DE102016113714A1

DE102016113714A1 - Transfektionsverfahren mit nicht-viralen Genliefersystemen

Info

Publication number: DE102016113714A1
Application number: DE102016113714.6A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2016-07-26
Publication date: 2018-02-01
Also published as: WO2018019341A1; US20190264228A1

Abstract

Vorliegende Erfindung offenbart ein Transfektionsverfahren zum Einschleusen von Nukleinsäuren in eukaryotischen Zellen mittels eines nicht-virales Genliefersystem, wobei die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptoren behandelt werden, sowie eine Zusammensetzung und ein Baukastensystem für ein solches Verfahren.

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Transfektionseffizienz von nicht-viralen Genliefersystemen, sowie eine Zusammensetzung dafür und ein zugehöriges Baukastensystem.
Hintergrund der Erfindung
Das Einschleusen von Nukleinsäuren (DNA, RNA, etc.) in eukaryotische Zellen, auch als Transfektion bezeichnet, stellt eine Schlüsseltechnologie in der modernen Biotechnologie dar, da sie den Zugriff auf den zentralen Steuerungsapparat einer Zelle und damit beispielsweise die Herstellung oder das Ausschalten bestimmter Proteine erlaubt. Die Transfektion mit DNA oder mRNA erlaubt beispielsweise die Expression (Herstellung) eines beliebigen Proteins, die Transfektion mit siRNA, Ribozymen oder Antisense Molekülen erlaubt, beispielsweise durch RNA-Interferenz, den „Knockdown“ (Ausschalten) eines Gens bzw. eines Proteins. Aber auch microRNA kann in Zellen eingeschleust werden und es kann auf diese Weise Einfluss auf regulatorische Funktionen ausgeübt werden. Diese Schlüsseltechnologie findet sowohl in Forschungslaboratorien, in der Medizin und bei der industriellen Erzeugung von Proteinen Anwendung. Nicht zuletzt sei auf die grundlegende Anwendung der Transfektion bei dem "Genome Editing" nach der CRISPR/Cas9 Methode erwähnt, welches erlaubt sehr gezielt das Genom einer Zelle zu verändern, hingewiesen.
Insbesondere ermöglicht diese Schlüsseltechnologie in humanen Zellen durch Mutation zerstörte Gene zu ersetzen und somit Fehlfunktionen zu heilen. Auch können beispielsweise Krebszellen durch entsprechende Suizidgene zum „Selbstmord“ gezwungen werden. Der „Knock-down“ eines Gens stellt eine weitere Möglichkeit dar, heilend zu wirken, z.B. indem wichtige Gene für Angiogenese in Krebsgeschwüren stillgelegt werden. Unter Knock-down wird eine Abschwächung oder Ausschaltung der Translation einer mRNA zu einem Protein bei der Proteinbiosynthese verstanden. Viele Krankheiten werden durch eine Fehlsteuerung von Zellen ausgelöst, die mittels microRNA aufgehoben werden könnte.
Wie erfolgreich eine solche Transfektion ist, wird unter anderem über die sogenannte Transfektionseffizienz definiert. Unter einer Transfektionseffizienz versteht man dabei die Menge einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte Protein codiert, oder auch das Ausmaß eines Knock-downs einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches einen solchen Knock-down auslösen kann. Als genetisches Material findet insbesondere siRNA, Antisense-RNA, Ribozyme, Antisense-DNA oder DNA, die für siRNA oder Ribozyme codiert, Verwendung. Häufig wird die Transfektionseffizienz auch durch den Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten genetischen Materials in Folge von Transfektionsprozessen zeigt, definiert.
Um Nukleinsäuren in Zellen einschleusen zu können, braucht man in der Regel Genliefersysteme, die zumindest die Membranbarriere der Zellen für die Nukleinsäure passierbar macht. Im Folgenden wird deshalb unter Transfektion eine Behandlung von eukaryotischen Zellen durch ein Genliefersystem und Nukleinsäuren verstanden.
Üblicherweise werden die vorhandenen Genliefersysteme in zwei Hauptgruppen unterteilt, nämlich virale Systeme und nicht-virale Systeme.
Bei den insbesondere in der Gentherapieforschung bevorzugten viralen Systemen, werden Viren als Genliefersysteme angewendet. Da das Einbringen von Nukleinsäuren, insbesondere DNA oder RNA, in Fremdzellen ein integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist, wurde diese Fähigkeit durch einen natürlichen, evolutiven Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit verfeinert, dass es ein äußerst effektives Genliefersystem darstellt. Die eingesetzten Viren werden dabei durch Genmanipulation so verändert, dass sie keine pathogenen Eigenschaften mehr besitzen und sich nicht mehr reproduzieren können.
Nachteilig an den viralen Systemen ist jedoch, dass die Viren dem Immunsystem eine große Angriffsfläche bieten, da das Immunsystem in einem ebenso evolutionären Anpassungsprozess Strategien entwickelt hat, sich den Viren zur Wehr zu setzen. Die Immunabwehr und die Aktivierung von Onkogenen durch zufällige Integration von genetischem Material in das Genom sind ungelöste Probleme, sodass es trotz jahrzehntelanger Forschung weltweit nur vereinzelt zugelassene Gentherapien gibt. In der Grundlagenforschung werden zwar auch häufig Viren eingesetzt, aber aufgrund des Sicherheitsrisikos und der aufwendigen Handhabung werden die viralen Systeme nur dort eingesetzt, wo es im Wesentlichen keine Alternativen gibt.
Bei nicht-viralen Genliefersystemen werden allgemein keine natürlich vorkommenden Viren eingesetzt und sie werden nicht durch Rekombination genetischen Materials von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Diese nicht-viralen Systeme können wiederum in zwei Untergruppen unterteilt werden, die auf chemischen Methoden basierenden Systeme und die auf physikalischen Methoden basierenden Systeme.
Die auf chemischen Methoden basierenden nicht-viralen Genliefersysteme beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder Derivatisierung der Nukleinsäuren selbst, die sie zellgängig machen, oder umfassen Stoffe, die, beispielsweise über elektrostatische Kräfte oder Wasserstoffbrückenverbindungen, Nukleinsäuren binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln können. Der Transport der Nukleinsäure durch die Zellmembran erfolgt in der Regel durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle, der sogenannten Endozytose.
Stoffe, die eine Bindung der Nukleinsäuren ermöglichen, enthalten beispielsweise kationische Lipide, kationische Polymere, kationische Peptide. Diese kationischen Lipide und kationischen Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse spontan sogenannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei durch die Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert, also in ihrer Größe minimiert. Diese Komplexe können durch die Zellen durch Endozytose aufgenommen werden. Auch werden manchmal Mischformen angewendet, bei welchen die Nukleinsäure durch kationische Polymere „vorkondensiert“ wird und anschließend durch kationische Lipide zu einer Mischform aus Lipoplexen und Polyplexen komplexiert werden. Häufig werden dazu beispielsweise Polylysin, Polyarginin oder Polyethylenimin angewendet. Selbstverständlich können auch andere dem Fachmann bekannte kationische Lipide, Polymere und Peptide verwendet werden.
Die für eine chemisch-basierte nicht-virale Genliefermethode geeigneten Stoffe können aber auch Moleküle mit zumindest einer ersten und einer zweiten Domäne/Molekülteil sein. Dabei ist die erste Domäne als nukleinsäurebindende Domäne/Molekülteil ausgebildet. Unter einem nukleinsäurebindenden Molekülteil versteht man einen Bereich in einem Molekül, der eine Nukleinsäure, insbesondere DNA und/oder RNA, kovalent oder über nicht kovalente Wechselwirkungen, insbesondere elektrostatische Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen bindet. Die zweite Domäne/Molekülteil enthält vorzugsweise einen Liganden. Dieser Ligand kann beispielsweise von einem Rezeptor auf der Zelloberfläche erkannt werden und durch diesen Erkennungsprozess die Endozytose auslösen.
Alternativ kann dieser Ligand in der Lage sein, einen Membrantransfer auszulösen, d.h. einen Transport auf die andere Seite der Membran zu vermitteln. Unter Membrantransfer versteht man, dass ein Molekül von einer Seite der Membran auf die andere Seite gelangen kann. Die Liganden, die eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen können, können aber auch kovalent an das genetische Material gebunden werden, wenn dadurch die biologische Wirkung nicht oder nur wenig beeinträchtigt wird.
Die Stoffe können auch besonders formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen, oder auch mehrere Komponenten mit unterschiedlichen Funktionen umfassen.
Nicht-virale Genliefersysteme, die auf physikalischen Methoden basieren, lokalisieren das genetische Material in der Nähe der Zelle und nutzen Energie insbesondere in Form von thermischer, kinetischer, elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Als ein wichtiges Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem physikalischen Verfahren beruht sei die Elektroporation genannt. Bei diesem Verfahren werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden verbracht, an die ein geeigneter Spannungsverlauf angelegt wird. Auf diese Weise werden die Zellen einem elektrischen Puls ausgesetzt, der zur einer reversiblen Öffnung (Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können Nukleinsäuren in die Zelle eindringen.
Weitere wichtige physikalische Methoden sind Mikroinjektion, hydrodynamische Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall benutzen. Darunter fallen auch Methoden, bei welchen die Nukleinsäure nackt in verschiedene Organe bzw. Muskeln injiziert wird, was in Sonderfällen zu einer geringen Expression der entsprechenden Gene führen kann.
Kombinationsverfahren wie die Magnetofektion vereinen chemische und physikalische Methoden. Hier werden Nukleinsäuren chemisch auf magnetischen Nanoteilchen immobilisiert um sie durch einen magnetischen Feldgradienten auf der Oberfläche von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösen.
Nachteilig an allen nicht-viralen Systemen ist jedoch, wie oben bereits bemerkt, dass ihre Effizienz nicht an die der viralen Systeme heranreicht. Da jedoch die virale Methode aufgrund der vielen Nachteile nur sehr eingeschränkt zur Gentherapie einsetzbar ist, wird unter den nicht-viralen Methoden nach entsprechend leistungsfähigen Alternativen gesucht.
Im Stand der Technik, beispielsweise der WO2009/065618 oder der WO2010/133369 wurde bereits festgestellt, dass das angeborene Immunsystem eine Barriere für eine erfolgreiche Transfektion darstellen kann, da die Zellen in der Lage sind über endosomale und cytosolische Rezeptoren Nukleinsäuren zu detektieren und daraufhin ihr physiologisches Verhalten zu ändern, mit dem Zweck einen mikrobiellen Angriff abzuwehren. Es ist deshalb im Stand der Technik vorgeschlagen worden, gezielt auf das Immunsystem einzuwirken und so die Transfektionseffizienz zu erhöhen.
Problematisch bei diesem Vorschlag ist jedoch, dass das angeborene Immunsystem in großen Bereichen einen redundanten Aufbau besitzt, das eine immense Anzahl an miteinander wechselwirkenden Mechanismen umfasst, die zum Teil noch nicht erforscht und deren Zusammenhänge noch nicht geklärt sind. Die Redundanz begründet sich in dem evolutionären Schlagabtausch insbesondere zwischen Bakterien und Viren einerseits und den Eukaryonten andererseits. Sollte ein Signalstrang als Angriffsstrategie durch ein Pathogen unterbrochen werden, so ist die Zelle aufgrund des redundanten Aufbaus des angeborenen Immunsystems nicht schutzlos ausgeliefert. Als Konsequenz liefert die Unterbrechung eines Signalstranges in der Regel nur moderate Steigerungen der Transfektionseffizienz.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, basierend auf einem Immunsystemsuppressionsmechanismus ein auf einem nicht-viralen Genliefersystem beruhendes Transfektionsverfahren bereitzustellen, das eine Erhöhung der Transfektionseffizienz ermöglicht.
Beschreibung der Erfindung
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1, eine Zusammensetzung gemäß Patentanspruch 9, sowie ein Baukastensystem gemäß Patentanspruch 18 gelöst.
Erfindungsgemäß wird ein Transfektionsverfahren zum Einschleusen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen mittels eines nicht-viralen Genliefersystems vorgeschlagen, bei dem das nicht-virale Genliefersystem in seiner Leistungsfähigkeit dadurch verbessert wird, dass die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor behandelt werden.
Unter einem Toll-like (ähnliche) Rezeptor (kurz TLR, von engl. toll-like receptor) versteht man Proteine des angeborenen Immunsystems. Sie gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die der Erkennung von pathogenen Strukturen dienen und entsprechende Aktivierungen von Genen steuern. Hierdurch wird insbesondere die Aktivierung des antigen-spezifischen erworbenen Immunsystems eingeleitet und moduliert. Durch die Toll-like Rezeptoren vermag das angeborene Immunsystem zwischen „selbst“ und „nicht selbst“ zu unterscheiden. Genauer gesagt handelt es sich bei den TLRs um Transmembranproteine mit einer extrazellulären, „leukin-reichen repeat" Domäne (LRR) und einer zytoplasmatischen Domäne, die derjenigen der IL-1 R Familie homolog ist. Die verschiedenen TLRs reagieren selektiv auf verschiedene molekulare virale und bakterielle Komponenten und steuern über eine Signaltransduktionskaskade eine entsprechende Aktivierung von Genen. Dies geschieht zunächst über so genannte Adaptermoleküle und darauf folgend über Kinasen, die schließlich Transkriptionsfaktoren (z.B. NF-kappaB und die IRF-Familien) durch Phosphorylierung derselben oder entsprechende intrazelluläre Inhibitoren dieser Transkriptionsfaktoren aktivieren. Letztendlich werden neben einer Vielzahl spezifischer Gene, die eine antimikrobielle Wirkung haben, sogenannte Zytokine produziert. Zytokine sind wiederum notwendige Stimulatoren für das erworbene Immunsystem und damit auch ein Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem.
Bisher sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), wovon wiederum nur drei beim Menschen momentan als nukleinsäuredetektierend gelten: TLR3 (lange dsRNA), TLR7 (ssRNA/dsRNA z.B. von RNA-Viren) und TLR9 (bakterielle/virale DNA).
IKKe und TBK-1 sind Kinasen, die eine wesentliche Rolle bei einer Signaltransduktionskaskade im angeborenen Immunsystem spielen, die einer Vielzahl von cytosolischen Rezeptoren nachgelagert ist und in der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren IRF3 und IRF7 endet. Die Kinase IKKe wird auch als IKKepsilon, IKappa Kepsilon, Ikappa Kinase epsilon oder IKK-3 bezeichnet. TBK-1 wird auch als TANK binding Kinase 1 bezeichnet. Da IKKe und TBK-1 zwei eng verwandte Kinasen sind, wirken Inhibitoren gegen IKKe in der Regel auch gegen TBK-1 und umgekehrt.
Unter einem Inhibitor wird erfindungsgemäß ein Molekül verstanden, das die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere eines Proteins verringern oder inhibieren kann. Dabei sind die Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren oder kleine organische Moleküle, wobei auch geeignete siRNA, die die Expression eines Proteins unterbinden, als Inhibitoren aufgefasst werden können. In diesem Fall muss die siRNA gegebenenfalls durch das Genliefersystem eingeschleust werden. Auch kann die inhibierende Wirkung dadurch zustande kommen, dass ein Molekül maskiert wird, das normalerweise durch ein Protein erkannt wird und dadurch eine biologische Wirkung auslöst. Die Wirksamkeit eines Inhibitors wird mittels des sogenannten IC₅₀-Wertes oder EC₅₀-Wertes angegeben. Der IC₅₀-Wert gibt die Konzentration eines Inhibitors an, die nötig ist um ein Target (z.B. Enzym, Zelle, Zellrezeptor, Mikroorganismus etc.) in vitro zu 50% zu blockieren. Der EC₅₀-Wert, die effektive Konzentration, gibt diese benötigte Konzentration in vivo an.
Zwar sind beide, die IKKe/TBK1 Kinase und die TLRs, als beeinflussende Faktoren für die Wirksamkeit des Immunsystem bekannt. Es hat sich jedoch völlig unerwarteter Weise herausgestellt, dass Zellen, die mit einer Kombination aus einem Inhibitor für die Kinase IKKe und/oder die Kinase TBK-1 und einem Inhibitor für nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptoren behandelt werden, also bei denen die Wirkung von IKKe/TBK1 Kinasen und TLRs ausgeschaltet wird, eine synergistische Steigerung der Transfektionseffizienz bei der Anwendung nicht-viraler Genliefersysteme zeigen. Dabei ist die Steigerung durch die Kombination größer, als die Summe der Steigerungen bei den einzelnen Komponenten.
Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel wird die Transfektionseffizienz dieses Verfahren insbesondere dadurch gesteigert, dass ein Inhibitor für den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) verwendet wird. TLR9 ist ein Rezeptor für bakterielle DNA, bzw. für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA gehäuft (20 × häufiger als in Säugerzellen) auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert, wodurch es unterschieden werden kann. Ähnliches wie für bakterielle DNA gilt auch für virale DNA, die auch von TLR9 detektiert wird.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für IKKe/TBK-1 ein Inhibitor mit einem IC₅₀-Wert von weniger als 500 nM, vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, verwendet und/oder als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor mit einem EC₅₀-Wert von weniger als 1000 nM, vorzugsweise weniger als 500 nM, am bevorzugtesten weniger als 200 nM, verwendet. Inhibitoren mit einem derartigen IC₅₀-Wert bzw. EC₅₀-Wert ermöglichen eine besonders gute Inhibition, die die Transfektionseffizienz signifikant steigert.
Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine und/oder der 4-Aminoquinoline, einschließlich derer Salze, verwendet.
Unter der Gruppe der 4-Aminoquinolin werden Verbindungen und ihre Salze zusammengefasst die folgende Grundstruktur zeigen, wobei R1 bis R7 beliebige Substituenten sein können.
Unter der Gruppe der 9-Aminoacridine werden Verbindungen und ihre Salze zusammengefasst, die folgende Grundstruktur zeigen, wobei R1 bis R4 wiederum beliebige Substituenten sein können.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für mindestens einen Toll-like Rezeptor Quinacrin aus der Gruppe der 9 Aminoacridine und/oder Chloroquin aus der Gruppe der 4-Aminoquinoline verwendet. Quinacrin:
Chloroquin:
Zwar wurde Chloroquin schon früher zur Steigerung der Transfektionseffizienz bei Transfektionsprozessen verwendet, zeigte aber in der bisher untersuchten solitärer Verwendung ein sehr inkonsistentes Verhalten, so dass die Transfektionseffizienz nicht zuverlässig gesteigert werden konnte. Erst durch die erfindungsgemäße Kombination mit einem Inhibitor der IKKe/TBK-1 Kinase konnte eine zuverlässige und signifikante Steigerung der Transfektionseffizienz erreicht werden.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel werden als Inhibitoren folgende Verbindungen aus der Gruppe der 9-Aminoacridine und 4-Aminoquinoline verwendet:
Auch diese Verbindungen zeigen in Kombination mit einem Inhibitor der IKKe/TBK-1 Kinase eine deutliche Steigerung der Transfektionseffizienz.
Alternativ kann als Inhibitor für einen Toll-like Rezeptor auch ein Oligonukleotid verwendet werden, dessen Sequenz geeignet ist, Toll-like Rezeptoren zu inhibieren, oder es können auch Antikörper verwendet werden, die gegen Toll-like Rezeptoren gerichtet sind. Eine Inhibition lässt sich natürlich auch mit einer Kombination der genannten Ausführungsbeispiele erreichen.
Dabei können auch hier weitere Inhibitoren für nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptoren vom Rahmen der Erfindung umfasst sein, die erst später als solche erkannt werden. Zudem können zusätzlich zu der Kombination eines Inhibitors für IKKe/TBK-1 und eines Inhibitors für einen Toll-like Rezeptor auch weitere Inhibitoren verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Inhibitor für IKKe/TBK-1 einer oder mehrere der folgenden Inhibitoren, einschließlich deren Salze, verwendet:

– BX795 (N-(3-((5-Iodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl)amino)propyl)amino)-2-pyrimidinyl)amino)phenyl)-1-pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9);
– BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1-carbonylamino)anilino)pyrimidin-4-yl)amino)propyl)-2,2-dimethyl propanediamide, CAS 702676-93-5);
– Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1-yl)-3-(2-methanesulfonyl-benzyloxy)-thiophene-2-carbonitrile, CAS 862812-98-4);
– Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1-yl)-3-((4-methylsulfonyl)phenyl)methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21-2);
– Amlexanox (2-Amino-7-(1-methylethyl)-5-oxo-5H-[1]Benzopyrano[2,3-b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8);
– MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4-morpholinylmethyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]amino]propyl]-cyclobutanecarboxamide, CAS 1190378-57-4);
– CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4).

Bei der vorteilhaften Verwendung dieser Inhibitoren ist eine Steigerung der Transfektionseffizienz deutlich zu sehen.
Als weitere bekannte Inhibitoren für IKKe/TBK-1 können SU6668 (Sugen Inc.), MPI-0485520 (Myraid Pharma), MCCK1, und der Amgen TBK 1 inhibitor (Compound II) (Ou et al.; Molecular Cell; 2011; 41; 458–470) verwendet werden. In EP 1720864 , WO 2009030890 , WO 2010100431 , WO 2012059171 , WO002012161877 , WO002012161879 , WO002013034238 , WO002013024282 , WO002013075785 , WO002013117285 , WO002014189806 , WO002014128486 WO002014093936 , WO002015134171 , WO002016057338 , US020150352108 und US020160015709 sind weitere IKKe/TBK-1 Inhibitoren aufgeführt, die ebenfalls Verwendung finden können.
Dabei können auch andere Inhibitoren verwendet werden, die nicht oben aufgeführt sind, falls sie eine inhibierende Wirkung auf IKKe und/oder TBK-1 aufweisen. Ebenfalls sind Inhibitoren umfasst, deren Wirkung auf IKKe und/oder TBK-1 erst zu einem späteren Zeitpunkt erkannt wird.
Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der durch die Transfektion eingeschleusten Nukleinsäure insbesondere um modifizierte und/oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsRNA. Dabei hat sich als besonders bevorzugt dsDNA und ssRNA erwiesen. Dabei können auch verschiedene Typen von Nukleinsäuren kombiniert angewendet werden, wie es beispielsweise beim "Genome Editing" nach der CRISPR/Cas9 Methode häufig notwendig ist.
Dabei versteht man unter einer Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure, die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen, z.B. dsDNA und dsRNA, oder die aus einem Strang (einzelsträngig = ss) besteht, z.B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplementäre Bereiche aufweisen kann. Das genetische Material dient im Falle von DNA zur Erzeugung von RNA und/oder Proteinen. Im Falle von ssRNA dient es zur Erzeugung von Proteinen. Im Falle von dsRNA dient das genetische Material dazu einen Knockdown eines Gens durch RNA-Interferrenz zu erreichen oder als microRNA zu wirken. Als Antisense-DNA oder Antisense-RNA dient die Nukleinsäure der Inhibition der Translation von mRNA.
Als modifizierte Nukleinsäuren bezeichnet man natürliche Nukleinsäuren, die durch Modifikation in ihren Eigenschaften verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen insbesondere chemische Veränderungen sein, die das Phosphatgerüst, und/oder die Zucker und/oder die Basen betreffen, was insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren gegen Nukleasen und Ribonukleasen erhöht und deren Erkennbarkeit durch nukleinsäuredetektierende Rezeptoren verringern soll.
Des Weiteren können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften der Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer Verfolgbarkeit durch Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente) oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise zellgängig machen. Beispiele für Modifikationen sind der Austausch von Sauerstoff gegen Schwefel im Phosphatgerüst, im Falle von RNA die Methylierung von 2’-OH Gruppen der Ribose, oder die Methylierung der Basen. Ein weiteres Beispiel, ist die vollständige Substitution von 2’OH Gruppen der RNA durch Fluor, um die Stabilität gegen Nukleasen zu erhöhen. Noch ein weiteres Beispiel ist das Anheften von FITC (fluorescein isothiocyanate) als Fluoreszenzlabel, um den Weg des genetischen Materials in der Zelle mikroskopisch verfolgen zu können oder das Anheften von sogenannten NLS (Nuclear localisation signals, zB. PKKKRKVG) um einen Transport in den Zellkern zu erreichen.
Als nicht virales Genliefersystem kann jedes dem Fachmann bekannte Genliefersystem gewählt werden. Insbesondere ist bevorzugt, wie ein weiteres Ausführungsbeispiel zeigt, wenn als nicht-virales Genliefersystem ein Genliefersystem verwendet wird, das:

– ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder
– eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder
– eine Verbindung umfasst, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann.

Alternativ oder zusätzlich kann das nicht-virale Genliefersystem auch auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion, Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruhen.
Gemäß einem weiteren Aspekt vorliegender Erfindung wird ferner eine Zusammensetzung aus zumindest mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor bereitgestellt. Vorzugsweise kann die Zusammensetzung weiterhin zumindest ein nicht-virales Genliefersystem, und/oder eine oder mehrere modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren aufweisen.
Dabei können in der Zusammensetzung vorzugsweise einer oder mehrerer der oben diskutierten Inhibitoren, Genliefersysteme und/oder Nukleinsäuren umfasst sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt vorliegender Erfindung wird ferner ein Baukastensystem zur Durchführung des oben diskutierten Transfektionsverfahren mit zumindest einer ersten Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen der oben diskutierten Inhibitoren für IKKe und/oder TBK-1 umfasst, und einer zweiten Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen der oben diskutierten Inhibitoren für zumindest einen nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptor umfasst, bereitgestellt.
Alternativ kann gemäß diesem Aspekt der Erfindung das Baukastensystem auch eine Inhibitorenzusammensetzung bereitstellen, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und zugleich mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst.
Zusätzlich kann das Baukastensystem eine Genliefersystemzusammensetzung mit mindestens einem nicht-viralen Genliefersystem, und/oder eine Nukleinsäurezusammensetzung mit mindestens einer modifizierten oder unmodifizierten Nukleinsäure bereitstellen.
Die Inhibitorenzusammensetzung oder mindestens eine der Inhibitorenteilzusammensetzungen ist dabei eine Zusammensetzung aus Inhibitoren, wie oben diskutiert.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel können in dem Baukastensystem eine oder mehrere der Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen eine Kombinationszusammensetzung mit einer oder mehreren anderen Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen bilden.
Das heißt, bei dem erfindungsgemäßen Baukastensystem können alle Komponenten getrennt voneinander vorliegen, oder in allen kombinatorisch möglichen Kombinationen als Zusammensetzung gemeinsam vorliegen. So können die Komponenten entweder getrennt voneinander z.B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder zu mehreren als Zusammensetzung in entsprechenden Behältern bereitgestellt werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder das erfindungsgemäße Baukastensystem können zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden. Ferner kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung als pharmazeutische Zusammensetzung vorliegen. Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder ein Baukastensystem zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie, zum "Genome Editing" z.B. mittels CRISPR-Cas9 oder auch zur repetitiven Transfektion von Zellen verwendet werden.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausführungsbeispiele sind in den Ansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen definiert. Weiterhin können die beschriebenen Merkmale einzeln oder in Kombination vorliegen. Zudem können, sofern nicht anders angegeben, Merkmale, die in Kombination beschrieben sind, als Einzelmerkmale oder in anderen Kombinationen als der angegebenen Kombination vorliegen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispielen näher beschrieben werden. Dabei sind die Ausführungsbeispiele rein exemplarischer Natur und sollen nicht den Schutzbereich der Anmeldung definieren. Dieser ist allein durch die anhängigen Ansprüche definiert.
Es zeigen:
1: eine graphische Darstellung von Transfektionseffizienzen gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel; und
2: eine graphische Darstellung von Transfektionseffizienzen gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel.
Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen
1 und 2 zeigen schematisch vergleichende Darstellungen von Transfektionseffizienzen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und ohne das erfindungsgemäße Verfahren erzielt werden.
Wie den Figuren zu entnehmen ist kann durch die erfindungsgemäße Behandlung der Zellen vor und/oder während der Transfektion eine deutliche Steigerung der Transfektionseffizienz erreicht werden. Die Transfektionseffizienz wurde indirekt über ein Luziferaseenzym gemessen, das von der eingeschleusten Nukleinsäure codiert wurde. Es handelt sich dabei um ein sogenanntes Reportergensystem. Diese sind etablierte Systeme zum Nachweis der Transfektionseffizienz. Je höher also die Menge an Luziferase ist, die in einem Kulturgefäß nach Lyse der transfizierten Zellen nachgewiesen werden kann, desto größer ist die Transfektionseffizienz. Der Nachweis der Menge von Luziferase erfolgt über eine Enzym-Substratreaktion, bei der ein Lichtquant freigesetzt wird. Diese Lichtquanten können von geeigneten Messgeräten, sogenannten Luminometern gemessen werden. Da die Anzahl der gemessenen Lichtquanten, insbesondere von dem Zeitintervall abhängig ist, indem die Messung stattfand, wird diese Lichtquantenmenge auch als „relative light units“ bezeichnet. Für vergleichende Studien müssen die Messbedingungen demnach gleich sein.
In den Figuren sind auf der X-Achse die unterschiedlichen Behandlungen der Zellen aufgetragen und auf der y-Achse die für die jeweiligen Behandlungen erzielte Transfektionseffizienz in [%]. Dabei wurden die Messwerte auf die Transfektion ohne Inhibitoren normiert indem diese 100% gleichgesetzt wurde. Dabei ist bei beiden Beispielen bei der Behandlung durch den IKKe/TBK-1 Inhibitor und einem Inhibitor für einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor eine signifikante Steigerung zu verzeichnen, die auch nicht durch bloße Addition der einzelnen Steigerungsraten für IKKe/TBK-1 Inhibitor und einem Inhibitor für einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor allein zu erklären ist. Es handelt sich also klar um einen synergistischen Effekt.
Zu den Figuren im Einzelnen:
Als allgemeines Material wurde folgendes verwendet:

1. HeLa Zellen; ATTC CCL-2
2. Rotifect Plus, Carl Roth; Kat-Nr.: CL21.2
3. 48 Well Platten; Cellstar; Greiner BioOne; Kat-Nr.: 677180
4. DMEM; High Glucose; Biowest, w/stable Glutamine/Sodiumpyruvat, Kat-Nr.: L103-500
5. Serum FBS Gold; PAN Biotech; Lot.Nr. P130914; Kat-Nr.: P40-37500
6. pCMV-luc, Plasmid Factory, Kat-Nr.: PF461
7. Luciferase Assay Kit, Promega
8. Dimethylsulfoxid (DMSO für die Molekularbiologie), Fluka; Kat-Nr.: 41639
9. (N-(3-((5-Iodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl)amino)propyl)amino)-2-pyrimidinyl)amino)phenyl)-1-pyrrolidinecarboxamide (BX795), Merck4Biosciences, Kat-Nr.: 204001
10. Chloroquin-diphosphat; Fluka; Kat.-Nr.: C6628
11. Quinacrin Dichlorid Hydrat; TCI; Kat.-Nr.: Q0056

Beispiel 1 – Fig. 1
Das in 1 gezeigte, erste Ausführungsbeispiel betrifft eine Lipofektion von HeLa Zellen mit einem handelsüblichen Transfektionsreagenz (Rotifect Plus), die vor und während der Transfektion mit dem Inhibitor BX795 für IKKe und TBK-1 und mit Chloroquin als Inhibitor für TLR9 behandelt wurden.
Die Lipofektion der HeLa Zellen wurde während eines 3-tägigen Zeitraums durchgeführt:
1. Tag:
Es wurden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wurde eine Zellzahl von 1·10⁵ Zellen pro Well in 250 µl komplettem DMEM-Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wurde 24 h in einem CO₂-Inkubator (10%) inkubiert.
2. Tag:
Von Chloroquin und BX795 wurden Stocklösungen in einem Gemisch aus DMSO und Wasser hergestellt. 2 Stunden vor der Transfektion wurden jeweils 4 Wells mit Chloroquin oder BX795 und 4 Wells mit beiden Substanzen bestückt. Mit einer entsprechenden Menge der beiden Stocklösungen wurde die Konzentration der Inhibitoren in dem Kulturmedium der Zellen dabei so eingestellt, dass Chloroquin in einer Konzentration von 10 µM und BX795 in einer Konzentration von 0,5 µM vorlag. Weiter wurde darauf geachtet, dass die DMSO Konzentration 1% v/v nicht überschritt. Die Transfektion aller Zellen in der 48 Well Platte wurde mit 0,3 µg pCMV-Luc und 1,2 µl Rotifect Plus entsprechend den Herstellerangaben für das Transfektionsreagenz durchgeführt. Anschließend wurde 24 h in einem CO₂-Inkubator (10%) inkubiert.
3. Tag:
Die Effizienz der Transfektion wurde mit einem Luciferase Assay Kit bestimmt. Der Assay wurde entsprechend den Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Ergebnisse in RLU (Mittelwerte von drei Tests)

ST Chloroquin BX795 BX795 + Chloroquin

14087 16817 50282 80788

100% 119% 356% 574%

ST = Standardtransfektion ohne BX795 und Chloroquin
BX795: C = 0,5 µM
Chloroquin: C = 10 µM
Die Steigerung durch die einzelne Anwendung von Chloroquin respektive BX795 gegenüber der Standardtransfektion beträgt 19% bzw. 256%. Die Steigerung durch eine kombinierte Anwendung beträgt mit 474% weit mehr als die Summe der Steigerungen bei einzelner Anwendung, d.h. bei der kombinierten Anwendung zeigt sich ein synergistischer Effekt.
Beispiel 2 – Fig. 2
Das in 2 gezeigte, zweite Ausführungsbeispiel betrifft eine Lipofektion von HeLa Zellen, die vor und während der Transfektion mit dem Inhibitor BX795 für IKKe und TBK-1 und mit Quinacrin als Inhibitor für TLR9 behandelt wurden.
Die Lipofektion der HeLa Zellen wurde analog Beispiel 1 durchgeführt. Ergebnisse in RLU/µg Protein (Mittelwerte)

ST BX795 Quinacrin BX795 + Quinacrin

19271 27260 73924 141056

100% 141% 385% 732%

ST = Standardtransfektion ohne BX795 und Quinacrin
BX795: C =0,5 µM
Quinacrin: C = 2,5 µM
Die Steigerung durch die einzelne Anwendung von Quinacrin respektive BX795 gegenüber der Standardtransfektion beträgt 41% bzw. 285%. Die Steigerung durch eine kombinierte Anwendung beträgt mit 632% weit mehr als die Summe der Steigerungen bei einzelner Anwendung, d.h. bei der kombinierten Anwendung zeigt sich ein synergistischer Effekt.
Im allgemeinen kann also resümiert werden, dass vorteilhafterweise durch die erfindungsgemäße Behandlung der Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor eine signifikante Steigerung der Transfektionseffizienz zu verzeichnen ist, die auf einem synergistischen Effekt beruht.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2009/065618 [0019]
WO 2010/133369 [0019]
EP 1720864 [0042]
WO 2009030890 [0042]
WO 2010100431 [0042]
WO 2012059171 [0042]
WO 002012161877 [0042]
WO 002012161879 [0042]
WO 002013034238 [0042]
WO 002013024282 [0042]
WO 002013075785 [0042]
WO 002013117285 [0042]
WO 002014189806 [0042]
WO 002014128486 [0042]
WO 002014093936 [0042]
WO 002015134171 [0042]
WO 002016057338 [0042]
US 020150352108 [0042]
US 020160015709 [0042]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Ou et al.; Molecular Cell; 2011; 41; 458–470 [0042]

Claims

Transfektionsverfahren zum Einschleusen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in eukaryotischen Zellen mittels eines nicht-viralen Genliefersystems, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor, TLR, behandelt werden.
Transfektionsverfahren nach Anspruch 1, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest ein Inhibitor für TLR 9, den Toll-like Rezeptor 9, verwendet wird.
Transfektionsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei als Inhibitor für IKKe/TBK-1 ein Inhibitor mit einem IC₅₀-Wert von weniger als 500 nM, vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, verwendet wird; und/oder als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor mit einem EC₅₀-Wert von weniger als 1000 nM, vorzugsweise weniger als 500 nM, am bevorzugtesten weniger als 200 nM, verwendet wird.
Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der der 4-Aminoquinoline, einschließlich deren Salze, verwendet wird, wobei die Verbindung folgende Grundstruktur
aufweist, wobei R1 bis R7 beliebig wählbar ist.
Transfektionsverfahren nach Anspruch 4, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Chloroquin, einschließlich dessen Salze, verwendet wird mit R5 = Cl und R7 = NHCHMe(CH₂)₃NEt₂ und dementsprechend folgender Struktur
und/oder als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich deren Salze, verwendet wird mit R5 = Cl und R7 = NHCH₂CH(C₆H₄OMe)(CH₂)₂NEt₂ und dementsprechend folgender Struktur:
und/oder als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich deren Salze, verwendet wird mit R5 = OMe, R7 = NHCHMe(CH₂)₃NEt₂, R1 = C₆H₅ und dementsprechend folgender Struktur:
Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine, einschließlich deren Salze, verwendet wird, wobei die Verbindung folgende Grundstruktur
aufweist, wobei R1 bis R4 beliebig wählbar sind.
Transfektionsverfahren nach Anspruch 6, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Quinacrin, einschließlich dessen Salze, verwendet wird mit R1 = OMe, R2 = H, R3 = Cl, R4 = NHCHMe(CH₂)₃NEt₂ und dementsprechend folgender Struktur
Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 einer oder mehrere aus der Gruppe – BX795 (N-(3-((5-Iodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl)amino)propyl)amino)-2-pyrimidinyl)amino)phenyl)-1-pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); – BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1-carbonylamino)anilino)pyrimidin-4-yl)amino)propyl)-2,2-dimethyl propanediamide, CAS 702676-93-5); – Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1-yl)-3-(2-methanesulfonyl-benzyloxy)-thiophene-2-carbonitrile, CAS 862812-98-4); – Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1-yl)-3-((4-methylsulfonyl)phenyl)methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21-2); – Amlexanox (2-Amino-7-(1-methylethyl)-5-oxo-5H-[1]Benzopyrano[2,3-b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8); – MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4-morpholinylmethyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]amino]propyl]-cyclobutanecarboxamide, CAS 1190378-57-4); – CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4); einschließlich deren Salze, gewählt werden.
Zusammensetzung für ein Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zumindest mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung weiterhin umfasst: a. ein nicht-virales Genliefersystem, und/oder b. eine oder mehrere modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der mindestens eine Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor für TLR 9, den Toll-like Rezeptor 9, ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Inhibitor für IKKe/TBK-1 einen IC₅₀-Wert von von weniger als 500 nM, vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, aufweist; und/oder der Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor einen EC₅₀-Wert von weniger als 1000 nM, vorzugsweise weniger als 500 nM, am bevorzugtesten weniger als 200 nM, aufweist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der der 4-Aminoquinoline, einschließlich deren Salze, umfasst, die folgende Grundstruktur
aufweist, mit R1 bis R7 beliebig wählbar.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Chloroquin, einschließlich dessen Salze, umfasst mit R5 = Cl und R7 = NHCHMe(CH₂)₃NEt₂ und dementsprechend folgender Struktur
und/oder der Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich dessen Salze, umfasst, mit R5 = Cl und R7 = NHCH₂CH(C₆H₄OMe)(CH₂)₂NEt₂ und dementsprechend folgender Struktur:
und/oder der Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich dessen Salze, umfasst, mit R5 = OMe, R7 = NHCHMe(CH₂)₃NEt₂, R1 = C₆H₅ und dementsprechend folgender Struktur:
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine, einschließlich dessen Salze, umfasst, die folgende Grundstruktur
aufweist, wobei R1 bis R4 beliebig wählbar sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Quinacrin, einschließlich dessen Salze, umfasst mit R1 = OMe, R2 = H, R3 = Cl, R4 = NHCHMe(CH₂)₃NEt₂ und dementsprechend folgender Struktur
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei der Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 einen oder mehrere aus der Gruppe – BX795 (N-(3-((5-Iodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl)amino)propyl)amino)-2-pyrimidinyl)amino)phenyl)-1-pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); – BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1-carbonylamino)anilino)pyrimidin-4-yl)amino)propyl)-2,2-dimethyl propanediamide, CAS 702676-93-5); – Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1-yl)-3-(2-methanesulfonyl-benzyloxy)-thiophene-2-carbonitrile, CAS 862812-98-4); – Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1-yl)-3-((4-methylsulfonyl)phenyl)methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21-2); – Amlexanox (2-Amino-7-(1-methylethyl)-5-oxo-5H-[1]Benzopyrano[2,3-b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8); – MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4-morpholinylmethyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]amino]propyl]-cyclobutanecarboxamide, CAS 1190378-57-4); – CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4); einschließlich deren Salze, umfasst.
Baukastensystem für ein Transfektionsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Baukastensystem zumindest eine erste Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 umfasst, und eine zweite Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptor umfasst, aufweist oder, dass das Baukastensystem eine Inhibitorenzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und zugleich mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst, aufweist.
Baukastensystem nach Anspruch 18, wobei die Inhibitorenzusammensetzung oder mindestens eine der Inhibitorenteilzusammensetzungen eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 17 ist.
Baukastensystem nach einem der Ansprüche 18 bis 19, wobei das Baukastensystem weiterhin umfasst: a. eine Genliefersystemzusammensetzung mit mindestens einem nicht-viralen Genliefersystem, und/oder b. eine Nukleinsäurezusammensetzung mit mindestens einer modifizierten oder unmodifizierten Nukleinsäure.
Baukastensystem nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei eine oder mehrere der Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen eine Kombinationszusammensetzung mit einer oder mehreren anderen Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen bilden.