DE10201637A1

DE10201637A1 - Verfahren zur Herstellung einer Mais-Kalluskultur

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Publication number: DE10201637A1
Application number: DE2002101637
Authority: DE
Inventors: Ralph Bock; Stephanie Ruf
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2002-01-17
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2003-08-07

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der pflanzlichen Zellkultur sowie deren Regeneration zu vollständigen Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Etablierung eines Gewebekultursystems für Mais sowie Verfahren zur Regeneration vollständiger Maispflanzen aus Blattgewebe.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der pflanzlichen Zellkultur sowie deren Regeneration zu vollständigen Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Etablierung eines Gewebekultursystems für Mais sowie Verfahren zur Regeneration vollständiger Maispflanzen aus Blattgewebe.
Die zunehmende weltweite Knappheit an Nahrungsmitteln für eine ständig wachsende Weltbevölkerung stellt auch für die moderne Biotechnologie eine große Herausforderung dar. Zur Befriedigung dieses immer stärker wachsenden Bedarfs an Nahrungsmitteln sowie zur Verfügungstellung modifizierter Kulturpflanzen mit verbesserten oder neuen Eigenschaften sind bereits einige Verfahren zur in vitro Kultivierung und Regeneration pflanzlichen Materials etabliert worden.
Einer der ersten und wichtigsten Schritte in diesen Verfahren ist die Gewinnung und erfolgreiche Kultivierung von pflanzlichem Material, welches in Bezug auf die spätere Verwendung transformations- und regenerationskompetent sein sollte.
Während zahlreiche zweikeimblättrige Pflanzen bereits aus Blattmaterial regeneriert werden können, besteht für einkeimblättrige Pflanzen, wie insbesondere für Vertreter der Graminaceae, nach wie vor ein großer Bedarf an der Bereitstellung geeigneter Techniken zur Herstellung, Kultivierung und Regeneration entsprechenden pflanzlichen Materials (s. z. B. G. Hansen und M. S. Wright, Recent advances in the transformation of plants, Trends Plant Sci., 4, S. 226 bis 231 (1999)).
Im Hinblick auf Mais als einem der wichtigsten Vertreter dieser Pflanzengruppe stellen unreife zygotische Embryonen derzeit das am meisten verlässliche Ausgangsmaterial zur Etablierung von regenerations- und gewünschtenfalls transformationskompetenten Kalluskulturen sowie für die Bereitstellung von abgeleiteten Zellsuspensionen oder Protoplasten dar (s. z. B. C. L. Armstrong, The first decade of maize transformation: a review and future perspectives; Maydica, 44, S. 101 bis 109 (1999)). Die Anwendung dieser Techniken ist jedoch äußerst arbeitsintensiv und zeitaufwendig sowie auf eine begrenzte Anzahl von Genotypen beschränkt. Ferner besteht gewöhnlich das Erfordernis der fortgesetzten Kreuzung von Inzuchtlinien, um eine kontinuierliche Quelle an undifferenzierten bzw. unreifen Embryonen bereitzustellen (s. z. B. R. Bilang et al., Transformation of cereals, Genetic Engineering, 21, S. 113 bis 157 (1999)).
Für die Kallusherstellung aus Apikalmeristemen (SAM - shoot apical meristem) von Maistrieben wurde ein alternatives Verfahren entwickelt, bei dem entweder kultivierte Triebapices oder unreife Blütenanlagen verwendet werden (H. Zhong et al., The competence of maize shoot meristems for integrative transformation and inherited expression of transgenes, Plant Physiol., 110, S. 1097 bis 1107 (1996)). Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass es nur sehr wenig Ausgangsmaterial für die Kultivierung liefert und daher für die meisten Anwendungsgebiete eher ungeeignet ist.
Vereinzelt wurden auch Fortschritte erzielt bei der Verwendung von unreifem Blattgewebe für die Etablierung von Gewebekultursystemen, wobei deren Anwendbarkeit jedoch auf Hafer und Gerste beschränkt ist (C. Gless et al., Establishment of a highly efficient regeneration system from leaf base segments of oat (Avena sativa L.), Plant Cell Rep., 17, S. 441 bis 445 (1998); T. P. Pasternak et al., Embryogenic callus formation and plant regeneration from leaf base segments of barley (Hordeum vulgare L.), J. Plant Physiol., 155, S. 371 bis 375 (1999)).
Demgemäß besteht nach wie vor ein Bedarf an der Bereitstellung eines reproduzierbaren, auf Blattgewebe basierenden Systems zur Erzeugung einer Mais-Kalluskultur sowie für die anschließende Regeneration von Maispflanzen unter Verwendung dieser Kalluskultur.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch Bereitstellung des Verfahrens gemäß Hauptanspruch.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Mais-Kalluskultur bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Gewinnung von Blattgewebe aus dem Coleoptilbereich eines Keimlings,
b) Induktion der Kallusbildung durch Kultivierung des in Schritt (a) gewonnenen Blattgewebes in Anwesenheit von Prolin, Silbernitrat und mindestens einem Auxin.

Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Unteransprüchen dargestellt.
Für den Fachmann ist klar, dass sowohl die Keimung als auch die Präparation und anschließende Kultivierung des Blattgewebes zur Vermeidung von Kontaminationen unter sterilen Bedingungen erfolgen sollte.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Blattgewebe aus der Blattbasis im unteren Abschnitt des Coleoptilbereiches gewonnen und weist vorzugsweise eine überwiegend weißliche Färbung bzw. einen überwiegend undifferenzierten Status auf. Dieses erfindungsgemäß besonders geeignete Segment eines Maiskeimlings (s. Fig. 1) hat gewöhnlich eine Länge von bis zu 5 mm, wobei besonders bevorzugt die untersten 2 bis 3 mm verwendet werden.
Das Segment wird anschließend zu individuellen Blattstückchen verarbeitet und in bzw. auf ein die Kallusbildung induzierendes Medium überführt.
Es wird darauf hingewiesen, dass sowohl für die Keimung als auch für die anschließenden Phasen des erfindungsgemäßen Verfahrens etablierte Standardmedien eingesetzt werden können, wobei die jeweiligen Medien für die Schritte der Kallusbildung und der Induktion des Spross- und/oder Wurzelwachstums jedoch erfindungsgemäß zu modifizieren sind.
Die vorliegend verwendeten Begriffe "Medium" und "Medien" beziehen sich auf eine feste, halbfeste oder flüssige Zusammensetzung, welche Nährstoffe umfasst, die für die Unterstützung der in vitro Kultivierung vom Maissamen über die Kalluskultur bis zur Regeneration vollständiger Pflanzen und deren weiterer Kultivierung erforderlich sind. Die in einem solchen Grund- oder Basalmedium enthaltenen Inhaltsstoffe sind zumeist in deionisiertem und destilliertem Wasser gelöst.
Ein Kulturmedium für Pflanzen umfasst eine Vielzahl von Inhaltsstoffen, deren relative und absoluten Anteile gezielt auf den jeweiligen Verwendungszweck abgestimmt werden müssen. Eine "1X-Formulierung" bezieht sich daher auf jedwede wässrige Lösung, in der die gewünschten Inhaltsstoffe in den jeweils geeigneten Anwendungskonzentrationen enthalten sind. Beispielsweise kann sich die Angabe "1X-Formulierung" auf ein Komplettmedium oder auf jedwede Untergruppe von Inhaltsstoffen für ein solches Komplettmedium beziehen. Die Konzentration eines Inhaltsstoffes in einer 1X-Formulierung entspricht somit in etwa der Konzentration dieses Stoffes, wie sie in einer Formulierung zur Aufrechterhaltung oder Kultivierung pflanzlicher Zellen oder Geweben in vitro angetroffen wird. Jeder in einer 1X-Formulierung enthaltene Inhaltsstoff liegt in einer Konzentration vor, die im wesentlichen derjenigen entspricht, wie sie in einem Kulturmedium für pflanzliches Material angetroffen wird. Beispielsweise enthält das ML-1 Medium nach Kemper et al. (1996) neben anderen Inhaltsstoffen 463,0 mg/l Ammoniumsulfat und 2830 mg/l Kaliumnitrat. Eine 1X- Formulierung dieser Mediumbestandteile enthält diese Inhaltsstoffe daher in den angegebenen Konzentrationen in Lösung. Die Konzentrationen von Inhaltstoffen in einer 1X- Formulierung eines für pflanzliches Material geeigneten Kulturmediums sind dem Fachmann bekannt (vgl. z. B. Vasil und Thorpe, Hrsg., Plant Cell and Tissue Culture, Dodrecht, Netherlands: Kluwer Academic Publishers (1995)). Die Osmolarität und/oder der pH-Wert können sich jedoch zwischen einer 1X-Formulierung und einem Kulturmedium unterscheiden, was insbesondere dann der Fall ist, wenn die 1X-Formulierung weniger Inhaltsstoffe umfasst.
Eine 0,1X-Formulierung ist daher eine 10-fache Verdünnung einer 1X-Formulierung und enthält die Inhaltsstoffe in einer 10-fach geringeren Konzentration. Das gleiche gilt analog z. B. für eine 0,5X-Formulierung.
Die Inhaltsstoffe der erfindungsgemäß geeigneten Grundmedien umfassen i. d. R. anorganische Salze, Vitamine, Zucker wie Sucrose, Aminosäuren wie Glycin, und Verfestiger wie Agar, Agarose, Phytagel und dergleichen. Jeder dieser Inhaltsstoffe kann käuflich erworben werden, z. B. bei Sigma (Samt Louis, Missouri, USA).
Eine beispielhafte Aufzählung geeigneter Kulturmedien, die für die Zubereitung der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Medien verwendet werden können, umfasst MS-Medium (T. Murashige und F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Physiol. Plant., 15, S. 493 bis 497 (1962)), ML-1 Medium (E. L. Kemper et al., Effect of microprojectile bombardment parameters and osmotic treatment on particle penetration and tissue damage in transiently transformed cultured immature maize (Zea mays L.) embryos, Plant Sci., 121, S. 85 bis 93 (1996)), N6-Medium (C. C. Chu, Scientia Sinic., 18, S. 659 (1983)), Anderson's Pflanzenkulturmedien, CLC-Basalmedien, Gamborg's Medien, und dergleichen. Die Formulierungen dieser und weiterer geeigneter Grundmedien können z. B. den Produktbeschreibungen von GIBCO BRL (Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland, USA) sowie den Katalogen für pflanzliche Zellkulturen von Sigma (St. Louis, Missouri, USA) oder Duchefa Biochemie BV (Niederlande) entnommen werden.
Für den Fachmann ist klar, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Medien einen oder mehrere zusätzliche Komponenten enthalten können, wie z. B. Mittel zur Selektion (wie Farbstoffe, Antibiotika, Enzyme, Substrate etc.), Filterstoffe (wie Kohle), Aminosäuren, Salze, Polysaccharide, Ionen, Detergenzien, Stabilisatoren, und dergleichen.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Keimung des Maissamens in an sich bekannter Weise in einer 0,1X-Formulierung des Mediums nach Murashige und Skoog (a. a. O., 1962) mit der Abweichung, dass die Konzentrationen an MgSO₄ 370 mg/l (1X) und an Sucrose 10 g/l betragen, und dass die Formulierung 2,0 g/l Phytagel (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) enthält.
Nach erfolgter Keimung wird der Keimling bevorzugt der zuvor beschriebenen Präparation zugeführt, wobei auch andere Präparationen angewendet werden können, solange im Ergebnis dasselbe Blattmaterial erhalten wird. Anschließend wird das zubereitete Blattmaterial auf ein Grundmedium (z. B. ML1 nach Kemper et al., a. a. O., 1996) überführt, welches für die effiziente Induktion der Kallusbildung die Inhaltsstoffe Prolin, Silbernitrat und mindestens ein Auxin erfindungsgemäß in geeigneten Konzentrationen enthält.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das für die Induktion der Kallusbildung erfindungsgemäß erforderliche mindestens eine Auxin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Indolylessigsäure (IAA), 3-Indolylbuttersäure (IBA), 3-Indolylessigsäuremethylester (3-Methylindolylacetat), 3-Indolylacetyl-L-Alanin (IAA-L-Alanin), 3-Indolylacetyl-L-Asparaginsäure (IAA-L-Asparaginsäure), 3-Indolylacetyl-L-Phenylalanin (IAA-L-Phenylalanin), 3-Indolylacetylglycin (IAA-Glycin), 3- Indolylbutyryl-β-Alanin (IBA-Alanin), 3-Indolylpropionsäure (IPA), 5,6-Dichlor-3-Indolylessigsäure (5,6-Cl₂-IAA), p-Chlorphenoxyessigsäure (4-CPA), 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4- D), 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure (2,4,5-T), Beta-Naphtoxyessigsäure, Alpha-Naphtalinessigsäure (NAA), Phenylessigsäure (PAA), 4-Amino-3,5,6-trichlorpicolinsäure, 2,3,5-Trijodbenzoesäure (TIBA), Chlorogensäure, Centrophenoxin, und Kombinationen davon, wobei die Auswahl von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) besonders bevorzugt ist.
Die für die Kallusinduktion erfindungsgemäß geeignete Auxinmenge wird in einem Konzentrationsbereich von 0,5 bis 3,0, vorzugsweise von 0,7 bis 2,5, und besonders bevorzugt von 1,0 bis 2,2 mg/l eingestellt, während die geeignete Prolinmenge in einem Konzentrationsbereich von 500 bis 4000, vorzugsweise von 600 bis 3450, und besonders bevorzugt von 690 bis 3250 mg/l liegen sollte. Mit den oben genannten, relativ geringen Mengen an Auxin gelang es, vornehmlich den gewünschten festen, eher gelblichen Kallustyp zu erzeugen, der am besten zur Regeneration geeignet ist.
Das weitere, zur erfindungsgemäßen Kallusinduktion erforderliche Silbernitrat wird in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 20, vorzugsweise von 5 bis 15, und besonders bevorzugt von 8 bis 12 mg/l eingesetzt. Die Anwesenheit von Silbernitrat verursacht offenbar eine Unterdrückung der frühzeitigen Differenzierung.
Die Induzierung des Kalluswachstums zeigt sich nach etwa 4 bis 8 Wochen und führt gewöhnlich zur Ausbildung von zwei unterschiedlichen Kallustypen. Während der eine Typ einen eher gelblichen, festeren Gewebeverband mit der vorherrschenden Tendenz zur Sprossbildung kennzeichnet (s. Fig. 3), betrifft der andere Typ einen eher weißlichen, lockeren Gewebeverband mit der vorherrschenden Tendenz zur Wurzelgewebsbildung (s. Fig. 4). Erfindungsgemäß hat sich gezeigt, dass sich der wirtschaftlich interessantere erstgenannte Typ wesentlich effizienter zu vollständigen Pflanzen regenerieren lässt.
Die erhaltenen Kalli können mehrere Monate auf dem wie oben beschriebenen Grundmedium (z. B. ML1) weiter kultiviert und vermehrt werden. Dazu sollte die Kultur allerdings in etwa vierwöchigem Abstand auf frisches Medium umgesetzt werden. Je nach beabsichtigtem Verwendungszweck können die erfindungsgemäß hergestellten Maiskalli nachfolgenden Behandlungsschritten zugeführt werden.
Beispielsweise können aus der Kalluskultur in an sich bekannter Weise Suspensions- oder Protoplastenkulturen abgeleitet werden. Ferner können die Kalli oder davon abgeleitete Kulturen einer herkömmlichen Transformation zugeführt werden, um transgene Kulturen zu erhalten, die über bestimmte gewünschte Eigenschaften verfügen. Es wird darauf hingewiesen, dass die gegebenenfalls gewünschte Transformation auch bereits mit dem aus dem Coleoptilbereich präparierten Blattgewebe erfolgen kann, wodurch ebenfalls transformierte Kalli entstehen.
Schließlich können die transformierten oder untransformierten Kalli erfindungsgemäß zur Regeneration vollständiger Pflanzen oder Teilen derselben verwendet werden.
Hierfür kann man die erhaltenen Kalli in nachfolgend beschriebener Weise auf ein erfindungsgemäß geeignetes Differenzierungsmedium (z. B. ML1 S1 oder ML1 R) umsetzen, welches vorzugsweise im wesentlichen frei von Silbernitrat und Auxin sein sollte. Der Begriff "im wesentlichen frei" bedeutet im allgemeinen, dass das entsprechende Medium den oder die betreffenden Inhaltsstoffe nicht umfasst. Allerdings ist erfindungsgemäß denkbar, dass das entsprechende Medium den oder die Inhaltsstoffe in derart geringen Mengen enthält, dass die von dem eingesetzten Medium gewünschten funktionellen bzw. physiologischen Einwirkungen auf das pflanzliche Material nicht oder zumindest nicht deutlich beeinträchtigt werden. Da die erfindungsgemäß vorgeschlagene Verwendung von Silbernitrat zur Kallusbildung auf dessen offenbare Eignung zur Hemmung bzw. Unterdrückung einer frühzeitigen Differenzierung beruht, ist für den Fachmann klar, dass etwaige Mengen an Silbernitrat im nachfolgend zur Differenzierung eingesetzten Medium nur dann toleriert werden können, wenn die angestrebte Differenzierung durch die eingesetzten Konzentrationen an Silbernitrat nicht gefährdet, übermäßig verlangsamt oder unmöglich gemacht wird. Das gleiche gilt analog für das mindestens eine Auxin.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die erhaltene Kalluskultur zur effizienten Induktion des Sprosswachstums in ein Grundmedium (wie z. B. ML1, s. o.) überführt, welches für den Zweck der Sprossinduktion erfindungsgemäß jedoch im wesentlichen frei von Silbernitrat und Auxin ist. Besonders bevorzugt erfolgt die Kultivierung zur Induktion des Sprosswachstums in Anwesenheit von mindestens einem Cytokinin. Sofern die alleinige Induktion des Wurzelwachstums gewünscht ist, kann auf die Anwesenheit des mindestens einen Cytokinins verzichtet werden. Anders als die vorhergehende Phase der Kallusinduktion und des Kalluswachstums erfolgt dieser Differenzierungsschritt in an sich bekannter Weise unter Lichteinwirkung.
Vorzugsweise wird das mindestens eine Cytokinin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 6-Benzylaminopurin (BAP), N⁶ (Δ₂- Isopentenyl)adenin (2iP), Isopentenylpyrophosphat (ipp), 6-(4- Hydroxy-3-methyl-2-transbutenylamino)purin (Zeatin), 6-Furfurylaminopurin (Kinetin), und Kombinationen davon, wobei die Auswahl von 6-Benzylaminopurin (BAP) besonders bevorzugt ist.
Die für die effiziente Induktion des Sprosswachstums erfindungsgemäß geeignete Cytokininmenge wird in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,2, vorzugsweise von 0,2 bis 0,9, und besonders bevorzugt von 0,3 bis 0,7 mg/l eingestellt.
Die anschließende Pflanzenwachstumsphase wird in an sich bekannter Weise durchgeführt in einem Standard-Grundmedium, welches keine Besonderheiten aufweist und z. B. ein Medium umfassend 0,5 × MS-Salzen (T. Murashige und F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Physiol. Plant., 15, S. 493 bis 497 (1962)), 2% Sucrose und 0,72% Agar sein kann. Nach etwa vier Wochen können vollständige kleine Maispflänzchen entnommen und z. B. zur besseren Wurzelentwicklung in Erde oder in ein hydroponisches System überführt werden.
Demgemäß wird erfindungsgemäß auch ein Verfahren zur Herstellung einer Maispflanze oder Teilen derselben bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Gewinnung von Blattgewebe aus dem Coleoptilbereich eines Keimlings,
b) Induktion der Kallusbildung durch Kultivierung des in Schritt (a) gewonnenen Blattgewebes in Anwesenheit von Prolin, Silbernitrat und mindestens einem Auxin,
c) Regeneration einer vollständigen Maispflanze oder Teilen derselben durch Kultivierung des in Schritt (b) induzierten Kallus, wobei die Induktion des Sprosswachstums in einem Medium erfolgt, welches im wesentlichen frei von Silbernitrat und Auxinen ist, vorzugsweise aber mindestens ein Cytokinin enthält.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Maispflanze oder Teilen derselben, in welchem zusätzlich zum zuvor beschriebenen Verfahren das in Schritt (a) gewonnene Blattgewebe oder das in Schritt (b) induzierte Kallusgewebe vor der Induktion der Kallusbildung bzw. vor der Induktion des Sprosswachstums in bekannter Weise einer Transformation unterzogen wird, wobei das transformierte Blatt- oder Kallusgewebe nach der Transformation besonders bevorzugt einer Selektion auf positive Transformanten unterzogen wird.
Schließlich werden durch die vorliegende Erfindung ggf. transgene Maispflanzen oder Teile derselben bereitgestellt, die in zuvor beschriebener Weise erhalten werden können.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines jungen Keimlings. Das erfindungsgemäß besonders bevorzugte Segment des Coleoptilbereichs für die Entnahme des regenerationsfähigen Blattgewebes ist angegeben.
Fig. 2 ist ein Flussdiagramm und zeigt exemplarisch die Abfolge der einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens nach einer bevorzugten Ausführungsform.
Fig. 3 (A) zeigt das Ergebnis der Induktion der Kallusbildung aus unterschiedlichen Segmenten des Coleoptilbereichs am Beispiel des Genotyps Nr. 3 auf dem erfindungsgemäßen Medium ML1 C, sowie die Regeneration von Wurzel- bzw. Sprossgewebe. Wie dargestellt, erfolgt die Kallusinduktion am effektivsten unter Verwendung der unteren Bereiche des Segments (Blattbasis) (untere zwei Reihen); die Effizienz in den oberen Bereichen ist aufgrund der voranschreitenden Differenzierung deutlich geringer (obere zwei Reihen). (B) Darstellung der aus Segmenten der Blattbasis vom Genotyp Nr. 4 auf Medium ML1 C induzierten Kalli. Die roten Pfeile kennzeichnen den eher gelblichen, zur nachfolgenden Induktion des Sprosswachstums besonders geeigneten Kallustyp.
In Fig. 4 ist das Ergebnis der Verwendung des eher weißlichen Kallustyps für die Differenzierung dargestellt. Die diesem Kallustyp eigene Tendenz zur überwiegenden Wurzelbildung ist bei Verwendung der beiden Regenerationsmedien ML1 R (links) sowie ML S2 (rechts) deutlich zu sehen.
Fig. 5 zeigt die Sprossentwicklung ausgehend von induzierten Kalli des gelblichen, festeren Typs. Die Kulturschale links enthält junge Pflanzen nach vier Wochen andauernder Kultur auf Medium ML1 R (ohne Phytohormone), während rechts das Ergebnis der Kultur auf Medium ML1 S2 (mit BAP) dargestellt ist. Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, nicht aber der Beschränkung der vorliegenden Erfindung.

Herstellung geeigneter Kulturmedien

Das für die Keimung von Maissamen verwendete Grundmedium basierte auf einer 1X-Formulierung des MS-Mediums nach Murashige und Skoog (a. a. O., 1962) mit den folgenden Inhaltsstoffen in den angegebenen Konzentrationen:

CaCl₂ × 2H₂O	440,00 mg/l
KH₂PO₄	170,00 mg/l
KNO₃	1900,00 mg/l
MgSO₄ × 7H₂O	370,00 mg/l
NH₄NO₃	1650,00 mg/l
MnSO₄	15,100 mg/l
ZnSO₄ × 7H₂O	8,600 mg/l
H₃BO₃	6,200 mg/l
KJ	0,830 mg/l
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,250 mg/l
CuSO₄ × 5H₂O	0,025 mg/l
CoCl₂ × 6H₂O	0,025 mg/l
FeNaEDTA	50,000 mg/l
Sucrose	30,00 g/l

Für die Keimung der Maissamen wurde ein Medium der obigen Zusammensetzung verwendet, in welchem die obigen Salze mit Ausnahme von MgSO₄ jedoch in einer 10-fachen Verdünnung (0,1X- Formulierung) eingesetzt wurden. Ferner enthielt das eingesetzte Medium 10,0 g/l Sucrose und 2,0 g/l Phytagel.

Das im Anschluss an die Keimung für die Kallusbildung und -vermehrung sowie für die Spross- bzw. Wurzelbildung eingesetzte Grundmedium war eine 1X-Formulierung des ML1- Mediums nach Kemper et al. (a. a. O., 1996) mit den folgenden Inhaltsstoffen in den angegebenen Konzentrationen:

CaCl₂ × 2H₂O	166,00 mg/l
KH₂PO₄	400,00 mg/l
KNO₃	2830,00 mg/l
MgSO₄ × 7H₂O	185,00 mg/l
(NH₄)₂SO₄	63,00 mg/l
H₃BO₃	1,60 mg/l
KJ	0,80 mg/l
MnSO₄ × 1H₂O	3,33 mg/l
ZnSO₄ × 7H₂O	1,85 mg/l
FeNaEDTA	50,00 mg/l
Aminobenzosäure	0,050 mg/l
Biotin	0,100 mg/l
Cholin.Cl	0,100 mg/l
Folsäure	0,050 mg/l
Nicotinamid	0,200 mg/l
Pantothenat	0,100 mg/l
Pyridoxin.HCl	0,200 mg/l
Riboflavin	0,050 mg/l
Thiamin.HCl	0,100 mg/l
Cyanocobalamin	0,150 µg/l
myo-Inositol	100,0 mg/l
Glycin	2,0 mg/l
L-Prolin	690,0 mg/l
Caseinhydrolysat	100,0 mg/l
MgCl₂	650,0 mg/l
AgNO₃	10,0 mg/l
Sucrose	20,0 g/l
Phytagel	2,7 g/l
2,4 D	2,2 mg/l

Modifiziertes Medium zur Induktion der Kallusbildung

Das Grundmedium ML1 (s. o.) wurde in modifizierter Form zur Induktion der Kallusbildung und zum Wachstum der Kalluskultur eingesetzt. Die erfindungsgemäße Modifikation des Grundmediums betraf die Einstellung von geeigneten Konzentrationen der Inhaltsstoffe Prolin, Silbernitrat und Auxin, wobei insbesondere die nachfolgend dargestellten unterschiedlichen Konzentrationen untersucht wurden:
Die Medien ML1 C3, ML1 C4 und ML1 C5 ergaben den höchsten Anteil des gewünschten festeren, eher gelblichen Kallustyps, der am besten zur Induktion des Sprosswachstums geeignet ist. Folglich liegt das experimentelle Optimum der Prolinkonzentration zwischen 1440 und 2880 mg/l.

Modifiziertes Medium zur Induktion des Sprosswachstums

Die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Veränderungen des ML1- Grundmediums (s. o.) für die anschließende Induktion des Sprosswachstums betraf die Einstellung von geeigneten Konzentrationen der Inhaltsstoffe Silbernitrat, Auxin und 6- Benzylaminopurin (BAP), wobei insbesondere die nachfolgend dargestellten unterschiedlichen Konzentrationen untersucht wurden:

Modifiziertes Medium zur Induktion des Spross- und Wurzelwachstums

Für die simultane Induktion von Spross- und Wurzelwachstum wurden die folgenden modifizierten Medien untersucht:
Die Medien ML1 R2, ML1 R3 und ML1 R4 beinhalteten kein Caseinhydrolysat. Die Medien ML1 R3 und ML1 R4 beinhalteten zusätzlich 0,3 bzw. 0,15 mg/l NAA.
Die Ergebnisse zeigen, dass Medium ML1 S2 optimal für die überwiegende Induktion der Sprossbildung ist, während Medium ML1 R besonders günstig für die gleichzeitige Induktion von Spross- und Wurzelbildung ist.

Medium zum anschließenden Pflanzenwachstum

Das nachfolgend zum Pflanzenwachstum eingesetzte Medium war ein modifiziertes MS-Salzmedium. Dieses enthielt die MS-Salze mit der Abweichung, dass die Salze in einer 2-fachen Verdünnung (0,5X-Formulierung) eingesetzt wurden. Ferner enthielt das eingesetzte Medium 20,0 g/l Sucrose und 7,2 g/l Agarose.

Präparation des Blattgewebes und Induktion der Kallusbildung

Mit Hilfe eines Skalpells wurden aus dem Coleoptilbereich von Maiskeimlingen Segmente entnommen (s. Fig. 1) und von Coleoptilgewebe befreit. Die Segmente wurden jeweils durch ein bis zwei Längsschnitte in 2 bis 4 Streifen mit einer jeweiligen Breite von etwa 1 bis 2 mm aufgetrennt, bevor diese wiederum in Querrichtung geschnitten wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Blattstreifen sind in den meisten Fällen an ihrem unteren Ende von weißlicher Farbe und weisen an ihrem oberen Ende eine eher gelbliche Färbung auf. Diese Streifen wurden anschließend zu kleinen Blattstückchen mit einer jeweiligen Abmessung von 1 bis 2 mm × 0,5 mm zerkleinert und auf ein geeignetes Medium zur Kallusbildung überführt. Das verbleibende pflanzliche Material einschließlich der Apikalmeristeme wurde verworfen.
In Fig. 3 ist die hohe Frequenz der Kallusbildung dargestellt; die einzelnen Blattstückchen bzw. Kalli entstammten der Präparation eines Keimlings. Die Induktion des Kalluswachstums zeigte sich nach etwa 4 bis 8 Wochen.

Transformation des Kallusgewebes

Das Kallusmaterial wurde auf seine Transformationseigenschaften getestet, um die Eignung des erfindungsgemäßen Kultivierungssystem für diesen Awendungsbereich zu demonstrieren. Die drei Genotypen Nr. 3(Pa91 × H99) × A188, Nr. 4 Pa91 × H99, und Nr. 6 (H99) wurden in transienten Transformationexperimenten getestet. Unter Anwendung der dem Fachmann bekannten biolistischen Methode (Partikelbombardement) und unter Verwendung einer GUS-Reporter Genkassette, bestehend aus dem Vektor pPVC812 mit dem Hygromycinresistenzgen und dem GUS-Reportergen unter der Kontrolle des CaMV 35S Promotors, wurde das erfindungsgemäß erhaltene Kallusmaterial mit 0,6 µm großen Goldpartikeln beschossen, die mit dem obigen Plasmid beschichtet waren. Die anschließenden Assays zur transienten Expression ergaben eine hohe Anzahl an transienten Transformationsereignissen mit bis zu mehreren Hundert blauen Spots pro cm² Kallusoberfläche. Diese Ergebnisse belegen, dass der eher gelbliche, festere Kallustyp ein ausgezeichnetes Ausgangsmaterial für genetische Transformationen darstellt.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Experimente belegen eindrucksvoll, dass die direkte Bildung von Mais- Kalluskulturen aus unreifem, d. h. weitgehend undifferenziertem Blattmaterial induziert werden kann, und dass diese Kalluskultur zur Regeneration vollständiger Maispflanzen eingesetzt werden kann.
Da für dieses System keine unreifen Embryonen, sondern lediglich junge Keimlinge benötigt werden, die in praktisch unbegrenzter Zahl innerhalb weniger Tage aus Maissamen zur Verfügung gestellt werden können, wird die Herstellung von Gewebekulturen als Ausgangsmaterial für die Regeneration von Pflanzen als auch für die Herstellung transgener Pflanzen der Gattung Mais sowohl vereinfacht als auch zeitlich verkürzt.
Die untersuchten Mais-Genotypen Nr. 1 (A188), Nr. 2 (Hi-II), Nr. 3 (Pa91 × H99) x A188, Nr. 4 (Pa91 × H99, Nr. 5 (Pa91) sowie Nr. 6 (H99) konnten nach dem erfindungsgemäßen System alle zur Etablierung eines Gewebekultursystems gebracht werden und zeigten lediglich quantitative Unterschiede in der Effizienz der Kallusinduktion. Dieser Befund belegt, dass das erfindungsgemäße System zur Regeneration von Maispflanzen aus Blattgewebe weitgehend unabhängig von der Auswahl eines speziellen Genotyps und auf sämtliche Mais-Genotypen anwendbar ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Mais-Kalluskultur, umfassend die folgenden Schritte:

a) Gewinnung von Blattgewebe aus dem Coleoptilbereich eines Keimlings,

b) Induktion der Kallusbildung durch Kultivierung des in Schritt (a) gewonnenen Blattgewebes in Anwesenheit von Prolin, Silbernitrat und mindestens einem Auxin.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Blattgewebe aus der Blattbasis im unteren Abschnitt des Coleoptilbereiches gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das gewonnene Blattgewebe eine überwiegend weißliche Färbung aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das gewonnene Blattgewebe einen überwiegend undifferenzierten Status aufweist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Auxin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 3-Indolylessigsäure (IAA), 3-Indolylbuttersäure (IBA), 3-Indolylessigsäuremethylester (3-Methylindolylacetat), 3-Indolylacetyl-L- Alanin (IAA-L-Alanin), 3-Indolylacetyl-L-Asparaginsäure (IAA-L-Asparaginsäure), 3-Indolylacetyl-L-Phenylalanin (IAA-L-Phenylalanin), 3-Indolylacetylglycin (IAA-Glycin), 3-Indolylbutyryl-β-Alanin (IBA-Alanin), 3-Indolylpropionsäure (IPA), 5,6-Dichlor-3-Indolylessigsäure (5,6-Cl₂- IAA), p-Chlorphenoxyessigsäure (4-CPA), 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure (2,4,5-T), Beta-Naphtoxyessigsäure, Alpha-Naphtalinessigsäure (NAA), Phenylessigsäure (PAA), 4-Amino-3,5,6-trichlorpicolinsäure, 2,3,5-Trijodbenzoesäure (TIBA), Chlorogensäure, Centrophenoxin, und Kombinationen davon.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Auxin 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) ausgewählt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Auxinmenge in einem Konzentrationsbereich von 0,5 bis 3,0, vorzugsweise von 0,7 bis 2,5, und besonders bevorzugt von 1,0 bis 2,2 mg/l eingestellt wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Prolinmenge in einem Konzentrationsbereich von 500 bis 4000, vorzugsweise von 600 bis 3450, und besonders bevorzugt von 690 bis 3250 mg/l eingestellt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Silbernitrat in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 20, vorzugsweise von 5 bis 15, und besonders bevorzugt von 8 bis 12 mg/l eingestellt wird.

10. Verwendung der nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9 hergestellten Mais-Kalluskultur zur Regeneration vollständiger Maispflanzen in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, dass die Induktion des Sprosswachstums durch Kultivierung in einem Medium erfolgt, welches im wesentlichen frei von Silbernitrat und Auxinen ist, vorzugsweise aber mindestens ein Cytokinin enthält.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Cytokinin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 6-Benzylaminopurin (BAP), N⁶ (Δ₂- Isopentenyl)adenin (2iP), Isopentenylpyrophosphat (ipp), 6-(4-Hydroxy-3-methyl-2-transbutenylamino)purin (Zeatin), 6-Furfurylaminopurin (Kinetin), und Kombinationen davon.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Cytokinin 6-Benzylaminopurin (BAP) ausgewählt wird.

13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Cytokininmenge in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,2, vorzugsweise von 0,2 bis 0,9, und besonders bevorzugt von 0,3 bis 0,7 mg/l eingestellt wird.

14. Verfahren zur Herstellung einer Mais-Suspensionskultur, dadurch gekennzeichnet, dass die nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9 hergestellte Mais-Kalluskultur in an sich bekannter Weise in eine Suspensionskultur überführt wird.

15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Mais- Kalluskultur, Mais-Suspensionskultur oder Mais- Protoplastenkultur in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, dass die nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9 hergestellten Mais-Kalluskultur einer Transformation unterzogen wird und gewünschtenfalls in eine Mais-Suspensionskultur oder Mais-Protoplastenkultur überführt wird.

16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Maispflanze oder Teilen derselben, dadurch gekennzeichnet, dass das nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4 gewonnene Blattgewebe oder die nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9 hergestellte Mais-Kalluskultur einer Transformation unterzogen wird und nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 10 bis 13 zu einer vollständigen Pflanze regeneriert wird.

17. Verfahren zur Herstellung einer Maispflanze oder Teilen derselben, umfassend die folgenden Schritte:

a) Gewinnung von Blattgewebe aus dem Coleoptilbereich eines Keimlings,

b) Induktion der Kallusbildung durch Kultivierung des in Schritt (a) gewonnenen Blattgewebes in Anwesenheit von Prolin, Silbernitrat und mindestens einem Auxin,

c) Regeneration einer vollständigen Maispflanze oder Teilen derselben durch Kultivierung des in Schritt (b) induzierten Kallus, wobei die Induktion des Sprosswachstums in einem Medium erfolgt, welches im wesentlichen frei von Silbernitrat und Auxinen ist, vorzugsweise aber mindestens ein Cytokinin enthält.

18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Maispflanze oder Teilen derselben, umfassend die folgenden Schritte:

a) Gewinnung von Blattgewebe aus dem Coleoptilbereich eines Keimlings,

c) Regeneration einer vollständigen Maispflanze oder Teilen derselben durch Kultivierung des in Schritt (b) induzierten Kallus, wobei die Induktion des Sprosswachstums in einem Medium erfolgt, welches im wesentlichen frei von Silbernitrat und Auxinen ist, vorzugsweise aber mindestens ein Cytokinin enthält,

wobei das in Schritt (a) gewonnene Blattgewebe oder das in Schritt (b) induzierte Kallusgewebe vor der Induktion der Kallusbildung bzw. vor der Induktion des Sprosswachstums in bekannter Weise einer Transformation unterzogen wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das transformierte Blatt- oder Kallusgewebe nach der Transformation einer Selektion auf positive Transformanten unterzogen wird.

20. Transgene Maispflanze oder Teile derselben, erhältlich nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 17 bis 19.