DE60018848T2

DE60018848T2 - Agglutinations-Bestimmungsmethode in einem Bindermedium

Info

Publication number: DE60018848T2
Application number: DE60018848T
Authority: DE
Inventors: Kazuya Asaka-shi Kawasaki; Kentaro Asaka-shi Nakamura; Osamu Asaka-shi Seshimoto; Masahito Nagata; Toru Tanaka
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2020-06-17
Also published as: US20030049868A1; EP1061368B1; US20050153460A1; JP2001004629A; DE60018848D1; JP4219491B2; EP1061368A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion und Analyse einer in Spuren vorliegenden Substanz bzw. Spurensubstanz, in dem der Agglutinationsassay verwendet wird, bei welchem ein Analyt mit einem mit einem Partikel markierten Antianalyten, wie beispielsweise einem Antikörper, reagiert, um die Partikelagglutination hervorzurufen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Trockenanalyseverfahren zur Bestimmung eines Analyten, der die Agglutination der Partikel, die den Antianalyten tragen, in einer Lagenkonstruktion eines Trockenanalyseelements verursacht. Ebenso bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Trockenanalyseelement, welches solch ein Analyseverfahren ermöglicht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den letzten Jahren ist es sehr wichtig geworden, eine Spurensubstanz, insbesondere einen Antikörper oder ein Antigen, in einer Probe umgehend, bequem und präzise quantitativ zu analysieren, um den Zustand einer Erkrankung zu diagnostizieren oder die Auswirkungen einer Behandlung zu beurteilen. Zu diesem Zweck fand ein immun-serologischer Test zur Bestimmung der Existenz eines Antigens oder eines Antikörpers in der Körperflüssigkeit breite Anwendung, bei dem der Antikörper oder das Antigen an unlöslichen Trägerpartikeln adsorbiert und immobilisiert wird und die daraus hervorgehenden Partikel mit dem Antigen oder Antikörper zur Reaktion gebracht werden.
Der Latexpartikel-Agglutinationsimmunoassay wird routinemäßig durchgeführt, indem eine Suspension von Antikörper-beschichteten Latexpartikeln (sensibilisierter Latex) mit einer Probe auf einer Glasplatte gemischt wird. Als Ergebnis der Interaktion mit dem Analytenantigen in der Probe agglutinieren die Latexpartikel oder agglutinieren nicht. Das Ausmaß der Agglutination kann visuell durch Inaugenscheinnahme bestimmt werden. Dieser Assay ermöglicht es, das Antigen in der Probe halb-quantitativ zu analysieren, indem die Probe, ganz ähnlich zu einem anderen qualitativen Assay, in verschiedenen Verhältnissen verdünnt wird.
In den Japanischen Patentveröffentlichungen 11575/1983, 43138/1987 und 55013/1987 wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem Latexpartikel, an die ein Antikörper gebunden ist, mit dem Antigen in der Probe reagieren und das Ausmaß der Agglutination der Latexpartikel optisch mittels Nephelometrie bestimmt wird. Entsprechend dem vorgeschlagenen Verfahren wird ein Antigen oder Antikörper mittels eines automatischen Analysegeräts quantitativ untersucht.
Zusätzlich offenbaren die nicht-geprüften Japanischen Patentveröffentlichungen (KOKAI) 141665/1990, 94719/1994 und 213891/1994 ein Verfahren, bei dem eine antigene Substanz bestimmt wird, indem eine Veränderung der Absorption nach Agglutination der kolloidalen gold-markierten Antikörper gemessen wird.
Die oben beschriebenen Immunoassays erfordern keine B/F-Trennung und sind insofern nützlich. Das Latexreagens zeigt jedoch Schwächen bei der Lagerungsstabilität, da es in flüssiger Form vorliegt. Bei der kolloidalen Goldagglu tination ist die kolloidale Goldlösung oder -dispersion als Reagens ungeeignet, und zwar aufgrund ihrer schwachen Lagerstabilität. Ein kolloidales Gold-markiertes Reagens in lyophilisierter Form muss mit einer bestimmten geeigneten Lösung nach der Messung gemischt werden, was den Arbeitsvorgang mühsam macht. Dieses Verfahren geht auch mit solch einem Nachteil wie der Nichteignung zur Verwendung bei der Messung einer kleinen Probenmenge einher.
Im Gegensatz dazu ist ein sogenanntes Trockenanalyseverfahren besser in Bezug auf Lagerstabilität und bequeme Handhabung. Das sogenannte Nasssystem (oder Lösungssystem) umfasst das Lösen eines für den Assay zu verwendenden Reagens in einem wässrigen Lösungsmittel, wobei die entsprechende Reagenslösung hergestellt wird, die Zugabe dieser Reagenslösung zu einer zu analysierenden Probe und dann die Messung des Farbreaktionsproduktes mittels eines Kolorimeters. Im Gegensatz dazu umfasst das Trockenanalyseverfahren das Auftüpfeln einer wässrigen Probe direkt auf ein Trockenanalyseelement, wie ein Teststück, einen Analyseobjektträger oder ein Analyseband, in das in trockener Form eine Reagenszusammensetzung eingearbeitet ist und was eine Kollorimetrie der Farbentwicklung oder Farbveränderung, die in dem Element auftritt, bewirkt. Das Trockensystem ist dem Nasssystem unter Verwendung einer Reagenslösung in Bezug auf bequeme Handhabung und Assaygeschwindigkeit überlegen.
Ein Verfahren, das die Agglutination in der Lage eines Trockenanalyseelements verursacht, wobei direkt die Existenz eines Agglutinats selbst in der Lagenkonstruktion detektiert wird, wurde noch nicht vorgeschlagen.
Ein Trockenanalyseverfahren, ein sogenanntes Festphasen-Immunochromatographieverfahren, wurde ebenfalls vorgeschlagen (z.B. nicht-geprüfte Japanische Patentveröffentlichung (KOKAI) 5326/1997, welche der EP 0 834 741 A1 entspricht). Dieses Verfahren verwendet ein chromatographisches Medium, welches ein flüssig-permeables Material ist, das einer Kapillarwirkung dient. Die flüssig-permeable Lage wie beispielsweise ein Filterpapier weist eine Probenauftragszone und eine Detektionszone auf, wobei die Probenauftragszone einen kolloidalen Gold-markierten Antikörper enthält, und die Detektionszone einen immobilisierten zweiten Antikörper zur Bindung an das unterschiedliche Epitop des Analytenantigens enthält. Der zweite Antikörper wird als Einfangantikörper ("capturing antibody") verwendet. Wenn eine Testprobe, die ein Analytenantigen enthält, auf die Probenauftragszone, die den kolloidalen Gold-markierten Antikörper enthält, aufgetragen wird, reagiert das Analytenantigen mit dem kolloidalen Gold-markierten Antikörper unter Bildung eines Immunkomplexes. Der gebildete Komplex diffundiert und wandert in die Detektionszone, die den immobilisierten zweiten Antikörper enthält, und zwar durch die Kapillarwirkung des chromatographischen Mediums. Der Komplex aus Antigen und kolloidalem Gold-markierten Antikörper wird vom immobilisierten zweiten Antikörper eingefangen. Die Existenz des Analytenantigens wird bestätigt, indem der Farbton des kolloidalen Golds detektiert wird, welcher in der Detektionszone erscheint, die den zweiten Einfangantikörper enthält. Da das Reagens, das bei diesem Verfahren verwendet wird, bis direkt vor dem Assay unter trockenen Bedingungen bleibt, ist es in Bezug auf die Lagerstabilität herausragend. Es ist jedoch ein Problem, dass das Ergebnis nicht quantitativ ist. Außerdem ist das Verfahren im Prin zip ein Sandwich-Verfahren, bei dem ein kolloidaler Gold-markierter Antikörper mittels eines zweiten Antikörpers über ein dazwischen geschaltetes Analytenantigen eingefangen wird; es ist daher notwendig, eine permeable Agenslage mit einer genügend großen Fläche zu verwenden, so dass ein im Überschuss vorliegender kolloidaler, Gold-markierter Antikörper verteilt und aus der Detektionszone, an welche der zweite Einfangantikörper immobilisiert ist, entfernt wird. Dies ist der Grund, warum das Verfahren als immunchromatographisches Verfahren bezeichnet wird. Dementsprechend muss reichlich Flüssigkeit auf die Lage aufgetragen werden, und es ist notwendig, eine große Agenslage zu verwenden. Zusätzlich erfordert das immunchromatographische Verfahren eine lange Assayzeitspanne, da ausreichend Zeit für das Entfernen von überschüssigem kolloidalen Gold-markierten Antikörper aus der Einfangzone durch Kapillarwirkung erforderlich ist.
Unter solchen Umständen haben die Erfinder versucht, ein Material zu suchen, das in der Lage ist, die Agglutination in einer Agenslage eines Trockenanalyseelements zu verursachen. Als Ergebnis kann die Agglutination eines kolloidalen Metalls in einem Analyseelement quantitativ mit guter Sensitivität hervorgerufen werden, und zwar indem eine bestimmte Art Agens verwendet wird, und die Lagerstabilität des Reagens, welche ein wichtiges Charakteristikum eines Trockenanalyseelements ist, wird ebenfalls erfolgreich erreicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die zuvor genannten Umstände fertig gestellt. Ihr erstes Ziel ist es, ein Trockenanalyseverfahren zur Bestimmung eines Analyten unter Verwendung einer Agglutination der Partikel, die einen Antianalyten tragen, bereitzustellen, bei dem eine hoch-sensitive Analyse sichergestellt ist, während ein einfacher Arbeitsvorgang zur Anwendung kommt und das Reagens mit herausragender Stabilität im Trockenzustand gelagert werden kann.
Ein zweites Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Trockenanalyseelement bereitzustellen, welches die Agglutination detektieren kann, die durch die Reaktion eines Analyten mit einem Antianalyten, der mit einem Markierungspartikel markiert ist, zu detektieren, und dabei den Analyten auf bequeme und hoch-sensitive Weise analysieren kann.
Das erste Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein Agglutinationsassayverfahren zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer wässrigen Flüssigprobe unter Verwendung von Partikeln, die einen Antianalyten umfassen, wobei der Antianalyt in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, um so die Agglutination der Partikel hervorzurufen, umfassend:
Bereitstellen einer Reagenslage, die sich aus mindestens einem Bindemittel zusammensetzt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

1) einem wasserlöslichen Polymer, wobei eine Lösung daraus eine Viskosität von 6 cP oder weniger aufweist;
2) einem wasserunlöslichen und wasserquellbaren Polymer; und
3) Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger;

In der vorliegenden Erfindung wird die Agglutination der Partikel, die einen Antianalyten umfassen (wie einen kolloidalen Metall-markierten Antikörper) (auch als Markierungspartikel oder Träger bezeichnet), in einer Reagenslage durchgeführt, die aus einem Bindemittel gebildet ist, das ein beliebiges der folgenden Bestandteile umfasst, nämlich ein wasserlösliches Polymer mit einer Lösungsviskosität von 6 cP oder weniger, ein wasserunlösliches und wasserquellbares Polymer, und Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger. Bei Verwendung dieser Bindemittel kann die Reagenslage in einen Trockenzustand versetzt werden, und zwar bis zu einem Ausmaß, das der Stabilität der zu verwendenden Reagenszusammensetzung bei Lagerung nicht schadet. Während der Analyse jedoch wird die Reagenslage mit einer wässrigen Testprobe befeuchtet und nimmt dadurch einen ausreichenden Flüssigzustand ein, um die Agglutination der Markierungspartikel, die einen Antianalyten umfassen, zu verursachen.
Die Markierungspartikel können zusammen mit einem Analyten beim Assay zugeführt werden. Alternativ dazu sind die Partikel, die einen Antianalyten umfassen, zuvor in die Reagenslage eingearbeitet, und die Partikel, die einen Antianalyten umfassen bzw. tragen, können der Agglutination durch die Immunreaktion mit einem Analyten unterzogen werden.
Das Ausmaß der Agglutination, die in der Reagenslage verursacht wird, wird einfach detektiert, indem eine optische Veränderung des transmittierten oder reflektierten Lichts außerhalb der Reagenslage gemessen wird. Das Vorhandensein des Agglutinats und seine Menge kann als Trübungsveränderung in der Reagensmittellage oder als Veränderung im Farbton der Markierungspartikel aufgrund der Agglutination detektiert werden.
Das zweite Ziel der vorliegenden Erfindung wird durch ein Trockenanalyseelement zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer wässrigen Flüssigprobe erreicht, indem das Ausmaß der Agglutination von Partikeln, die einen Antianalyten umfassen, gemessen wird, wobei der Antianalyt in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, um die Agglutination dieser Partikel zu verursachen, umfassend:
eine Reagenslage, die aus mindestens einem Bindemittel gebildet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenslage Partikel, die einen Antianalyten umfassen. Zudem kann eine Ausbreitungs- bzw. Verteilungslage ("spreading layer") auf die Reagenslage aufgeschichtet sein. In diesem Fall kann die Verteilungslage Partikel enthalten, die einen Antianalyten umfassen, um so die Partikel, die einen Antianalyten umfassen, zusammen mit einem Analyten, in die Reagenslage einzutragen, wenn eine wässrige Probenlösung aufgetüpfelt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine bildliche Darstellung, die die Lagenstruktur einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trockenanalyseelements zeigt;
2 ist eine bildliche Darstellung, die die Lagenstruktur einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trockenanalyseelements zeigt;
3 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse von Beispiel 4 zeigt, genauer gesagt, Eichkurven von Trockenanalyseelementen des Objektträgers 1, die in Beispiel 4 erhalten wurden;
4 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse von Beispiel 5 zeigt, genauer gesagt, Eichkurven von Trockenanalyseelementen des Objektträgers 2, die in Beispiel 5 erhalten wurden; und
5 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse von Beispiel 6 zeigt, genauer gesagt, Eichkurven von Trockenanalyseelementen des Objektträgers 3, die in Beispiel 6 erhalten wurden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Analyt und Antianalyt
Als Analyt oder zu analysierende Substanz kann erfindungsgemäß jede Substanz verwendet werden, insofern ein spezifischer Bindungspartner oder eine spezifische Bindungssubstanz dazu in der Natur existiert oder insofern solch eine Substanz chemisch hergestellt werden kann. Der Antianalyt, d.h. der spezifische Bindungspartner oder die spezifische Bindungssubstanz meint, wie hier verwendet, eine Substanz, welche spezifisch den Analyten erkennen und binden kann und gleichzeitig an ein Markierungsträgerpartikel gebunden werden kann.
Beispiele für die Kombination eines Analyten und eines dazugehörigen Antianalyten umfassen Kombinationen von Antigen und Antikörper, einem bestimmten Saccharid und Lectin, Bio tin und Avidin, Protein A und IgG, Hormon und deren Rezeptoren, Enzym und Substrat, und Nukleinsäure und komplementäre Nukleinsäure. In den oben beispielhaft genannten Kombinationen können der Analyt und der Antianalyt vertauscht werden.
Das gebräuchlichste Beispiel ist eine Kombination eines Antigens als Analyt und eines Antikörpers als Antianalyt. Der Antikörper als Antianalyt kann entweder ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper sein. Alternativ dazu kann eine Vielzahl unterschiedlicher Antikörper verwendet werden. Es ist keine besondere Einschränkung in Bezug auf die Klasse des Antikörpers zu machen und es ist gleichgültig, ob diese IgG oder IgM ist. Es kann ein Fragment eines Antikörpers sein, z.B. Fab, Fab' oder F(ab')₂. Wenn ein monoklonaler Antikörper als spezifische Bindungssubstanz verwendet wird, muss ein Analytenantigen mindestens zwei gleiche Epitope aufweisen, um die Agglutination der Markierungspartikel mit einem darauf gebundenen Antikörper zu verursachen. Alternativ dazu können mindestens zwei gleiche Antikörper, welche jeweils an unterschiedliche Epitope des Analytenantigens binden, an die Markierungsträgerpartikel gebunden werden. Wenn das Analytenantigen sich aus einer Vielzahl von Untereinheiten zusammensetzt, wie beispielsweise Hämoglobin, besteht jedoch kein Bedarf, eine Vielzahl unterschiedlicher monoklonaler Antikörper zu verwenden. Die Agglutination des Partikels kann durch die Reaktion mit dem Analytenantigen verursacht werden, indem eine Vielzahl von Molekülen derselben Art von monoklonalem Antikörper an den Markierungsträger(-partikel) gebunden werden. Mindestens zwei Antikörpermoleküle werden bevorzugt an die Markie rungsträger(-partikel) zur Verursachung der Agglutination gebunden.
Markierungspartikel
Als Markierungsträger oder -partikel zur Markierung durch Bindung eines Antianalyten kann jedes Partikel verwendet werden, insofern es als Reaktion mit dem Analyten und dem Antianalyten, der an das Partikel gebunden ist, eine Agglutination durchmacht, und insofern das Ausmaß der Agglutination in einen detektierbaren Bereich fällt. Als Markierungspartikel können jene verwendet werden, die gewöhnlich zur Immunoagglutination verwendet werden können. Beispiele der Trägerpartikel umfassen organische hochmolekulare Latexpartikel wie Polystyrol oder Styrol-Butadien-Copolymer, und Metalle wie kolloidales Metall. Die Markierungspartikel (oder Kolloide) haben bevorzugt eine durchschnittliche Partikelgröße, die in einen Bereich von 0,02 bis 10 μm fällt. Wenn die Partikel eine übermäßig große Partikelgröße aufweisen, wird die optische Dichte aufgrund der optischen Reflexion oder Lichtstreuung der Partikel selbst vor der Immunreaktion zu hoch, was zu Schwierigkeiten bei der Messung der Veränderung der optischen Dichte führt. Andererseits tendieren zu kleine Partikelgrößen dazu, die Detektionssensitivität des Agglutinats zu verringern.
Jedes herkömmlich bekannte kolloidale Metall kann als Markierungspartikel verwendet werden. Beispiele umfassen kolloidales Gold, kolloidales Silber, kolloidales Platin, kolloidales Eisen und kolloidales Aluminiumhydroxid. Besonders sind kolloidales Gold und kolloidales Silber aufgrund ihrer roten bzw. gelben Farbe bei geeigneten Partikelgrößen be vorzugt. Die Partikelgröße eines kolloidalen Metalls ist bevorzugt ungefähr 1 bis 500 nm. Die Größe von 5 bis 100 nm ist besonders bevorzugt, weil sie die Entwicklung eines stärkeren Farbtons erlaubt.
Das kolloidale Metall und der Antianalyt können auf herkömmlich bekannte Weise verbunden werden (z.B. "The Journal of Histochemistry and Cytochemistry", Band 30, Nr. 7, S. 691–696 (1982)). Zum Beispiel werden ein kolloidales Metall und ein Antianalyt (z.B. ein Antikörper) in einer geeigneten Pufferlösung vermischt und bei Raumtemperatur für mindestens 5 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, um einen Überstand zu entfernen. Das erhaltene Präzipitat wird in einer Lösung dispergiert, die ein Dispergiermittel wie Polyethylenglykol enthält, um ein angestrebtes kolloidales Metall zu erhalten, das einen Antianalyten umfasst.
Im Falle der Verwendung eines kolloidalen Goldpartikels als kolloidales Metall kann ein kommerziell erhältlicher verwendet werden. Alternativ dazu kann ein kolloidales Goldpartikel entsprechend einem herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, z.B. einem Verfahren der Reduktion von Chlorgoldsäure mit Natriumcitrat (Nature Phys. Sci., Band 241, 20 (1973) usw.).
Bindemittel (Mittel bzw. Reagens der Reagenslage)
Als Bindemittel, das die Reagenslage bildet, kann jedes der folgenden alleine oder in Kombination verwendet werden:

1) ein wasserlösliches Polymer, wobei eine Lösung daraus eine Viskosität von 6 cP oder weniger aufweist;
2) ein wasserunlösliches und wasserquellbares Polymer; und
3) Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger.

Wie in den Ausführungsbeispielen später hierin beschrieben, kann die Agglutination der Markierungspartikel nach Auftüpfeln einer Probenlösung quantitativ in der Reagenslage hervorgerufen werden, in der diese Bindemittel als Mittel bzw. Agens verwendet werden.
Beispiele für das wasserlösliche Polymer mit einer Lösungsviskosität von 6 cP oder weniger umfassen Acrylamid-N-Vinylpyrrolidon-Copolymer; Acrylamid-N-Vinylpyrrolidon-Methacrylalkohol-Copolymer, wie beispielsweise
(Acrylamid)₆₀-(N-Vinylpyrrolidon)₃₈-(Methacrylalkohol)₂;
Polyvinylpyrrolidon ([C₆H₉NO-]_n);
Polyacrylamid ([-CH₂CH(CONH₂)-]_n);
(CH₂CH-COOCH₂CH(OH)CH₃)₆₀-(CH₂CH-CONHCCH₂SO₃(CH₃)₂)₄₀ und ähnliche.
Einstweilen ist die Viskosität einer Polymerlösung, die als "6 cP" definiert ist, eine solche, die wie folgt gemessen wird: Das Polymer wird in einer 50 mM Natriumcitrat-Lösung (pH 6,0), die 0,1% Natriumazid und 0,01% Triton X-100 enthält, gelöst, um eine 2%ige Polymerlösung herzustellen, und die Viskosität der 2%igen Polymerlösung wird bei 40°C mittels eines Viskosimeters vom B-Typ (Brookfield-Typ-Viskosimeter) gemessen.
Zusätzlich dazu umfassen Beispiele für das wasserunlösliche und wasserquellbare Polymer eine wasserunlösliche Stärke wie beispielsweise carboxymethylierte Stärke, und Carboxymethylcellulose.
Lagenstruktur eines Trockenanalyseelements
1 zeigt die Lagenstruktur einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trockenanalyseelements. In 1 bezeichnet Bezugszeichen 10 einen Träger, auf welchen eine Reagenslage 12 aufgeschichtet ist.
Der Träger 10 kann lichtundurchlässig (opak), licht-semidurchlässig (durchscheinend) oder lichtdurchlässig (transparent) sein, und es ist allgemein bevorzugt, dass der Träger lichtdurchlässig und wasserundurchlässig ist. Bevorzugte Materialien für den lichtdurchlässigen und wasserundurchlässigen Träger sind Polyethylenterephthalat, Polystyrol oder ähnliche. Allgemein wird eine Unterbeschichtung bzw. Grundierung verwendet, oder der Träger wird einer Hydrophilisierungsbehandlung unterzogen, um die Reagenslage, die darauf aufzuschichten ist, fest anzubringen.
Die Reagenslage 12 ist eine Lage, in der das zuvor genannte Bindemittel bzw. die zuvor genannten Bindemittel als Medium bzw. Agens verwendet werden, und es handelt sich um eine Reaktionslage, in der die Agglutination von Markierungspartikeln durch die Immunreaktion zwischen Analyt und Antianalyt, der an das Partikel gebunden ist, hervorgerufen wird.
In der Reagenslage 12 kann ein Puffer eingearbeitet sein, so dass die spezifische Bindungsreaktion zwischen Partikel-markiertem Antianalyten und dem Analyten bei einem optimalen pH-Wert auftritt. Für die Antigen-Antikörper-Reaktion können z.B. pH-Puffer verwendet werden, die für gewöhnliche Antigen-Antikörper-Reaktion verwendbar sind. Spezifische Beispiele von verwendbaren Puffern sind Pufferreagenzien, die Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) enthalten, Pufferreagenzien, die Phosphat enthalten, Pufferreagenzien, die Borat enthalten, Pufferreagenzien, die Citronensäure oder Citrat enthalten, Pufferreagenzien, die Glycin enthalten, Pufferreagenzien, die Bicin enthalten, Pufferreagenzien, die HEPES enthalten, und Pufferreagenzien, die Good's-Puffermittel wie MES (2-Morpholinoethansulfonsäure) enthalten. Die Reaktion kann bei jedem pH bewirkt werden, sofern der pH innerhalb eines Bereichs liegt, der eine gewöhnliche Antigen-Antikörper-Reaktion erlaubt.
In die Reagenslage kann ein hochmolekulares Polymer wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder PEG (Polyethylenglykol) zum Zwecke der Förderung der Agglutination eingearbeitet sein.
Die Reagenslage kann bereitgestellt werden, indem eine wässrige Lösung oder Dispersion, die die zuvor genannten Bindemittel – und zusätzliche andere Reagens-Zusammensetzung(en) – enthält, auf eine andere Lage aufgeschichtet wird, wie beispielsweise einen Träger oder eine Detektionslage, und indem dann die aufgeschichtete Lösung oder Dispersion getrocknet wird, wie in den folgenden Beschreibungen offenbart: Japanische Patentveröffentlichung 21677/1978 (entspricht US-Patent 3,992,158), ungeprüfte Japanische Patentveröffentlichung (KOKAI) 164356/1980 (entspricht US-Patent 4,292,272), 101398/1979 (entspricht US-Patent 4,132,528), 292063/1986 (Chemical Abstracts, 106; 210567y). Die Dicke der getrockneten Reagenslage, die die zuvor genannten Bindemittel enthält, kann im Bereich von ungefähr 2 μm bis ungefähr 50 μm liegen, und sie liegt bevorzugt im Bereich von ungefähr 4 μm bis ungefähr 30 μm, und die Bedeckung kann in einem Bereich von ungefähr 2 g/m² bis ungefähr 50 g/m² und bevorzugt von ungefähr 4 g/m² bis ungefähr 30 g/m² liegen.
Die Reagenslage 12 kann schon im voraus Partikel, die einen Antianalyten umfassen, enthalten. In diesem Fall kann die Agglutination in der Reagenslage 12 hervorgerufen werden, indem einfach eine Flüssigprobe, die einen Analyten enthält, auf die Reagenslage 12 aufgebracht wird.
2 zeigt eine zweite Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Trockenanalyseelements. In dieser Ausführungsform ist außerdem eine Verteilungslage 14 auf die Reagenslage 12 aufgeschichtet. Die Verteilungslage ist eine Lage, die eine sogenannte Dosierungsfunktion bzw. Zuteilungsfunktion besitzt, um eine Flüssigkeit über einen Bereich im wesentlichen proportional zum Volumen der Flüssigkeit, das zugeführt wird, zu verteilen. Das Vorhandensein der Verteilungslage 14 führt dazu, dass eine Menge der Flüssigkeit, die der Reagenslage 12 zugeführt wird, in Bezug auf die Flächeneinheit einheitlich wird, und dadurch wird die Genauigkeit und quantitative Bestimmung des Analyten durch Agglutination in der Reagenslage verbessert.
Die Verteilungslage ist bevorzugt eine poröse Lage und kann faserförmig oder nicht-faserförmig sein. Als faserförmiges Material kann Filterpapier, Vliesstoff, gewebter Stoff (z.B. glatter gewebter Stoff wie z.B. Breitgewebe ("broad") und Popeline), Maschenware ("knitted cloth") (z.B. Maschenware wie Trikot, Doppel-Trikot und Milanese) oder aus Glasfasern hergestelltes Filterpapier verwendet werden. Beispiele der nicht-faserförmigen Materialien können entweder ein Membranfilter, zusammengesetzt aus Celluloseacetat, wie in der ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. 53888/1974 (korrespondierend zu US-Patent 3,992,258) beschrieben, oder eine partikuläre Strukturlage, die miteinander verbundene Hohlräume enthält, und aus anorganischen oder organischen Feinpartikeln zusammengesetzt ist, wie in ungeprüfter Japanischer Patentveröffentlichung (KOKAI) Nrn. 53888/1974 (korrespondierend zu US-Patent 3,992,258), 90859/1980 (korrespondierend zu US-Patent 4,258,001) und 70163/1983 (korrespondierend zu US-Patent 4,486,537) offenbart. Eine Laminatstruktur, hergestellt aus teilweise gebundenen multiplen porösen Lagen kann außerdem vorzugsweise verwendet werden, wobei Beispiele einer solchen Struktur in den ungeprüften Japanischen Patentanmeldungen (KOKAI) Nrn. 4959/1986 (korrespondierend zu EP 0 166 365 A ), 116 248/1987, 138 756/1987 (korrespondierend zu EP 0 226 465 A ), 138757/1987 (korrespondierend zu EP 0 226 465 A ) und 138 758/1987 (korrespondierend zu EP 0 226 465 A ) offenbart sind.
Bevorzugte Materialien für die Verteilungslage sind Gewebe und Maschenware. Die Gewebe oder dergleichen können einer Glimmentladungsbehandlung unterzogen werden, wie in ungeprüfter Japanischer Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. 663599/1982 (korrespondierend zu US-Patent 4,783,315 und GB 2,087,974 A ) beschrieben. Um die Fläche oder Rate für die Verteilung einzustellen, kann die Verteilungslage ein hydrophiles Polymer oder ein Tensid enthalten, wie in den ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichungen (KOKAI) Nrn. 222770/1985 (korrespondierend zu EP 0 162 301 A ), 219397/1988 (korrespondierend zu DE 37 17 913 A ), 112999/1988 (korrespondierend zu DE 37 17 913 A ) und 182652/1987 (korrespondierend zu DE 37 17 913 A ).
Ferner kann die Verteilungslage 14 lichtreflektierende Feinpartikel aus beispielsweise Titandioxid oder Bariumsulfat enthalten, um einer lichtreflektierenden Funktion zu dienen. Die Verteilungslage 14 mit der lichtreflektierenden oder lichtabschirmenden Funktion kann als ein weißer Hintergrund wirken, so dass die in der Reagenslage 12 durch Agglutination erzeugte Änderung der Farbe oder Farbdichte reflektierend von der lichtdurchlässigen Träger 10-Seite gemessen wird. Wenn die Verteilungslage 14 selbst eine optische Eigenschaft besitzt, die als weißer Hintergrund geeignet ist, kann die Lage keine lichtreflektierenden Feinpartikel enthalten.
Anstatt der Reagenslage 12 kann die Verteilungslage 14 die Markierungspartikel, die einen Antianalyten tragen, enthalten. In diesem Fall können, durch Tüpfeln, um eine wässrige Testprobe auf die Reagenslage 14 aufzubringen, die Markierungspartikel in der Verteilungslage 14 zusammen mit einem Analyten in die Reagenslage 12 transferiert werden, um in der Reagenslage 12 Agglutination zu verursachen.
Herstellung des Trockenanalyseelements
Das erfindungsgemäße Trockenanalyseelement kann durch einen beliebigen der in den Beschreibungen der zuvor zitierten Patente beschriebenen bekannten Prozesse hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Analyseelement kann in ein quadratisches Stück mit Seiten, die jeweils von etwa 15 bis 30 mm reichen oder eine Scheibe mit im wesentlichen derselben Fläche geschnitten werden. Im Hinblick auf die Herstellung, Verpackung, den Versand, die Lagerung und Messvorgänge ist es bevorzugt, dass das Element in einem Gleitrahmen zur Verwendung als ein Objektträger für chemische Analyse enthalten ist, wie beispielsweise in Japanischer Patentveröffentlichung Nr. 28331/1982 (korrespondierend zu US-Patent 4,169,751), ungeprüfter Japanischer Gebrauchsmusterveröffentlichung Nr. 142454/1981 (korrespondierend zu US-Patent 4,387,990), ungeprüfter Japanischer Patentveröffentlichung Nr. 63452/1982, ungeprüfter Japanischer Gebrauchsmusterveröffentlichung Nr. 32350/1983 und ungeprüfter Japanischer Patentveröffentlichung Nr. 501144/1983 (korrespondierend zu Internationaler Veröffentlichung WO 83/00391) beschrieben. Für die Bequemlichkeit bei manchen Anwendungen kann es in eine lange Bandform, welche in einer Kassette oder einem Magazin enthalten ist, geformt sein, oder ein kleines Stück davon kann auf einer Karte mit einer Öffnung angebracht werden oder darin enthalten sein.
Analyseverfahren unter Verwendung des Trockenanalyseelements
Das erfindungsgemäße Analyseelement kann zur quantitativen Analyse eines Analyts in einer Probenflüssigkeit verwendet werden, indem es durch die in den Beschreibungen der zuvor zitierten Patente beschriebenen Operationen verwendet wird. Wenn der Analyt ein Antigen oder ein Antikörper ist, werden etwa 5 μl bis etwa 30 μl, vorzugsweise 8 μl bis 15 μl, einer wässrigen Probenflüssigkeit, wie z.B. Plasma, Serum oder Urin, auf die Reagenslage 12 getüpfelt, oder im Fall, dass die Verteilungslage 14 darauf laminiert ist, auf die Verteilungslage 14. Das so getüpfelte Analyseelement wird 1 bis 10 Minuten lang bei einer konstanten Temperatur von etwa 20°C bis etwa 45°C, vorzugsweise bei einer konstanten Temperatur von etwa 30°C bis etwa 40°C inkubiert. Die Reflexionsoptische Dichte der Farbe oder die Farbänderung in dem Element können von der lichtdurchlässigen Trägerseite gemessen werden, und die Menge des in der Probe enthaltenen Analyts kann unter Verwendung einer vorausgehend erstellten Eichkurve, basierend auf dem Prinzip der Kolorimetrie, bestimmt werden. Das Volumen der getüpfelten Flüssigprobe und die Zeit und die Temperatur für die Inkubation werden konstant gehalten, um die Genauigkeit bei der quantitativen Analyse zu verbessern.
Der Messvorgang kann durchgeführt werden, indem die chemischen Analyseapparate verwendet werden, die in den ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichungen Nrn. 125543/1985, 220862/1985, 294367/1986 und 161867/1983 (korrespondierend zu US-Patent 4,424,191) beschrieben sind, um eine quantitative Analyse bei einer hohen Genauigkeit durch einen extrem leichten Vorgang zu realisieren. Abhängig vom Zweck oder der erforderlichen Präzision kann jedoch semiquantitative Messung durchgeführt werden, indem der Grad der Färbung oder der Veränderung des Farbtons visuell bewertet wird.
Wenn das Analyseelement die Markierungspartikel, die einen Antianalyten tragen, nicht enthält, kann eine notwendige immunologische Reaktion in einem anderen geeigneten Reaktionsgemisch als dem Element durchgeführt werden, und dann wird das resultierende Reaktionsgemisch auf das Element getüpfelt. Auf diese Weise kann der Analyt analysiert werden. Zum Untersuchen beispielsweise eines Antigens wird eine wässrige Probenflüssigkeit mit einer Lösung vermischt, die einen Antikörper, markiert mit dem Markierungspartikel, enthält, um die Bindungsreaktion zu vervollständigen, und dann auf das Element getüpfelt.
Beispielsweise kann, wenn ein Antigen, ein Antikörper, ein kolloidales Metall und carboxymethylierte Stärke als ein Analyt, ein Antianalyt, ein Markierungsträgerpartikel bzw. ein Bindemittel für das Medium bzw. Agens der Reagenslage verwendet werden, ein Trockenanalyseelement hergestellt werden, und es kann eine Trockenanalyse unter Verwendung des Elements wie unten beschrieben durchgeführt werden.
Genau bezeichnet, wird ein mit einem kolloidalen Metall markierter Antikörper in einer Lösung carboxymethylierter Stärke dispergiert. Die resultierende Dispersion wird auf einen lichtdurchlässigen Träger 10 aufgebracht, gefolgt von Trocknen, wodurch eine Reagenslage 12 gebildet wird und folglich ein Trockenanalyseelement für einen Agglutinationsassay hergestellt werden kann.
Eine wässrige Flüssigprobe, die einen Analyten (z.B. Antigen) enthält, wird getüpfelt und auf das resultierende Analyseelement aufgebracht. Das Analyt-Antigen verursacht die Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion mit dem kolloidales Metall-markierten Antikörper in der carboxymethylierte Stärke-Lage 12, was in einer Agglutination des kolloidalen Metalls resultiert.
Agglutination verändert den Farbton oder Farbnuancierung ("hue") des kolloidalen Metalls, so dass der Analyt in der Probe detektiert werden kann und quantitativ analysiert werden kann, indem eine Änderung beim Farbton der Reagenslage gemessen wird. Beispielsweise färbt ein kolloidales Gold vor Agglutination rötlich-violett mit einer Hauptabsorptionswellenlänge bei etwa 540 nm. Durch die Agglutination wird das kolloidale Gold größer, was zum Verlagern seines Absorptionsvermögens zur Seite einer längeren Wellenlänge führt, und als Ergebnis färbt das agglutinierte kolloidale Gold hellrötlich-lila oder grau. Dementsprechend kann der Analyt (das Antigen) von einer Abnahme bei der Reflexionsoptischen Dichte bei 540 nm her, einer Zunahme bei der Reflexions-optischen Dichte bei etwa 630 nm her, welche durch Agglutination auftritt, oder einer Differenz zwischen den Reflexions-optischen Dichten bei 540 nm und 630 nm her quantitativ analysiert werden.
Beispiel 1
Auswahl von wasserlöslichem Polymer, in welches kolloidales Metall eingearbeitet wird
Agglutinationsexperimente in Lösungssystemen wurden wie unterhalb beschrieben durchgeführt, wobei ein immunologischer Kit der Detektion von fäkalem okkultem Hämoglobin "Immuno-Gold Hem" (hergestellt von Godo Shusei Co., Ltd., verkauft von Wako Pure Chemicals Industries Ltd.) verwendet wurde. Verschiedene Polymere wurden zu dem Reaktionssystem gegeben, um die Endkonzentration auf 1,6 Gew.-% einzustellen. Wie im nachstehend aufgeführten Beispiel 4 beschrieben, wurde im Fall, dass eine Reagenslage unter Verwendung eines wasserlöslichen Polymers als Bindemittel hergestellt wurde, gewöhnlich eine etwa 3%ige Lösung des Polymers auf einen Träger aufgetragen, wobei die Polymerbeschichtung etwa 7,5 g/m² war. Wenn etwa 10 μl einer wässrigen Probe auf die Reagenslage mit einer derartigen Polymerbeschichtung getüpfelt wurde, breitet sich die wässrige Probe in die Reagenslage aus, was in einer Scheibenform mit einem Durchmesser von etwa 5 mm resultiert. Von der Berechnung, basierend auf der Flüssigkeitsmenge beim Tüpfeln und der Verteilungsfläche ist die Polymerkonzentration in der Reagenslage etwa 1,5% in dem Bereich, wo die wässrige Probe aufgebracht wird. Hinsichtlich einer solchen Endkonzentration des Polymers in dem Analysenelement wurden hierin Experimente zum Auswählen von Polymeren, die in dem Analyseelement keine Agglutination unterdrücken, durchgeführt, indem verschiedene Polymere zu dem Reaktionssystem gegeben wurden, so dass die Endkonzentration auf 1,6 Gew.-% eingestellt wurde.
Gemäß der Anweisung zur Verwendung des Kits wurde eine Flasche eines kolloidalen Gold-Antikörperreagens (enthaltend 2 mg Konjugat von kolloidalem Gold und einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen menschliches Hämoglobin) in 2,5 ml einer Flüssigkeit zum Auflösen des kolloidalen Goldreagens, das in dem Kit enthalten war, gelöst, um eine Lösung eines kolloidalen Gold-markierten Antikörpers herzustellen. Zu dieser Zeit wurde jedes der verschiedenen wasserlöslichen Polymere zu der Lösung von kolloidales Gold-markiertem Antikörper gegeben, um die Konzentration auf 2,5% einzustellen.
Menschliches Hämoglobin A₀ (hergestellt von Exocell Inc.) wurde mit einer wässrigen 0,2 M Ammoniumchloridlösung (pH 6,8), enthaltend 6% Polyethylenglykol 6000, verdünnt, um 0 ng/ml und 1000 ng/ml Hämoglobin (Hb)-Lösungen herzustellen, welche nachstehend als Probenflüssigkeiten verwendet wurden. Während die Lösung von kolloidales Gold-markiertem Antikörper, zu welcher jedes der verschiedenen Polymere gegeben wurde, verwendet wurde, wurde die Hb-Probenflüssigkeit durch Befolgen der Anweisungen des Kits untersucht. Und zwar würde ein Tropfen (50 μl) der Hb-Probenflüssigkeit in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben, wozu dann 2 Tropfen (90 μl) einer Lösung von kolloidales Gold-markiertem Antikörper, enthaltend jedes der verschiedenen Polymere, gegeben wurden, gefolgt von 5-minütiger Reaktion bei Raumtemperatur nach behutsamem Mischen. Die Polymerkonzentration in dem Agglutinationssystem wurde wie folgt berechnet: 2,5% × (90 μl/(90 + 50) μl) = 1,6%.
Nach Vervollständigung der immunologischen Reaktion wurde die optische Dichte (OD) des durchgehenden Lichts bei 540 nm mittels eines Plattenlesegeräts gemessen. Der Unterschied zwischen ODs bei der Hb-Konzentration von 0 ng/ml und 1000 ng/ml wurde bestimmt und durch ΔOD dargestellt. Die folgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
Die in Tabelle 1 gezeigte Lösungsviskosität ist eine Viskosität (cP), gemessen bei 40°C, mittels eines Viskosimeters vom B-Typ, nachdem das Polymer in einer Menge von 2% der Mischung zu 50 mM Natriumcitrat-Lösung, enthaltend 0,1% Natriumazid und 0,01% Triton X-100, zugegeben worden ist.
TABELLE 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, nahm bei der Kontrolle (kein Polymer) die Transmissions-optische Dichte bei 540 nm durch Agglutination bei Vorliegen von Hämoglobin ab, und die Abnahme (ΔOD) war etwa 0,64. Selbst wenn jedes der verschiedenen Polymere in einer Menge von 1,6% koexistierte, wurde in manchen Fällen Agglutination als eine Abnahme der OD₅₄₀ beobachtet. Unter diesen Fällen zeigten nur die Polymere mit einer Lösungsviskosität von 6 cP oder weniger eine Sensitivität von etwa 50% oder mehr, wenn sie mit der Kontrolle verglichen wurden.
Dementsprechend kann, selbst wenn ein kolloidales Gold-markierter Antikörper in eine Lage eingearbeitet wird, die aus einem wasserlöslichen Polymer, das eine Lösungsviskosität von 6 cP oder weniger aufweist, als dem Bindemittel zusammengesetzt ist, Agglutination in der Lagenkonstruktion des Elements verursacht werden kann, und erwartet werden, dass sie Sensitivität beinahe gleich dem konventionellen Agglutinationsverfahren in einem Lösungssystem ist. Dies kann erwartet werden, indem man die Endkonzentration des Polymers in der Lage beim Tüpfeln einer Probenflüssigkeit so einstellt, dass sie sich nicht stark von 1,6% unterscheidet, welches die Endkonzentration des Polymers in der wässrigen Lösung ist, die zum Verursachen sensitiver Agglutination beiträgt.
BEISPIEL 2
Auswahl von Gelatine, in welche kolloidales Metall eingearbeitet wird
Es wurden Experimente durchgeführt, indem ein immunologischer Kit zum Detektieren von fäkalem okkultem Hämoglobin "Immuno-Gold Hem" (Produkt von Godo Shusei Co., Ltd., verkauft von Wako Pure Chemicals Industries Ltd.) verwendet wurde. Mit der Ausnahme, dass jede von verschiedenen Gelatinen anstelle von verschiedenen wasserlöslichen Polymeren zu der Lösung von kolloidales Gold-markiertem Antikörper gegeben wurde, um die Menge auf 2,5 Gew.-% einzustellen, wurde vollkommen die gleiche Operation wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Endkonzentration der Gelatine in dem Reaktionsgemisch für die Agglutination war 1,6%, welche das gleiche wie in Beispiel 1 ist. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Die in Tabelle 2 gezeigte Lösungsviskosität ist eine Viskosität (cP), gemessen bei 40°C mittels einem Viskosimeter vom B-Typ, nachdem die Gelatine in einer Menge von 2% der Mischung zu 50 mM Natriumcitrat-Lösung (pH 6,0), enthaltend 0,1% Natriumazid und 0,01% Triton X-100, zugegeben worden ist.
TABELLE 2
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, war im Fall von Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 die Abnahme von ΔOD nur gering, und nahezu die gleiche Sensitivität wie im Fall der Kontrolle (keine Gelatine) wurde beibehalten. Auf der anderen Seite war die Abnahme von ΔOD im Fall von Gelatine mit einem hohen Molekulargewicht von 98.000 bemerkenswert. Es wird nämlich eine Tendenz beobachtet, dass Agglutination von kolloidales Gold-markiertem Antikörper nicht fortschreitet und kein ausreichendes ΔOD erzielt werden kann, wenn die Gelatine ein hohes Molekulargewicht aufweist.
Entsprechend kann, wenn ein kolloidales Metall-Antikörper unter Verwendung einer Gelatine, die ein Molekulargewicht von 20.000 oder weniger aufweist, als Bindemittel in eine Lage eingearbeitet wird, Agglutination in der Lage des Analyseelements verursacht werden. Man kann erwarten, dass die Sensitivität nahezu gleich zum konventionellen Agglutinationsverfahren in einem Lösungssystem ist, solange die Konzentration der Gelatine in der Lage beim Tüpfeln einer Probenflüssigkeit eingestellt ist, sich nicht stark von 1,6%, welches die Konzentration der Gelatine in der Lösung, fähig zum Verursachen der Agglutination, ist, zu unterscheiden.
BEISPIEL 3
Auswahl von carboxymethylierter Stärke, in welche kolloidales Metall eingearbeitet wird
Ähnlich den Beispielen 1 und 2 wurden Experimente durchgeführt, indem ein immunologischer Kit zur Detektion von fäkalem okkultem Hämoglobin "Immuno-Gold Hem" (Produkt von Godo Shusei Co., Ltd., verkauft von Wako Pure Chemicals In dustries, Ltd.) verwendet wurde. Mit der Ausnahme, dass jeweils eine carboxymethylierten Stärke (CM-Stärke) als wasserunlösliches und wasserquellbares Polymer anstelle verschiedener wasserlöslicher Polymere in Beispiel 1 zu der Lösung von kolloidales Gold-markiertem Antikörper gegeben wurde, um die Konzentration wie in Tabelle 3 gezeigt, einzustellen, wurde gänzlich der gleiche Assay wie in Beispiel 1 durchgeführt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.
TABELLE 3
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, wurde im Fall carboxymethylierter Stärke ein ausreichender ΔOD-Wert erhalten, selbst wenn die Stärke in einer Menge von bis zu 2% zu der Lösung von kolloidales Gold-markiertem Antikörper zugegeben wurde. Deshalb kann, wenn die Konzentration der carboxymethylierten Stärke in der Lage beim Tüpfeln einer Probenflüssigkeit nicht mehr als die oder nicht sehr verschieden von der Endkonzentration bei der Agglutination vom Lösungstyp, d.h., 1,28% (= 2,0% × (90 μl/(90 + 50) μl), ist, ein kolloidales Metall-markierter Antikörper in eine Lage des Elements eingearbeitet werden, so dass die Agglutination in der Lagenkonstruktion des Elements stattfindet. Aufgrund einer solchen Beschaffenheit kann erwartet werden, dass die Sensitivität nahezu gleich dem konventionellen Agglutinations verfahren vom Lösungstyp ist. Bei dem unten in Beispiel 5 genannten Trockenanalyseelement wurde eine Reagenslage hergestellt, indem eine etwa 3%ige Dispersion der carboxymethylierten Stärke aufgebracht wurde, und die Konzentration der carboxymethylierten Stärke wurde, basierend auf der Flüssigkeitsmenge, beim Tüpfeln und dem Verteilungsbereich, auf etwa 1,5% berechnet. Obwohl die Agglutination vom Lösungstyp nicht bei einer solchen Endkonzentration von 1,5% untersucht wurde, konnte erwartet werden, dass die Agglutination ohne bemerkenswerte Abnahme von ΔOD, selbst wenn die Endkonzentration der carboxymethylierten Stärke 1,5% war, stattfinden wird. Diese Erwartung wurde von dem Ergebnis von Beispiel 5, durchgeführt gemäß einem trockenen System, untermauert.
BEISPIEL 4
Herstellung eines Trockenanalyseelements unter Verwendung von wasserlöslichem Polymer und Auswertung davon

Eine wässrige Lösung der folgenden Zusammensetzung wurde auf einen farblosen, transparenten, glatten und flachen Polyethylenterephthalatfilm (Träger, Dicke: 180 μm), unterschichtet mit Gelatine, beschichtet, was von Trocknen gefolgt wurde, um eine Reagenslage zu bilden, wodurch ein Trockenanalyseelement zum Analysieren von Hämoglobin hergestellt wurde. Die einzelnen Komponenten hatten die Beschichtungsmenge wie unten dargelegt.

(CH₂CH-COOCH₂CH(OH)CH₃)₆₀ -(CH₂CH-CONHCCH₂SO₃(CH₃)₂)₄₀	7,5 g/m²
50 mM Natriumphosphatpuffer	(pH 7,0) 242,3 g/m²
kolloidales Gold-markierter Anti-menschliches Hämoglobin-Antikörper	200 mg/m²

Das so hergestellte Element wurde in rechteckige Chips von 12 × 13 mm Größe geschnitten. Die Chips zu mehreren mit Objektträgerrahmen, beschrieben in ungeprüfter Japanischer Patentveröffentlichung Nr. 63452/1982, umgeben, um einen trockenen Objektträger 1 zur Analyse von Hämoglobin gemäß dem vorliegenden Beispiel herzustellen.
Menschliches Hämoglobin A₀ (Hb) (Produkt von Exocell, Inc.) wurde mit 0,2 M wässrige Ammoniumchlorid-Lösung (pH 6,8), enthaltend 6% Polyethylenglykol 6000, verdünnt, um eine Reihe verdünnter Lösungen von 0, 100, 250, 500 und 1000 ng/ml herzustellen. Die Reihe verdünnter Lösungen wurde auf den trockenen Objektträger 1 in einer Menge von jeweils 10 μl getüpfelt. Nachdem jeder Objektträger 6 Minuten lang bei 37°C inkubiert war, wurde die Reflexions-optische Dichte bei zentraler Wellenlänge von 540 nm von der PET-Trägerseite gemessen. Beim Messen wurde eine aus Teflon (Polytetrafluorethylen) hergestellte weiße Platte auf die Reagenslagenseite als eine reflektierende Platte platziert, welche als weißer Hintergrund für den Farbton des kolloidalen Golds verwendet wurde.
Die Ergebnisse wurden in 3 als eine Eichkurve gezeigt. Wie aus 3 ersichtlich ist, wies der Objektträger 1, umfassend die Reagenslage, enthaltend ein wasserlösliches Polymer, eine Änderung der Reflexions-optischen Dichte OD₅₄₀, abhängig von der Hämoglobin-Konzentration, in den Proben auf. Die Tatsache zeigte, dass die Agglutination von Hämoglobin (Antigen) mit kolloidales Gold-markiertem Antikörper in der Reagenslage des Objektträgers 1 verursacht wurde. Ferner wurde bestätigt, dass Hämoglobin mit guter Sensitivität bei einer niedrigen Konzentration von 0,1 μg/ml quantitativ analysiert werden konnte. Weiterhin war eine brauchbare quantitative Analyse innerhalb von nur 6 Minuten, nachdem die Probenflüssigkeit getüpfelt worden war, möglich.
BEISPIEL 5
Herstellung eines Trockenanalyseelements unter Verwendung unlöslicher Stärke und Auswertung davon
Eine wässrige Lösung der folgenden Zusammensetzung wurde auf einen farblosen, transparenten, glatten und flachen Polyethylenterephthalatfilm (Träger, Dicke: 180 μm), unterschichtet mit Gelatine, aufgetragen, was von Trocknen gefolgt wurde, um eine Reagenslage auszubilden, wodurch ein Trockenanalyseelement zum Analysieren von Hämoglobin hergestellt wurde. Die einzelnen Komponenten hatten die unten dargelegte Auftragsmenge.

Carboxymethylierte Stärke 7,5 g/m²

50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 242,3 g/m²

kolloidales Gold-markierter Anti-menschliches Hämoglobin-Antikörper 200 mg/m²
Das hergestellte Element wurde in rechteckige Chips von 12 × 13 mm Größe geschnitten. Die Chips wurden mit Objekt trägerrahmen, beschrieben in ungeprüfter Japanischer Patentveröffentlichung Nr. 63452/1982 umgeben, um einen trockenen Objektträger 2 zur Analyse von Hämoglobin gemäß dem vorliegenden Beispiel herzustellen.
Eine Reihe von verdünnten Lösungen (0, 100, 250, 500 und 1.000 ng/ml), hergestellt durch Verdünnen von menschlichem Hämoglobin A₀ (Hb) (Produkt von Exocell, Inc.) mit einer wässrigen 0,2 M Ammoniumchlorid-Lösung (pH 6,8), enthaltend 6% Polyethylenglykol 6.000, wurden auf den trockenen Objektträger 2 in einer Menge von jeweils 10 μl getüpfelt. Nachdem jeder Objektträger 6 Minuten lang bei 37°C inkubiert war, wurde die Reflexions-optische Dichte bei zentraler Wellenlänge von 540 nm von der PET-Trägerseite gemessen. Beim Messen wurde eine aus Teflon (Polytetrafluorethylen) hergestellte weiße Platte auf der Reagenslagenseite als eine reflektierende Platte (weißer Hintergrund) platziert.
4 zeigt die Ergebnisse der Messung mit dem Objektträger 2 als eine Eichkurve. Wie aus 4 ersichtlich, zeigte der Objektträger 2, der die Reagenslage umfasste, wo carboxymethylierte Stärke, d.h., eine unlösliche Stärke, als ein Bindemittel-Medium eingesetzt war, auch, dass Agglutination von Hämoglobin (Antigen) mit kolloidales Gold-markiertem Antikörper in der Reagenslage verursacht war. Ferner wurde bestätigt, dass die Eichkurve über den ganzen gemessenen Konzentrationsbereich eine relativ gute Linearität aufwies, und folglich Hämoglobin präziser mit guter Sensitivität innerhalb eines weiten Konzentrationsbereichs analysiert werden konnte.
BEISPIEL 6
Herstellung eines Trockenanalyseelements, beschichtet mit Verteilungslage, und Auswertung davon
Eine wässrige Lösung der folgenden Zusammensetzung wurde auf einen farblosen, transparenten, glatten und flachen Polyethylenterephthalat-(PET-)Film (Träger, Dicke: 180 μm), unterschichtet mit Gelatine, aufgetragen, was von Trocknen gefolgt wurde, um eine Reagenslage auszubilden. Die einzelnen Komponenten hatten die unten dargelegte Abdeckung bzw. Auftragsmenge.

Carboxymethylierte Stärke 7,5 g/m²

50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 242,3 g/m²

kolloidales Gold-markierter Anti-menschliches Hämoglobin-Antikörper 200 mg/m²
Auf die Reagenslage wurde ein Seidensieb platziert, auf welches ein Haftmittel für den Büroarbeitsplatz (Stärkepaste) mittels dem Druckverfahren ("squeeze method") aufgebracht war, gefolgt von Abziehen des Siebs, um Maschenpunkte des Haftmittels auf der Reagenslage zu bilden. Dann wurde darauf ein weißes gewebtes Breitgewebe ("Broad"), hergestellt aus einem Polyester, welcher zuvor in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2; supplementiert mit 1,0% Rinderserumalbumin) 24 Stunden lang bei Raumtemperatur eingetaucht worden war und getrocknet worden war, platziert. Das Gewebe wurde durch leichten Druck eingedrückt und angeklebt, um eine Verteilungslage auf der Reagenslage zu bilden, wodurch ein Trockenanalyseelement hergestellt wurde.
Dann wurde das Element in rechteckige Chips von 12 × 13 mm Größe geschnitten, und mit Objektträgerrahmen, beschrieben in ungeprüfter Japanischer Patentveröffentlichung Nr. 63452/1982, umgeben, wobei ein trockener Objektträger 3 zur Analyse von Hämoglobin gemäß dem vorliegenden Beispiel hergestellt wurde.
Auf den Objektträger 3 wurde die Reihe verdünnter Hämoglobin-Lösungen (0, 100, 250, 500 und 1000 ng/ml), welche die gleiche, wie in Beispielen 4 und 5 eingesetzt, war, in einer Menge von je 20 μl getüpfelt. Nachdem jeder Objektträger 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert war, wurde die Reflexions-optische Dichte bei zentraler Wellenlänge von 540 nm von der PET-Trägerseite gemessen. Nachdem die aus Gewebe hergestellte Verteilungslage auch als lichtreflektierende Lage und ein weißer Hintergrund beim Messen von Licht wirkte, wurde die Reflexions-optische Dichte gemessen, ohne dass eine reflektive Platte auf die Reagenslagenseite platziert wurde. 5 zeigt die erhaltene Eichkurve.
Wie aus 5 ersichtlich, zeigte der Objektträger 3, umfassend die Verteilungslage auf der Reagenslage, wo carboxymethylierte Stärke als ein Bindemittel-Medium eingesetzt war, auch, dass Hämoglobin mit guter Genauigkeit quantitativ bestimmt werden konnte. Vornehmlich war die Abnahme von OD₅₄₀ in einem Bereich niedriger Hb-Konzentration drastisch. Diese Tatsache zeigt, dass der Objektträger 3, umfassend die Verteilungslage, eine höher-sensitive Analyse erlaubt und für quantitative Bestimmung des Analyten im Bereich niedrigerer Konzentration, wenn verglichen mit dem Objektträger 1 und 2, die keine Verteilungslage umfassen, geeignet ist. Zusätzlich wird bestätigt, dass der Objektträ ger 3, der die Verteilungslage umfasst, es ermöglicht, beim Tüpfeln der Flüssigprobe eine Flüssigprobe in der Verteilungslage zu behalten, und folglich ist, infolge keiner Störung eines Flüssigkeitsflusses beim Handhaben, beim Transport zu einem Messgerät oder beim Objektträger-Transport innerhalb eines Messgeräts, die Bedienbarkeit verbessert.
BEISPIEL 7
Lagerungsbeständigkeit des Trockenanalyseelements (1)
Die Lagerungsbeständigkeit des Trockenanalyseelements (Objektträger 2), erhalten in Beispiel 5, wurde untersucht. Ein Trockenanalyseelement ist bei 4°C im allgemeinen für eine Dauer von etwa 1 Jahr stabil. In diesem Experiment wurden, als ein Beschleunigungstest, die Elemente in einem trockenen Inkubator, eingerichtet bei 35°C, 0, 1, 4, 7 Tage lang nach Herstellung der Objektträger, gelagert.
Als ein Vergleichsbeispiel wurde eine 250 μg/ml-Lösung von kolloidales Gold-markiertem Anti-menschliches Hämoglobin-Antikörper (50 mM Natriumphosphat, pH 7,0) hergestellt und als ein Reagens für Agglutination vom Lösungstyp im Vergleichsbeispiel verwendet. Das Lösungsreagens des Vergleichsbeispiels wurde in einem Inkubator von 35°C 0, 1, 4, 7 Tage lang nach der Herstellung in einer ähnlichen Weise wie die des Objektträgers 2 gelagert.
100 ng/ml oder 500 ng/ml einer Lösung menschlichen Hämoglobins (menschliches Hämoglobin A₀ (Hb) (Produkt von Exocell, Inc.): enthaltend 6% Polyethylenglykol 6000, 0,2 M Ammoni umchlorid (pH 6,8)) wurden, in einer Menge von 10 μl, auf jeden Objektträger 2 nach Lagern während der festgesetzten Tage getüpfelt. Nachdem jeder Objektträger 6 Minuten lang bei 37°C inkubiert war, wurde die Reflexions-optische Dichte bei 540 nm von der Trägerseite gemessen. Von der erhaltenen Reflexions-optischen Dichte wurde die Hämoglobin-Konzentration, basierend auf der Eichkurve, hergestellt in Beispiel 5 an dem Tag, als der Objektträger 2 hergestellt worden war, berechnet.
Was das Vergleichsbeispiel betrifft, wurden 100 μl des Lösungs-Reagens, das in den festgesetzten Tagen gelagert war, mit 50 μl der Lösung von 100 oder 500 ng/ml menschlichem Hämoglobin gemischt. Nach der 10-minütigen Reaktion wurde die Transmissions-optische Dichte bei 540 nm gemessen, und die Hämoglobin-Konzentration wurde, basierend auf der Eichkurve, die vorab unter Verwendung von Standardlösungen hergestellt worden war, berechnet.
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde, im Fall des Lösungsreagens (das Vergleichsbeispiel) zum Einsatz für konventionelle Lösungstyp-kolloidales Gold-Agglutination, der Fehler der berechneten Hb-Konzentration während Lager bei 35°C mit dem Vorübergehen von Tagen größer. Der Fehler reichte bis etwa 20% am 4. Tag und etwa 40% bis 60% am 7. Tag vom Beginn der Lagerung. Auf der anderen Seite war, im Fall des Objektträgers 2, der Fehler nur 5 bis 10%, selbst am 7. Tag, vom Beginn der Lagerung. Wie in dem oben Stehenden gezeigt, besitzt das Trockenanalyseelement gemäß der vorliegenden Erfindung ausgezeichnete Lagerungsbeständigkeit.
TABELLE 4 Vergleich der Lagerungsbeständigkeit
BEISPIEL 8
Lagerungsbeständigkeit des Trockenanalyseelements (2)
Die Lagerungsbeständigkeit des Trockenanalyseelements (Objektträger 3), erhalten in Beispiel 6, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7 beschrieben, gemäß dem Beschleunigungstest untersucht. 250 μg/ml einer Lösung von kolloidales Gold-markiertem Anti-menschliches Hämoglobin-Antikörper (50 mM Natriumphosphat, pH 7,0), die in Beispiel 7 verwendet wurde, wurde auch für den Objektträger 3 als ein Vergleichsbeispiel eingesetzt.
100 ng/ml oder 500 ng/ml einer Lösung menschlichen Hämoglobins (menschliches Hämoglobin A₀ (Hb) (Produkt von Exocell, Inc.), enthaltend 6% Polyethylenglykol 6000, 0,2 M Ammoniumchlorid (pH 6,8)) wurden, in einer Menge von 20 μl, auf jeden Objektträger 3, nach Lagerung über die festgesetzten Tage, getüpfelt. Nachdem jedes Dia 5 Minuten bei 37°C inkubiert war, wurde die Reflexions-optische Dichte bei 540 nm von der Trägerseite gemessen. Von der erhaltenen Reflexions-optischen Dichte wurde die Hämoglobinkonzentration, basierend auf der Eichkurve, hergestellt in Beispiel 6 am Tag als der Objektträger 3 hergestellt worden war, berechnet.
Was das Vergleichsbeispiel betrifft, wurde nach die festgesetzten Tage langer Lagerung des Lösungsreagens, ein Assay gemäß einem Verfahren, vollkommen ähnlich zu dem in Beispiel 7, durchgeführt, und dann wurde die Transmissions-optische Dichte bei 540 nm gemessen. Die Hämoglobinkonzentration wurde, basierend auf der Eichkurve, vorab hergestellt unter Verwendung von Standardlösungen berechnet.
Wie in Tabelle 5, im Dia 3, gezeigt, hat das Trockenanalyseelement gemäß der vorliegenden Erfindung ausgezeichnete Lagerungsbeständigkeit.
TABELLE 5 Vergleich der Lagerungsbeständigkeit
Wie oben beschrieben, verwendet das Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung eine Reagenslage, die (ein) Bindemittel umfasst, das/die irgendeines eines wasserlöslichen Polymers, das eine Lösungsviskosität von 6 cP oder weniger aufweist, eines wasserunlöslichen und wasserquellbaren Polymers, oder Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger enthält/enthalten. Dadurch kann eine Agglutination eines Analyten (z.B., Antigen) mit Partikeln, die einen Antianalyten (z.B., kolloidales Gold-markierter Antikörper) aufweisen, in einer Reagenslage, einer der Lagenstrukturen des Trockenanalyseelements, verursacht werden. Dementsprechend kann eine schnelle quantitative Bestimmung des Analyten durch die Agglutination bequem mit guter Sensitivität erreicht werden.
Ferner kann, da das Trockenanalyseelement eine Reagenslage unter Verwendung des/der Bindemittel(s) umfasst, das Element ein Medium von trockenem Zustand, bei Lagerung, in einem Ausmaß, der nicht für die Stabilität der zu verwendenden Reagenszusammensetzung schädlich ist, sein und kann außerdem ein Medium sein, das durch eine wässrige Testprobe angefeuchtet wird, die als ein Analyt-Antigen bei der Analyse zugeführt wird, um ausreichend die Agglutination von Partikeln, die einen Antianalyten aufweisen, zu verursachen, wodurch eine hochsensitive Analyse möglich gemacht wird.
Weiterhin kann, wenn Partikel, die einen Antianalyten aufweisen, in die Reagenslage oder eine Lage darauf, vorab eingearbeitet sind, eine hochsensitive Trockenanalyse des Analyten durchgeführt werden, indem man einfach eine Flüssigprobe, die den Analyten enthält, tüpfelt und zuführt.
Wenn verglichen mit der Nassprozess-Agglutination unter Verwendung einer konventionellen Reagenslösung, kann eine außerordentlich schnelle und bequeme Analyse realisiert werden, weil die Herstellung des Reagens bei der Verwendung und eine Mischtätigkeit nicht notwendig sind.

Claims

Agglutinationsassayverfahren zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer wässrigen Flüssigprobe unter Verwendung von Partikeln, die einen Antianalyten umfassen, wobei der Antianalyt in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, um so eine Agglutination der Partikel herbeizuführen, umfassend: Bereitstellen einer Reagenzlage, die sich aus mindestens einem Bindemittel zusammensetzt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 1) einem wasserlöslichen Polymer, wobei eine Lösung daraus eine Viskosität von 6 cP oder weniger aufweist; 2) einem wasserunlöslichen und wasserquellbaren Polymer; und 3) Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger; Zuführen der Probe, zusammen mit den Partikeln, zu der Reagenzlage, um die Agglutination der Partikel in der Reagenzlage herbeizuführen; und Messen des Ausmaßes der Agglutination der Partikel in der Reagenzlage, um die Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Partikel ein kolloidales Metall ist und das Ausmaß der Agglutination der Partikel aufgrund der Veränderung des Farbtons der kolloidalen Metalle, die durch die Agglutination verursacht wird, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das kolloidale Metall kolloidales Gold oder kolloidales Silber ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt ein Antigen und der Antianalyt ein Antikörper ist.
Agglutinationsassayverfahren zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer wässrigen Flüssigprobe unter Verwendung von Partikeln, die einen Antianalyten umfassen, wobei der Antianalyt in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, um so eine Agglutination der Partikel herbeizuführen, umfassend: Bereitstellen einer Reagenzlage, die die Partikel enthält, wobei sich die Reagenzlage aus mindestens einem Bindemittel zusammensetzt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 1) einem wasserlöslichen Polymer, wobei eine Lösung daraus eine Viskosität von 6 cP oder weniger aufweist; 2) einem wasserunlöslichen und wasserquellbaren Polymer; und 3) Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger; Zuführen der Probe zu der Reagenzlage, um die Agglutination der Partikel in der Reagenzlage herbeizuführen; und Messen des Ausmaßes der Agglutination der Partikel in der Reagenzlage, um die Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Partikel ein kolloidales Metall ist und das Ausmaß der Agglutination der Partikel aufgrund einer Veränderung im Farbton der kolloidalen Metalle, die durch die Agglutination verursacht wird, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das kolloidale Metall kolloidales Gold oder kolloidales Silber ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Analyt ein Antigen und der Antianalyt ein Antikörper ist.
Trockenanalyseelement zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer wässrigen Flüssigprobe durch Messen des Ausmaßes der Agglutination von Partikeln, die einen Antianalyten umfassen, wobei der Antianalyt in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, um so eine Agglutination der Partikel herbeizuführen, umfassend: eine Reagenzlage, die sich aus mindestens einem Bindemittel zusammensetzt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 1) einem wasserlöslichen Polymer, wobei eine Lösung daraus eine Viskosität von 6 cP oder weniger aufweist; 2) einem wasserunlöslichen und wasserquellbaren Polymer; und 3) Gelatine mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger; wobei die Agglutination der Partikel in der Reagenzlage stattfindet, wenn die Probe zusammen mit den Partikeln auf die Reagenzlage aufgebracht wird.
Trockenanalyseelement nach Anspruch 9, wobei die Reagenzlage die Partikel, die den Antianalyten umfassen, enthält.
Trockenanalyseelement nach Anspruch 9, das außerdem eine Verteilungslage umfasst, die der Reagenzlage aufgelagert ist.
Trockenanalyseelement nach Anspruch 11, wobei die Verteilungslage die Partikel enthält, die den Antianalyten umfassen.
Trockenanalyseelement nach Anspruch 9, wobei das Partikel ein kolloidales Metall ist und das Ausmaß der Agglutination der Partikel aufgrund einer Veränderung im Farbton der kolloidalen Metalle, die durch die Agglutination verursacht wird, bestimmt wird.
Element nach Anspruch 13, wobei das kolloidale Metall kolloidales Gold oder kolloidales Silber ist.
Trockenanalyseelement nach Anspruch 9, wobei der Analyt ein Antigen und der Antianalyt ein Antikörper ist.