DE69434870T2

DE69434870T2 - Verfahren zur Herstellung von aus Meristemen abgeleiteten To-Generationen vollständig transgener Pflanzen

Info

Publication number: DE69434870T2
Application number: DE69434870T
Authority: DE
Inventors: Nathalie Clifton Hill KNITTEL; Philippe Lenee
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1993-08-30
Filing date: 1994-08-19
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2014-08-20
Also published as: HUT74664A; EP0716706B1; DE69434870D1; ES2274513T3; AU7539694A; ATE342991T1; FR2709496A1; HU9600504D0; US6649812B1; WO1995006741A1; HU220857B1; JPH09509302A; AU695398B2; SK25896A3; FR2709496B1; EP0716706B9; EP0716706A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen ausgehend von Meristemen, wobei die Pflanzen in der Generation T₀ vollständig transformiert sind.
Die gentechnischen Verfahren werden nun häufig bei der Verbesserung von Pflanzenarten angewandt. Diese Techniken erlauben die Einführung neuer Merkmale, die sich durch die klassischen Techniken nur schwer oder gar nicht einbringen lassen. Trotz der Entwicklung dieser Techniken gibt es dennoch bestimmte Arten, die sich bei der Transformation als schwierig erweisen oder die nicht aus differenzierten Explantaten, wie Kotyledonen oder Blätter, regeneriert werden können. Für diese Arten (beispielsweise die Sonnenblume, die Baumwolle, die Erbse, die Bohne, die Sojabohne, etc.) wurde gezeigt, dass diese Schwierigkeiten zum Teil durch Verwendung eines meristematischen Explantats, beispielsweise eines apikalen Meristems, als Explantat für die Transformation überwunden werden können.
Durch die Verwendung von Meristemen lassen sich fruchtbare Pflanzen ohne Kallusgenese-Schritt regenerieren. Die Regenerationstechnik ausgehend von Meristemen trifft auf eine große Anzahl verschiedener Arten und bei einer gleichen Art auf eine große Anzahl von Genotypen zu. Durch diese Technik konnten zahlreiche schwer zugängliche Arten transformiert und regeneriert werden (siehe beispielsweise: Bidney et al., Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992; Bidney et al., Proc. 13. Int. Sunflower Conf. Bd. II, Pisa Sept. 1992; Schrammeijer et al., Plant Cell Rep. 9: 55-60, 1990; Christou et al., The Plant Journal, 2(3), 283-290, 1992; Gambley et al., Plant Cell Rep. 12 : 343-346, 1993; Russel et al., Plant Cell Rep. 12 165-169, 1993).
Dennoch weist dieses Verfahren einige Unzulänglichkeiten auf. Die Transformationshäufigkeit ist äußerst gering, und die regenerierten Pflanzen sind fast ausschließlich Chimäre, d.h. bestimmte Gewebe sind transformiert, während es für andere nicht der Fall ist. Dieses Merkmal beruht auf der Tatsache, dass das Meristem das Zellmaterial als Ursprung für sämtliche Gewebe der verschiedenen Organe der Pflanze (Stängel, Wurzeln, Blätter) produziert. Gleich, welches die eingesetzte Technik ist, führt der Transformationsvorgang zudem nur zur Transformation einer begrenzten Anzahl von Zellen in dem Explantat, wobei diese Zellen zufällig verteilt sind. Das Meristem ist nach einer derartigen Manipulation niemals vollständig transformiert. Demnach sind die aus einem Meristem regenerierten Pflanzen, die einen Transformationsschritt durchlaufen haben, Chimäre. Vollständig transgene Pflanzen werden nur in der Nachkommenschaft erhalten, und zwar mit der Maßgabe, dass die Zellen der Keimbahn durch die Transformation erhalten wurden. Diese Art von Verfahren ist beispielsweise beschrieben in: Bidney et al., Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992; Schrammeijer et al., Plant Cell Rep. 9 : 55-60, 1990.
Die beim Erhalt von chimären Pflanzen bestehenden Unzulänglichkeiten sind aus dem Stand der Technik bekannt, allerdings konnte noch keine Lösung bereitgestellt werden. Ein Markersystem, durch das es möglich ist, unter den chimären T₀-Pflanzen diejenigen zu erkennen, die eine Transformation der Keimbahn durchlaufen haben und die demnach dazu geeignet wären, das neue Merkmal auf ihre Nachkommen zu übertragen, wurde bereits beschrieben (Christou et al., The Plant Journal, 2(3), 283-290, 1992). Dieses Verfahren erleichtert in der Folgegeneration den Erhalt von vollständig transformierten Pflanzen, allerdings sind die in der T₀-Generation produzierten Pflanzen immer noch Chimäre.
Bis heute existiert kein Verfahren, durch das sich systematisch und vorhersehbar transgene Pflanzen produzieren lassen, die, ausgehend von meristematischen Explantaten, vollständig in der T₀-Generation transformiert werden.
Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem. Die Erfindung beruht auf der Entwicklung eines Verfahrens durch die Erfinder, durch das sich die Meristeme mit transformierten Zellen anreichern lassen, um zu vollständig transformierten Meristemen zu führen, d.h. Meristeme, bei denen sämtliche Zellen transformiert sind. Erfindungsgemäß erfolgt die Regeneration von Pflanzen anschließend ausschließlich ausgehend von diesen vollständig transformierten Explantaten, was den transgenen Charakter der erhaltenen Pflanzen sicherstellt. Die Erfinder haben auch gezeigt, dass unter bestimmten Bedingungen die Neoformation von Meristemen und von neomorphen Blattknospen auf den Blättern von Explantaten, die aus Meristemen hervorgegangen sind, induziert werden kann. Die Existenz dieser neomorphen Blattknospen, die neomorphe Blattmeristeme enthalten, wurde bisher in der Literatur noch nicht beschrieben. Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich diese neomorphen Blattmeristeme auch in einem vollständig transformierten Zustand erhalten. Demnach stellen sie ein ausgezeichnetes Zellmaterial zur Regeneration von vollständig in T₀ transformierten Pflanzen dar.
Allgemein stellt die Erfindung demnach ein Verfahren zur Herstellung von vollständig transformierten Meristemen und ein Verfahren bereit, durch das sich ausschließlich ausgehend von diesen Explantaten Pflanzen regenerieren lassen, die in T₀ vollständig transgen sind.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die vollständig in der T₀-Generation transformiert werden, umfassend:

a) einen Schritt zur genetischen Transformation eines meristematischen Explantats; und
b) einen Schritt der selektiven Kultivierung, der die spezifische Entwicklung, unter sämtlichen transformierten Zellen, von denjenigen Zellen erlaubt, die von sekundären Meristemen abstammen, und/oder von denjenigen Zellen, die in der Lage sind, neomorphe Blattmeristeme zu bilden;
c) die Regeneration von transgenen Pflanzen, ausgehend von in Schritt ii) erhaltenem Zellmaterial;

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "meristematisches Explantat" ein Explantat, das im Wesentlichen oder ausschließlich aus meristematischem Gewebe oder aus Gewebe besteht, das dazu geeignet ist, während seiner Entwicklung meristematisch zu werden. Erfindungsgemäß umfasst dieser Begriff insbesondere:

– ein apikales Meristem (in der Technik auch als "primäres Meristem" bekannt), insbesondere ein apikales Stängel-Meristem, d.h. das dem Stängel entstammt;
– eine neomorphe Blattknospe;
– einen Teil eines jungen Blattes, der in der Lage ist, neomorphe Blattknospen zu bilden.

Der Begriff "neomorphe Blattknospe" bezeichnet eine Knospe, die auf der oberen Epidermis eines Blatts beruht. Sie enthält ein neomorphes Blattmeristem. Ihre Entwicklung wird "künstlich" durch eine Reihe von exakten Kulturbedingungen ausgelöst.
Die Natur dieser unterschiedlichen Explantate wird nachstehend im Einzelnen beschrieben.
Der Begriff "sekundäres Meristem" bezeichnet ein Meristem, das aus einem primären Meristem hervorgeht. Insbesondere bezieht sich dieser Begriff, im Zusammenhang mit der Erfindung, auf die achselständigen Meristeme, die in der Achsel der Blätter angeordnet und für den Aufbau der Seitenzweige der Pflanze verantwortlich sind.
Der Begriff "Achselknospe" bezeichnet eine in der Achsel eines Blattes liegende Knospe, die ein sekundäres Meristem enthält.
Der Begriff "neomorphes Blattmeristem" bezeichnet ein Meristem, das in einer neomorphen Blattknospe enthalten ist. Die Bildung dieser Meristeme wird "künstlich" durch Kulturbedingungen, die nachstehend definiert werden, hervorgerufen.
Auf Zellniveau weisen die sekundären Meristeme und die neomorphen Blattmeristeme eine strukturelle Organisation und eine Funktionsweise auf, die zu denjenigen des Hauptmeristems identisch sind. Sie sind allerdings kleiner. Ferner sind die neomorphen Blattmeristeme kleiner als die sekundären Meristeme.
Die Arbeiten, die zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung führen, beruhen auf den folgenden morphogenetischen Prinzipien. Das apikale Meristem enthält in der Achsel der Blattprimordien Zellen, die auf zuvor festgelegte Weise durch Zellvermehrung sekundäre Meristeme hervorbringen. Während eines genetischen Transformationsvorgangs kann es vorkommen, dass diese "vorprogrammierten" Zellen transformiert werden. Die sekundären Meristeme, die aus der Vermehrung dieser Zellen hervorgehen, bestehen ausschließlich aus transformierten Zellen. Gleiches gilt für die Zellen, die unter günstigen Kulturbedingungen neomorphe Blattmeristeme hervorbringen. Folglich sind die aus diesen sekundären transformierten Meristemen und aus transformierten neomorphen Blattmeristemen regenerierten Pflanzen vollständig transgen.
Die Erfinder haben ein selektives Kultursystem entwickelt, das unter den transformierten Zellen die Entwicklung derjenigen Zellen begünstigt, die aus sekundären Meristemen und neomorphen Blattmeristemen stammen. Die anderen Zellen werden eliminiert.
Vorzugsweise umfasst die selektive Kultur die folgenden Schritte:

i) die Kultivierung des meristematischem Explantats, das den Transformationsschritt durchlaufen hat, auf einem Selektionsmedium;
ii) die Entnahme der transformierten Achselknospen und gegebenenfalls der transformierten neomorphen Blattknospen, die in Schritt i) erhalten wurden;
iii) die Kultivierung der gemäß ii) erhaltenen transformierten Knospen auf einem Selektionsmedium;
iv) die mindestens einmalige Wiederholung der Schritte ii) und iii).

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die vollständig in der T₀-Generation transformiert werden, umfassend

a. einen Schritt zur genetischen Transformation eines meristematischen Explantats;
b. die Kultivierung des meristematischen Explantats, das den Transformationsschritt durchlaufen hat, auf einem Selektionsmedium;
c. die Entnahme der transformierten Achselknospen und gegebenenfalls der transformierten neomorphen Blattknospen, die in Schritt b. erhalten wurden;
d. die Kultivierung der gemäß Schritt c. erhaltenen transformierten Knospen auf Selektionsmedium;
e. die wenigstens einmalige Wiederholung der Schritte c. und d., um vollständig transformierte sekundäre Meristeme und gegebenenfalls vollständig transformierte neomorphe Blattmeristeme zu erhalten;
f. die Regeneration von transgenen Pflanzen ausgehend von in Schritt e. erhaltenem Zellmaterial.

Mit anderen Worten wird erfindungsgemäß das Explantat, das den Transformationsschritt durchlaufen hat, während einer bestimmten Zeit auf Selektionsmedium kultiviert. Wenn Knospen und einige Blätter auftreten, wird die Kultivierung unterbrochen, und die Achselknospen und gegebenenfalls die neomorphen Blattknospen, die mindestens zum Teil transformiert sind, werden entnommen. Der transformierte Zustand wird mit Hilfe des Selektionsmarkers erkannt. Die Knospen werden anschließend wieder ausgepflanzt und auf Selektionsmedium kultiviert, bis sie nacheinander Achselknospen und gegebenenfalls neomorphe Blattknospen bilden. Die Kultivierung wird unterbrochen, und die transformierten Knospen werden erneut entnommen und kultiviert. Indem dieser Zyklus von "Kultivierung von begrenzter Dauer/Entnahme der Knospen" mehrmals wiederholt wird, werden schließlich vollständig transformierte Knospen erhalten. In der Tat steigen die Anzahl von transformierten Zellen in der Knospe und der Anteil von transformierten Zellen im Vergleich zu nicht transformierten Zellen auf Grund der Zellvermehrung an. Die Zyklen werden demnach wiederholt, bis vollständig transformierte Knospen erhalten werden. Eine vollständig transformierte Knospe wird an ihrer Fähigkeit erkannt, einen Trieb zu produzieren, der durchwegs eine grüne Farbe aufweist, die für seine Fähigkeit charakteristisch ist, der Hemmung durch den Selektionsmarker zu widerstehen, was dem transformierten Zustand entspricht. Die Regeneration der transgenen Pflanze erfolgt ausgehend von Achselknospen oder neomorphen Blattknospen.
Der Begriff "Selektionsagens" bezeichnet, im Zusammenhang mit der Erfindung, ein Agens, das die Entwicklung von transformierten Zellen begünstigt. Das eingesetzte Selektionsagens ist normalerweise Kanamycin. In diesem Fall umfasst die während der Transformation eingebrachte heterologe Sequenz ein Gen, das die Kanamycin-Resistenz codiert, beispielsweise NPT II. Kanamycin wirkt durch Blockade der Chloroplasten-Ribosomen. Folglich ist eine Kanamycin-resistente Pflanze grün, da sie in der Lage ist, funktionsfähige Chloroplasten zu produzieren, während eine nicht resistente Pflanze eine gelbe oder weiße Farbe aufweist, die für das Fehlen von funktionsfähigen Chloroplasten charakteristisch ist. Dieses Phänomen gestattet die visuelle Selektion der Transformanten. Die grünen neomorphen Blattknospen und die grünen Achselknospen werden selektiert; die Hauptknospe, der Hauptkeimling und sämtliche anderen Teile der Pflanze, die weiß oder gelb sind, werden verworfen.
Die Beseitigung der Hauptknospe begünstigt die Entwicklung der Achselknospen, insbesondere wenn es sich um eine Art mit Apikaldominanz handelt, wie die gewählte Sonnenblume.
Die Anzahl von selektiven Kultivierungszyklen beträgt vorzugsweise mindestens zwei, einschließlich der ersten Kultivierung des meristematischen Explantats, welches den Schritt der Transformation durchlaufen hat. Die Anzahl von Zyklen muss ausreichen, damit sich vollständig transformierte Knospen erhalten lassen. Typischerweise müssen 3 Zyklen verwendet werden, allerdings könnte es bei bestimmten Arten oder mit bestimmten Transformationstechniken notwendig sein, hiervon mehr, beispielsweise 4, 5 oder 6 Zyklen, durchzuführen.
Allgemein dauert jeder Kultivierungsschritt auf Selektionsmedium etwa 15 Tage, kann allerdings je nach Art zwischen 1 und 3 Wochen schwanken. Die Dauer eines jeden Kultivierungsschritts muss ausreichen, damit das Auftreten von Trieben mit mindestens einem Blatt möglich ist. Wenn der Selektionszyklus dreimal wiederholt wird, beträgt die Gesamtdauer des selektiven Kultivierungsschritts etwa 6 Wochen, wobei das Selektionsagens während der Gesamtheit dieses Zeitraums vorhanden ist. Gegebenenfalls kann ein Reportergen, beispielsweise GUS, während der Transformation eingebracht werden, damit sich der Transformationszustand analysieren lässt.
Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist unerwartet, da die Gesamtheit der erfindungsgemäßen Kultivierungsschritte eine Dauer aufweist, die deutlich höher ist als die üblicherweise durchgeführte (beispielsweise 6 Wochen statt 2 Wochen). Auch wurde von mehreren Autoren angegeben, dass Kanamycin auf die Regeneration der Pflanze schädliche Wirkungen ausübt (Schrammeijer et al., Plant Cell Rep. 9: 55-60, 1990). Die bisher entwickelten Transformations- und Regenerationsverfahren wiesen demnach die Tendenz auf, die Dauer des Selektionsschrittes zu minimieren (Bidney et al., Proc. 13. Int. Sunflower Conf. Bd. II, Pisa September 1992). In der Tat haben die vorliegenden Erfinder im Gegensatz zu dem, was in der Literatur angegeben ist, gezeigt, dass eine längere selektive Kultivierungsdauer auf Kanamycin keinerlei inhibitorische Wirkung auf die Regeneration der Pflanze ausübt.
Hinsichtlich des Transformationsschrittes des meristematischen Explantats kann jede geeignete Technik eingesetzt werden. Dieser Schritt umfasst das Inkontaktbringen des meristematischen Explantats mit Agrobacterium, das eine heterologe Sequenz enthält, die dazu bestimmt ist, in die Pflanzenzellen eingebracht zu werden, unter Bedingungen, die den Transfer der DNA erlauben.
Als Beispiel für die Transformationstechnik kann das Bombardement des meristematischen Explantats mit Mikropartikeln genannt werden, wobei das Inkontaktbringen des Explantats mit Agrobacterium entweder gleichzeitig oder nach dem Bombardement durchgeführt wird. Durch diese Technik lässt sich eine erhöhte Anzahl von Mikroverletzungen auf dem Explantat realisieren, was für den Transfer von DNA durch Agrobacterium notwendig ist. Im Falle eines Bombardements und einer gleichzeitigen Transformation sind die Mikropartikel mit Agrobacterium beschichtet (EP-A-0486234). Vorzugsweise wird das Inkontaktbringen mit Agrobacterium nach dem Bombardement durchgeführt, wobei beispielsweise die in der EP-A-0486233 verwendete Technik eingesetzt wird. Die Mikropartikel bestehen normalerweise aus Gold oder Wolfram.
Eine weitere Transformationstechnik besteht darin, das meristematische Explantat mit einer Suspension von Agrobacterium in Kontakt zu bringen. In diesem Fall ist es bevorzugt, Verletzungen auf dem Explantat vorzunehmen, indem es beispielsweise mit einem Skalpell angeritzt wird, um die Transformation zu erleichtern.
Der Transformationsschritt umfasst auch einen Zeitraum der Cokultivierung des Explantats mit dem Agrobacterium. Dieser hat eine Dauer von 2 bis 4 Tagen, wobei 3 Tage bevorzugt sind. Das Cokulturmedium kann jedes normalerweise zu diesem Zweck verwendete Medium sein: Ein besonders zweckmäßiges Medium ist das M2-Medium, das mit BAP angereichert ist, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Das Agrobacterium ist normalerweise Agrobacterium tumefaciens. Diverse Stämme können eingesetzt werden, beispielsweise der Stamm GV2260 oder LBA 4404. Als Vektor können das binäre Plasmid pGA 492-GI oder auch das p35GUS Intron genannt werden. Das Paar "Stamm/Vektor" kann die Effizienz der Transformation beeinflussen. Es ist bevorzugt, den Stamm LBA 4404 mit dem Vektor pGA 492-GI zu verwenden.
Die Nucleinsäuresequenz, die zum Einbringen in die Pflanzenzellen bestimmt ist, umfasst alle Sequenzen, die dazu geeignet sind, auf die Pflanze Eigenschaften von landwirtschaftlichem Interesse zu übertragen. Nennenswerte Beispiele sind Sequenzen, die eine Resistenz gegenüber Insekten, Herbiziden oder Pilzkrankheiten (beispielsweise Sclerotinia sclerotorium oder Botrytis cinerea) vermitteln, ein oder mehrere Gene für Speicherproteine von Samen, oder Gene, die die Qualität der Speicherproteine verbessern, die Fruchtreife modifizierende Sequenzen, Virusresistenz vermittelnde Sequenzen, ein oder mehrere Ribozyme, ein oder mehrere Antisense-Sequenzen, ein oder mehrere am Metabolismus der Fettsäuren oder der Aminosäuren beteiligte Gene oder ein oder mehrere an der männlichen Sterilität beteiligte Gene.
Ferner umfasst die heterologe Sequenz auch eine Sequenz, die ein Agens codiert, durch das sich Transformanten selektieren lassen, beispielsweise ein Agens, das eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, wie Kanamycin, G418 oder Neomycin, verleiht. Der Vektor umfasst die regulatorischen Sequenzen, die für die stabile Expression der heterologen Sequenz notwendig sind. Als Promotor kann der 35S-Promotor, der doppelte 35S-Promotor mit dem Translationsenhancer Ω oder der Ubiquitinpromotor aus der Sonnenblume genannt werden. Der NOS-Terminator ist besonders bevorzugt.
Die vorstehend beschriebenen Schritte der Transformation und der selektiven Kultivierung bilden Teil einer Gesamtheit von Vorgängen, durch die sich ausgehend von dem Explantat transgene Pflanzen regenerieren lassen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in seiner Gesamtheit also folgendermaßen zusammengefasst werden:

1. Herstellung des meristematischen Explantats;
2. Durchführung des Schrittes der Transformation des Explantats wie vorstehend beschrieben;
3. Durchführung der Reihe von Selektionsschritten, wie vorstehend dargelegt;
4. Regeneration von transgenen Pflanzen aus den am Ende der Selektionszyklen erhaltenen Strukturen;

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren besteht die Herstellung des meristematischen Explantats in einem Vorkultivierungsschritt eines apikalen Meristems oder eines apikalen Halbmeristems für 5 bis 30 Tage, vorzugsweise zwischen 5 bis 8 Tage.
Das Vorkulturmedium ist ein Pflanzenzellenkulturmedium, dem ein Cytokin und insbesondere 6-Benzylaminopurin (nachstehend als BAP bezeichnet) zugesetzt wurde. Vorzugsweise ist das Medium das MS-Medium (Murashige-Skoog), dem 0,05 bis 2,0 mg/l BAP, beispielsweise 0,1 mg/l BAP, ohne weiteres Hormon zugesetzt wurde.
Die Erfinder haben gezeigt, dass der Vorkultivierungsschritt und seine Dauer einen bedeutenden Einfluss auf die Entwicklung des Explantats ausüben. Wenn er eine Dauer von über 9 oder 10 Tagen aufweist, erscheinen auf den Blättern neomorphe Blattknospen. Die auf dem apikalen Meristem regenerierten Triebe weisen demnach Blätter auf, die auf der oberen Epidermis neomorphe Blattknospen tragen.
Nach dieser Variante der Erfindung ist es vor dem Transformationsschritt möglich, die neomorphen Blattknospen abzuschneiden oder sogar einfach Blattstücke zu entnehmen und sie im Transformationsschritt zu verwenden. Nach dieser Ausführungsform der Erfindung kann das meristematische Explantat, mit dem die Transformation durchgeführt wurde, also entweder aus einem Teil eines Blattes, das nach mindestens 9-tägiger Vorkultivierung erhalten wurde und dazu geeignet ist, neomorphe Blattknospen zu ergeben, oder aus abgeschnittenen neomorphen Blattknospen bestehen.
Für den Fall, dass die Vorkultivierung zwischen 5 und 12 Tagen dauert, dient das apikale Meristem in dem Transformationsschritt normalerweise direkt als meristematisches Explantat. Genauer gesagt, werden in diesem Fall die neomorphen Blattknospen während des Vorkultivierungsschrittes induziert, allerdings erscheinen sie erst im Laufe der letzten Entwicklung, beispielsweise während der Co-Kultur oder während der Kultur auf Selektionsmedium.
Erfindungsgemäß kann das gleiche Kulturmedium für die Vorkultivierungs-, Cokultivierungs- und Selektionsschritte verwendet werden. Dieses Medium ist vorzugsweise das MS-Medium, dem BAP in einer Konzentration von 0,05 bis 2,0 mg/l, vorzugsweise von 0,1 mg/l, zugesetzt wurde. Normalerweise ist BAP das einzige in dem Medium vorhandene Phytohormon. Insbesondere ist es bevorzugt, dass dieses Medium weder Gibberellinsäure noch Indolessigsäure enthält, insbesondere wenn es sich um Vorkulturmedium handelt. Dem Medium kann auch während der Vorkultivierungs- und Cokultivierungsschritte eine Phenolverbindung, beispielsweise Acetosyringon, zugesetzt werden, das in der Lage ist, die vir-Gene von Agrobacterium zu aktivieren. Eine Konzentration von etwa 200 μM ist geeignet. Für den selektiven Kultivierungsschritt enthält das Medium mindestens ein Selektionsagens, vorteilhafterweise Kanamycin, in einer Konzentration zwischen 50 und 200 mg/l, vorzugsweise 50 mg/l und gegebenenfalls bakteriostatische Agenzien.
Die apikalen Meristeme werden durch Keimung von reifen, geschälten und sterilisierten Samen erhalten. Das Keimungsverfahren besteht typischerweise in der Kultivierung von Samen auf einem Keimungsmedium, vorzugsweise verfestigt, beispielsweise MS-Medium, dessen Makro- und Mikroelemente gegebenenfalls um die Hälfte reduziert wurden. Die Keimung dauert zwischen 2 bis 4 Tagen, vorzugsweise 4 Tage, bei 25 °C, vorzugsweise mit einer Lichtperiode von etwa 16 h.
Nach den Vorkultivierungs-, Transformations- und Selektionsschritten wird ein Regenerationsschritt ausgehend von den vollständig transformierten Knospen und den Trieben durchgeführt. Die Kulturmedien und die Bedingungen sind diejenigen, die gewöhnlich in der Technik für die in Frage kommende Art angewandt werden. Für die Sonnenblume sind die Regenerationsbedingungen in den nachfolgenden Beispielen angegeben.
Außer dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen betrifft die vorliegende Anmeldung auch die vollständig transformierten neomorphen Blattknospen und sekundären Meristeme, die während dieses Verfahrens erhalten wurden. Sie betrifft auch die in der T₀-Generation vollständig transformierten transgenen Pflanzen, die ausgehend von den meristematischen Explantaten erhalten wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist zahlreiche Vorteile auf. Insbesondere ist es wirksamer als die Verfahren des Standes der Technik, da die Regeneration nur erfolgt, wenn das Explantat vollständig transformiert ist. Die bestehenden Verfahren würden im Gegensatz dazu die Regeneration sämtlicher Meristeme, mit denen der Transformationsvorgang durchgeführt wurde, und die anschließende Selektion unter den erhaltenen chimären Pflanzen von denjenigen, deren Keimbahn transformiert wurde, implizieren. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet demnach einen bedeutenden materiellen und zeitlichen Gewinn.
Ferner ist die durch dieses Verfahren erhaltene Ausbeute an transgenen Pflanzen bedeutend höher als diejenige, die durch die bisherigen Techniken erhalten wurde. Bei der Sonnenblume beispielsweise, ergeben 92 % der regenerierten Pflanzen mindestens eine transgene Pflanze in der Nachkommenschaft (Tabelle 8 nachstehend). Diese Zahl ist mit 0,2 bis 2 % zu vergleichen, die von Bidney et al., Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992, berichtet wurde.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet für zahlreiche Pflanzenarten und insbesondere Dikotyledone, insbesondere diejenigen, die schwierig zu transformieren und zu regenerieren sind. Als Beispiel werden Baumwolle, Soja, die Ölpflanzenarten, beispielsweise die Sonnenblume, die Arten, die der Familie der Leguminosen angehören, beispielsweise die Erbse, die Bohne, oder auch die Arten, die der Familie der Cucurbitaceae angehören, beispielsweise der Zucchino, zitiert. Bei diesen Arten können zahlreiche verschiedene Genotypen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist die Sonnenblume.
Verschiedene Aspekte der Erfindung sind in den Figuren erläutert:
1 zeigt das Protokoll der Transformation von Blättern, die aus Halbmeristemen stammen, zur Analyse der Expression von Glucuronidase in den aus neomorphen Blattknospen regenerierten achselständigen Trieben.

1: Same
2: Keimungsmedium M0, 2 Tage
3: Dissektion der Apices: Beseitigung der Kotyledonen, der Wurzel und des ersten Blattes
4: Schneiden des Apex in zwei Hälften
5: Vorkultivierung der Halbmeristeme auf M2-Medium, enthaltend Acetosyringon, 200 μM, während 30 Tagen
6: neomorphe Blattknospe
7: achselständige Triebe, induziert ausgehend von Halbmeristemen
8: Entnahme von Blättern, die neomorphe Blattknospen tragen, initiiert auf der oberen Oberfläche
9: Entnahme von Blättern ohne neomorphe Blattknospen
10: Bombardement und 3 Tage Cokultivierung der Blätter mit Agrobacterium tumefaciens auf M2-Medium, enthaltend Acetosyringon, 200 μM
11: Kultivierung auf M2-Medium, enthaltend Augmentin, 400 mg/l, während 15 Tagen
12: achselständige Triebe
13: Entwicklung von neomorphen Blattknospen zu achselständigen Trieben
14: Analyse der Expression von Glucuronidase in den achselständigen Trieben, induziert ausgehend von neomorphen Blattknospen, die auf den Blättern erscheinen
15: Blattexplantat
16: Spots von transformierten GUS+-Zellen
17: Bereiche transformierter GUS+-Zellen
18: Streifen transformierter GUS+-Zellen
19: transformierte achselständige GUS+-Knospen

2 zeigt das Protokoll der Transformation von Halbmeristemen zur Analyse der Expression der Glucuronidase.

1: Same
2: Keimungsmedium M0, 2 Tage
3: Dissektion der Apices: Beseitigung der Kotyledonen, der Wurzel und des ersten Blattes
4: Schneiden des Apex in zwei Hälften
5: Vorkultivierung der Halbmeristeme auf M2-Medium, enthaltend Acetosyringon, 200 μM, während 5 Tagen
6: Bombardement und 3 Tage Cokultivierung der Halbmeristeme mit Agrobacterium tumefaciens auf M2-Medium, enthaltend Acetosyringon, 200 μM
7: Kultivierung der bombardierten und cokultivierten Halbmeristeme auf M2-Medium, enthaltend Augmentin, 400 mg/l, während 15 Tagen
8: neomorphe Blattknospe
9: achselständige Triebe, induziert ausgehend von den Halbmeristemen
10: achselständiger Trieb
11: Kallus an der Basis
12: Analysen der Expression der Glucuronidase in den achselständigen Trieben induziert ausgehend von Halbmeristemen
13: Spots von transformierten GUS+-Zellen
14: Bereiche transformierter GUS+-Zellen
15: neomorphe transformierte GUS+-Blattknospen
16: Streifen transformierter GUS+-Zellen
17: transformierte achselständige GUS+-Knospen

3 zeigt die Selektion von transformierten achselständigen Trieben, die ausgehend von auf den Blättern auftretenden neomorphen Blattknospen oder ausgehend von Halbmeristemen regeneriert wurden.

Erste Kultivierung zur Selektion auf Kanamycin:

3: Kanamycin-resistente grüne neomorphe Blattknospe
4: Kultivierung von Explantaten auf M2-Medium, enthaltend Augmentin, 400 mg/l und Kanamycin, 50 mg/l, während 15 Tagen
5: weißer, nicht transformierter Kanamycin-empfindlicher Teil
6: grüne achselständige Kanamycin-resistente Knospe
7: grüner Kanamycin-resistenter transformierter Teil
8: Entnahme von grünen achselständigen Knospen
9: Entnahme von grünen neomorphen Blattknospen

Zweite Kultivierung zur Selektion auf Kanamycin:

10: Kultivierung von grünen achselständigen Blattknospen, von grünen neomorphen Blattknospen und von grünen achselständigen Trieben auf M2-Medium, enthaltend Augmentin, 400 mg/l und Kanamycin, 50 mg/l, während 15 Tagen
11: grüne Kanamycin-resistene neomorphe Blattknospe
12: Kanamycin-empfindlicher nicht transformierter weißer Teil
13: Kanamycin-resistente grüne achselständige Blattknospe
14: Kanamycin-resistenter grüner Teil
15: achselständiger grüner Kanamycin-resistenter Trieb
16: Entnahme von grünen achselständigen Knospen
17: Entnahme von grünen neomorphen Blattknospen
18: Entnahme von grünen achselständigen Trieben

4 zeigt die Regeneration von transformierten Pflanzen.

Dritte Kultivierung zur Selektion auf Kanamycin:

1: Kultivierung der grünen achselständigen Knospen, der grünen neomorphen Blattknospen und der grünen achselständigen Triebe auf M2-Medium, enthaltend Augmentin, 400 mg/l und Kanamycin, 50 mg/l, während 15 Tagen
2: Entnahme der grünen achselständigen Triebe
3: chimärer achselständiger Trieb mit weißen nicht transformierten Teilen und grünen transformierten Teilen
4: Kultivierung im SORBAROD-System, dem M3-Medium zugesetzt wurde, während 30 Tagen in einer Kulturkammer
5: Bewurzelung
6: Abwaschen von M3-Medium, Zugabe von M4-Medium
7: bewurzelte Pflanze
8: Kultivierung im SORBAROD-System während 10 Tagen in Kulturkammer
9: nicht bewurzelte Pflanze
10: Entwicklung
11: Kultivierung in dem SORBAROD-System im Gewächshaus während 10 Tagen
12: Entwicklung und Akklimatisierung
13: Auspflanzen der bewurzelten Pflanzen auf Torf in Töpfe, Pfropfung der nicht bewurzelten Pflanzen auf Pfropfträger, Kultivierung im Gewächshaus
14: Blüte, Selbstbefruchtung
15: Wachstum

Beispiel 1: Transformation von Blättern, die aus Halbmeristemen stammen, zur Analyse der Expression der Glucuronidase in regenerierten Trieben ausgehend von neomorphen Blattknospen (1).
1.1 – Herstellung von Halbmeristemen
Die Samen der Sonnenblume (Helianthus annuus) der Linien (Ha300, RHa 274, RHa 297, RHa 356, RHa 359, RHa 362), zwei Populationen LG60 und LG61, abgeleitet aus interspezifischen Kreuzungen mit Helianthus petiolaris, und mehrere Linien, die von der Fa. LIMAGRAIN GENETICS (Les Alleuds) bereitgestellt wurden, werden für diese Experimente verwendet. Die Samen werden geschält, um die Tegumente zu beseitigen, anschließend 20 min in Wasser mit 12 % Chlor (Chlorbleiche), dem 1 ml/l Teeen 80 zugesetzt wurde, sterilisiert. Die geschälten Samen werden anschließend fünf Mal mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Anschließend werden die Samen 1 h in sterilem destilliertem Wasser eingeweicht, anschließend wird das Häutchen, das den Samen bedeckt, entfernt. Die nackten Samen werden erneut 2 min in Wasser mit 6 % Chlor (Chlorbleiche) sterilisiert, dreimal in destilliertem sterilem Wasser gespült und auf Papierfilter in einem Dunstabzug getrocknet. Die trockenen Samen werden anschließend auf M0-Medium: Makroelemente, Mikroelemente, Fe-EDTA und Vitamine des MS-Mediums (Murashige und Skoog, 1962 – Physiologia Plantarum, 15 : 473-497), dem 10 g/l Saccharose, 7 g/l Agar-Agar, pH 5,8, zugesetzt wurden, keimen gelassen; und 10 Tage in einer Kulturkammer bei 26 °C mit 16 h Licht (50μ Einstein/m² Lichtintensität) keimen gelassen. Die gekeimten Samen werden entnommen, die Kotyledonen und Keimwurzeln sowie der apikale Teil des Apex werden entfernt. Der so erhaltene Zylinder von einigen mm Durchmesser wird anschließend in der Kotyledonen-Insertionsachse in zwei Hälften geschnitten. Dieses Explantat, das ein apikales Halbmeristem enthält, wird Halbmeristem genannt.
1.2 – Kultivierung der Halbmeristeme
Die Halbmeristeme werden anschließend in M2-Medium (Makroelemente, Mikroelemente, Fe-EDTA und Vitamine des MS-Mediums), dem 10 g/l Saccharose, 0,1 mg/l BAP, 8 g/l Agar-Agar, pH: 5,8-6, zugesetzt wurden, enthaltend 200 μM Acetosyringon, 30 Tage in einer Kulturkammer bei 26 °C mit 16 h Licht (50μ Einstein/m² Lichtintensität) kultiviert. Während dieses Kultivierungszeitraums entwickeln die Halbmeristeme Triebe, die aus den sekundären Meristemen der Achsel der Blattprimordien stammen. Nach 10 Tagen Kultivierung erscheinen auf der oberen Fläche der Blätter Höcker. Diese Höcker, die neomorphe Blattmeristeme darstellen, wandeln sich zu neomorphen Blattknospen (1). Diese Knospen entstammen Neoformationen von vegetativen Meristemen aus epidermalen und subepidennalen Zellen der oberen Oberfläche der Blätter.
Nach 30 Tagen Kultivierung zeigen die Blätter sekundäre Meristeme oder neomorphe Blattknospen, und die Blätter ohne neomorphe Blattknospen werden entnommen (1).
1.3 – Bombardement und Cokultivierung der Blätter aus Halbmeristemen
Diese Blätter werden mit einer Heliumpartikelkanone (Particle Inflow Gun, PIG) (FINER et al., 1992 – Plant Cell Reports, 11 : 323-328) mit Wolframteilchen (0,2 μm bis 2 μm Durchmesser) beschossen, um Mikroverletzungen auf den Explantaten hervorzurufen.
Die Wolframpartikel (50 mg) werden in 500 μl 95 % Ethanol 20 min sterilisiert, anschließend vier Mal durch Zentrifugation in sterilem Wasser (10.000 U/min, während 1 min) gespült. Die sterilen Partikel werden wieder in 300 μl TE-Puffer (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) aufgenommen. Ein Volumen von 2 μl nackten Partikeln wird für jedes Bombardement verwendet. Die Blätter werden mit der oberen Fläche nach oben auf eine Petrischale von 5 cm Durchmesser gelegt, die 15 g/l Gelosewasser enthielt. Die Petrischalen, die die Explantate enthalten, werden in den Schussbereich der Kanone gebracht, und ein Vakuum von 29 in.Hg wird angelegt. Das Bombardement der Teilchen erfolgt mit einem Druck von 8 bar in einem Abstand von 16 cm zwischen Kanone und zu bombardierenden Explantaten.
Die bombardierten Explantate werden anschließend in eine Petrischale von 9 cm Durchmesser übergeführt, die M2-Medium enthält, dem 200 μM Acetosyringon zugesetzt wurden. Ein Tropfen (1-10 μl) einer Suspension von „disarmed" Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (HOEKEMA et al., 1983 – Nature, 303: 179-180) aus einer Übernachtkultur mit einer optischen Dichte Do = 2 bei 600 nm wird auf das Explantat aufgebracht. Der Stamm LBA 4404 enthält den binären Vektor pGA492-GI (AN, 1986 – Plant Physiol., 81 : 86-91), ein Träger des NPT II-Gens, das Kanamycin-Resistenz verleiht, unter der Kontrolle des pNOS-Promotors (HERRERA-ESTRELLA et al., 1983 – EMBO J., 2 : 987-995) und des t-NOS-Terminators (DEPICKER et al., 1982 – Mol. Appl. Genet., 1 : 561-573), in den an der Sca I-Schnittstelle das GUS-Intron-Gen unter der Kontrolle des p35S-Promotors von CaMV und des t-NOS-Terminators inseriert wurde (VANCANNEYT et al., 1990 – Mol. Gen. Genet., 220: 245-250). Die bombardierten und mit Agrobacterium tumefaciens inokulierten Explantate werden 3 Tage lang bei 26 °C mit 16 h Licht (50μ Einstein/m²) cokultiviert. Durch die Kombination des Bombardements mit den nackten Teilchen und der Cokultivierung mit Agrobacterium tumefaciens lassen sich durch das Bombardement in den Zellen der Blätter und in den sekundären Meristemen Mikroverletzungen hervorrufen. Diese Mikroverletzungen gewährleisten das Eindringen des Bakteriums und eine höhere Transformationseffizienz nach dem Verfahren von BIDNEY et al., 1992 (Plant Mol Biol., 18: 301-313).
1.4 – Kultivierung der Blätter und Regeneration von Trieben ausgehend von neomorphen Blattknospen
Nach der Cokultivierung werden die Explantate wieder in eine Petrischale ausgebracht, enthaltend M2-Medium, dem Augmentin, 400 mg/l, zugesetzt wurde, und werden 15 Tage in eine Kulturkammer (16 h Licht, 15 μ Einstein/m², 23 °C und 8 h Dunkelheit, 21 °C) verbracht.
Nach 15-tägiger Kultivierung haben sich die neomorphen Blattknospen, die auf den bombardierten und cokultivierten Blättern erschienen oder bereits vorhanden sind, zu Trieben entwickelt, die 1 bis 5 Blätter und einen kurzen Stängel besitzen. Diese Triebe werden für die Analyse der Glucuronidaseaktivität abgetrennt und in einen Puffer übergeführt (1).
1.5 Analyse der Glucuronidaseaktivität in den aus neomorphen Blattknospen hervorgehenden Trieben
Die aus neomorphen Blattknospen hervorgehenden Triebe werden in einen GUS-Puffer, der 1 mg/ml X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäurecyclohexylammonium) (JEFFERSON, 1987- Plant Mol. Biol. Rep., 5 : 387-405) enthält, eingetaucht, unter Vakuum infiltriert und 24 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert.
Nach 24 h Inkubation besitzen die transformierten Zellen, die das GUS-Gen exprimiert haben, eine Glucuronidase-Aktivität (bezeichnet mit GUS+ Aktivität), sind in der Lage, das X-Gluc zu hydrolysieren, und setzen eine Verbindung von blauer Farbe frei.
Nach einer Inkubation von 24 h sind verschiedene Typen von Bereichen transformierter Zellen mit einer GUS+ Aktivität sichtbar (1).

– Spots von einigen mm Durchmesser, die auf der Oberfläche der Blätter der aus neomorphen Blattmeristemen regenerierten Triebe angeordnet sind. Diese Spots stammen von Zellen von neomorphen Blattmeristemen, die während des Bombardements und der Cokultivierung transformiert wurden.
– Große Bereiche von transformierten Zellen, die entweder blaue Kreise mit einem Durchmesser über 5 mm sein können oder blaue Halbblätter oder blaue Streifen von Zellen. Diese großen Bereiche entstammen transformierten Zellen, die im Inneren der Meristeme von neomorphen Blattknospen liegen, die vollständig transformierte Zellnachkömmlinge ergeben haben (Halbblätter – Kreise und Streifen).
– In einigen Fällen werden blaue Knospen oder sekundäre Meristeme, die Glucuronidase exprimieren, in der Blattachsel der Blätter der Triebe festgestellt. Diese sekundären Meristeme sind vollständig transformiert. Sie entstammen entweder internen Zellen der bombardierten und cokultivierten neomorphen Blattmeristeme, die während des Wachstums und während der Differenzierung eine achselständige Knospe in der Blattachsel eines Blattes ergeben haben, oder transformierten Zellen auf der Oberfläche des Blattes, das neomorphe Blattmeristeme und anschließend eine sekundäre Knospe neu gebildet hat.

Die Ergebnisse von Tabelle 1 erläutern den prozentualen Anteil von cokultivierten und bombardierten Blättern, die zu Trieben führten, die entweder Spots von GUS+-Zellen oder große Bereiche von GUS+-Zellen zeigen, oder sekundäre GUS-Meristeme ergeben haben. Der größte Teil der bombardierten Blattexplantate regeneriert Triebe ausgehend von neomorphen Blattknospen, die GUS+-Spots (80 %) und große GUS+-Bereiche (55 %) enthalten. Diese Triebe sind chimäre Keimlinge, bestehend aus einem Gemisch von transformierten und nicht transformierten Zellen.
Diese Triebe ergeben nur eine genetisch transformierte Nachkommenschaft, wenn transformierte Zellen in der Zone des Meristems vorliegen, welches die Keimzellen zur Bildung der Eizellen oder der Pollenkörner enthält. Im Gegensatz dazu enthalten 2 % der cokultivierten und bombardierten Blattexplantate transformierte Achselknospen, die in der Blattachsel der Blätter liegen, die von Trieben getragen werden, die aus neomorphen Blattknospen stammen. Der einzellige Ursprung dieser achselständigen Knospen impliziert, dass sie vollständig transformiert sind und eine Nachkommenschaft von transformierten Pflanzen nach der Mendelschen Segregation ergeben (mindestens ¾ transformierte Pflanzen und ¼ nicht transformierte Pflanzen).
Beispiel 2: Transformation von Halbmeristemen zur Analyse der Expression der Glucuronidase in den aus Halbmeristemen regenerierten Trieben (2).
2.1 – Herstellung der Halbmeristeme
Die Herstellung der Halbmeristeme ist identisch mit der in Beispiel 1 dargestellten (Abschnitt 1.1).
2.2 – Vorkultivierung der Halbmeristeme
Die Halbmeristeme werden 1, 5, 8 und 12 Tage in M2-Medium, enthaltend Acetosyringon, 200 μM, bei 26 °C mit 16 h Licht (50μ Einstein/m²) vorkultiviert.
Nach der Vorkultivierung bilden die Halbmeristeme kleine Triebe, die sich aus den sekundären Meristemen und aus dem Apikalmeristem entwickelt haben. Die Entwicklung dieser Triebe ist eine Funktion der Vorkultivierungsdauer. Je länger die Vorkultivierungsdauer, desto mehr Triebe entwickeln sich. Nach 12-tägiger Vorkultivierung tragen die Triebe Blätter und neomorphe Blattknospen an der oberen Oberfläche der Blätter (2).
2.3 – Bombardement und Cokultivierung der vorkultivierten Halbmeristeme
Nach der Vorkultivierung werden die Halbmeristeme nach dem in Beispiel 1, Abschnitt 1.3 beschriebenen Protokoll bombardiert und cokultiviert.
2.4 – Kultivierung der bombardierten und cokultivierten Halbmeristeme
Die Halbmeristeme werden nach Vorkultivierung, Bombardierung und Cokultivierung in Petrischalen von 9 cm Durchmesser, enthaltend M2-Medium, dem 400 mg/l Augmentin zugesetzt wurde, kultiviert und in eine Kulturkammer (16 h Licht, 15 μ Einstein/m², 23 °C und 8 h Dunkelheit, 21 °C) gebracht.
Nach 15-tägiger Kultivierung entwickeln sich aus den achselständigen Knospen, dem Apikalmeristem und auch aus den neomorphen Blattknospen, die auf der oberen Oberfläche der Blätter erschienen sind, mehrere Triebe, die 1 bis 5 Blätter und einen Stängel besitzen.
2.5 – Analyse der Glucuronidaseaktivität in den aus Halbmeristemen entstandenen Trieben (2)
Die aus den Halbmeristemen gebildeten Triebe werden abgetrennt und hinsichtlich der Expression der Glucuronidaseaktivität analysiert. Die Bedingungen des Tests der Glucuronidaseaktivität sind in Beispiel 1, Abschnitt 1.5 beschrieben. Die Zellformen mit einer Glucuronidaseaktivität werden festgestellt (2):

– Spots von blauen transformierten Zellen, die Glucuronidase exprimieren (GUS+)
– große Bereiche oder Streifen von Zellen, die Glucuronidase exprimieren (GUS+)
– vollständig blaue sekundäre Meristeme in der Blattachsel der Blätter, die Glucuronidase exprimieren (GUS+)
– ferner erscheinen im Falle der Transformationen von vorkultivierten Halbmeristemen (1 bis 12 Tage) transformierte GUS+ neomorphe Blattknospen auf der oberen Oberfläche der Blätter (2). Diese neomorphen Blattknospen entstammen transformierten Zellen, die während des Bombardements und der Cokultivierung des Halbmeristems auf den jungen Blättern angeordnet sind. Diese Zellen entwickeln sich anschließend zu neomorphen Blattknospen. Der einzellige Ursprung dieser neomorphen Blattknospen gestattet den Erhalt von vollständig transformierten Knospen, die vollständig transformierte Pflanzen ergeben.

Die Transformationshäufigkeiten, die durch Bombardement von Halbmeristemen erhalten wurden, sind erhöht; 38 bis 70 % von bombardierten und cokultivierten Halbmeristemen zeigen GUS+-Spots, und 26 bis 47 % zeigen große GUS+-Bereiche (Tabelle 2).
Der prozentuale Anteil an bombardierten und cokultivierten Halbmeristemen, die große GUS+-Bereiche zeigen, ist am höchsten, wenn die Halbmeristeme 5 Tage (40 %) und 8 Tage (47 %) vorkultiviert wurden (Tabelle 2).
Nur die 5 Tage vorkultivierten Halbmeristeme haben Triebe mit vollständig blauen achselständigen Blattknospen oder vollständig blaue neomorphe Blattknospen ergeben.
Diese vollständig transformierten neomorphen achselständigen Knospen oder Blattknospen ergeben vollständig transformierte Pflanzen, deren Nachkommenschaft mindestens ¾ transformierte Pflanzen und ¼ nicht transformierte Pflanzen darstellen werden. Eine Vorkultivierungsdauer von 5 Tagen ist demnach die optimale Dauer für das in dieser Erfindung beschriebene Standardprotokoll.
Beispiel 3: Transformation von Halbmeristemen oder aus Halbmeristemen entstandenen Blättern (3 und 4)
3.1 – Transformation von aus Halbmeristemen entstandenen Blättern
Die Herstellung und Vorkultivierung der Halbmeristeme, das Bombardement und die Cokultivierung der aus Halbmeristemen entstandenen Blätter erfolgen nach dem in Beispiel 1 (Abschnitte 1.1, 1.2 und 1.3) beschriebenen Protokoll.
3.2 – Transformation von Halbmeristemen
Die Herstellung, Vorkultivierung, das Bombardement und die Cokultivierung der Halbmeristeme erfolgen nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll (Abschnitte 2.1, 2.2, 2.3).
3.3 – Selektion der Kanamycin-resistenten Triebe
3.3.1 Erste Selektionskultivierung in Gegenwart von Kanamycin (3)
Nach der Cokultivierung werden die Explantate (Halbmeristeme oder Blätter) in eine Petrischale von 9 cm Durchmesser überführt, die M2-Medium enthält, dem 400 mg/l Augmentin und 50, 100, 200 und 400 mg/l Kanamycin zugesetzt waren.
Die Schalen, die die Explantate enthalten, werden zur Kultivierung 15 Tage in eine Kulturkammer gebracht (16 h Licht, 15 μ Einstein/m², 23 °C und 8 h Dunkelheit, 21 °C). Während dieser Kultivierung entwickeln sich die Explantate, um Triebe zu ergeben, die 1 bis 5 Blätter und einen kurzen Stängel besitzen (3).
Nach 15 Tagen Kultivierung auf dem Selektionsmedium, das Kanamycin enthält, weisen die regenerierten Triebe verschiedene Aspekte auf, je nach Menge an Kanamycin-resistenten transformierten Zellen, aus denen sie bestehen:

– Triebe, die Blätter mit weißen oder gelben Bereichen tragen, bestehend aus nicht transformierten Kanamycin-empfindlichen Zellen, und grünen Bereichen, bestehend aus transformierten Kanamycin-resistenten Zellen.
– Triebe, die grüne achselständige Knospen in der Blattachsel der Blätter während der Entwicklung tragen. Diese achselständigen grünen Knospen sind transformiert und entwickeln sich in Gegenwart von Kanamycin zu achselständigen Trieben.
– Triebe, die auf ihren Blättern gelbe oder weiße nicht transformierte neomorphe Kanamycin-empfindliche Blattknospen tragen.
– Vollständig weiße oder gelbe nicht transformierte Kanamycin-empfindliche Triebe.
– Triebe, die auf den Blättem Knospen oder Kanamycin-resistente grüne neomorphe Blattmeristeme, die sich in der Entwicklung befinden, tragen.

3.3.2 – Zweite Selektionskultivierung in Gegenwart von Kanamycin (3)
Die grünen achselständigen Triebe, die grünen achselständigen Knospen und die grünen Meristeme oder neomorphen Blattknospen werden erneut auf M2-Medium, das Augmentin, 400 mg/ml und Kanamycin (50-100-200 und 400 mg/l) enthält, ausgepflanzt und 15 Tage unter den gleichen Kulturbedingungen wie zuvor (Abschnitt 3.3.1) inkubiert.
Nach diesem Kultivierungszeitraum haben sich die achselständigen Knospen und die neomorphen Blattknospen erneut zu Trieben entwickelt (3).

– Bestimmte nicht transformierte Triebe sind vollständig weiß, was eine Kanamycin-Empfindlichkeit anzeigt.
– Bestimmte Triebe haben Blätter, die grüne Teile aufweisen, bestehend aus Kanamycin-resistenten transformierten Zellen, und weiße Teile, bestehend aus nicht transformierten Kanamycin-empfindlichen Zellen.

Die Gegenwart von nicht vollständig transformierten Trieben zeigt an, dass am Ende der ersten Kultivierung nicht alle grünen Achsel- und neomorphen Blattknospen vollständig transformiert waren und chimäre Triebe, bestehend aus einem Gemisch von transformierten und nicht transformierten Zellen, entstehen ließen.

– Bestimmte chimäre Triebe weisen grüne sekundäre Meristeme oder Achselknospen auf, die Kanamycin-resistent sind.
– Bestimmte chimäre Triebe weisen Blätter mit grünen und weißen Bereichen auf, die neomorphe grüne Blattknospen oder Blattmeristeme tragen, die Kanamycinresistent sind.
– Bestimmte Triebe weisen grüne Blätter auf, die grüne Achselknospen oder sekundäre Meristeme tragen. Diese Triebe, die aus transformierten Zellen bestehen, sind Kanamycin-resistent.

Diese vollständig grünen Triebe, die aus Achselknospen oder neomorphen Blattknospen oder Blattmeristemen stammen, entwickeln sich. Diese Triebe bestehen aus einer großen Anzahl von transformierten Kanamycin-resistenten Zellen.
Unter den am Ende der zweiten Kultivierung erhaltenen Trieben wird eine bestimmte Anzahl von vollständig grünen Trieben festgestellt, obwohl am Ende der ersten Kultivierung kein vollständig grüner Trieb festgestellt wurde, was anzeigt, dass bestimmte in der zweiten Kultivierung in Gegenwart von Kanamycin kultivierte Achselknospen oder neomorphe Blattknospen vollständig transformiert waren.
3.3.3 – Dritte Selektionskultivierung in Gegenwart von Kanamycin (4)
Die vollständig grünen Triebe, die grünen achselständigen Knospen und die grünen neomorphen Blattknospen oder Blattmeristeme werden abgetrennt und wieder in M2-Medium ausgepflanzt und wie zuvor (Abschnitt 3.3.1) (3 und 4) kultiviert.
Nach 15 Tagen Kultivierung entwickeln sich aus diesen Explantaten Triebe. Der größte Teil der Triebe ist vollständig grün und entwickelt sich schnell auf dem M2-Medium, das Kanamycin enthält. Diese Triebe sind vollständig transformiert. Eine kleine Anzahl von Trieben zeigt noch grüne Bereiche und Bereiche von weißen Zellen. Diese chimären Triebe werden verworfen (4).
Nur die grünen Triebe werden wieder in einem SORBAROD-Kultursystem ausgepflanzt. Das SORBAROD-Kultursystem besteht aus einem geschlossenen und sterilen Miniaturtreibhaus, enthaltend Cellulosezylinder, die mit M3-Medium (Makroelemente, Mikroelemente, Fe-EDTA und Vitamine des MS-Mediums), dem 10 g/l Saccharose zugesetzt wurde, befeuchtet sind. Das Miniaturtreibhaus ist mit 3 Öffnungen perforiert, die mit einer Membran bedeckt sind, die den Gasaustausch gewährleistet und die relative innere Feuchtigkeit mit der relativen äußeren Feuchtigkeit ins Gleichgewicht bringt.
Die grünen Triebe der dritten Kultivierung werden in Cellulosezylinder eingepflanzt und in den SORBAROD-Miniaturtreibhäusern angeordnet (4). Die Miniaturtreibhäuser werden in einer Kulturkammer (16 h Licht, 23 °C, 15 μ Einstein/m², und 8 h Dunkelheit, 21 °C) angeordnet. Nach 30 Tagen Inkubation sind die transformierten Pflanzen bewurzelt und entwickeln sich. Das M3-Medium wird anschließend durch Pipettieren entfernt, und die Zylinder werden dreimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült, und anschließend werden die Zylinder mit M4-Medium (Makroelemente, Mikroelemente, Fe-EDTA und Vitamine des MS-Mediums), saccharosefrei, befeuchtet. Nach 10 Tagen Kultivierung in der Kulturkammer entwickeln die Pflanzen große Blätter und erreichen eine Höhe von 2 bis 3 cm. Die SORBAROD-Miniaturtreibhäuser werden für 10 Tage in ein Treibhaus überführt (Temperatur 26 °C, Lichtdauer 16 h/8 h). Während dieses Zeitraums entwickeln sich die bewurzelten Pflanzen und akklimatisieren sich an die Treibhausbedingungen. Anschließend werden die Zylinder, die Sonnenblumenpflanzen mit entwickelten Wurzeln und Blättern tragen, in Töpfe überführt, die Torf enthalten, der mit einer Lösung vom Typ COIC und LESAINT (1971 – Hortic. Fr., 8 : 11) gegossen wurde.
Die nicht bewurzelten Pflanzen werden auf Pfropfträgerstängel gepfropft (nicht transformierte Sonnenblume, Stadium 4 bis 6 Blätter nach dem Aufgehen). Die Basis des Stängels der transformierten Pflanze wird schräg abgeschnitten und in einem Spalt angeordnet, der auf den Stängel des Pfropfträgers realisiert wurde. Der Pfröpfling wird mit einem Bastband auf dem Pfropfträger befestigt und mit einem Plastikbeutel umwickelt. Nach Ansetzen des Pfropfs entwickeln sich die Blätter und der Stängel, und der Plastikbeutel wird entfernt. Die Pfropfträger und die Pfröpflinge werden anschließend in ein Treibhaus mit Gießen mit einer Nährlösung vom Typ COIC und LESAINT (1971 – Hortic. Fr., 8: 11) gebracht.
Die Sonnenblumenpflanzen wachsen, blühen und befruchten sich selbst. Die Samen von jeder transformierten Pflanze werden zur Analyse der Segregation des Kanamycin-Resistenzgens und des GUS-Gens geerntet (siehe Beispiel 8).
Beispiel 4: Einfluss des Bakterienstamms und des binären Plasmids auf die Effizienz der genetischen Transformation der aus Halbmeristemen entstandenen Blätter
Die aus Halbmeristemen entstandenen Blätter werden bombardiert und mit verschiedenen Stämmen cokultiviert:

– LBA 4404, enthaltend das binäre Plasmid PGA 492-GI (beschrieben in Beispiel 1, Abschnitt 1.3)
– GV 2260, enthaltend das binäre Plasmid p35S GUS-Intron (VANCANNEYT et al., 1990 – Mol. Gen. Genet, 220 : 245-250)
– C58'3 (MULLINEAU et al., 1989 – Plant Sci., 63: 237-245), enthaltend das Plasmid pGA 492-GI (Cf Beispiel 1, Abschnitt 1.3)

Nach 6 Wochen Kultivierung der Blätter (nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll) auf Selektionsmedium, enthaltend 100 mg/l oder 200 mg/l Kanamycin, wird mit den Kanamycin-resistenten grünen Trieben ein Expressionstest auf Glucuronidaseaktivität durchgeführt. Wenn die Zellen die Glucuronidaseaktivität exprimieren, wird diese Aktivität als Aktivität GUS+ bezeichnet. Das Protokoll zum Testen der Glucuronidaseaktivität ist in Beispiel 1, Abschnitt 1.5, beschrieben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
Nur die regenerierten Triebe aus Cokulturen mit GV 2260 (pGUS Intron) und LBA 4404 (pGA 492 GI) zeigen eine Expression der Glucuronidase (GUS+-Aktivität). Mit dem Stamm C58'3 wurde keinerlei GUS+-Aktivität nachgewiesen. Der prozentuale Anteil an bombardierten und cokultivierten Explantaten, die mindestens einen Trieb mit großen Bereichen zeigen, die eine GUS+-Aktivität exprimieren, ist viermal höher wenn die Explantate mit dem Stamm LBA 4404 (pGA 492-GI) cokultiviert sind als wenn sie mit dem Stamm GV 2260 (pGUS-Intron) cokultiviert sind. Nur durch den Stamm LBA 4404 lassen sich Triebe oder sekundäre Meristeme erhalten, die in allen Zellen eine GUS+-Aktivität aufweisen.
Beispiel 5: Einfluss des Bakterienstammes und des binären Plasmids auf die Effizienz der genetischen Transformation von Halbmeristemen
Die Halbmeristeme werden bombardiert und mit den Stämmen LBA 4404 (pGA 492-GI), C58'3 (pGA 492-GI) und GV 2260 (p35S GUS Intron), beschrieben in Beispiel 4, bombardiert und cokultiviert.
Nach 6 Wochen Kultivierung nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll wurde die Anzahl von Halbmeristemen, die in Gegenwart von Kanamycin (100 mg/l) Triebe zu entwickeln vermochte, erfasst (Tabelle 4).
Die Ergebnisse sind die Folgenden:
Die Transformationseffizienz ist definiert als prozentualer Anteil bombardierter und cokultivierter Halbmeristeme, die mindestens einen Kanamycin-resistenten Trieb ergeben.
Durch die Cokultivierung von Halbmeristemen mit dem Stamm LBA 4404 (pGA 492-GI) lässt sich ein prozentualer Anteil von 4,5 % von Halbmeristemen erhalten, die nach 6 Wochen in dem Medium M2, das 100 mg/l Kanamycin enthält, Kanamycinresistente transformierte Triebe initiieren. Dieser prozentuale Anteil ist viermal höher als der mit dem Stamm GV 2260 (p35S Gus-Intron) erhaltene Prozentsatz. Mit dem Stamm C58'3 wurde kein Kanamycin-resistenter Trieb erhalten.
Der Stamm LBA 4404 (pGA 492-GI) wurde für das Standardprotokoll (beschrieben in Beispiel 3) gewählt, da sich durch ihn routinemäßig in erhöhter Zahl vollständig transformierte Triebe erhalten lassen.
Beispiel 6: Einfluss der Konzentration an Kanamycin auf die genetische Transformation von Halbmeristemen
Die bombardierten und mit dem Stamm LBA 4404 (pGA 492-GI) cokultivierten Halbmeristeme werden 6 Wochen in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Kanamycin, 50, 100, 200, 400 mg/l, in M2-Medium (nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll) kultiviert. Nach 6 Wochen Kultivierung werden die Kanamycin-resistenten grünen Triebe einem Test auf Expression der Glucuronidase (Protokoll beschrieben in Beispiel 1, Abschnitt 1.5) unterzogen.
Die Ergebnisse sind die Folgenden (Tabelle 5):
Tabelle 5 zeigt die Wirkungen von Kanamycin auf den prozentualen Anteil von Halbmeristemen, die eine Expression der Glucuronidase zeigen. 25 bis 30 % der bombardierten und cokultivierten Halbmeristeme ergeben mindestens einen Trieb, der die Glucuronidase in Form von Spots exprimiert, gleich welche Konzentration an Kanamycin verwendet wird. Eine Selektion auf hoher Kanamycinkonzentration (200 mg/l oder 400 mg/l) vermindert etwas den prozentualen Anteil von Halbmeristemen, die Triebe mit GUS+-Spots ergeben, vermindert allerdings deutlich den prozentualen Anteil an Halbmeristemen, die Triebe mit großen GUS-Bereichen ergeben. Nur durch die Konzentrationen von 50 mg/l und 100 mg/l lassen sich nach Selektion 3,3 % vollständig transformierte Triebe erhalten. Die Konzentration von 50 mg/l Kanamycin wurde für das Standardprotokoll (beschreibt die 3 und 4) gewählt; bei dieser Konzentration können resistente Triebe, die Glucuronidase exprimieren, routinemäßig und in erhöhter Zahl erhalten werden.
Beispiel 7: Effizienz der Transformation von verschiedenen Sonnenblumen-Genotypen
7.1 – Eignung zur vegetativen Vermehrung von Halbmeristemen und zur Neubildung von neomorphen Blattmeristemen
In einem Vorexperiment wurden 50 Sonnenblumenlinien auf ihre Fähigkeit selektioniert, achselständige Triebe, ausgehend von Halbmeristemen, und neomorphe Blattmeristeme auf den Blättern von Trieben zu induzieren. Alle getesteten Linien regenerieren achselständige Triebe aus Halbmeristemen mit prozentualen Anteilen, die von 20 bis 90 % schwanken. Sämtliche getesteten Linien ergeben 7 bis 44 % Halbmeristeme, die achselständige Triebe bilden, die auf der oberen Oberfläche der Blätter neomorphe Blattmeristeme tragen. Mehr als 60 % der getesteten Linien ergeben mindestens 20 % Halbmeristeme, die achselständige Triebe mit auf den Blättern neomorphen Blattmeristemen regenerieren.
7.2 – Eignung zur Transformation von Halbmeristemen
Unter den 50 Linien wurden 10, die eine besondere Eignung zur vegetativen Vermehrung von Trieben und zur Initiierung von Meristemen zeigen, zur Bestimmung der Effizienz der genetischen Transformation von Halbmeristemen gewählt.
Etwa 200 Halbmeristeme für jede der 16 Linien wurden bombardiert und mit dem Stamm LBA 4404 (pGA 492-GI) bombardiert und cokultiviert und anschließend 6 Wochen (nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll) auf M2-Medium, das 400 mg/l Augmentin und 50 mg/l Kanamycin enthielt, kultiviert.
Nach 6 Wochen der Selektion von Kanamycin-resistenten Trieben (50 mg/l) ergeben sämtliche getesteten Linien mindestens ein Halbmeristem, das achselständige Kanamycin-resistente Triebe bildet, was zeigt, dass sich durch das beschriebene Verfahren zu 100 % vollständig transformierte Sonnenblumenpflanzen aus den getesteten Sonnenblumenlinien erhalten lassen (Tabelle 6).
Die Transformationseffizienz schwankt von 0,5 bis 6 %, je nach Linie. Die Linien, die die stärkste Transformationseffizienz ergeben (LG15, LG60 und LG61), hatten auch die stärkste Eignung zur vegetativen Vermehrung aus Halbmeristemen, was eine positive Korrelation zwischen der Eignung zur Transformation durch das in der Erfindung beschriebene Verfahren und mit der Eignung zur Regenerierung aus Halbmeristemen nahe legt.
Beispiel 8: Analyse der transformierten, aus Halbmeristemen regenerierten Pflanzen und ihrer Nachkommenschaft
Die Kanamycin-resistenten Triebe, die in das SORBAROD-System überführt und im Gewächshaus akklimatisiert wurden (Beispiel 3), werden im Gewächshaus kultiviert. An diesen Pflanzen entwickeln sich mehrere Verzweigungen mit jeweils einem Blütenköpfchen.
Analysen der Glucuronidaseaktivität wurden an jeder Pflanze und jeder Verzweigung vorgenommen. Für jede Verzweigung wird ein Glucuronidaseaktivitätstest an einem Blatt, an einer Blüte mit Hüllblättchen (Blüte, die in einem Kreis des Blütenkopfes angeordnet ist, der eine Petale besitzt) und an einer Einzelblüte (interne Blüte des Blütenkopfes ohne Petale) durchgeführt. Die Analysen der GUS-Aktivität haben die Bestimmung des prozentualen Anteils von vollständig transformierten Pflanzen, die eine Nachkommenschaft ergeben, deren inserierte Gene (NPT II-Gen und GUS-Gen) sich auf Mendelsche Weise segregieren, zum Ziel. Derartige Pflanzen müssen aus transformierten Zellen in sämtlichen Geweben und Organen und insbesondere in den Blütenorganen bestehen, die die Eizellen und Pollen enthalten, die nach der Befruchtung den in dem Samen enthaltenen zygotischen Embryo ergeben. Eine Pflanze wird als vollständig transformiert betrachtet, wenn sie eine GUS-Aktivität in sämtlichen ihrer Verzweigungen und für jede der Verzweigungen, in den Blättern, den Einzelblüten und den Blüten mit Ligulae besitzt.
Tabelle 7 zeigt, dass 92 % der im Gewächshaus durch die in dieser Beschreibung beschriebene Erfindung kultivierten transformierten Pflanzen vollständig transformiert sind: Für diese Pflanzen besitzen sämtliche Verzweigungen Blätter, Blüten mit Ligulae, Einzelblüten, die eine Glucuronidaseaktivität exprimieren.
Im Gegensatz dazu weisen 8 % der transformierten Pflanzen Merkmale von chimären Pflanzen auf:

– 1,5 % der Pflanzen haben bestimmte Verzweigungen, bei denen die Blätter und die Blütenköpfe eine GUS+-Aktivität zeigen, und andere Verzweigungen, deren Blätter und Blütenköpfe keine Glucuronidaseaktivität zeigen.

Diese chimären Pflanzen entstammen Trieben, von denen bestimmte Achselknospen transformiert und andere Achselknospen nicht transformiert waren.

– 6,5 % der Pflanzen haben Verzweigungen, bei denen die Blätter eine Glucuronidaseaktivität zeigen und die Einzelblüten oder die Blüten mit Ligulae keine Glucuronidase exprimieren.

Diese chimären Pflanzen entstammen Trieben, deren Achselknospen aus transformierten Zellen auf dem Niveau des meristematischen vegetativen Rings, die Ausgangspunkt für vegetative Teile sind (Blätter, Stängel und Blattstiele) und aus nicht transformierten Zellen auf dem Niveau des medulären Teils des Meristems, die Ausgangspunkt für Blütenorgane und Reproduktionsorgane sind, bestehen.
Der erhaltene prozentuale Anteil von chimären Pflanzen ist gering (8 %). Bei der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Technik werden die Pflanzen mit einer Blüte mit Ligula oder einer Einzelblüte, die keine Glucuronidaseaktivität exprimiert, als Chimäre betrachtet und werden verworfen.
Die vollständig transformierten Pflanzen werden durch mehrere aufeinander folgende Durchgänge, um den Pollen auf jedes Blütenköpfchen auszubreiten, selbst befruchtet. Die Samen werden anschließend 1 bis 2 Monate nach der Befruchtung geerntet. Die Samen werden durch 5 h Einweichen in Ethrel (0,1 % Lösung in Wasser) behandelt, anschließend enthülst und sterilisiert (nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll). Die sterilisierten Samen werden anschließend in MO-Medium, enthaltend 100 mg/l Kanamycin, in Phytatray-Kulturtlaschen (SIGMA Ref. P1552) keimen gelassen. Nach 15 Tagen Keimung sind die transformierten Kanamycin-resistenten Keimlinge grün und entwickeln grüne Blätter. Die nicht transformierten Kanamycin-empfindlichen Keimlinge sind weiß und entwickeln weder Wurzeln noch grüne Blätter.
Ein Glucuronidaseaktivitätstest wird an den grünen Blättern der Kanamycinresistenten Keimlinge durchgeführt.
Der prozentuale Anteil an Kanamycin-resistenten Keimlingen und der prozentuale Anteil an Pflanzen, die das GUS-Gen exprimieren, werden bestimmt (Tabelle 8).
Die Segregation der GUS- und NPT II-Gene in den Nachkommenschaften der vollständig transformierten Pflanzen folgt einer Segregation vom Mendelschem Typ, denn in fast sämtlichen Fällen exprimieren mindestens ¾ der Pflanzen das NPT II-Gen oder das GUS-Gen, und ¼ der Pflanzen sind nicht transformiert. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die produzierten Pflanzen vollständig transformiert und nicht chimär sind.
Molekularbiologische Analysen dieser transgenen Pflanzen wurden durchgeführt, um die Anzahl der Insertionsstellen und die Anzahl von TDNA-Kopien zu identifizieren und um die Ränder des Inserts zu kartographieren.

Claims

Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die vollständig in der Generation T₀ transformiert werden, umfassend: a. einen Schritt zur genetischen Transformation eines meristematischen Explantats; b. die Kultivierung des meristematischen Explantats, das den Transformationsschritt durchlaufen hat, auf einem Selektionsmedium; c. die Entnahme der transformierten Achselknospen und gegebenenfalls der transformierten neomorphen Blattknospen, die in Schritt b erhalten wurden; d. die Kultivierung der gemäß Schritt c erhaltenen transformierten Knospen auf Selektionsmedium; e. die wenigstens einmalige Wiederholung der Schritte c und d, um vollständig transformierte sekundäre Meristeme und gegebenenfalls vollständig transformierte neomorphe Blattmeristeme zu erhalten; f. die Regeneration von transgenen Pflanzen ausgehend von in Schritt e erhaltenem Zellmaterial;
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das meristematische Explantat vor dem Schritt der Transformation einen Schritt der Vorkultur von 5 bis 30 Tagen Dauer, vorzugsweise zwischen 5 und 8 Tagen, in einem Kulturmedium durchläuft, das ein Cytokinin enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das meristematische Explantat aus einem Primärmeristem oder einer neomorphen Blattknospe oder aber aus einem einzelnen jungen Blatt besteht, das ausgehend von einem primären oder sekundären Meristem regeneriert wurde und Zellen enthält, die die Bildung von neomorphen Blattmeristemen ermöglichen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Transformationsschritt das Bombardement mindestens eines Teils des Explantats mit Mikropartikeln umfasst, wobei das bombardierte Explantat anschließend mit Agrobacterium in Kontakt gebracht wird, das mindestens eine Nucleinsäuresequenz enthält, die in die meristematischen Zellen eingeführt werden soll.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Transformationsschritt das Bombardement mindestens eines Teils des Explantats mit Mikropartikeln umfasst, die mit DNA ummantelt sind, die in die meristematischen Zellen eingeführt werden soll.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Transformationsschritt das Inkontaktbringen des Explantats mit einer Agrobacterium-Suspension umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäuresequenz, die in die Pflanzenzellen eingeführt werden soll, ein Resistenzgen gegen Insekten, Herbizide, Pilzkrankheiten, zum Beispiel Sclerotinia sclerotorium oder Botrytis cinerea, ein oder mehrere Gene für Speicherproteine von Samen, oder Gene, die die Qualität der Speicherproteine verbessern, die Fruchtreife modifizierende Sequenzen, Virusresistenz vermittelnde Sequenzen, ein oder mehrere am Metabolismus der Fettsäuren oder der Aminosäuren beteiligte Gene oder ein an der maskulinen Sterilität beteiligtes Gen umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäuresequenz, die in die Pflanzenzellen eingeführt werden soll, eine Sequenz umfasst, die ein Agens codiert, das die Selektion der Transformanten erlaubt, z.B. ein Agens, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum wie Kanamycin verleiht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens, z.B. Stamm LBA 4404, ist, das einen binären Vektor, z.B. pGA492-GI, enthält.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das in den Schritten der Vorkultur, der Co-Kultur und der Selektion verwendete Kulturmedium das Medium MS ist, angereichert mit etwa 0,05 bis 2,0 mg/l BAP, vorzugsweise 0,1 mg/l BAP, und im Fall des Selektionsmediums mit mindestens einem Selektionsagens, z.B. Kanamycin, sowie gegebenenfalls bakteriologischen Agenzien.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium während der Schritte der Vor- und der Co-Kultur, auch mit einer Phenolverbindung, z.B. mit Acetosyringone, angereichert ist, die die Aktivierung der vir-Gene des Agrobacteriums ermöglicht.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die hergestellte transgene Pflanze eine transgene Sonnenblume ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das meristematische Explantat von der Baumwolle, von einer Ölpflanzenart, z.B. der Sonnenblume (Helianthus annuus), von einer zur Familie der Leguminosen gehörenden Pflanzenart, z.B. der Erbse (Pisum sativum), der Bohne (Phaseolus vulgaris), von einer zur Familie der Cucurbitaceae gehörenden Pflanzenart, z.B. dem Zuchino (Cucurbita pepo) stammt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das meristematische Explantat von der Sonnenblume stammt.
Verfahren zur Herstellung von vollständig transformierten sekundären Meristemen oder von vollständig transformierten neomorphen Blattmeristemen, gekennzeichnet durch: i) die Ausführung eines Schritts zur genetischen Transformation der meristematischen Explantate; ii) die Kultivierung der Explantate, die den Transformationsschritt durchlaufen haben, auf einem Selektionsmedium; iii) die Entnahme der transformierten Achselknospen, sowie gegebenenfalls der transformierten neomorphen Blattknospen, die in Schritt ii) erhalten wurden; iv) die Kultivierung der gemäß Schritt iii) erhaltenen transformierten Knospen auf einem Selektionsmedium; v) die mindestens einmalige Wiederholung der Schritte iii) und iv).
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Meristeme von der Sonnenblume stammen.