hergestellte Trägermateriallen, insbesondere Teststreifen, für größere Nachweisflächen, Ansätze, eine größere Probenanzahl und/oder Probenmenge und/oder die Analyse verschiedener Analyten, wie es In der Forschung der Lebenswissenschaften in der Regel nötig ist, bereitgestellt werden, würde das eine entsprechend größere Menge an Komponenten/Reagenzien erfordern. Eine flexible und/oder wirtschaftliche Nutzung ist nach dem Stand der Technik nicht ermöglicht, daher sind die in der In-vitro-Diagnostik gängigen Produkte und/oder Verfahren für den Laboralltag in der Forschung nachteilig.
  • Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Trägermaterial umfassend mindestens eine Komponente, in vorteilhafter Weise weiterzubilden, insbesondere dahingehend, dass eine höhere Flexibilität und/oder Wirtschaftlichkeit in der Anwendung erreicht wird.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Trägermaterial mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Danach ist vorgesehen, dass ein Trägermaterial bereitgestellt wird, umfassend mindestens eine Komponente, wobei die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
  • Die Erfindung basiert auf dem Grundgedanken, dass ein Binden einer Komponente auf einem Trägermaterial erfolgt, und zwar dahingehend, dass die Komponente eine adhäsive Bindung an das Trägermaterial eingeht und so eine einfache Wiederfreisetzung zu einem späteren Zeitpunkt ermöglicht wird. Dabei kann eine für eine bestimmte Anwendung angepasste Menge einer Komponente auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet werden. Diese an das Trägermaterial adhäsiv gebundene und/oder immobilisierte und/oder eingetrocknete Komponente kann einerseits stabil ohne strukturelle und/oder funktionelle Schädigung gelagert und/oder transportiert werden. Durch das Eintrocknen der Komponente auf dem Trägermaterial kann eine besonders hohe Stabilität gegenüber degenerativen Einflüssen, wie z.B. Temperaturänderung, Einfrieren, Wärme, Luftfeuchte und biologische Zersetzung erreicht werden. Andererseits wird es ermöglicht, dass die Komponente durch ein Elutionsfluid zu einem gewünschten Zeitpunkt vom Trägermaterial in Form einer homogenen Lösung wieder freigegeben wird. Insgesamt muss kein relevanter Verlust von Funktion und/oder Struktur und/oder der Menge der Komponente in Kauf genommen werden, was insbesondere bei teuren und aufwendig hergestellten Komponenten, welche für teure und aufwendige Verfahren verwendet werden, vorteilig ist.
  • Die Erfindung berücksichtigt ferner die besonderen Erfordernisse In der allgemein immunologischen, nicht diagnostischen Anwendung. Hier wird eine besondere Flexibilität in der Anwendung benötigt, da die Forscher häufig wechselnde Analyten nachweisen müssen.
  • Die beschriebene Erfindung sieht insbesondere vor, empfindliche Komponenten durch Einbringen auf das Trägermaterial in schonender Weise, portionsgerecht zu trocknen. Die Komponenten sind in der so getrockneten Form geschützt gegen Beschädigung, z.B. durch Proteolyse, Oxidation oder Hydrolyse und/oder Instabilität und/oder Funktionsverlust, sind einfach zu Solubilisieren und unterliegen keiner Lagerinstabilität unter Umgebungsbedingungen, da das Trägermaterial sie hinreichend auch vor dem Einfluss der Luftfeuchtigkeit schützt. So können vor allem ansonsten temperatursensitive und auch Degradatlons-empfindliche polymere Stoffe auch ohne Kühlung stabil gelagert werden.
  • Zum Anwendungsbereich der Erfindung sind insbesondere die Erzeugung stabil lagerfähiger degradations- und aggregations-sensitiver Stoffe, wie beispielsweise biogene und abiogene Makromoleküle und/oder Polymere zu nennen.
  • Ein „Molekül“ bezeichnet ein Teilchen, das aus zwei oder mehreren zusammenhängenden Atomen besteht, welche durch kovalente Bindungen verbunden sind.
  • Ein „Makromolekül“ bezeichnet, die aus vielen (bis zu mehreren Hunderttausend) gleichen oder unterschiedlichen Bausteinen (Atome oder Atomgruppen) bestehen und damit eine relativ große Molekülmasse (über 1000 Da; bzw. über 1000 g/mol) haben. Der Begriff Makromoleküle umfasst Proteine, Peptide, Polymere, Kolloide, Proteine und Nukleinsäuren.
  • Ein „Polymer“ bezeichnet eine chemische Verbindung, die aus Ketten- oder verzweigten Molekülen besteht, die aus gleichen oder gleichartigen Einheiten (den sogenannten Monomeren) bestehen. Ein Polymer umfasst Makromoleküle, chemische Verbindungen, Salze und Metalle.
  • Ein „Stoff“ bezeichnet Materie regelmäßiger Beschaffenheit, die sich durch die Elementareinheiten, aus denen sie zusammengesetzt ist, definiert. Diese Elementareinheiten können Atome, Moleküle oder Formeleinheiten (etwa bei Salzen) sein. Stoffe werden durch ihre physikalischen Eigenschaften, wie Dichte, Schmelzpunkt, elektrische Leitfähigkeit etc., charakterisiert.
  • Der Begriff „biogen“, bezeichnet Stoffe, die von biologischen Systemen abstammend oder durch solche bedingt.
  • Der Begriff „abiogen“, bezeichnet Stoffe, die nicht von biologischen Systemen abstammend oder durch solche bedingt. Insbesondere bezeichnet der Begriff künstlich, bzw. synthetisch erzeugte Stoffe.
  • Ein „Nanopartikel“ bzw. „NanoteIlchen“ bezeichnet einen Verbund von wenigen bis einigen tausend Atomen oder Molekülen, dessen Größe typischerweise bei 1 bis 100 Nanometern liegt, ggf. aber auch bis 1000 Nanometer erweitert werden kann. Nanopartikel können sowohl auf natürlichem Wege (z. B. Vulkanausbruch oder Waldbrand), als auch durch anthropogene (vom Menschen verursachte) Einflüsse (z. B. Auto- und Industrieabgase) oder synthetisch Nanopartikel hergestellt sein.
  • „Bioassays“ bezeichnen eine Reihe von Verfahren in der Analytik (insbesondere der Bioanalytik) zur Erkennung und damit zum Nachweis eines Analyten durch Bindung des Analyten an einen (spezifischen) Bindungspartner.
  • Gängige Bioassays umfassen unter anderem immunologische Verfahren wie Western-Bot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunassay (RIA), Immunmarkierung, Immunhistochemie, Slot Blot und/oder Dot Blot, aber auch Lateral-Flow Immunoassays.
  • Eine „Komponente“, im Sinne der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf einen Stoff, der ein Molekül und/oder ein Makromolekül und/oder ein Polymer sein kann..
  • Ein „Analyt“, Im Sinne der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf ein Molekül, das über die Bindung eines Bindungspartners an eine Bindestelle des Analyten nachgewiesen werden kann.
  • Ein Analyt kann ein Protein umfassen, wobei die Bindungsstelle ein Teil des Proteins ist, an welche der Bindungspartner selektiv bindet. Der Analyt kann ein einzelnes Peptid und/oder Polypeptid sein, aber auch ein Komplex aus verschiedenen Polypeptiden.
  • Denkbar ist auch, dass der Analyt einen Antikörper und/oder Fragment eines Antikörpers und/oder ein Epitop eines Antikörpers umfasst.
  • Denkbar ist auch, dass der Analyt ein oder mehrere Kohlenhydrate, Lipide, DNA, RNA, komplexe organische Moleküle wie Enzymhemmer, Rezeptorbindemittel, Hormone und/oder pharmazeutische Verbindungen und/oder Verbindungen aus einem oder mehreren Stoffen umfasst.
  • Ein „Elutionsfluid“, im Sinne der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf ein Fluid, In welchem ein Stoff gelöst werden kann. Insbesondere kann ein Elutionsfluid eine Flüssigkeit sein. Insbesondere kann ein Elutionsfluid eine Lösung sein. Insbesondere kann eine Lösung ein polares oder unpolares Lösungsmittel sein. Insbesondere kann die Lösung eine Pufferlösung sein. Insbesondere kann die Pufferlösung eine im Labor gängige Pufferlösung sein, beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) oder eine Tris-gepufferte Salzlösung (Tris-buffered saline, TBS). Insbesondere kann die Lösung eine klare Lösung sein.
  • Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass die mindestens eine Komponente eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff umfasst. Dadurch kann bewirkt werden, dass Eigenschaften, insbesondere verschiedene Eigenschaften, von mindestens zwei Stoffen, insbesondere mindestens zwei verschieden Stoffen, miteinander kombiniert vorliegen. Es kann vorgesehen sein, dass bei einer erfindungsgemäßen Komponente die Fähigkeit eines ersten Stoffes an einen Analyten zu binden und die Fähigkeit eines zweiten Stoffes ein detektierbares Signal zu geben vorliegt.
  • Werden mindestens zwei Stoffe mit einer gleichen Eigenschaft zu einer Komponente verbunden, so kann durch die Verbindung der mindestens zwei Stoffe mit der gleichen Eigenschaft eine stärkere Ausprägung der Eigenschaft der Komponente im Vergleich zur Ausprägung der Eigenschaft des ersten Stoffes und/oder des zweiten Stoffes alleine erzielt werden.
  • Zudem ist denkbar, dass der erste Stoff einen spezifischen Bindungspartner eines Analyten umfasst, wobei der Bindungspartner mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody und/oder chemischen Ligand umfasst und wobei der zweite Stoff einen Marker umfasst, wobei die Markierung mindestens einen Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Ollgonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierendes Nanopartikel, magnetisches Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst. Dadurch kann bewirkt werden, dass bei der Komponente die Fähigkeit eines ersten Stoffes an einen Analyten zu binden und die Fähigkeit eines zweiten Stoffes ein detektierbares Signal zu geben kombiniert vorliegt. Insbesondere kann eine Verbindung eines spezifischen Bindungspartners eines Analyten mit einen Nanopartikel, z.B. einem Gold-Nanopartikel, den Vorteil haben, per bloßem Auge detektierbar zu sein.
  • Das Fluorophor und/oder Fluorochrom kann beispielsweise ein Fluorescein, ein Fluoresceinderlvat, Fluoresceinisothiozyanat (FITC), 5(6)-Tetramethylrhodamine isothiocyanate ((5(6)-TRITC), Rhodamin Texas Red, Grün Fluorescierendes Protein (GFP), Gelb Fluoreszierendes Protein (yellow fluorescent protein, YFP), Rot Fluoreszierendes Protein (RFP) und/oder jedes beliebige andere Fluorophor und/oder Fluorochorm sein sein. Ein Fluorophor und/oder Fluorchrom kann auch ein Redox-abhängiges Protein, z.B. ein roGFP, rxYFT und/oder HyPer sein. Als fluoreszentes Protein-Tag kann auch das Flash-Tag verwendet werden.
  • Das Enzym kann ein Reporterenzym sein, beispielsweise eine Peroxidase (z.B. eine Meerrettichperoxidase) oder eine alkalische Phosphatase. Wird ein Enzym als Marker verwendet, kann durch das Enzym eine Farb- oder Chemolumineszenzreaktion (enhanced chemoluminescence, ECL) katalysiert werden.
  • Einer Peroxidase kann üblicherweise Wasserstoffperoxid als Substrat angeboten werden. Die freiwerdenden Protonen oxidieren ein chromogenes Substrat zu seinem farbigen Endprodukt unter Bildung von Wasser. Das chromogene Substrat kann beispielsweise 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthlazolin-6-sulfonsäure (ABTS), 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-naphthol (CN), 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), Luminol und andere Dextrane, Tetramethylbenzidin (TMB) und/oder andere chromogene Substrate sein.
  • Einer alkalischen Phosphatase können üblicherweise organische Phosphatverbindungen als Substrat angeboten werden. Die alkalische Phosphatase spaltet Phosphat ab und die freigesetzte Verbindung reagiert zu einem farbigen Endprodukt. Das Substrat kann beispielsweise 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) in Verbindung mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), Tetrazolium-Salz mit Indoxyl, Naphthol-AS-MX-Phosphat, Naphthol AS mit Fast Red TR, Neufuchsin und/oder ein anderes Substrat sein.
  • Gängige Detektionsverfahren und/oder Detektionssysteme umfassen unter anderem Phosphoimager, Röntgenfilme, CCD Kameras und/oder Fluoreszenzdetektorsysteme.
  • Das radioaktive Isotop kann beispielsweise 131Iod, 32Phosphor 3Tritium und/oder ein anderes radioaktives Isotop sein.
  • Es ist denkbar, dass ein Nanopartikel eine Größe von etwa 1-200nm hat. Der Nanopartikel kann auch eine Größe <1nm haben. Der Nanopartikel kann ein metallischer Nanopartikel sein, Insbesondere ein Gold-Nanopartikel. Generell ist es auch möglich, dass Gold-Nanopartikel kolloidale Gold-Nanopartikel sind.
  • Es ist auch vorstellbar, dass die Nanopartikel magnetische Nanopartikel sind bzw. umfassen, besonders superparamagnetische Nanopartikel und/oder Silika-Sphären gefüllt mit Farbstoffen, fluoreszierende Nanopartikel, besonders Quantum Dots und/oder Quantum Rods und/oder Nanopartikel beinhaltend seltene Erden sind bzw umfassen. Weiterhin ist vorstellbar, dass Nanopartikel, Stoffe umfasst, die als Einheit in Polymermizellen vorliegen, und/oder eingehüllt beispielsweise in Acrylat, Surfmer, Dendrimer und/oder Polymer, so diese direkt oder indirekt gebunden die Solubilisierung und Anheftung einer Komponente im Sinne dieser Schrift erlauben.
  • Weiter ist vorstellbar, dass die mindestens eine Komponente mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody, chemischen Ligand, Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
  • Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial mindestens ein poröses Material umfasst, insbesondere ein Fasergewebe aus Zellulose, Glasfaser, Polymerfaser, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/oder Baumwoll-Linter und/der einen Schwamm. Durch die poröse Beschaffenheit des Trägermaterials ist das Trägermaterial geeignet, Flüssigkeiten aufzunehmen und/oder zu speichern.
  • Ein Schwamm kann ein synthetischer und/oder natürlicher Schwamm sein.
  • Generell kann das Trägermaterial aus jedem synthetischen und/oder nicht-synthetischen Material und/oder jeder synthetischen oder nicht-synthetischen Materialkombination hergestellt sein.
  • Generell kann das Trägermaterial eine Kombination aus mehreren Geweben und/oder Materialen und/oder Stoffen sein.
  • Generell kann das Trägermaterial aus Kohlehydraten aufgebaut sein.
  • Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial mindestens ein poröses Material umfasst und in einem Elutionsfluid lösbar ist. Bei einem Trägermaterial, das in einem Elutionsfluid lösbar ist kann vermieden werden, dass nach Freigabe der Komponente in das Elutionsfluid möglicherweise ungewollt störendes Trägermaterial im Elutionfluid vorliegt. Insbesondere kann so auch vermieden werden, dass ein Verlust an Elutionsfluid verzeichnet werden muss, dadurch, dass ein Volumenanteil des Elutionsfluids im Trägermaterial gebunden ist.
  • Denkbar ist Insbesondere, dass das Trägermaterial ein Zucker, Protein und/oder Polymer ist oder ein Gemisch aus diesen oder ähnlichen wasserlöslichen Materialien.
  • Denkbar ist insbesondere, dass das Trägermaterial eine lösbare Tablette ist.
  • Weiter ist denkbar, dass das das Trägermaterial eine Dicke größer als 0,1 mm und einen Durchmesser von 0,5 cm bis 5 cm, insbesondere von 1 cm bis 5 cm aufweist.
  • Diese Dimensionen des Trägermaterials ermöglichen die Aufnahme und/oder Bindung eines gewissen Flüssigkeitsvolumens.
  • Weiter ist vorstellbar, dass das Trägermaterial eine weitgehend runde Form aufweist.
  • Insbesondere ist es möglich, dass das Trägermaterial eine kreisrunde Form aufweist.
  • Denkbar Ist, dass eine runde Form des Trägermaterials das passgenaue einbringen des Trägermaterials in ein rundes Reaktionsgefäß ermöglicht.
  • Es ist möglich, dass das Trägermaterial aus einem Rohling ausgestanzt und/oder ausgeschnitten wurde.
  • Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial ein Bindungsvolumen von bis zu 20 ml hat. Ein Bindungsvolumen von bis zu 20ml kann bewirkten, dass auch bei niedrig konzentrierten Flüssigkeiten eine ausreichende, definierte Menge einer Komponente aufgenommen wird.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Kitsystem.
  • Es ist denkbar, dass ein Kitsystem folgendes umfasst:
    • - ein Reaktionsgefäß, welches zur Aufnahme eines Fluids geeignet ist;
    • - ein Trägermaterial, wobei das Trägermaterial mindestens eine Komponente umfasst,
    dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben, und wobei das Trägermaterial in dem ansonsten leeren Reaktionsgefäß eingebracht Ist.
  • Ein erfindungsgemäßes Kitsystem ermöglicht eine einfache und schnelle Durchführung eines Versuches, zum Beispiel eines Bioassays. Ein erfindungsgemäßes Kitsystem erlaubt es einem Anwender bei Einsatz des Kitsystems genau definierte, standardisierte Bedingungen anzuwenden, sodass, mit dem Kitsystem durchgeführte Versuche und/oder Testreihen, sowie deren Ergebnisse untereinander direkt vergleichbar sind.
  • Ein Reaktionsgefäß kann generell jede Form von Behälter sein. Insbesondere ist es möglich, dass das Reaktionsgefäß ein Röhrchen ist.
  • Generell ist es möglich, dass das Reaktionsgefäß zum Erfassen jedes erdenklichen Volumens ausgebildet sein kann (z.B. 100µl, 200µl, 1,0 ml, 1,5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500mL, 1L).
  • Es ist generell möglich, dass auf dem Reaktionsgefäß eine Füllstandanzeige (z.B. in ml) angebracht ist. Dies ermöglicht das direkte Ablesen von in das Reaktionsgefäß eingebrachten Volumina von Flüssigkeiten, z.B. eines Elutionsfluids.
  • Ferner Ist denkbar, dass die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet ist.
  • Weiter ist vorstellbar, dass das Reaktionsgefäß nahezu luftdicht verschließbar ist, Insbesondere mit einem Deckel.
  • Der Deckel kann beispielsweise ein Schraubverschluss, ein Klickverschluss, eine Kapsel, ein Stopfen, eine Scheibe und/oder eine Folie sein. Ein nahezu luftdichter Verschluss des verschließbaren Reaktionsgefäßes ermöglicht eine Stabilisierung des Trägermaterials (und/oder der Komponente), insbesondere gegen Kontaminationen aller Art, z.B. mikrobielle Kontamination(en), z.B. durch Bakterien und/oder Pilze. Ferner ermöglicht der nahezu luftdichte Verschluss des Reaktionsgefäßes eine Stabilisierung des Trägermaterials gegen Umwelteinflüsse, z.B. hohe und/oder schwankende Luftfeuchtigkeit. Ein nahezu luftdichter Verschluss des verschließbaren Reaktionsgefäßes kann zudem das Halten von Schutzgasen In dem Reaktionsgefäß ermöglichen, was ebenso eine Stabilisierung des Trägermaterials (und/oder der Komponente) ermöglicht.
  • Generell kann das Reaktionsgefäß wiederverschließbar sein.
  • Vorstellbar ist, dass das Trägermaterial im Deckel des Reaktionsgefäßes angebracht ist. Das Einbringen des Trägermaterials in den Deckel des Reaktionsgefäßes ermöglicht eine einfache Handhabung des Reaktionsgefäßes selbst, beispielsweise kann es so ermöglicht werden, dass ein Volumen einer sich in dem Reaktionsgefäß befindlichen Flüssigkeit mit Hilfe einer auf dem Reaktionsgefäß befindlichen Füllstandanzeige korrekt abgelesen werden kann, ohne dass das scheinbare Volumen der Flüssigkeit durch ein frei in der Flüssigkeit schwimmendes Trägermaterial verfälscht wird.
  • Insbesondere ist vorstellbar, dass das Trägermaterial in den Deckel des Reaktionsgefäßes hineingespannt und/oder geklickt wird.
  • Es ist generell auch möglich, dass das Trägermaterial in den Deckel geklebt wird.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kitsystems nach einem der Ansprüche 10-13 für die Herstellung eines Analysefluids für einen Bioassay. Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kitsystems für die Herstellung eines Analysefluids für einen Bioassay, wie zum Beispiel einer Antikörperlösung für einen Immunassay, hat den Vorteil, dass Assays mit möglichst geringem Zeitaufwand durchgeführt werden können. Insbesondere ist dies durch das Wegfallen und/oder Verkürzen von üblicherweise durchgeführten Blockler- und/oder Inkubations- und/oder Waschschritten zu erklären. Zudem können durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kitsystems für die Herstellung eines Analysefluids, wie zum Beispiel einer Antikörperlösung für einen Immunassay, beispielsweise einen Western Blot, Dot Blot, Slot Blot, ELISA, Radioimmunassay, Immunmarkierung und/oder Immunhistochemie, standardisierte Bedingungen gewährleistet werden, sodass mit dem Kitsystem durchgeführte Versuche und/oder Testreihen, sowie deren Ergebnisse miteinander vergleichbar sind.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran und/oder anderer, geeigneter Oberfläche, beispielsweise der Oberfläche einer ELISA-Platte.
  • Das Verfahren kann mindestens die folgenden Schritte umfassen:
    • - Beladung eines Trägermaterials mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Verbindung aus einem spezifischen Bindungspartner des Analyten und einem Marker;
    • - Adhäsive Bindung der Verbindung an das Trägermaterial;
    • - Trocknung des Trägermaterials;
    • - Einbringen des Trägermaterials in ein trockenes Reaktionsgefäß;
    • - Einbringen eines Elutionsfluids In das Reaktionsgefäß, wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet;
    • - Aufbringen des Analysefluids auf die Membran;
    • - Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über den Marker.
  • Ferner ist vorstellbar, dass das Verfahren einen oder beide weitere folgende Schritte umfasst:
    • - Vorbehandlung des Trägermaterials mit einem Fluid und/oder
    • - Einbringung von Zusatzstoffen zur aufzutragenden Komponente
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran umfasst weniger Verfahrensschritte als nach dem Stand der Technik durchgeführte Verfahren. Beispielsweise sind im erfindungsgemäßen Verfahren Im Vergleich zu dem nach dem Stand der Technik durchgeführten Verfahren keine Wasch- und/oder Blockierungsschritte erforderlich, was den Vorteil einer Zeitersparnis mit sich bringt. Des Weiteren verringern sich die Prozessschritte des Verfahrens, da die nacheinander durchzuführende Inkubation von Primär- und Sekundärantikörper, wie es bei Indirekten Assays angewandt wird nicht erforderlich.
  • Ferner wird durch das Trocknen des Trägermaterials die adhäsiv an das Trägermaterial gebundene Komponente stabilisiert, was zu einer geringeren Fehleranfälligkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den nach dem Stand der Technik durchgeführten Verfahren führt. Insgesamt ist während des Verfahrens eine einfache Handhabung der Komponente möglich, da die Komponente portionsgerecht und stabilisiert vorliegt und nicht wie üblich auf Eis und/oder In einer Kühlung gearbeitet werden muss. Bei Verwendung Goldnanopartikel markierter Antikörper als Komponente ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren direkt den Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten. In den üblichen Verfahren sind In der Regel aufwendige und/oder teure Detektionsverfahren und/oder Detektionssysteme nötig (unter anderem Phosphoimager, Röntgenfilme, CCD Kameras und/oder Fluoreszenzdetektorsysteme).
  • Das erfindungsgemäße Trägermaterial und/oder Kitsystem und/oder Verfahren kann generell für Bioassays und vor allem für direkte und indirekte Immunassays und/oder nicht kompetitive Immunassays oder kompetitive Immunassays verwendet werden.
  • Mögliche Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Trägermaterials und/oder Kitsystems und/oder Verfahrens umfassen beispielsweise die Diagnostik und/oder Analytik in den Lebenswissenschaften (Biologie, Medizin, Biomedizin, Pharmazie, Biochemie, Chemie, Molekularbiologie, Biophysik, Bioinformatik, Humanbiologie, Forensik, Agrarwissenschaft, Agrartechnologle, Ernährungswissenschaft, Lebensmittelforschung, etc.).
  • Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung sollen nun anhand eines/der in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispiels/e näher erläutert werden.
  • Es zeigen:
    • 1: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägermaterials;
    • 2: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der Herstellung eines erfindungsgemäßes Trägermaterials;
    • 3: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Kitsystems umfassend ein erfindungsgemäßes Trägermaterial gemäß 1;
    • 4: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems gemäß 3.
    • 5: eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran;
    • 6: eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran;
    • 7: eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Dot-Blot direkt;
    • 8: eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Dot-Blot indirekt;
    • 9; eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Western Blot direkt; und
    • 10: eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Western Blot indirekt.
  • Flg. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T ein poröses Material.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T ein Fasergewebe.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T aus Baumwoll-Linter.
  • Alternativ und/oder zusätzlich kann das Trägermaterial T Zellulose, Glasfasern, Polymerfasern, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/der einen Schwamm umfassen.
  • In anderen Worten, generell kann das Trägermaterial T mindestens ein poröses Material umfassen, insbesondere ein Fasergewebe aus Zellulose, Glasfaser, Polymerfaser, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/oder Baumwoll-Linter und/der einen Schwamm.
  • Generell ist es möglich, dass das Trägermaterial T mehrere poröse Materialien umfasst.
  • Generell kann das Trägermaterial eine Kombination aus mehreren Geweben und/oder Materialen und/oder Stoffen sein.
  • Generell kann das Trägermaterial aus Kohlehydraten aufgebaut sein.
  • Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial mindestens ein poröses Material umfasst und in einem Elutionsfluid lösbar ist.
  • Denkbar ist insbesondere, dass das Trägermaterial ein Zucker, Protein und/oder Polymer ist oder ein Gemisch aus diesen oder ähnlichen wasserlöslichen Materialien.
  • Denkbar ist insbesondere, dass das Trägermaterial eine lösbare Tablette ist.
    In diesem Ausführungsbeispiel weist das Trägermaterial T eine weitgehend runde Form auf.
  • Alternativ kann das Trägermaterial T in jeder erdenklichen anderen Form vorliegen.
  • Alternativ kann das Trägermaterial T in jede erdenkliche andere Form gebracht werden.
  • Nicht gezeigt in 1 Ist, dass das Trägermaterial T eine Dicke von 0,75 mm hat.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass das Trägermaterial T einen Durchmesser von 13 mm hat.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T eine Dicke größer als 0,1 mm aufweist.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T einen Durchmesser von 0,5 cm bis 5 cm, insbesondere von 1 cm bis 5 cm aufweist.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass das Trägermaterial T ein Bindungsvolumen von 0,1 mL 0,5 ml hat.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T ein Bindungsvolumen von bis zu 20 ml hat.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass Trägermaterial T alternativ mindestens ein poröses Material umfassen kann und in einem Elutionsfluid lösbar sein kann.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass das Trägermaterial T geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
  • Das Trägermaterial T umfasst eine Komponente K.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden.
  • Alternativ kann die Komponente K auf dem Trägermaterial T immobilisiert und/oder Eingetrocknet sein.
  • Generell ist es möglich, dass eine Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden und/oder auf dem Trägermaterial T immobilisiert und/oder eingetrocknet ist.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass die Komponente K eine Verbindung aus einem ersten Stoff und einem zweiten Stoff umfasst.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass die Komponente K eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff umfassen kann.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass das Trägermaterial T auch mehr als eine Komponente K umfassen kann, wobei die mehr als eine Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden und/oder auf dem Trägermaterial T immobilisiert und/oder eingetrocknet sein kann.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der erste Stoff der Komponente ein Bindungspartner für einen Analyten.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der erste Stoff der Komponente ein spezifischer Bindungspartner für einen Analyten.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der spezifische Bindungspartner für den Analyten ein Antikörper.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der spezifische Bindungspartner für den Analyten ein polyklonaler Antikörper.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der spezifische Bindungspartner für den Analyten ein polyklonaler Sekundärantikörper gegen in Maus erzeugte, Analyt-spezifische Erstantikörper.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der zweite Stoff ein Marklerungsmolekül.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Markierungsmolekül ein Nanopartikel.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der Nanopartikel ein Gold-Nanopartikel.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass es generell möglich ist, dass der erste Stoff der Komponente einen spezifischen Bindungspartner eines Analyten umfasst, wobei der Bindungspartner mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody und/oder chemischen Ligand umfasst und wobei der zweite Stoff einen Marker umfasst, wobei die Markierung mindestens einen Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
  • Nicht gezeigt in 1 ist, dass alternativ die mindestens eine Komponente K keine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff sein muss.
  • Nicht gezeigt in 1 Ist, dass die mindestens eine Komponente K mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody, chemischen Ligand, Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfassen kann.
  • 2 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T.
  • In diesem Ausführungsbeispiel umfasst die Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T die Schritte S1-S4.
  • Es ist generell möglich, dass die Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T eine größere Anzahl an Schritten als die Schritte S1-S4 umfasst.
  • Es ist generell möglich, dass die Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T eine kleinere Anzahl an Schritten als die Schritte S1-S4 umfasst.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T in einem ersten Schritt S1 vorbehandelt.
  • Durch die Vorbehandlung wird ein Milieu geschaffen, dass die Komponenten vor allem während des Trocknungsvorgangs, aber auch bei der Lagerung stabilisiert.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einer Lösung vorbehandelt.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einem Puffer vorbehandelt.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T in einem Puffer inkubiert.
  • Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T mit jeder Form von Fluid vorbehandelt wird.
  • Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T mit jeder Form von Fluid vorbehandelt wird, welches Proteine oder Peptide enthält.
  • Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T mit einem Fluid vorbehandelt wird, welches Zusatzstoffe enthält.
  • Generell ist es möglich, dass das Trägermaterial T mit mehreren Fluiden vorbehandelt wird.
  • Es ist generell möglich, dass die Zusatzstoffe Kohlenhydrate, vor allem Zucker, vor allem Saccharose und/oder Trehalose, Tenside, vor allem Polysorbat 80, Proteine, vor allem Bovines Serum Albumin (BSA), Antioxidantien und/oder Polyethylenglycol (PEG) und/oder weitere Stoffe sind.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem zweiten Schritt S2 das Trägermaterial T nach der Vorbehandlung getrocknet.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T nach der Vorbehandlung luftgetrocknet.
  • Generell sind alternativ und/oder zusätzlich andere Trocknungsverfahren denkbar.
  • Es ist generell möglich, dass das Trocknungsverfahren in einem Inkubator stattfindet.
  • Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T vakuumgetrocknet wird.
  • Alternativ Ist es möglich, dass keine Vorbehandlung des Trägermaterials T stattfindet.
  • Es ist generell möglich, dass keine Vorbehandlung des Trägermaterials T und/oder keine Trocknung nach der Vorbehandlung des Trägermaterials stattfindet.
  • In anderen Worten, es ist generell möglich, dass die Schritte S3-S4 die Schritte S1-S4 ersetzten.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem dritten Schritt S3 ein Trägermaterial T mit der Komponente K beladen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff, vgl. 1.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T durch Auftropfen eines bestimmten Volumens einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K mit der Komponente K beladen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einem vorbestimmten Volumen einer Lösung einer bekannten Konzentration der Komponente K beladen.
  • In anderen Worten, in diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einer definierten Menge der Komponente K beladen.
  • Generell sind alternativ und/oder zusätzlich andere Verfahren möglich, um das Trägermaterial T mit der Komponente K zu beladen.
  • Denkbar sind Verfahren wie Sprühen, Tauchen, Injizieren und/oder weitere Verfahren.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird die Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T geeignet Ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K aufzunehmen.
  • In einem vierten Schritt S4 wird das mit der Verbindung beladene Trägermaterial T getrocknet.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T luftgetrocknet.
  • Generell sind alternativ und/oder zusätzlich andere Trocknungsverfahren denkbar.
  • Es ist generell möglich, dass das Trocknungsverfahren in einem Inkubator stattfindet.
  • Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T vakuumgetrocknet wird.
  • Flg. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Kitsystems KS umfassend ein erfindungsgemäßes Trägermaterial T gemäß 1.
  • In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Kitsystem KS ein Reaktionsgefäß R.
  • In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Kitsystem KS ein erfindungsgemäßes Trägermaterial T.
  • Das in 1 dargestellte Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Trägermaterials T weist im Wesentlichen dieselben strukturellen und funktionalen Merkmale wie das Trägermaterial T des in 3 dargestellten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Kitsystems KS auf.
  • In diesem Ausführungsbeispiel hat das Reaktionsgefäß R eine Öffnung.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R verschließbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R wiederverschließbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R verschlossen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R nahezu luftdicht verschließbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R nahezu luftdicht wiederverschließbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R nahezu luftdicht verschlossen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D verschließbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D wiederverschließbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel Ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D verschlossen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D nahezu luftdicht verschließbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D nahezu luftdicht verschlossen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der Deckel D des Reaktionsgefäßes R ein Schraubverschluss.
  • Alternativ und/oder zusätzlich kann der Deckel D des Reaktionsgefäßes R ein Schraubverschluss, ein Klickverschluss, eine Kapsel, ein Stopfen, eine Scheibe, eine Folie und/oder ein anderes Verschlusssystem sein.
  • In diesem Ausführungsbeispiel hat das Reaktionsgefäß R ein Fassungsvolumen von 15 ml.
  • Generell ist es möglich, dass das Reaktionsgefäß R zum Erfassen jedes erdenklichen Volumens ausgebildet Ist (z.B. 100 µl, 200µl, 1,0 ml, 1,5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml, 11).
  • In diesem Aufführungsbeispiel ist das Trägermaterial T in dem Reaktionsgefäß R eingebracht.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T in dem ansonsten leeren Reaktionsgefäß R eingebracht.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T im Deckel D des Reaktionsgefäßes R angebracht.
  • Alternativ und/oder zusätzlich kann das Trägermaterial T am Boden oder an der Wand des Reaktionsgefäßes R angebracht sein
  • Alternativ und/oder zusätzlich kann ein erfindungsgemäßes Trägermaterial T an jede beliebe Stelle eines Reaktionsgefäßes R eingebracht sein.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R zur Aufnahme eines Fluids geeignet.
  • Nicht gezeigt in 3 ist, dass das Trägermaterial T geeignet ist, ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
  • Nicht gezeigt in 3 ist, dass das Kitsystem KS für die Herstellung eines Analyseflulds für einen Bioassay verwendet werden kann.
  • Nicht gezeigt in 3 ist, dass das Kitsystem KS für die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay verwendet werden kann.
  • Flg. 4 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß 3.
  • Das in 4 dargestellte erste Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß 3 umfasst zunächst die Schritte S1-S4 des in 2 dargestellten ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T.
  • In diesem Ausführungsbeispiel sind die Schritte S1-S4 des in 2 dargestellten Verfahrens die Schritte S11-S14.
  • In diesem Ausführungsbeispiel umfasst die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß 3 die Schritte S11-S16.
  • Es ist generell möglich, dass die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß 3 eine größere Anzahl an Schritten als die Schritte S11-S16 umfasst.
  • Es ist generell möglich, dass die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß 3 eine kleinere Anzahl an Schritten als die Schritte S11-S16 umfasst.
  • In einem fünften Schritt S15 wird in diesem Ausführungsbeispiel ein Reaktionsgefäß R mit dem Trägermaterial T umfassend die Komponente K bestückt.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T in das ansonsten trockene Reaktionsgefäß R eingebracht.
  • Nicht gezeigt in 4 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T schon vor der Vorbehandlung und/oder vor der Beladung mit der Komponente K in das Reaktionsgefäß eingebracht ist.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem sechsten Schritt S16 das mit dem Trägermaterial T beladene Reaktionsgefäß R mit einem Elutionsfluid befüllt.
  • Nicht gezeigt in 4 ist, dass das Elutionsfluid ein Puffer ist.
  • Nicht gezeigt In 4, ist, dass jede Lösung als Elutionsfluid eingesetzt werden kann.
  • Nicht gezeigt in 4 ist, dass das Elutionfluid Proteine und/oder Peptide enthalten kann.
  • Es ist generell möglich, dass das Elutionsfluid einen spezifischen Bindungspartner umfasst.
  • Es ist generell möglich, dass das Elutionsfluid mit spezifischen Bindungsmolekülen versetzt ist.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird durch das Elutionsfluid die Komponente K von dem Trägermaterial T gelöst.
  • In diesem Ausführungsbeispiel kann die erfolgreiche Solvatisierung der Komponente K durch eine Farbveränderung des Elutlonsfluids beurteilt werden.
  • Nicht gezeigt in 4 ist, dass zur Solvatisierung der Komponente K das Reaktionsgefäß R invertiert wird.
  • Nicht gezeigt in 4 ist, dass die Solvatisierung der Komponente alternativ und/oder zusätzlich durch Vibration (Vortex) und/oder Schütteln und/oder andere Verfahren erreicht werden kann.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T geeignet das bestimmte Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K, das zuvor aufgenommen wurde, in Anwesenheit des Elutionsfluids wieder freizugeben.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird durch den Schritt S16 ein Analysefluid gebildet.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird durch die erfolgreiche Solvatisierung der Komponente aus dem Elutionsfluid ein Analysefluid.
  • Nicht gezeigt in 4 ist, dass das Verfahren zur Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay mit dem erfindungsgemäßen Kitsystem ein funktionales Analysefluid bekannter Konzentration der Komponente hervorbringt.
  • Das Analysefluid kann für den Nachweis von in Flüssigkeiten befindlichen Analyten genutzt werden.
  • In diesem Ausführungsbeispiel enthält das Elutionsfluid Proteine.
  • In diesem Ausführungsbeispiel enthält das Elutionsfluid einen Primärantikörper.
  • Der Primärantiköper ist geeignet spezifisch an einen Analyten zu binden.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K eine Verbindung eines Antikörpers mit einem Gold-Nanopartlkel.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K eine Verbindung eines Sekundärantikörpers mit einem Gold-Nanopartikel.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der Sekundärantikörper geeignet an den Primärantikörper zu binden.
  • In diesem Ausführungsbeispiel bindet der Sekundärantikörper der Verbindung an den Primärantikörper.
  • In anderen Worten, es entsteht eine Verbindung zwischen dem mit dem Gold-Nanopartikel markierten Sekundärantikörper mit dem Primärantikörper.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist das Analysefluid eine Antikörperlösung.
  • Das Analysefluid kann für den Nachweis von immobilisierten Analyten genutzt werden.
  • In einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass das Elutionsfluid keinen Primärantikörper enthält.
  • In einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass die Komponente K eine Verbindung aus einem Primärantikörper und einem Marker umfasst.
  • In einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass das Analysefluid keinen Sekundärantikörper umfasst.
  • Flg. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der Analyt ein Protein.
  • Nach einem gängigen Verfahren werden Proteine umfassend den Analyten auf eine Membran transferiert.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist die Membran eine Nitrozellulosemembran.
  • In diesem Ausführungsbeispiel werden in einem vorgelagerten Verfahren die Proteine durch das Verfahren Western Blot auf eine Membran transferiert.
  • Die Proteine liegen immobilisiert auf der Membran vor.
  • Generell sind alternativ andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen denkbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das gängige Verfahren nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran die Schritte S21-S26.
  • Es ist generell möglich, dass das gängige Verfahren nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran eine größere Anzahl an Schritten als die Schritte S21-S26 umfasst.
  • Es ist generell möglich, dass das gängige Verfahren nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran eine kleinere Anzahl an Schritten als die Schritte S21-S26 umfasst.
  • In einem ersten Schritt S21 wird eine Blockierungslösung zu der Membran gegeben.
  • Durch die Blockierungslösung werden unspezifische Proteinbindestellen auf der Membran blockiert.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird das Blockieren durch Inkubation der Membran in einer üblichen Blockierungslösung (z.B. 3-5% (oder andere) BSA in PBS, 3-5% (oder andere) BSA In TBS, Milchpuffer in PBS, oder andere gängige Blockierungslösungen, auch kommerzielle Blockierungslösungen) erreicht.
  • Die Blockierungslösung wird verworfen.
  • In einem zweiten Schritt S22 wird eine erste Antikörperlösung umfassend einen Primärantikörper in Blockierungslösung gegen einen bestimmten Analyten zu der Membran gegeben.
  • Die Membran wird mit der ersten Antikörperlösung inkubiert.
  • Die Inkubation der Membran mit der ersten Antikörperlösung findet üblicherweise bei etwa 4°C für 2 Stunden bis über Nacht statt.
  • Der Primärantikörper bindet spezifisch an den Analyten.
  • Die erste Antikörperlösung wird verworfen.
  • In einem dritten Schritt S23 wird eine Waschlösung zu der Membran gegeben.
  • Die Membran wird mit der Waschlösung gewaschen.
  • Generell kann die Waschlösung ein Puffer sein.
  • Die Waschlösung wird verworfen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird die Membran 3 mal 5 Minuten mit der Waschlösung gewaschen.
  • Generell ist es möglich, dass die Membran länger oder kürzer und/oder mit weiteren Waschschritten gewaschen wird.
  • In einem vierten Schritt S24 wird eine zweite Antikörperlösung zu der Membran gegeben.
  • Die zweite Antikörperlösung umfasst einen Sekundärantikörper, welcher markiert ist und an den Primärantikörper bindet.
  • Die Membran wird mit der zweiten Antikörperlösung Inkubiert.
  • Der Sekundärantikörper bindet spezifisch an den Primärantikörper.
  • Die Inkubation der Membran mit der zweiten Antikörperlösung findet üblicherweise bei Raumtemperatur für etwa 1-2 Stunden statt.
  • Die zweite Antikörperlösung wird verworfen.
  • In einem fünften Schritt S25 wird eine Waschlösung zu der Membran gegeben.
  • Die Membran wird mit der Waschlösung gewaschen.
  • Generell kann die Waschlösung ein Puffer sein.
  • Die Waschlösung wird verworfen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird die Membran 3 mal 5 Minuten mit der Waschlösung gewaschen.
  • Generell ist es möglich, dass die Membran länger oder kürzer und/oder mit weiteren Waschschritten gewaschen wird.
  • Die Markierung kann visualisiert werden.
  • Gängige Visuallsierungsmethoden umfassen beispielsweise die Detektion von Fluoreszenz (Fluoreszenzmarkierung) und/oder Chemolumineszenz.
  • In diesem Ausführungsbeispiel kann die spezifische Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über die Markierung des Sekundärantikörpers visualisiert werden.
  • In einem sechsten Schritt S26 wird die Markierung durch ein gängiges Visualisierungsverfahren visualisiert.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird ein Fluoreszenzdetektionsverfahren zur Visualisierung des Merkers benutzt.
  • Die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten kann über den an den Sekundärantikörper gebundenen Marker quantifiziert werden.
  • Die gestrichelt umrandeten Verfahrensschritte sind sowohl Bestandteil von Verfahren gemäß dem Stand der Technik als auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, vgl. 6.
  • Flg. 6 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist der Analyt ein Protein.
  • Nach einem gängigen Verfahren werden Proteine umfassend den Analyten auf eine Membran transferiert.
  • In diesem Ausführungsbeispiel ist die Membran eine Nitrozellulosemembran.
  • Alternativ und/oder zusätzlich kann die Membran aus Nylon, Glasfaser oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) oder anderen Materialien bestehen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel werden in einem vorgelagerten Verfahren die Proteine durch das Verfahren Western Blot auf eine Membran transferiert.
  • Die Proteine liegen immobilisiert auf einer Membran vor.
  • Generell sind alternativ andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen denkbar.
  • Ein erfindungsgemäßes Analysefluid wird gemäß des in 4 dargestellten Verfahrens mit dem in 3 dargestellten Kitsystem hergestellt.
  • Eine erfindungsgemäße Antikörperlösung wird gemäß des in 4 dargestellten Verfahrens mit dem in 3 dargestellten Kitsystem hergestellt.
  • Der Primärantikörper ist geeignet, spezifisch an den Analyten zu binden.
  • Die Membran wird mit dem Analysefluid inkubiert.
  • Diesem Schritt kann ein weiterer Schritt vorgelagert sein, der das Abspülen der Membran oder das Inkubieren In einem Waschpuffer oder einer Blockierungslösung umfasst. Die Blockierungslösung kann bzw. soll auch als Elutionsfluid benutzt werden.
  • Diesem Schritt liegt die Überlegung zu Grunde, dass nach dem Blotten die Membran vorteilhafter Weise von Detergenz befreit werden sollte bzw. ist dies in bestimmten Anwendungsfällen auch notwendig, bevor ein Reagenz darauf trifft. Das kann am einfachsten durch Abspülen unter Leitungswasser geschehen. Alternativ kann das das Inkubieren in einem Waschpuffer oder einer Blockierungslösung durchgeführt werden.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem Schritt S31 die Membran mit dem Analysefluid inkubiert.
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem Schritt S31 die Membran für einen Zeitraum von 0,5h-2,0h mit dem Analysefluid Inkubiert.
  • Generell sind längere oder kürzere Inkubationszeiten möglich.
  • Der Primärantikörper bindet spezifisch an einen Analyten.
  • Das Analysefluid wird verworfen.
  • In diesem Ausführungsbeispiel kann die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über Markierung des Sekundärantikörpers nachgewiesen werden.
  • In diesem Ausführungsbeispiel kann die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über den an den Sekundärantikörper gebundenen Gold-Nanopartikel nachgewiesen werden.
  • Die Gold-Nanopartikel sind direkt sichtbar.
  • In diesem Ausführungsbeispiel bedarf es keines weiteren Visualisierungsverfahrens, z.B. eines Chemolumineszenzdetektionsverfahren oder eines Fluoreszenzdetektionsverfahrens.
  • Die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über den an den Sekundärantikörper gebundenen Marker kann quantifiziert werden.
  • Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Immobilisierten Analyten auf einer Membran die Beladung eines Trägermaterials T mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Verbindung aus einem spezifischen Bindungspartner des Analyten und einem Marker umfassen.
  • Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran die adhäsive Bindung der Verbindung an das Trägermaterial T umfassen.
  • Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Immobilisierten Analyten auf einer Membran die Trocknung des Trägermaterials T umfassen.
  • Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran das Einbringen des Trägermaterials T in ein trockenes Reaktionsgefäß R umfassen.
  • Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran das Einbringen eines Elutionsfluids in das Reaktionsgefäß R umfassen, wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial T in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet.
  • Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran das Aufbringen des Analysefluids auf die Membran umfassen.
  • Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran den Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über die Markierungumfassen.
  • Ferner kann das Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran weitere Schritte umfassen.
  • Ferner kann das Verfahren eine Vorbehandlung des Trägermaterials T mit einem Fluid umfassen.
  • Flg. 7 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Dot-Blot direkt.
  • Beim Dot-Blot direkt ist der markierte Primärantikörper die Komponente auf dem Träger und wird mit Elutionsfluid (Puffer + Schutzprotein) solubilisiert. Das so entstandene Analysefluld wird auf die Membran aufgebracht, die den Analyten trägt.
  • Zu sehen ist die nach 10-minütiger Inkubation sichtbare Markierung des Analyten (vgl. die Punkte auf der Membran), nämlich die erfindungsgemäße Färbung verschiedener poly-Histidin markierter Zielproteine aufgetropft auf einer Nitrocellulose Membran.
  • Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA in 1xPBS als Elutionsfluid.
  • Flg. 8 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Dot-Blot indirekt.
  • Beim Dot-Blot Indirekt ist der markierte Sekundärantikörper die Komponente auf dem Träger und wird mit Elutionsfluid (Puffer + Schutzprotein +zusätzllch Primärantikörper) solubilisiert. Das so entstandene Analysefluid wird auf die Membran aufgebracht, die den Analyten trägt. Zu sehen ist die nach 10-minütiger Inkubation sichtbare Markierung des Analyten (vgl. die Punkte auf der Membran).
  • Zu sehen ist die erfindungsgemäße Färbung verschiedener poly-Histidin markierter Zielproteine aufgetropft auf einer Nitrocellulose Membran.
  • Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti-Maus Sekundärantikörper und Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA In 1xPBS und Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus als Elutionsfluid.
  • Flg. 9 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Western Blot direkt.
  • Zu sehen ist links eine ECL-Färbung (ECL = enhanced chemiluminescence) des poly-Histidin markierten Zielproteins (His6-Kin1 L) auf einer Nitrocellulose Membran nach Blottransfer. Die Färbung der Membran erfolgt mit ECL Chemiluminescent Substrate nach Inkubation mit Antikörpergegen Penta Histidin als HRP Konjugat (HRP = horseradish peroxidase).
  • Rechts Ist eine erfindungsgemäße Färbung des poly-Histidin markierten Zielproteins (His6-Kin1L) auf einer Nitrocellulose Membran nach Blottransfer zu sehen. Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA in 1xPBS als Elutionsfluid.
  • Flg. 10 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Western Blot indirekt.
  • Zu sehen ist links eine ECL-Färbung des poly-Histidin markierten Zielproteins (ATX1) auf einer PVDF Membran (PVDF = Polyvinylidenfluorid (auch Polyvinylidendifluorid)) nach Blottransfer. Die Färbung der Membran erfolgt mit ECL Chemiluminescent Substrate nach Inkubation mit Antikörpergegen Penta Histidin als HRP Konjugat.
  • Rechts ist eine erfindungsgemäße Färbung des poly-Histidin markierten Zielproteins (ATX1) auf einer PVDF Membran nach Blottransfer zu sehen. Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti-Maus Sekundärantikörper und Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA in 1xPBS und Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus als Elutionsfluid.
  • Bezugszeichenliste
    • D
    Deckel
    K
    Komponente
    KS
    Kitsystem
    R
    Reaktionsgefäß
    T
    Trägermaterial
    S1
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
    S2
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
    S3
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
    S4
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
    S11
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
    S12
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
    S13
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
    S14
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
    S15
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
    S16
    Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
    S21
    Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
    S22
    Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
    S23
    Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
    S24
    Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
    S25
    Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
    S26
    Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
    S31
    Schritt eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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    • EP 1361436 A1 [0030]
    • WO 2018203145 A1 [0031]

Claims (21)

  1. Trägermaterial (T) umfassend mindestens eine Komponente (K), wobei die Komponente (K) adhäsiv an das Trägermaterial (T) gebunden und/oder auf dem Trägermaterial (T) immobilisiert und/oder eingetrocknet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente (K) aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
  2. Trägermaterial (T) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (K) mindestens einen Stoff umfasst.
  3. Trägermaterial (T) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stoff ein biogenes Makromolekül ist oder umfasst.
  4. Trägermaterial (T) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das biogene Makromolekül einen spezifischen Bindungspartner eines Analyten umfasst, wobei der Bindungspartner mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, ein Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody, Peptid, Enzym und/oder chemischen Ligand umfasst und/oder ein Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
  5. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Komponente (K) eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff umfasst.
  6. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) mindestens ein Material umfasst, welches durch seine physikalische Beschaffenheit geeignet ist die Komponente (K) unter Laborbedingungen zu Trocknen und so vor Degradation und/oder Aggregation zu schützen, wobei das Trägermaterial (T) insbesondere ein Fasergewebe aus Zellulose, Glasfaser, Polymerfaser, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/oder Baumwolle, einen festen Schaum, ein poröses Material und/oder einen Schwamm umfasst.
  7. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) mindestens ein poröses Material umfasst und in einem Elutionsfluid lösbar ist.
  8. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Trägermaterial (T) eine Dicke größer als 0,1 mm und einen Durchmesser von 0,5 cm bis 5 cm, insbesondere von 1 cm bis 5 cm aufweist.
  9. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) eine weitgehend runde Form aufweist.
  10. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) ein Bindungsvolumen von bis zu 20 ml hat.
  11. Kitsystem (KS) umfassend: - ein Reaktionsgefäß (R), welches zur Aufnahme eines Fluids geeignet ist; -ein Trägermaterial (T), wobei das Trägermaterial (T) mindestens eine Komponente (K) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente (K) aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben, und wobei das Trägermaterial (T) in dem ansonsten leeren Reaktionsgefäß (R) eingebracht ist.
  12. Kitsystem (KS) nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (K) adhäsiv an das Trägermaterial (T) gebunden und/oder auf dem Trägermaterial (T) immobilisiert und/oder eingetrocknet ist,
  13. Kitsystem (KS) nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß (R) nahezu luftdicht verschließbar ist, insbesondere mit einem Deckel (D).
  14. Kitsystem (KS) nach Anspruch 13, dadurch charakterisiert, dass das Trägermaterial (T) im Deckel (D) des Reaktionsgefäßes (R) angebracht ist.
  15. Verwendung eines Kitsystems (KS) nach einem der Ansprüche 11 bis 14 für die Herstellung eines Analysefluids für einen Bioassay.
  16. Verwendung eines Kitsystems (KS) nach einem der Ansprüche 11 bis 14 für die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay.
  17. Verfahren zum Bereitstellung eines biogenen Makromoleküls und/oder eines Markierungsmoleküls, umfassend mindestens die Schritte: - Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge mindestens einer Komponente aus einem biogenen Makromolekül und/oder eines Markierungsmoleküls; - Bindung der Komponente (K) an das Trägermaterial (T); - Trocknung des Trägermaterials (T); - Freisetzen der Komponente (K) aus dem Trägermaterial (T).
  18. Verfahren zur Nutzung eines biogenen Makromoleküls und/oder eines Markierungsmoleküls in einem Bioassay, umfassend mindestens die Schritte: - Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge mindestens einer Komponente (K) umfassend mindestens ein biogenes Makromolekül und/oder Markierungsmoleküls; - Bindung der Komponente (K) an das Trägermaterial (T); - Trocknung des Trägermaterials (T); - Freisetzen der Komponente (K) aus dem Trägermaterial (T) durch Zugabe eines Elutionsfluids, wobei die Komponente (K) in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial (T) in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet; - Einbringen des Analysefluids, bestehend aus der im Elutionsfluid und der freigesetzten Komponente (K), in einem Bioassay.
  19. Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend mindestens die Schritte: - Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmtem Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Komponente (K) umfassend eine Verbindung eines spezifischen Bindungspartners des Analyten und eines Markierungsmoleküls; - Bindung der Verbindung an das Trägermaterial (T); - Trocknung des Trägermaterials (T); - Einbringen des Trägermaterials (T) in ein trockenes Reaktionsgefäß (R); - Einbringen eines Elutionsfluids in das Reaktionsgefäß (R), wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial (T) in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet; - Aufbringen des Analysefluids auf die Membran; - Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über das Markierungsmolekül.
  20. Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer festen Matrix, umfassend mindestens die Schritte: - Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Komponente aus einem spezifischen Bindungspartner des Analyten und einem Markierungsmolekül; - Adhäsive Bindung der Verbindung an das Trägermaterial (T); - Trocknung des Trägermaterials (T); - Einbringen des Trägermaterials (T) in ein trockenes Reaktionsgefäß (R); - Einbringen eines Elutionsfluids in das Reaktionsgefäß (R), wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial (T) in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet; - Aufbringen des Analysefluids auf die Membran; - Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über das Markierungsmolekül.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, weiter umfassend den Schritt: - Vorbehandlung des Trägermaterials (T) mit einem Fluid.
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