-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung für die Diagnose
von Allergien.
-
Die
Erfindung betrifft insbesondere eine Immunoassay-Vorrichtung, die
keine komplizierte Laboreinrichtung oder technisches Fachwissen
erfordert und für
die Verwendung zu Hause oder in der ärztlichen Praxis geeignet ist.
-
Eine
Anzahl von Testkits unter Verwendung von Immunoassay-Technologie (hauptsächlich für Schwangerschaftstests
oder zur Vorhersage der Fertilität)
sind weithin erhältlich
zur Verwendung zu Hause oder in einer Arztpraxis. Das Format der
im Immunoassay-Technologie bei solchen Testkits ist grundsätzlich ähnlich,
indem Teststreifen verwendet werden, die immobilisiertes Immunreaktans
enthalten und um wobei der Benutzer eine Probe einer vorbestimmten
Körperflüssigkeit
zur Verfügung
stellen und aufbringen muss. Manche Vorrichtungen, bei denen Urin
als Quelle der Analyse verwendet wird, erfordern kein weiteres Eingreifen
als das Aufbringen der Probe auf die Vorrichtung. Dies ist eine
ideale Situation, wo Urin nicht nur das Analyt beinhaltet sondern
außerdem
als die Flüssigkeitskomponente
einer mobilen Phase wirkt, welche die chemische Reaktion innerhalb
der Vorrichtung initiiert. Andere Proben sind jedoch möglicherweise
nicht ohne weiteres in derart ausreichenden Volumina verfügbar. Bei
Anwendungen, wo Urin nicht geeignet ist, ist üblicherweise eine Blutprobe
erforderlich, wenngleich auch andere Körperflüssigkeiten Verwendung finden
können,
zum Beispiel Speichel oder Tränenflüssigkeit.
Aus praktischen und ethischen Gründen
müssen
Vorrichtungen, die für
eine Verwendung zu Hause vorgesehen sind und die eine Blutprobe
erfordern, mit einer Kapillarprobe arbeiten, die üblicherweise
nicht größer als ein
paar hundert Mikroliter im Volumen ist.
-
Auf
Grund von physikalischen Beschränkungen
wie etwa der Fließeigenschaften
ist ein solches Volumen für
die meisten Vorrichtungen unzureichend, die chemische Reaktion zu
initiieren und ihr Fortschreiten zuzulassen. Dann müssen zusätzliche Flüssigkeitskomponenten
zu dem Testkit hinzugefügt werden,
um eine mobile Phase zu ermöglichen.
Diese mobile Phase kann innerhalb eines Behältnisses innerhalb der Vorrichtung
aufbewahrt werden, deren Freisetzung entweder durch physikalischen
Eingriff durch den Benutzer oder durch eine chemische Interaktion
der Probe mit einer physikalischen Barriere initiiert wird, die
die mobile Phase von den Immunreaktanzen trennt. Die mobile Phase
könnte
auch aus einem separaten Behälter
in eine Aufnahmevorrichtung an der Vorrichtung selbst hinzugefügt werden. Je
mehr Bedienungsschritte für
die Benutzung des Testkits erforderlich sind, desto größer ist
natürlich die
Chance für
eine Fehlbedienung und desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit,
ein korrektes Ergebnis zu erhalten.
-
In
manchen medizinischen Situationen ist es wichtig, ein rasches Testresultat
zu erhalten. In Notfallsituationen kann es zum Beispiel erforderlich
sein, ein Resultat innerhalb von Minuten nach Aufbringen der Probe
zu erhalten, während
in anderen Situationen ein Resultat innerhalb von Minuten nicht
erforderlich sein mag.
-
EP0314499
offenbart eine chromatographische Testeinrichtung zum Nachweis der
Anwesenheit eines Analyts in einer Flüssigkeitsprobe. Die Vorrichtung
weist wenigstens zwei Flüssigkeit
leitende Zonen auf, die separate Flüssigkeits-Fließwege bilden,
welche separate Flüssigkeitsströme zu einer Reaktionszone
hin führen.
EP 0186799 offenbart eine ähnliche
Diagnose-Einrichtung,
in der eine biologische Flüssigkeit
mit einem spezifischen funktionalen Sektor der Einrichtung in Kontakt
gebracht wird, wobei die Flüssigkeit
durch mehrere funktionale Sektoren, die nebeneinander angeordnet
sind und geeignete Reagens-Komponenten enthalten, hindurch migriert.
-
EP0590695
offenbart eine Flüssigkeitstransfer-Vorrichtung
zum einmaligen Gebrauch zur Durchführung eines biochemischen Diagnosetests.
Die Vorrichtung umfasst zwei Flüssigkeits-Fließkanäle, die
von einem entsprechenden Paar Kanalenden zu einem Ort in einem gemeinsamen
Kanalsegment führen,
an welchem sich die Kanäle
vereinigen, wobei sie so arbeiten kann, dass diesem Ort nacheinander
Flüssigkeit
zugeführt
werden kann, nachdem diese Flüssigkeit
gleichzeitig in die Kanalenden eingebracht wurde. WO9517676 offenbart
eine Vorrichtung zur Trennung und zum Nachweis von Zielmolekülen in einer
Flüssigkeitsprobe.
-
Derzeit
erhältliche
Vorrichtungen arbeiten oft nicht sequenziell, das heißt, dass
die Reaktion nur einen einzigen Schritt umfasst. Eines der Hauptprobleme
bei nicht-sequenziellen immunometrischen Testkits besteht jedoch
im Auftreten eines Phänomens, das
als „Hochdosis-Hakeneffekt" bezeichnet wird. Der
Hochdosis-Hakeneffekt tritt auf, wenn hohe Pegel von Antigen das
System sättigen.
Dies kommt dadurch, dass nach der Reaktion sämtlichen verfügbaren gekennzeichneter
Immunreaktanz' freie
Analyte in der Probe verbleiben, und durch die inadäquate Bindungsfähigkeit
des Immunadsorbens für
die Menge an komplextem und freiem Analyt im System. Dieses unmarkierte
Analyt kann dann in nachgeschalteten Schritten um das immobilisierte
Immunreaktanz konkurrieren. In manchen Fällen, wenn die Probe eine große Menge
Analyt enthält,
kann man falsche negative Ergebnisse nur auf Grund der Sättigung
der markierten Immunreaktanz und Immunadsorbens erhalten. Diese
falschen negativen oder abnorm niedrigeren Resultate können Entscheidungen
des Benutzers oder des Klinikers hinsichtlich der Behandlung beeinflussen.
Dies tritt jedoch nicht auf, wenn ausreichend Immunadsorbens vorhanden
ist. Die Bindungsfähigkeit
eines Immunadsorbens unterliegt jedoch Beschränkungen, und es ist allgemein
nicht praktisch, die Menge an gekennzeichnetem Immunreaktanz im
System so weit zur erhöhen,
dass der Hochdosis-Hakeneffekt vermieden wird, da dies dazu führen kann,
dass die nicht-spezifische Verbindung des gekennzeichneten Immun reaktanz
erhöht
wird, wodurch die analytische Empfindlichkeit des Tests vermindert
wird, wodurch erhöhte
Referenz-Resultate erscheinen. Bei bekannten Labor-Immunoassays wird
dieses Problem dadurch gelöst,
dass sequenzielle Tests durchgeführt
werden, mit diskreten Wasch-Schritten zwischen den Hinzufügungen von Proben
und Immunreaktanzen. in einem Labor können sequenzielle immunometrische
Tests leicht durchgeführt
werden. Zum Beispiel kann man eine Probe, welche Analyt enthält, mit
einem für
das fragliche Analyt spezifischen immobilisierten Immunreaktanz
regieren lassen. Nach einer vorherbestimmten Inkubationszeit kann
ungebundenes Analyt in der Probe abgewaschen werden, üblicherweise
mittels einer Kombination von Dekantieren und Waschen. Dann werden
die gekennzeichneten Immunreaktanzen hinzugefügt.
-
Ein
weiteres Verfahren zum Umgehen des Hochdosis-Hakeneffekts und zum
Vermeiden des sequenziellen Formats, bestünde darin, ein kompetitives
Testformat zu verwenden. Dies ist jedoch nicht ideal. Bei solchen
Tests ist zum Beispiel die Präzision weitgehend
von der Region der untersuchten Dosisansprechkurve abhängig. Im
Gegensatz zu immunometrischen Tests ist das Ansprechen bei kompetitiven
Tests umgekehrt proportional zum Ansprechen – das heißt bei höheren Konzentrationen von Analyt erlangt
man ein niedrigeres Signal. Allgemein ist dies keine bevorzugte
Eigenschaft für
einen Heimtestkit, wo die Abwesenheit eines Signals ein positives
Ergebnis vermittelt. Ein bevorzugter Weg zum Vermeiden des Hochdosis-Hakeneffekts
bei Aufrechterhaltung eines akzeptablen Testformats ist ein sequenzieller
immunometrischer Test-Ansatz. Das Erfordernis des separaten Zuführens vom
Reagens durch den Benutzer und dazwischen-geschaltete Wasch-Schritte
machen jedoch eine derartige Testeinrichtung zu mühselig für die Anwendung
zu Hause oder in der Praxis.
-
Ziel
der vorliegenden Erfindung ist es er, die Probleme im Zusammenhang
mit nicht-sequenziellen immunometrischen Tests zu überwinden,
in dem ein Selbstdiagnoseapparat vorgesehen wird, welcher ein sequenzielles
Immunoassay-Verfahren durchführen
kann, welcher jedoch keine komplizierte Laboreinrichtung oder technische
Fachkenntnisse erfordert.
-
Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Selbstdiagnoseeinrichtung
anzugeben, die Immunoassay-Technologie verwendet, die besonders
nützlich
ist für
die Messung von antigen-spezifischem Immunglobulin E (IgE), wie
bei der Diagnose von Allergien, welche jedoch auch für andere
Analyte und Isotope (sic) verwendet werden kann.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein analytischer Testapparat zum Überprüfen auf die Anwesenheit eines
Analyten in einer Probe von Körperflüssigkeit
vorgesehen, die von einem tierischen Wesen (insbesondere einem menschlichen
Wesen) erhalten wurde, wobei der Apparat umfasst:
- (a)
einen ersten Fließweg,
der eine Probenaufnahmezone zum Aufnehmen der Probe enthält,
- (b) einen zweiten Fließweg,
der nicht immobilisiertes markiertes immunreaktives Material enthält, das
mit dem Analyten in Wechselwirkung treten kann,
- (c) eine Aufnahmezone für
eine mobile Phase zum Aufnehmen einer mobilen Phase, wobei die Aufnahmezone
für die
mobile Phase in Verbindung mit dem ersten und zweiten Fließweg steht und
- (d) eine Nachweiszone, die ein Immunadsorbens zum Binden des
Analyten enthält,
wenn der Analyt in der Probe vorliegt,
wobei der erste
Fließweg
so angeordnet und ausgebildet ist, dass er ein Fließen der
Probe in der mobilen Phase von der Probenaufnahmezone zu der Nachweiszone
erlaubt, wodurch der Analyt, wenn er in der Probe vorliegt, im Wesentlichen
an das Immunadsorbens binden kann, und der zweite Fließweg so angeordnet
und ausgebildet ist, dass er ein Fließen des markierten immunreaktiven
Materials in der mobilen Phase zu der Nachweiszone im Wesentlichen nach
dem Eintreffen der Probe an der Nachweiszone erlaubt, wodurch das
markierte immunreaktive Material im Wesentlichen an den Analyten
binden kann, wenn der Analyt an das Immunadsorbens gebunden hat,
um so eine Anzeige für
das Vorliegen des Analyten in der Probe bereitzustellen.
-
Die
vorgenannten Probleme bei nicht-sequenziellen immunometrischen Tests
können überwunden
werden, indem man dem Analyten erlaubt, die Nachweiszone zu erreichen,
wo er in durch ein Immunadsorbens immunextrahiert wird, bevor eine erhebliche
Menge immunreaktiven Materials die Nachweiszone erreicht.
-
Gemäß einer
ersten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann dies erreicht werden, indem man
eine Nachweiszone vorsieht, welche von den Fließwegen getrennt werden kann,
wodurch es der Nachweiszone ermöglicht
wird, nur dann von dem Fließweg
mit dem Analyten zu dem Fließweg
mit dem markierten immunreaktiven Material zu wechseln, wenn eine
ausreichende Immunadsorbtion des Analyten in der Nachweiszone stattgefunden
hat.
-
Demgemäß ist die
Nachweiszone entsprechend einer ersten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung beweglich von einer ersten Stellung in Verbindung mit
dem ersten Fließweg
zu einer zweiten Stellung in Verbindung mit dem zweiten Fließweg, wobei,
wenn die Nachweiszone in der ersten Stellung ist, ein Fließen der
Probe in der er mobilen Phase von der Probenaufnahmezone zur Nachweiszone
hin stattfindet, und wenn die Nachweiszone in der zweiten Stellung
ist, ein Fließen
des gekennzeichneten immunreaktiven Materials in der mobilen Phase
zur Nachweiszone hin stattfindet.
-
Die
Fließwege
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen längliche
Folien- oder Leistenmaterialien (Blatt- oder Streifmaterialien)
mit einem Segmente, das mit dem ersten und/oder zweiten Fließweg verbunden
wer den kann. Die Fließwege
sind so ausgebildet, dass sie ein Fließen in Richtung auf die Nachweiszone
potenzieren, indem sie die Bewegung der mobilen Phase in Längsrichtung
erlauben.
-
Gemäß einer
zweiten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann die Ankunft des gekennzeichneten
immunreaktiven Materials an der Nachweiszone verzögert werden,
in dem ein längerer Fließweg für das gekennzeichnete
immunreaktive Material im Verhältnis
zum Fließweg
für den
Analyten vorgesehen ist.
-
Die
Immunoassay-Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst vorzugsweise einen externen Korpus und einen internen
Korpus. Der externe Korpus beinhaltet üblicherweise eine Aufnahme
zum Aufbringen einer den Analyten enthaltenen Probe und ein Behältnis, wo
das Ergebnis des Tests abgelesen werden kann.
-
Des
Weiteren kann der externe Korpus der Vorrichtung eine Lanzette umfassen,
um es dem Benutzer der Einrichtung in zu ermöglichen, eine Blutprobe zu
produzieren. Die Lanzette kann integral als ein Gusskörper mit
dem externen Korpus der Vorrichtung oder separat vorgesehen sein.
-
Des
Weiteren kann eine Trocknungsmittel-Tablette in der Vorrichtung
vorgesehen sein, und die gesamte Einheit kann hermetisch versiegelt
sein, um eine Verschlechterung infolge von Änderungen in der Luftfeuchte
zu verhindern. Die Vorrichtung ist besonders geeignet zur Verwendung
zu Hause, am Krankenbett oder in der Arztpraxis.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der Vorrichtung ist der Einschluss einer Ausnehmung im externen
Korpus der Vorrichtung, in die ein Blutstropfen gegeben wird. Diese
Ausnehmung führt
vorzugsweise direkt zur Oberfläche
des ersten Fließwegs.
Die Ausnehmung kann so ausgebildet sein, dass sie ver hindert, dass
der Benutzer während
des Tests die Oberfläche
des Fließweges
berührt.
-
Alle
zur Erlangung eines Ergebnisses erforderlichen Komponenten, mit
Ausnahme der das nachzuweisende Analyt enthaltenden Probe, können als
ein Testsatz vorgesehen sein; die Verwendung des erfindungsgemäßen Apparates
ist damit nicht auf das Labor beschränkt.
-
Um
den Apparat gemäß der vorliegenden
Erfindung zu benutzen, liefert ein Benutzer eine Probe, die das
Analyt enthält,
zum Beispiel eine Blutprobe. Mittels einer Lanzette zum Einstichen
in einem Finger (die vorzugsweise Teil des Apparates darstellt)
kann eine Kapillar-Blutprobe abgenommen werden. Die Blut- oder sonstige
Probe wird dann in eine Probenaufnahmezone eingebracht. Die Probenaufnahmezone
umfasst vorzugsweise einen geeigneten Blutfilter, um ein Separieren
des Plasmas von der Vollblutprobe zu ermöglichen. Oberhalb der Probe
kann dann mobile Phase eingebracht werden. Aliquote mobiler Phase
können
indirekt aus einem separaten, mobile Phase enthaltenden Behältnis, zum
Beispiel, aus einer oder mehreren Tropfflaschen, in die Aufnahmezone
für die
mobile Phase eingebracht werden. In diesem Fall wird die mobile
Phase auf eine adsorbierende feste Phase aufgebracht, welcher eine
Verlängerung
des Korpus der Testvorrichtung ist, oder sie kann in Form einer
Quellvorrichtung mit einer Verbindungskammer zur Aufnahmezone für die mobile
Phase und zu anderen Leitungselementen zugeführt werden. Alternativ kann
die mobile Phase, die üblicherweise
physiologische Kochsalzlösung und
antimikrobiotische Konservierungsmittel enthält, direkt aus einem integrierten
Reservoir in die Vorrichtung freigegeben werden. In diesem Fall
kann die mobile Phase in einer Blase oder etwas ähnlichem enthalten sein, das
die Freigabe der mobilen Phase während
des Betriebs der Vorrichtung erlaubt. Die mobile Phase kann durch
Anwendung von Druck oder, zum Beispiel, durch geeignete Penetrierungsmittel
freigesetzt werden, die so auf die Oberfläche der Blase einwirken, dass
diese punktiert wird. Das Penetrierungsmittel kann in die Vorrichtung
integriert sein. Nach der Punktierung führt Druck auf die Oberseite
der Blase zu einer Deformierung der Blase, wodurch die mobile Phase
aus der Blase herausgedrückt
wird. Alternativ kann die direkte Freisetzung der mobilen Phase
durch chemische Einwirkungen erfolgen. Die chemische Einwirkung
kann durch Verbindungen in der Probe initiiert werden, die so wirken, dass
sie eine Membran "verdauen", wodurch der Inhalt
eines Reservoirs für
die mobile Phase freigesetzt wird. Kein weiteres Eingreifen durch
den Benutzer ist erforderlich, außer das Ergebnis des Tests
abzulesen, wobei ein positives Ergebnis durch eine Farbe in der
Nachweiszone angezeigt wird, nach einer vorbestimmten Inkubationszeit.
-
Wie
bereits erwähnt,
ist die vorliegende Erfindung besonders geeignet zur Verwendung
zu Hause oder in der Arztpraxis. Es wäre daher nicht praktisch durchführbar, eine
Blutprobe mit einem Volumen von mehr als ein paar Hundert μl zu erhalten;
ein bevorzugtes Volumen liegt bei weniger als 50 μl. Dieses
Volumen an Vollblut besteht ungefähr zu 50 Prozent aus zellularen
Anteilen, weshalb normalerweise weniger als 20 μl Probenflüssigkeit für die Analyse verbleiben. Allergietests
müssen
hoch empfindlich sein, um auch geringste Mengen von im zirkulieren Blut
anwesendem IgE nachzuweisen. Es ist daher vorteilhaft, so viel Plasma
wie möglich
in das Testsystem zu extrahieren. Ein System, das die Probe als Quelle
der mobilen Phase für
die gekennzeichneten Immunreaktanzen und nachfolgender Waschschritte eines
sequenziellen Immunoassays verwendet, ist daher bei den in diesem
Falle vorliegenden geringen Volumina nicht praktisch durchführbar. Hier
wird eine separate mobile Phase aus einem Reservoir zugeführt, die
das Plasma seitlich durch den Filter aus der Probe herausdrückt.
-
Vorteilhafterweise
ist es diese seitliche Trennung, anstatt des quer laufenden Flusses
der kapillaren Blutprobe durch ein geeignetes Filtrierungsmittel (welches
in vorteilhafter Weise das Material des ersten Fließwegs umfas sen
kann), die zu der effizienten Extrahierung vom Plasma-Komponenten
frei von roten Blutzellen führt.
Die mobile Phase drückt
die Plasma-Komponente aus der Probe heraus, wodurch das Plasma seitlich
den Fließweg
entlang wandert (anstatt auf herkömmliche Weise durch die Tiefe
eines Filters zu einer Separierung zu kommen, was dazu führen würde, dass
ein wesentlicher Teil das Plasmas zurückgehalten würde). Die
zellenfreie Probe wird durch Hinzufügen einer mobilen Phase, die auch
ein markiertes Reaktanz enthalten kann, seitlich durch den Fließweg in
Richtung zum Immunadsorbens gezogen. Dies unterscheidet sich von
Vorrichtungen mit nur einem Verfahrensschritt, in denen die der
Einbringungszone nächstgelegenen
immobilisierten Reaktanzen mehr von dem Analyten ausgesetzt werden
als immobilisierte Reaktanzen, die weiter distal zur Einbringungszone
liegen.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst die Vorrichtung zusätzlich ein
Blutfilter. Eine Probe Vollblut (üblicherweise ungefähr 50 μl) kann auf
die Oberfläche
eines geeigneten Zellfilters, zum Beispiel eines Cyto-Sep-Filters
(Ahlstrom Filtration) oder eines Glasfaser-Filters wie etwa GF/A
(Whatman) oder GF51 (Schleicher and Schuell), aufgebracht werden,
der mit Detergenzien, Antikoagulanzien und anderen in der Immunoassay-Technologie üblichen
Reagenzien vorbehandelt sein kann. Das Aufnahmegehäuse eines
derartigen Filters schützt
den Benutzer vor den chemischen und allergenen Inhaltsstoffen der
Vorrichtung. Den Filter kann ein chemisches Antikoagulanz wie etwa
Oxalat oder Fluorid, einen Chelatbildner (wie etwa EDTA) oder ein
Antikoagulanz wie Heparin enthalten. Manche Zellen könne auch
durch spezifische Bindemittel entfernt werden, die nahe der Probeneinführungszone
immobilisiert sind, wie etwa reaktiven Lectinen mit polyfunktionalen
Gruppen. Die Zellen können
auch mittels physikalischer oder chemischer Schocks, wie etwa Veränderungen
im pH-Wert oder der Ionenkonzentration der Umgebung, Gefrieren,
Erhitzen, Austrocknen oder durch die Einwirkung spezifischer biologischer
Lysemittel oder organischer Verbindungen aufgelöst werden. Bei manchen Analyten
ist jedoch eine Entfernung der Zellen für den erfolgreichen Einsatz
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
nicht erforderlich.
-
Sobald
eine Blutprobe oder eine sonstige Probe vollständig absorbiert wurde, kann
das Plasma von den Zellen getrennt werden, in dem man das freie
Ende des Filters in Kontakt mit einer Lösung bringt, die anti-humanes
IgE enthält,
das Hapten- oder direkt markiert sein kann, zusammen mit Konservierungsmitteln
und Stabilisatoren (die in der Praxis der Entwicklung von Immunoassays
zur Minimierung nicht-spezifischer Wechselwirkungen üblich sind).
Allerdings kann die Verwendung eines anti-humanen IgG nützlich sein,
wenn man Lebensmittel-Allergien diagnostiziert, die nicht von IgE-Mechanismen abhängen. Wird
bei dem obigen Schritt eine indirekte Markierung hinzugefügt, so kann
ein zweites mit markierten Gruppen an den anti-IgE- oder anti-IgG-Antikörpern reaktives
Reagenz hinzugefügt werden,
indem man einfach das freie Ende des Filters einem Reagenz aussetzt,
das das markierte zweite Antikörper
enthält.
Mit dieser letzteren Methode lässt
sich somit die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens verbessern.
Nach einer vorbestimmten Zeit zeigt das Immunadsorbens einen Fingerabdruck des
allergenen Profils des Patienten als eine Reihe von Bändern, die
der Existenz von allergen-spezifischen IgE- oder IgG-Antikörpern zugeschrieben
werden können,
womit die Möglichkeit
IgE/IgG-induzierter allergischer Reaktionen auf die getesteten Allergene
nahegelegt wird.
-
Bezug
nehmend insbesondere auf die beschriebene Ausführungsform mit beweglicher
Nachweiszone kann die mobile Phase gleichzeitig entlang zweier separater
Wege absorbiert werden, die von der Aufnahmezone für die mobile
Phase wegführen. Die
Probenaufnahmezone kann ein Blutfilter umfassen. Dieses erlaubt
eine seitliche Trennung des Plasmas von den Zellen und danach das
Fließen
des Plasmas in die Nachweiszone. Nach einer festen Zeitdauer, üblicherweise
10 Minuten, ist der Plasma-Anteil der Blutprobe aus der Blutprobe
extrahiert und durch die Nachweiszone gewandert, gefolgt von einer
mobilen Phase, was zum Entfernen irgendwelcher freien unreagierten
Analyte im Plasma aus der Nachweiszone führt.
-
Der
Blutfilter kann zusätzlich
Additive für
die spezifische Entfernung von nicht-IgE-Isotypen aus dem Plasma
enthalten. Da die Plasmaprobe eines positiv testenden Probanden
Antikörper
enthalten kann, die gegen die Allergene in der Nachweiszone gerichtet
sind, außer
allergen-spezifischem IgE (dieser Zustand kann bei Patienten mit
Lebensmittelallergien sehr ausgeprägt sein), besteht eine Tendenz
der IgG-Antikörper,
zum Beispiel in der Plasmaprobe, die Bindung der IgE-Antikörper mit
dem Allergen zu verdrängen.
Dies kann dazu führen,
dass auf Grund der Hemmung des Tests durch nicht-IgE-Antikörper-Isotypen
falsche negative Ergebnisse für
die Plasmaprobe gemeldet werden. Hier durchläuft ein Großteil das Plasmas und damit
des Analyts den Blutfilter, der die Entfernung der nicht-IgE-Antikörper fördert. Die Mittel
zum Entfernen von nicht-IgE-Komponenten können ionenaustauschenes Material
umfassen, das IgE-Antikörper
ungehindert hindurchlässt
während es
sich an die nicht-IgE-Isotypen bindet und damit deren Eintritt in
die Nachweiszone verhindert.
-
Die
Matrix oder der Filter für
die Entfernung von nicht-IgE-Komponenten kann getrennt von dem Blutfilter
vorgesehen sein. Der Blutfilter und/oder die Matrix zum Entfernen
von nicht-IgE-Komponenten sind vorzugsweise zwischen der Probeneinführungszone
und der Nachweiszone angeordnet.
-
Eine
wichtige Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
welche die Spezifizität des
Diagnosetests erhöht,
besteht darin, dass die Probe, z. B. zum Messen von allergen-spezifischem IgE,
frei von nicht-IgE-Isotypen
absorbiert werden kann, indem man die Probe durch eine Matrix hindurchlaufen
lässt,
die ein Adsorbens enthält,
das mit humanen IgE, IgM oder IgA, z. B. Lectinen, Protein A oder
anti-humanen Antikörpern
reagiert, außer
den verwendeten spezifischen Antikörpern, wodurch die Adsorption nicht-spezifischer
Isotypen (zur Messung von IgG-, IgD- und IgA- oder IgG-Unterklassen) erleichtert
wird. Die Einbindung einer Adsorptions-Matrix zwischen die Probeneinbringungszone
und das Immunadsorbens führt
zu höher
spezifischen und empfindlicheren Allergietests, in dem Wechselwirkungen
mit nicht-IgE-Antikörpern
ausgeschlossen werden. Alternativ kann die Matrix in der Probeneinbringungszone
innerhalb des Blutfilters vorgesehen sein. Alternativ kann die Matrix
getrennt vom Blutfilter vorgesehen sein. Auch ist es möglich, Antikörper zu immobilisieren,
um in dem Nachweismittel eine dem allergen-imprägnierten Mittel vorgeschaltete
Zone zu erhalten. Zum Beispiel hemmt die Anwesenheit großer Mengen
von nicht-IgE-Allergen-Antikörpern in der
Probe die Bindung von IgE-Antikörpern
durch Wettbewerb um das Allergosorbens, wodurch die Gefahr eines
falschen negativen Resultats entsteht, was besonders wichtig bei
der Diagnose von durch IgE-induzierten
Lebensmittelallergien ist, oder bei Patienten, die sich einer Immuntherapie
mit Allergen-Extrakten unterzogen haben (was zu erhöhten IgE-Immunglobulin-Isotypen
führen
kann). Es ist daher zu erwarten, dass ein Test unter Verwendung
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
einige Patienten als positiv reagierend gegenüber bestimmten Allergenen klassifiziert,
während
andere handelsübliche
Allergietests zu einer negativen Klassifizierung oder einer niedrigeren
Allergie-Klasse kommen. Dies kann ein wichtiges Merkmal sein, wenn
es um objektive Messungen von IgE in Abwesenheit anderer Isotypen geht,
oder wenn spezifische Isotypen von Antikörpern ohne Einwirkungen anderer
Isotypen gemessen werden. Eine weitere Implikation dieser Ausführungsform
ist die Entfernung von im Immunkomplexen von Allergenen, IgE und
IgG, aufgrund der polyklonalen Natur der Immunantwort auf eine Reihe
von Epitopen auf der Oberfläche
der Allergene. Die Entfernung solcher Komplexe könnte die Anzahl asymptomatischer
spezifischer IgE-positiver Ergebnisse vermindern, die derzeit bei
heutigen klassischen Allergietests bei der Messung spezifischen
IgE auftritt. Die Absorptionstechnik kann auch auf die Entfernung von
kreuzreaktiven Antigenen in im Falle von Immunoassays für andere
Analyte erweitert werden oder für
die Entfer nung störender
Komponenten (wie etwa Immunkomplexe bei bestimmten Krankheiten)
oder wo biologisch aktive Komponenten oder chemisch wechselwirkende
Materialien (wie etwa Proteasen oder sonstige bindende Substanzen)
entfernt werden müssen.
-
Die
mobile Phase läuft
gleichzeitig entlang des zweiten Fließwegs durch das markierte immunreaktive
Material zur Nachweiszone. Während
der anfänglichen
10-minütigen
Trennung des Plasmas von der Vollblutprobe dient die mobile Phase
auch zur Rehydrierung getrockneten Entwicklers, wie etwa anti-humanen
IgE-Antikörpern,
im zweiten Fließweg.
-
Nach
einer bestimmten Zeitperiode, üblicherweise
10 Minuten, wird die zweite Phase der Reaktion durch die physikalische
Bewegung der Nachweiszone von dem ersten Fließweg zum zweiten Fließweg eingeleitet.
Dieser Prozess kann manuell oder mit anderen Mitteln durchgeführt werden.
Nun verläuft
der aktive Fließweg
vom Reservoir bzw. der Aufnahmezone für die mobile Phase durch die
rehydrierten markierten Antikörper
in die Nachweiszone. Ein wichtiges Merkmal der Unterbrechung des
Flusses des ersten Fließweges
liegt darin, dass die Gefahr gering ist, dass die roten Blutzellen
von der Blutprobe in die Nachweiszone diffundieren und damit das
Ergebnis am Nachweis-Filter unkenntlich machen.
-
Die
markierten Immunreaktanzen durchlaufen die Nachweiszone in einem
Bolus, und zwar aus zwei Gründen:
- (i) Die Konzentration der markierten Immunreaktanzen
in der Nachweiszone wird vergrößert, wodurch
die Reaktionsrate erhöht
wird;
- (ii) der Bolus wird von einer Zone der mobilen Phase gefolgt,
in die dazu dient, die Nachweiszone von verbleibenden markierten
Immunreaktanzen zu reinigen, wodurch nicht-spezifische Bindungen
vermindert und der Störsignalabstand verbessert
wird.
-
Am
Ende der Nachweiszone liegt ein Ausguss (eine Senke), der stets
im Kontakt mit der Nachweiszone sein kann aber nicht muss, außer während der
zweiten Phase des Tests, wo die Nachweiszone und der zweite Fließweg in
Kontakt stehen. Dieser Bereich dient als Ausguss für alles
unreagierte Material und kann damit unreagierte (überschüssige) markierte
Immunreaktanzen ansammeln, wodurch die sichtbare Erscheinung des
Ausgusses entweder direkt im Falle partikulärer Markierungen oder indirekt durch
Reaktion der markierten Immunreaktanzen mit einem weiteren Entwickler
verändert
wird. Hierdurch können
die überschüssigen markierten
Immunreaktanzen als ein Mittel zur Feststellung dienen, wann der
Test fertig ist.
-
Die
Bewegung der Nachweiszone stellt ein wesentliches Merkmal dar. Die
Nachweiszone wird in den zweiten Fließweg eingeklinkt und hält wesentlicher
Weise den Filter in einem Winkel zur Oberfläche der Nachweiszone. Der erste
Fließweg
und der zweite Fließweg
sind ebenso in einem entsprechenden Winkel geneigt, so dass die
Nachweiszone, wenn die Nachweiszone aus dem ersten Fließweg heraus
gezogen wird, gegen den zweiten Fließweg gedrängt wird, wodurch ein guter
Kontakt sichergestellt wird, der eine Kontinuität des Flusses der mobilen Phase und
der von ihr mitgeführten
Reaktanzen erlaubt. Die Nachweiszone kann außerdem ein Fenster enthalten,
durch welches das Ergebnis des Tests sichtbar ist.
-
Gemäß einem
weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung kann ein Allergosorbens
eingesetzt werden. Auf Grund der hohen Empfindlichkeit, die für den Nachweis
geringer Mengen an allergen-spezifischem IgE erforderlich ist, im
Vergleich zu allergen-spezifischem IgG, und auf Grund der Tatsache,
dass das IgE nur zu einem kleinen Teil des Allergosorbens geleitet
werden kann, müssen
die Eigenschaften des Substrats zum Binden der Allergene hoch effizient
sein. Die Flussrate ist gleichfalls wichtig, weil eine zu schnelle
Flussrate zu einer zu niedrigen Empfindlichkeit führen würde. Eine
Nitrozellulosemembran mit einem Kunststoffrücken (SSLU, Schleicher and
Schuell) mit einer Porengröße von 3 bis
5 μm, oder
eine Whatmann 3 mm, hat sich als geeignet für den Nachweis von allergen-spezifischem IgE
herausgestellt.
-
Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
kann für den
Nachweis von multiplem allergen-spezifischem IgE, im Gegensatz zu
einem einzelnen Allergen reaktiven IgE, eingesetzt werden. Im Falle
der erfindungsgemäßen Ausführungsform
mit einer nicht beweglichen Nachweiszone z. B. ist die Flussrate
durch das Allergosorbens proportional zur Länge des entsprechenden Fließweges.
Je größer also
die Bandbreite von getesteten Allergenen, desto länger wird
die Entwicklungszeit, bis sich ein Ergebnis ablesen lässt.
-
Die
Allergene können
auf die Nitrozellulose mittels eines Schachts aufgebracht werden,
der wässrige
Allergenextrakte mit 1 μl
je linearem cm mit Konzentrationen zwischen 1 und 10 mg/ml in 50
mM Tris gepufferter Kochsalzlösung
mit einem pH-Wert von 7,4 (wobei die Protein-Konzentration von der Quelle
des verwendeten Extrakts abhängig
ist). Die Nitrozellulose kann dann 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur
trocknen. Die überflüssigen reaktiven Gruppen
auf der Nitrozellulose können
dann eine Stunde lang mit einer Tris gepufferten Kochsalzlösung, die
0,05% v/v Tween-20 enthält,
blockiert werden. Ein weiterer Waschvorgang mit dem vorgenannten
Puffer kann durchgeführt
werden, und zwar 15 Minuten, bevor man die Membran 3 Stunden lang
bei Zimmertemperatur trocknen lässt
und dann das getrocknete Material bei 2–8°Celsius lagert.
-
Die
Nachweiszone enthält
vorzugsweise ein Immunadsorbens. Viele bekannte Immunoassay-Vorrichtungen
arbeiten, indem die Probe durch eine Zone mit gekennzeichneten Immunreaktanzen stromab
von der Probenaufnahmezone fließt,
wobei die Immunreaktanzen sich spezifisch an das Analyt binden,
wenn dieses in der Probe aufgefunden wird. Die Markierung stellt
ein Mittel dar, vermittels dessen das spezifische Analyt für den Benutzer
nachweisbar gemacht wird. Dieses markierte Immunreaktanz kann direkt
sein, zum Beispiel wenn es an gefärbte Latex-Partikel, Goldkolloide
oder Farbsols gebunden ist. Das markierte Immunreaktanz kann auch
indirekt sein, z. B. wenn die Markierung ein biologisches Enzym
ist, das vor dem Nachweis der Markierung eine Behandlung mit einem
Substrat und einem Chromogen erfordert, oder wenn Splitter-Enhancer-Reagenzien
benötigt
werden, bevor vorher nicht nachweisbare Gold-Markierungen sichtbar
gemacht werden. Das markierte Immunreaktanz kann frei sein, mit
der mobilen Phase mitzuschwimmen.
-
Hier,
zum Beispiel, kann sich ein weiteres Immunreaktanz, wiederum spezifisch
für den
Analyten (jedoch für
eine andere reaktive Gruppe an dem Analyten) stromab von der Markierungszone
an den markierten Immunreaktanz-Analyt-Komplex binden. Die Anwesenheit
von Analyt in der Probe kann somit durch die Akkumulierung von markierten
Komplexen am Ort des Immunadsorbens sichtbar gemacht werden. Bei
einem weiteren Merkmal der Vorrichtung, abhängig von der Natur der markierten
Immunreaktanzen, die mobile Phase kann wasser-basiert (z. B. Kochsalzlösung) sein,
kann sie ein Substrat und/oder ein Chromogen für eine Enzym-Markierung enthalten,
oder sie kann ein Splitter-Enhancer-Reagens (wie etwa ein handelsübliches,
für die
Sichtbarmachung histologischer Abschnitte mit kolloidalen Gold-Reagenzien von der
Firma Sigma-Aldrich) enthalten oder eine der Komponenten eines solchen
Reagens, wenn Gold-markierte Immunreaktanzen (oder sogar andere
Nachweis-Reagenzien) für
den Nachweis verwendet werden.
-
Der
Test kann durch den seitlichen Fluss einer Splitter-Enhancer-Lösung empfindlicher gemacht werden.
Dies ermöglicht
die Verwendung kleinerer Goldkolloide, die eine bessere Penetration
und Auflösung
der Membran bieten, dann jedoch verstärkt durch die Ablagerung metallischen
Silbers auf der Oberfläche
des kolloidalen Goldes. Dies dürfte
für das
chemische Labor nützlich
sein wo Anwendungen mit kleinsten Probenvolumina erforderlich sind,
oder wo ultra-sensitive Nachweis-Systeme für den gleichzeitigen Nachweis
multipler Analyte aus einer winzigen Probe erforderlich sind. Die
Goldkonjugate können
auch vor ihrem Einschluss in die erfindungsgemäße Vorrichtung mit Silber beschichtet
werden.
-
Solche
Konjugate können
angefertigt werden, indem man ein titiertes Aliquot eines Gold-markierten
Antikörpers
inkubiert (dialyiert oder ausreichend verdünnt, um Ionen wie etwa Chlorid
zu entfernen), vorzugsweise 5 nm oder weniger, mit einer reaktiven
Splitter-Enhancer-Lösung
für fünf bis 10
Minuten, danach zentrifugiert und dreimal mit gleichen Volumina
destillierten Wassers wäscht,
um überschüssigen Splitter-Enhancer
zu entfernen.
-
Ein
positives Ergebnis bei solchen Immunoassays, die vorab mit Silber
behandelte Goldkonjugate mit mit Silber behandelten Goldkonjugaten
verwenden, stellt sich als eine intensive schwarze Färbung am
Bindungsort dar, womit Empfindlichkeiten erreicht werden, die viele
Größenordnungen
höher liegen
als bei dem ursprünglichen
Goldkolloid. Diese mit Silber behandelten Goldkonjugate können leicht hergestellt
werden und sind sowohl in flüssiger
wie auch getrockneter Form stabil. Kleinere Goldkonjugate von 5
nm oder weniger sind bestens geeignet für die Behandlung mit Silber.
Die Intensität
der Silberbehandlung kann mittels der Konzentration der Reaktanzen,
der Entfernung störender
Salze, der Temperatur (eine Verminderung der Temperatur kann dazu verwendet
werden, die Reaktionsrate zu steuern) sowie der Art des verwendeten
Markierungssystems moduliert werden. Diese mit Silber behandelten Goldkonjugate
können
auch nützlich
sein, wenn ein passives Immunoassay-Format verwendet wird, wie beim
klassischen Protein- und Nukleinsäure-Blotting.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann eine integrierte Steuerung vorgesehen sein, die
anzeigt, wenn der Test fertig gestellt oder erfolgreich ist. Diese
Steuerung (oder eine weitere Steuerung) kann auch als eine Referenz
zu dem mit dem spezifischen Analyten erlangten Testergebnis verwendet
werden. Durch Vergleich der Intensität der Referenz mit dem Testergebnis
erlangt man also eine Anzeige dafür, ob das Testergebnis positiv
oder negativ war. Mittels einer weiteren Vorrichtung also, die die
Intensität
des Ansprechens misst, kann man eine quantitative Messung erlangen,
indem man die Aktivität
der Referenz mit dem Testergebnis vergleicht.
-
Alternativ
kann die Vorrichtung auch ein elektronisches Mittel zum Erkennen
des Ergebnisses, der Beendigung des Tests und für hörbare oder sichtbare schrittweise
Anweisungen zur Durchführung
des Tests enthalten. Durch das Vorsehen derartiger elektronischer
Mittel würde
man dem Benutzer ein größeres Vertrauen
darin geben, den Test korrekt durchzuführen, und die Notwendigkeit
des Durchlesens von Anweisungen vor der Benutzung vermindern. So könnten z.
B. Regionen der Vorrichtung Sensoren enthalten, die Feuchtigkeit
der Fließwege
erkennen und damit den Schritt feststellen, bei welchem sich der
Test während
der Verarbeitung der Probe befindet. Derartige Sensoren könnten mit
sichtbaren oder hörbaren
Anzeigen des Verfahrensschritts verbunden sein und den nächsten Schritt
anzeigen. Derartige Sensoren in der Nachweiszone könnten densitometrische
Messungen beinhalten, die die Menge markierter Antikörper feststellen,
die in der Nachweiszone spezifisch an Analyte gebunden sind, um ein
quantitatives Resultat zu erlangen, oder ein Mittel zum Anzeigen,
wann das Nachweismittel zu der Entwicklerposition gezogen werden
sollte, wie etwa ein Warngeräusch
oder eine sichtbare Anweisung oder ein Signal. Der elektronische
Sensor könnte
auch anzeigen, wenn ausreichend Blut in die Probenaufnahmezone eingebracht
wurde, z. B. durch Feststellen der Veränderung der Leitfähigkeit
des Filters zwischen dem trocknen und dem feuchten Zustand, oder wenn
sich die ionische Zusammensetzung des Filters durch das Hinzufügen polarer
Lösemittel
oder einer Probe verändert,
oder durch Messen einer Veränderung
in der optischen Dichte, wie etwa durch das Hinzufügen einer
gefärbten
Probe wie im Falle eines Blutstropfens, z. B. durch eine Fotozelle.
-
Eine
weitere Ausführungsform
kann ein Mittel zum Messen der Menge der zugeführten Probe beinhalten; dies
könnte
wiederum mit elektronischen Mitteln wie oben beschrieben erfolgen
oder noch einfacher durch Verwendung eines integrierten Kapillarröhrchens
oder dergleichen, das ein bestimmtes Volumen der Probe zur Analyse
in die Vorrichtung "einsaugt".
-
Der
Detektor könnte
auch die Form einer elektronischen Vorrichtung haben, wo die physikalischen
Eigenschaften der ersten Phase, in die die Allergene absorbiert
werden, durch die Bindung der markierten anti-humanen IgE an die
Körper
an dieser Zone in Anwesenheit des Analyten, das heißt allergen-spezifischem
IgE, verändert
wird.
-
Die
vorliegende Erfindung hilft somit, übliche Stolperfallen in der
Immunoassay-Technologie bei bekannten Vorrichtungen auszuräumen.
-
Der
sequenzielle Test erlaubt auch die Verstärkung des Testsystems durch
Verwendung mehrfacher Zugaben von Antikörpern, zum Beispiel kann im
Fall eines empfindlichen Allergietests der erste Antikörper ein
biotinyliertes anti-humanes IgE sein, welches durch einen zweiten,
gold-markierten Anti-Biotin-Antikörper durchgewaschen wird, welcher leicht
für das
bloße
Auge sichtbar ist, wenn er in Form einer diskreten Reaktionszone
am Ort des Immunadsorbens konzentriert ist.
-
Das
Hinzufügen
diskreter Waschschritte, wie es in der Routine sequenzieller Tests üblich ist,
die in klinischen Laboratorien durchgeführt werden, ist für dieses
Testformat auf Grund der kapillaren Natur der Filter und Membranen
nicht notwendig, da der erste Antikörper mit geringer Reaktivität und Vermischung mit
dem zweiten Antikörper
ausgewaschen wird. Das Gleiche gilt für die Probe, die durch das
Einfließen des
primären
Antikörpers
aus dem Filter herausgedrückt
wird.
-
Eine
prinzipielle Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist die Umgehung des Erfordernisses diskreter Waschschritte bei
gleichzeitiger Aufrechterhaltung eines sequenziellen immunometrischen
Testformats und ist insbesondere anwendbar für Vorrichtungen zur Verwendung
zu Hause oder in der Arztpraxis. Dies wird erreicht durch die Konstruktion
und, im Falle der Ausführungsform
mit unbeweglichem Nachweismittel, durch die Geometrie der leitenden
Elemente, die die mobile Phase transportieren. Im Gegensatz zu bekannten
Vorrichtungen ist ein Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung, dass die Probe
in einer Region nahe dem Immunadsorbens eingebracht werden kann.
Dann kann mobile Phase oberhalb der Probe zugeführt werden, entweder durch
Freisetzen aus einem Behältnis
innerhalb des Gerätes
oder zuzuführen
von einem separaten Behälter,
der als Teil der Vorrichtung mitgeliefert wird. Dies umgeht die
Notwendigkeit, dass die mobile Phase in die Zone des gekennzeichneten
Immunoreaktanz eintritt, bevor sie die Probe erreicht.
-
Gemäß der Ausführungsform
der Erfindung mit unbeweglichen Nachweismitteln kann es der mobilen
Phase ermöglicht
werden, gleichzeitig mehr als einen Weg entlang zu wandern. Der
direkteste Weg der mobilen Phase verläuft durch den Punkt der Einführung der
Patientenprobe und in das Immunadsorbens. Gleichzeitig kann die
mobile Phase jedoch auch ein anderes leitendes Element entlang wandern.
Bei dieser alternativen Route wandert die mobile Phase durch eine
Zone gekennzeichneten Immunoreaktanz', welche sich nur in dem feuchten Zustand
frei in dem leitenden Element bewegen kann. Dieser alternative Weg
der mobilen Phase unter Mitnahme der gekennzeichneten Immunreaktanzen führt auch
zu dem Immunadsorbens.
-
Aufgrund
einer möglichen
Differenz in den Fließeigenschaften
der beiden oben genannten Wege ist es daher ersichtlich, dass die
Ankunft der gekennzeichneten Immunreaktanzen am Immunadsorbens zu
einem viel späte ren
Zeitpunkt als das initiale Analyt vom Punkt der Probenzuführung führt effektiv
zu einem sequenziellen immunometrischen Assay. Dieses Verfahren
erlaubt das beschriebene sequenzielle Format, das hier stattfindet
ohne das Erfordernis einer vorherigen Interaktion mit einem gekennzeichneten
Immunreaktanz und ohne diskrete Waschschritte oder separate mehrfache
Zuführungen
von Reagenzien durch den Benutzer.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist die Anzahl der Wege nicht notwendigerweise auf
zwei beschränkt.
Eine weitere Erhöhung der
Anzahl der Wege mit unterschiedlichen Fließeigenschaften bietet eine
größere Flexibilität des Testsystems
und erlaubt den Ablauf komplexerer chemischer Vorgänge oder
erleichtert erforderlichenfalls verbesserte Waschschritte oder chemische
Modifikation Schritte oder Reaktionen mit verschiedenen gekennzeichneten
Immunreaktanzen nacheinander an der festen Phase. Nichtsdestotrotz
muss der Benutzer, unabhängig
von der Anzahl der Fließwege,
nicht mehr tun als am Zuführungspunkt
eine Probe einzubringen und dann den Fluss der mobilen Phase entweder
innerhalb der Vorrichtung oder von einem externen Behältnis zu
initiieren.
-
Der
schnellste Weg muss nicht notwendig zu der Probe führen. Die
vorliegende Erfindung kann auch Anwendung finden bei der Durchführung der Immobilisierung
von Immunreaktanzen während
des Betriebs der Vorrichtung, anstatt dass dies durch den Hersteller
vorbereitet wird.
-
Ein
sequenzielles Format ist besonders nützlich, wenn monoklonale Antikörper nicht
zur Verfügung
stehen. Allgemein bieten polyklonale Antikörper bei Immunoassays potenziell
höhere
Empfindlichkeit und können
stabiler sein als monoklonale Antikörper, wenn sie markiert sind.
Es ist wichtig, wenn man wie oben beschrieben eine nicht-sequenzielle
Assay-Vorrichtung benutzt, dass der markierte Antikörper für ein Epitop
spezifisch ist, während
das immobilisierte Immunreagens für ein räumlich Verschiedenes entferntes
Epi top spezifisch ist. In manchen Fällen würde dies jedoch die Verwendung
polyklonaler Antikörper
verbieten, wegen der Möglichkeit
einer Reaktion mit den Epitopen, die von dem immobilisierten Immunreaktanz
an dem Immunadsorbens erkannt werden, wodurch die Epitope effektiv
gegenüber
dem Immunadsorbens maskiert werden, mit der Folge verminderter Bindung
und damit einer Reduzierung des Signals.
-
Ein
sequenzielles Testformat beseitigt diese Probleme und ist besonders
nützlich,
wenn das Analyt ein Immunglobulin ist oder wenn nur polyklonale Antiseren
zur Verfügung
stehen. Das Immunadsorbens ist normalerweise immobilisiertes Allergenextrakt.
Spezifische Allergentests können
jedoch auch durchgeführt
werden, indem man einen immobilisierten anti-humanen IgE-Antikörper und
markierte Allergene verwendet. Der mehrfache gleichzeitige Nachweis
von gegen ein Allergen gerichteten IgE- und IgG-Antikörpern könnte auch
durchgeführt
werden, indem man dieses Verfahren mit markierten Allergenen modifiziert.
Bei diesem Verfahren kann der Detektor zum Beispiel zwei Zonen beinhalten:
- (a) eine Zone, die einen immobilisierten anti-IgE-Antikörper enthält; und
- (b) ein immobilisiertes IgG-bindendes Reagens wie etwa Protein
A oder anti-IgG-Antikörper.
-
Anderes
als viele immunometrischer Asssays, wo das Immunadsorbens eine Zubereitung
gereinigter Antikörper
ist, liegt im Falle von Allergen-Extrakten üblicherweise
eine komplexe. Mischung einer Vielzahl von Proteinen vor. Zum Beispiel
enthalten Hausstaubmilben-Extrakte viele Antigene und Allergene,
die unterschiedlich mit Blutproben von verschiedenen Personen regieren.
Hier kann eine vorherige Reaktion des in einer kapillaren Blutprobe
vorhandenen IgE mit markierten anti-humanen IgE-Antikörpern, wie
sie bei bekannten Geräten
zur Durchführung
von Tests zu Hause oder in der Praxis auftreten würde, möglicherweise
Interaktionen mit dem Allergosor bens fester Phase hemmen, auf Grund
der Orientierung des anti-IgE/IgG-Komplexes, der die Bindung dieses Komplexes
an das Immunadsorbens stört.
Ein besonderes Merkmal der meisten in Laboratorien durchgeführten Allergietests
ist, dass sie ein sequenzielles Testformat durchführen und
damit dieses Problem räumlicher
Behinderung umgehen, in dem sie dem IgE in der Patientenprobe erlauben, sich
zuerst an das Allergen fester Phase zu binden. Dann kann eine polyklonal
markierte anti-humane IgE-Antikörper-Zubereitung im Überschuss
verwendet werden, um eine quantitative Abschätzung des gebundenen spezifischen
IgE sicherzustellen.
-
Ein
Hauptvorteil bei der Verwendung des sequenziellen Formats bei einer
diagnostischen Einrichtung liegt bei der Enzöliakie. Hier ist die Anwesenheit
von Immunglobulin A (IgA)-Antikörpern
gegen das Hirnprotein Gliadin im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten,
zum Beispiel Speichel, ein Anzeichen für Enzöliakie. Der Anteil von Gliadin-spezifischem
IgA im Verhältnis
zum Gesamt-IgA in Blutproben von Personen mit Enzöliakie kann
jedoch sehr klein sein. Dies bedeutet, dass zum Nachweis von Gliadin-spezifischem
IgA ein empfindliches Nachweis-System sowie ein großes Probenvolumen
erforderlich ist, wenn man das Signal, dass man von einer Gliadin-spezifisches
IgA enthaltenden Probe erhält, von
Blutproben unterscheiden will, die solches nicht enthalten. Die
Erhöhung
der Probengröße entspricht einer
Erhöhung
des gesamten IgA, was dazu führt, das
bekannte nicht-sequenzielle Tests zu empfindlich sein können, da
die Gefahr besteht, dass auf Grund des vergrößerten Probenvolumens und der
höheren Pegel
an Gesamt-IgA die hohe Pegel nicht-Gliadin-spezifischen IgA den
Nachweis des Gliadin-spezifischen
IgA durch Sättigung
der markierten anti-humanen IgA-Antikörper verdrängt.
-
Die
Verwendung eines sequenziellen Tests, bei dem man zunächst erlaubt,
dass sich das humane anti-Gliadin-spezifische IgA an das immobilisierte Gliadin-Immunadsorbens
bindet, um danach in einer separaten Stufe mit dem markierten anti-humanen IgA
zu reagieren, führt
zu spezifischeren, empfindlicheren Tests mit einer verminderten
Gefahr falscher negativer Ergebnisse, die auf Grund der Sättigung des
Testsystems mit dem in der Blutprobe vorhandenen nicht-Gliadin-spezifischen
IgA auftreten. Es ist auch möglich,
dass die mobile Phase dafür
verwendet wird, ein langsames oder graduelles Freisetzen markierter
Reaktanzen aus einer Matrix zu bewirken, was im Zusammenspiel mit
dem oben beschriebenen sequenziellen Testformat zu einer noch klareren Trennung
von Immunreaktanzen während
des Betriebs der Vorrichtung führt.
Im Falle von spezifischem IgA gegen Gliadin zum Beispiel wäre der Test relativ
unempfindlich, wenn man nicht vor dem Nachweis nicht-spezifisches
IgA mit einer anti-IgA-Markierung entfernen würde, was man bei bekannten
Immunoassays im Labor durch ein sequenzielles Testformat umgeht,
das einen Waschschritt zum Entfernen nichtspezifischer Immunreaktanzen
vor dem Hinzufügen
markierter Antikörper
beinhaltet. Bei diagnostischen Einrichtungen jedoch, die zur Verwendung
zu Hause oder in der Praxis konzipiert sind, sind diskrete Waschschritte
unpraktisch und mühsam
und stellen eine mögliche
Fehlerquelle dar.
-
Das
Ergebnis hängt
von einer Anzahl von Faktoren ab, darunter: die manuelle Intensität des vom
Benutzer durchgeführten
Waschens; die für
den Waschschritt verwendeten Reagenzien können unterschiedlich sein,
insbesondere wenn Leitungswasser verwendet wird, zum Beispiel kontaminierende Stoffe,
mikrobiologische Substanzen, Partikel, Kräfte und Temperaturen. Um die
Notwendigkeit für
einen Waschschritt zu umgehen, sollte die Vorrichtung erforderlichenfalls
Mittel zum Entfernen nicht-spezifischer Reaktanzen enthalten. Es
ist daher eine weitere Ausführungsform
der hier beschriebenen Vorrichtung, dass, soweit erforderlich und
abhängig
von dem zu messenden Analyten, ein Mittel für das langsame Freisetzen oder
die Desorption der markierten Immunreaktanzen ein integraler Bestandteil
der Operation sein sollte. In der Praxis könnte ein derartiger Mechanismus
für das
langsame Freisetzen die Form einer mechanischen Barriere, zum Beispiel
ein Gel oder ein einkapselndes Material, oder eines chemischen Mittels
wie Adsorption an einer geladenen Matrix wie etwa einem wie Ionenaustausch-Material oder
einer Affinität
absorbiert durch eine spezifische Bindungseigenschaft des markierten
Reaktanz mit einem immobilisierten Liganden und Desorption durch
eine geeignete Veränderung
der Ionenstärke, der
Wasserstoffionenkonzentration, oder Zuführung von Verbindungen, die
Bindungen zwischen Ligand und Reaktanz antagonisieren. Im letzteren
Fall kann das langsame Freisetzen dadurch gesteuert werden, dass
das immobilisierte markierte Analyt von einer Umgebung umgeben ist,
die Bindungen förderte,
wobei die mobile Phase diese Bindungen antagonisiert. Dies erzeugt
im Wesentlichen einen Gradienten durch die Matrix, die die absorbierte
markierte Reaktanz hält,
bis schließlich
bei einer bestimmten Gradientenstärke die Freisetzung des absorbierten
Materials beginnt. Vor der Freisetzung des markierten Reaktanz erlaubt
das Hindurchwandern der mobilen Phase durch die ab Adsorptionszone
für die
Probe die spezifische Bindung des für den immobilisierten Liganden
spezifischen humanen Antikörpers
in der Nachweiszone, ohne störende
Einflüsse
von den markierten Reaktanzen mit nicht-spezifischen Analyten.
-
Die
Translokation der mobilen Phase einschließlich der Immunreaktanzen kann
erreicht werden durch Bewegung entlang Kammern oder Kanälen, die
vom Korpus der Vorrichtung selbst gebildet werden, spezifischen
Kapillarröhrchen,
-kanälen
und an -rinnen oder von Behältnissen
mit flussbegrenzenden Öffnungen
oder Bewegung entlang Dochten durch Kapillarkräfte. Derartige Dochte können aus synthetischen
oder natürlichen
Materialien bestehen. Die Auswahl des geeigneten Materials für die Translokation
hat sich danach zu orientieren, dass keine passive Adsorption der
Immunreaktanzen in diese Leitungselemente auftritt; das Material
kann behandelt sein, um Ablagerung der Immunreaktanzen an der Oberfläche der
Leitungselemente zu verhindern. Soweit erforderlich, können die
für die
Leitungselementen verwendeten Materialien entweder behandelt werden,
bevor die Vorrichtung zu sammengebaut wird, und/oder während des
Betriebs des Gerätes. Zum
Beispiel sollten keine blockierenden Komponenten wie etwa irrelevante
Proteine, Polymere, Detergenzien und sonstige routinemäßig verwendete,
in der Praxis der Konstruktion von Immunoassays üblichen Blockierungsmittel
vorhanden sein. Der Hauptzweck der kapillaren Elemente besteht darin, einen
Fließweg
für die
mobile Phase zur Verfügung zu
stellen und Abschnitte der Vorrichtung, die Immunreaktanzen oder
Nachweis-Reagenzien enthalten, die vor der Durchführung des
Testes separat gehalten werden müssen,
zu verbinden und das Hinzufügen
von Reagenzien zu dem Immunadsorbens zu verschiedenen Zeiten zu
ermöglichen.
Die Verwendung von Mitteln zum Modifizieren der Viskose kann der
Einstellung der Translokationsrate ebenso wie der Fließeigenschaften
der Leitungselemente dienen. Leitungselemente können auch derart modifiziert
werden, dass sie chemische/immunologische Wechselwirkungen mit der
mobilen Phase und ihren Inhaltsstoffen in der betreffenden Region
der Vorrichtung ausführen.
Die Auswahl des Materials für
die Leitungselemente ist damit von großer Wichtigkeit für den erfolgreichen
Betrieb der Vorrichtung.
-
Eine
wichtige Ausführungsform,
mit der ein sequenzieller Test durch eine einmalige Gabe von mobiler
Phase zu Beginn des Betriebs der Vorrichtung durchgeführt werden
kann, besteht daran, eine Anzahl getrennter Leitungselemente vorzusehen.
Bei einem derartigen System treten Leitungselemente aus einem einzelnen
Reservoir heraus, welches chemisch oder immunologisch aktive Bestandteile
enthalten kann, aber nicht muss, je nach Erfordernis des jeweiligen
nachzuweisenden Analyten. Ein einziges Reservoir als Quelle einer
Anzahl von Leitungselementen erlaubt es, dass verschiedene Reagenzien an
verschiedenen Positionen und zu gesteuerten Zeitintervallen der
Testzone zugeführt
werden. Das heißt,
dass ein differenziertes Variieren der Fließeigenschaften der jeweiligen
Leitungselemente zu unterschiedlichen Flussraten führt und
damit zur Ankunft verschiedener Reagenzien beim Immunadsorbens zu
unterschiedlichen Zeiten. Der Fluss der mobilen Phase und der Reaktanzen
durch ein bestimmtes Leitungselement kann auch moduliert werden durch
die Zusammensetzung der Leitungselemente-Matrix oder auch durch
Hinzufügen
von Mitteln zum Modifizieren des Flusses zu den jeweiligen Leitungselementen
zur Veränderung
der Viskosität. Eine
wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Umgehung des Erfordernisse von
Moderatoren für
Nachweis-Reagenzien. Zum Beispiel können Reduzierungsmittel eingesetzt
werden, um eine vorzeitige Chromogen-Bildung zu verhindern, wenn
man mit Meerrettich-Peroxidase markierte Immunreaktanzen verwendet.
-
Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
kann eine unbegrenzte Zahl von Hinzufügungen von Reagenzien erlauben,
obwohl sie alle von einem einzigen Reservoir mobiler Phase initiiert
werden. Dies vergrößerte deutlich
den potenziellen Nutzen derartiger Ein-Schritt-Vorrichtungen, da
das Problem des sequenziellen Hinzufügens von Reagenzien überwunden
werden kann. Das multiple Leitungselemente-System umgeht das Erfordernis
für diskrete Waschschritte
bei derartigen Vorrichtungen und erlaubt die Messung eines breiteren
Dynamikbereiches von Analyten und Konzentrationen bei gleichzeitiger Eliminierung
der Gefahr von Hochdosis-Hakeneffekten, welche bei manchen nicht-sequenziellen
immunometrischen Assays auftreten können, die keinen Waschschritt
vorsehen, um ungebundene Analyte zum immobilisierten Immunreaktanz
solider Phase zu entfernen.
-
Die
multiplen Leitungselemente können
als eine Folie (ein Blatt) in zwei Dimensionen oder als eine dreidimensionale
Struktur angeordnet werden, wobei mehr als ein "Blatt" von Leitungselementen durch "isolierende" Schichten eines
Materials getrennt werden, wodurch ein Sandwich von Leitungselementen
gebildet wird. Für
manche Analyte kann die optimale Konfiguration der Vorrichtung eine
Kombination der beiden Formate sein, insbesondere wenn mehr als
ein Analyt gleichzeitig nachgewiesen werden soll. In jedem Fall
erlaubt eine derartige Konstruktion den Ablauf einer komplexen Serie chemischer
und immunologische Reaktionen zu unterschiedlichen Zeiten und an
unterschiedlichen Orten, jedoch schließlich zusammengeführt in der
korrekten Abfolge an der Nachweiszone, um das erforderte Ergebnis
zu liefern.
-
Das äußere Erscheinungsbild
der Vorrichtung (1)
beinhaltet eine Aufnahme zum Zuführung
der mobilen Phase (1), eine Zone zum Hinzufügen der
Probe des Benutzers, die den Analyten enthält (2), welche auch
in (1) integriert sein kann, wobei sowohl (1)
als auch (2) nahe der Oberfläche des Gehäuses (3) der Vorrichtung
liegen. Die Nachweiszone (4) liegt innerhalb des Korpus' (3) und
kann durch ein transparentes Fenster geschützt sein. Die Nachweiszone
enthält
das Immunadsorbens, an welchem das Ergebnis zu beobachten ist.
-
Eine
wichtige Ausführungsform
der Vorrichtung nach 2 ist
die Konstruktion der Leitungselemente. Im Prinzip besteht die Vorrichtung
aus Leitungselementen verschiedener Weglängen und Fließeigenschaften.
Der schnellste und direkteste Weg für die mobile Phase entsteht
am Punkt der Reservat-Zuführung
(1), wo die mobile Phase hinzugefügt wird, und führt zur
Probenzuführungszone
(2), die am Immunadsorbens oder nahe diesem liegt. Die Geometrie
der festen Phase, ebenso wie die zur Konstruktion des Reservoirs
(1), des Ausgusses (8), der Leitungselemente (6)
und des Immunadsorbens (4) verwendeten Materialien, sind
so gewählt,
dass sie den Fluss in Richtung zum Ausguss (8) potenzieren. Die
Probenzuführungzone
führt über ein
Filter 9 zum Entfernen von nicht IgE-Komponenten zu dem
immobilisierten Reaktanz am Immunadsorbens (5). Die Zone
für markierte
Antikörper
(7) ist innerhalb der Leitungselemente frei beweglich,
wenn mobile Phase vom Reservoir vorhanden ist, und kann direkt zum Immunadsorbens
führen
oder durch die Probenzone hindurchtreten, wie in 2 gezeigt. Die Zeit, die die markierten
Reaktanzen benötigen,
um das Immunadsorbens zu erreichen, ist länger als die der Probe. Diese
Konfiguration ist einfach aus zur Verfügung stehenden Materialien
herzustellen und bietet ein sequenzielles Testformat im Wesentlichen
auf Grund des Unterschieds in den Ankunftszeiten der Probe und der
markierten Antikörper
oder weiteren Reagenzien an der Zone des immobilisierten Immunreaktanz.
-
Bezug
nehmend auf 3 wird eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung repräsentiert
durch ein Reservoir (1), das die mobile Phase enthält, einen
ersten Fließweg
mit einer Probenzuführungzone
(2), einem Filter (9) zum Entfernen von nicht
IgE-Komponenten sowie einem zweiten Fließweg mit einer Zone für markierte
Antikörper
(7). Weiterhin ist eine bewegliche Nachweiszone (4)
vorgesehen, die einen Ausguss (eine Senke) (8) umfasst. Die
Nachweiszone (4) ist im Zusammenhang mit dem ersten Fließweg gezeigt.
-
Bezug
nehmend auf 4 ist die
Vorrichtung nach 3 gezeigt,
wobei die Nachweiszone (4) hier im zweiten Fließweg liegt.
-
Eine
Begrenzung auf zwei Leitungselemente, wie hier gezeigt, ist nicht
erforderlich; es kann eine Vielzahl vorgesehen sein, wann immer
eine komplexere Chemie von Reaktanzen gewünscht wird. Diese Anordnung
kann auch einfach extrapoliert werden, um eine dreidimensionale
Struktur zu erhalten, wobei die Leitungselemente mit verschiedenen
physikalischen Eigenschaften aufeinander gestapelt werden, bevor
das Immunadsorbens angeschlossen wird.
-
Die
Erfindung wird nachstehend detaillierter unter Bezugnahme auf die
folgenden erprobten Beispiele beschrieben.
-
Beispiel 1
-
Ein
Stück Nitrozellulose
mit Kunststoffrücken (SSLU)
5 mm × 60
mm der Firma Schleicher und Schuell wurde wie oben beschrieben präpariert.
Drei Zeilen Allergene wurden in die Nitrozellulose eingedruckt,
jeweils mit Abständen
von 10 mm, entsprechend Allergengemisch nach Timothy Grass/Cocksfoot
(2 mg/ml), Katzenallergen (10 mg/ml, Bayer) und Dermatophagoides
Pteronyssimus-Extrakt (20 mg/ml, Smithkline Beecham). An das proximate Ende
der Nitrozellulose oder ein Stück
GF/A-Glasfaserfilterpapieren (Whatman, 5 mm × 35 mm) angebracht, und ein
Stück CHR17
Whatman, 5 mm × 40 mm)
wurde mittels Lösungsmittelklebstoff
an das distale Ende ein anderer Kundststoffträger befestigt, mit einer Überlagerung
von 5 mm auf die Oberfläche
der Nitrozellulose. Eine Probe von 25 μl dreier Serum-Pools RAST Grad
3 bis 4 positiv auf entweder Graspollen, Katzen- oder Milbenallergene
oder ein normaler Ziegenserum-Pool wurden versetzt mit einem gleichgroßen Volumen
frischer humaner roter Blutzellen eines normalen Spenders und als
ein 50 μl-Aliquot
zur Mitte eines GF/A-Filters hinzugefügt. Sobald dieses absorbiert
war, wurde das freie Ende des Filters in Kontakt mit 200 μl 50 mM Tris-gepufferter
Kochsalzlösung
mit einem pH-Wert 7,4 gebracht, die 0,5 μg biotinyliertes Ziegen-anti-humanes
IgE (Vector Laboratories) enthielt, und 1 Stunde lang absorbieren
gelassen. Das freien Ende des Filters wurde dann in Kontakt gebracht
mit 300 μl
des oben genannten Puffers, der 30 μl Gold (40 nm)-markierten Ziegen-Antibiotins
(British Biocell International) enthielt, und absorbieren gelassen.
Nach 30 Minuten wurden positive Ergebnisse beobachtet, durch die Anwesenheit
rosafarbiger/roter Linien entsprechend den jeweiligen Allergene
aus den Serum-Pools, außer
bei dem normalen Ziegenserum, welches als negative Kontrolle diente,
wo keine Linien für
irgendwelche der getesteten Allergene sichtbar wurden.
-
Beispiel 2
-
Ein
Stück Nitrozellulose
(5 × 30
mm) von Schleicher und Schuell wurde wie oben beschrieben mit Milbenextrakt
imprägniert.
Ein Stück
GF51 (Schleicher und Schuell, 5 × 25 mm) wurde mit einer Überlappung
von 5 mm an der Nitrozellulose angebracht, und beide Komponenten
wurden mit einem Kunststoffträger
verklebt. Dann wurde ein 25 μl
Aliquot RAST Grad 4 positives Se rum von einem Hausstaubmilben-positiven
Patienten-Pool zu dem GF51 hinzugefügt, in einer Region, die zuvor
mit 0,5 μg
biotinyliertem anti-humanem Ziegen-IgE in 10 μl Tris-gepufferter Kochsalzlösung imprägniert worden war.
Dann wurde ein 100 μl
Aliquot Gold (40 nm)-markierten Ziegen-Antibiotins in Tris-Puffer
mit 1% w/v Rinder-Serumalbumin tropfenweise auf den GF51-Filter aufgebracht.
Innerhalb von 30 Minuten konnte ein positives Band entsprechend
einer Reaktion des Serums mit dem Milbenextrakt beobachtet werden.
-
Mit
Ausnahme der mobilen Phase bewahrt man die Reaktanzen wohl am besten
innerhalb der Vorrichtung in fester Form auf, um die Stabilität zu verbessern,
da es erwünscht
ist, dass die Vorrichtung unter Raumbedingungen gelagert wird. Biologische Komponenten
sind dafür
bekannt, dass sie sich in Lösung
leicht abbauen, wohingegen die Lagerung in einem getrockneten oder
chemisch mit einer Matrix verbundenen Zustand einen gewissen Schutz
gegen die ihnen immanente Instabilität bietet. Ein weiteres Problem
mit biologischen Materialien (insbesondere Proteinen) ist ihre Tendenz
zur unspezifischen Adsorption an Matrix-Oberflächen wie etwa Glas, Papier
und Kunststoffen. Diese Wechselwirkungen müssen minimiert werden, wenn
die Reaktanzen in der Vorrichtung sinnvoll eingesetzt werden sollen. Ein
Verfahren besteht darin, die die Reaktanzen enthaltende Matrix mit
einem unspezifischen Blockierungsmittel wie oben beschrieben vorzubehandeln. Ein
anderes Verfahren kann darin bestehen, sie chemisch an die feste
Phase zu binden, jedoch ein Freisetzungsmittel vorzusehen, dass
die Reaktanzen aus der festen Phase in die mobile Phase freisetzt. Eine
Möglichkeit
des Hinzufügens
der Reaktanzen ist in flüssiger
Form auf die nicht-adsorbierende Matrix mit anschließender Entfernung
der Flüssigkeit
und damit Antrocknen als Film. Die Reaktanzen können auch in Form eines Gels
(wie etwa Agarose oder Gelatine) hinzugefügt werden, oder einfach mit
einem Detergens auf die Matrix aufgetrocknet werden. Die Komponenten
der Vorrichtung können
auch Konservierungsmittel enthalten, um einen Abbau des Produkts
durch mikro biologische Organismen zu verhindern und einen Schutz
gegen schädigende
Umwelteinflüsse,
z. B. Temperatur, Licht oder Feuchtigkeit, zu bieten.