EP3490608A1 - Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen - Google Patents

Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen

Info

Publication number
EP3490608A1
EP3490608A1 EP17751996.4A EP17751996A EP3490608A1 EP 3490608 A1 EP3490608 A1 EP 3490608A1 EP 17751996 A EP17751996 A EP 17751996A EP 3490608 A1 EP3490608 A1 EP 3490608A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
inhibitor
receptor
nucleic acid
composition
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP17751996.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rosa KARL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority claimed from PCT/DE2017/200056 external-priority patent/WO2018019341A1/de
Publication of EP3490608A1 publication Critical patent/EP3490608A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the transfection efficiency of non-viral gene delivery systems, as well as a
  • Composition for it and an associated modular system Composition for it and an associated modular system.
  • nucleic acids DNA, RNA, etc.
  • transfection a key technology in modern biotechnology because it provides access to the central
  • Control apparatus of a cell and thus, for example, the production or switching off certain proteins allowed.
  • Transfection with DNA or mRNA allows the expression (production) of any protein that allows transfection with siRNA, ribozymes or antisense molecules, for example by RNA interference, the "knockdown" of a gene or a protein MicroRNA can be introduced into cells and influence regulatory functions, a key technology found in both
  • this key technology makes it possible to replace genes destroyed in human cells by mutation and thus to heal malfunctions. It is also possible, for example, to force cancer cells to commit suicide by means of suicidal genes. "Knock-down" of a gene is another way of acting in a healing manner, for example by producing important genes for
  • Knock-down is understood as a weakening or elimination of the translation of an mRNA into a protein during protein biosynthesis. Many diseases are triggered by a mismanagement of cells that could be abrogated by microRNA.
  • transfection efficiency is understood to be the amount of protein expression of a cell population as a consequence of transfection processes with genetic material which, inter alia, encodes this expressed protein or also the extent of a knockdown of a protein expression of a cell population as a consequence of
  • Transfection processes with genetic material that can trigger such a knockdown In particular siRNA, antisense RNA, ribozymes, antisense DNA or DNA coding for siRNA or ribozymes is used as the genetic material.
  • the transfection efficiency is also determined by the proportion of cells of a total population of cells that determines the biological effectiveness of the introduced genetic material as a result of
  • transfection is understood as meaning a treatment of eukaryotic cells by a gene delivery system and nucleic acids.
  • viruses are used as gene delivery systems. Since the introduction of nucleic acids, particularly DNA or RNA, into foreign cells is an integral part of the viral propagation cycle, this capability has been refined by a natural, evolutionary process in the history of the virus to make it a highly effective gene delivery system. The viruses used are genetically manipulated so that they no longer possess pathogenic properties and can no longer reproduce.
  • Immune system offer a large attack surface, since the immune system has developed strategies in an evolutionary adaptation process, to defend the viruses.
  • the immune defense and the activation of oncogenes by random integration of genetic material into the genome are unsolved problems, so that there are only a few approved gene therapies worldwide despite decades of research.
  • Viruses are often used in basic research, but due to the security risk and the complex handling, the viral systems are only used where it is needed
  • non-viral gene delivery systems generally no naturally occurring viruses are used and they are not produced by recombination of genetic material from naturally occurring viruses.
  • These non-viral systems can in turn be subdivided into two sub-groups, the chemical-based systems and the physical ones
  • non-viral gene delivery systems based on chemical methods are based either on a chemical modification or derivatization of the nucleic acids themselves, which make them cell-like, or comprise substances which, for example, via electrostatic forces or
  • Hydrogen bonds, bind nucleic acids and transport can mediate through the cell membrane.
  • the transport of the nucleic acid through the cell membrane is usually carried out by an active transport mechanism of the cell, the so-called endocytosis.
  • Substances which allow binding of the nucleic acids include, for example, cationic lipids, cationic polymers, cationic peptides. These cationic lipids and cationic polymers spontaneously form so-called lipoplexes or polyplexes in the presence of DNA or RNA due to the opposing charge ratios. The DNA is thereby through the
  • nucleic acid is "precondensed" by cationic polymers and then complexed by cationic lipids to form a mixture of lipoplexes and polyplexes, for example, polylysine, polyarginine or polyethylenimine, of course cationic lipids, polymers and peptides are used.
  • the substances suitable for a chemically-based non-viral gene delivery method may also be molecules having at least a first and a second domain / moiety.
  • the first domain is formed as a nucleic acid binding domain / moiety.
  • a nucleic acid-binding moiety is understood as meaning an area in a molecule containing a nucleic acid,
  • DNA and / or RNA covalently or via non-covalent
  • the second domain / moiety preferably contains a ligand.
  • This ligand can be recognized, for example, by a receptor on the cell surface and by this
  • this ligand may be capable of initiating membrane transfer, ie mediating transport to the other side of the membrane.
  • membrane transfer is meant that a molecule from one side of the Membrane can get to the other side.
  • the ligands which can induce receptor-mediated endocytosis or membrane transfer can also be covalently bound to the genetic material, if the biological effect is not or only little affected.
  • the substances may also be specially formulated, in particular as micelles or liposomes, or also comprise a plurality of components having different functions.
  • Non-viral gene delivery systems based on physical methods localize the genetic material in the vicinity of the cell and utilize energy, in particular in the form of thermal, kinetic, electrical or other energy, to mediate transport of the genetic material through the cell membrane.
  • An important example of a non-viral method based on a physical method is called electroporation.
  • the cells to be transfected are placed between two electrodes to which a suitable voltage waveform is applied. In this way, the cells are exposed to an electrical pulse, which leads to a reversible opening (pores) of the cell membrane. These pores allow nucleic acids to enter the cell.
  • hydrodynamic methods ballistic methods (Genegun) or methods that use ultrasound. This includes methods in which the
  • Nucleic acid is injected nude into various organs or muscles, which in special cases can lead to low expression of the corresponding genes.
  • Combination methods such as magnetofection combine chemical and physical methods.
  • nucleic acids are chemically immobilized on magnetic nanoparticles to enrich them by a magnetic field gradient on the surface of cells and trigger endocytosis.
  • a disadvantage of all non-viral systems that their efficiency does not match that of the viral systems.
  • the viral method is very limited to gene therapy can be used due to the many disadvantages, is looking for non-viral methods for correspondingly powerful alternatives.
  • the object of the present invention is therefore based on an immune system suppressing mechanism on a non-viral
  • a transfection method for introducing one or more nucleic acids into eukaryotic cells by means of a non-viral gene delivery system is proposed in which the non-viral gene delivery system is improved in its performance in that the cells before and / or during transfection at least with at least one inhibitor for IKKe and / or TBK-1 and at least one inhibitor for at least one
  • Nucleic acid-detecting toll-like receptor can be treated.
  • a Toll-like (similar) receptor refers to proteins of the innate immune system. They belong to a group of receptors that serve to recognize pathogenic structures and to control the corresponding activation of genes. As a result, in particular, the activation of the antigen-specific acquired
  • the TLRs are around
  • TLR Transmembrane proteins with an extracellular, "leucine-rich repeat” domain (LRR) and a cytoplasmic domain homologous to those of the IL-1R family
  • LRR leucine-rich repeat domain
  • cytoplasmic domain homologous to those of the IL-1R family
  • cytokines are again necessary stimulators for the acquired immune system and thus also a link between the innate and acquired immune system.
  • TLR3 long dsRNA
  • TLR7 ssRNA / dsRNA eg of RNA viruses
  • TLR9 bacterial / viral DNA
  • IKKe and TBK-1 are kinases that play an essential role in a innate immune signal transduction cascade downstream of a variety of cytosolic receptors that terminate in the activation of transcription factors IRF3 and IRF7.
  • the kinase IKKe is also referred to as Ikkepsilon, Ikapa kepsilon, Ikappa kinase epsilon or IkK-3.
  • TBK-1 is also referred to as TANK binding kinase 1. Since IKKe and TBK-1 are two closely related kinases, inhibitors of IKKe usually also act against TBK-1 and vice versa.
  • an inhibitor is understood as meaning a molecule which can reduce or inhibit the biological action of another molecule, in particular of a protein.
  • the inhibitors themselves are proteins, modified or unmodified nucleic acids or small organic molecules, whereby also suitable siRNA, which suppress the expression of a protein, can be regarded as inhibitors.
  • the siRNA must be regarded as inhibitors. In this case, the siRNA must be regarded as inhibitors.
  • the inhibitory effect can be achieved by masking a molecule that is normally recognized by a protein and thereby induces a biological effect.
  • the effectiveness of an inhibitor is indicated by means of the so-called IC 50 value or EC 50 value.
  • the IC 50 value indicates the concentration of an inhibitor necessary to block a target (eg enzyme, cell, cell receptor, microorganism etc.) in vitro by 50%.
  • the ECso value, the effective concentration indicates this required concentration in vivo.
  • TLR9 is a receptor for bacterial DNA, or non-methylated CpG motifs that accumulate in bacterial DNA (20 times more abundant than in mammalian cells).
  • the CpG motif is highly methylated in mammalian cells, allowing it to be distinguished. Similar to bacterial DNA also applies to viral DNA, which is also detected by TLR9.
  • IKKe / TBK-1 an inhibitor with an IC 50 value of less than 500 nM
  • nM preferably less than 200 nM, most preferably less than 100 nM, and / or an inhibitor having an ECso value of less than 1000 nM as an inhibitor of the nucleic acid-detecting Toll-like receptor,
  • Inhibitors with such an IC 50 value or EC 50 value enable a particularly good inhibition, which significantly increases the transfection efficiency.
  • a compound from the group of 9-aminoacridines and / or 4-aminoquinolines, including salts thereof is used as an inhibitor for the nucleic acid-detecting Toll-like receptor.
  • 4-aminoquinoline compounds and their salts will together have the following basic structure, wherein R 1 to R 7 may be any substituents.
  • Oligonucleotide whose sequence is suitable, toll-like It is also possible to use antibodies which are directed against Toll-like receptors or to inhibit receptors. Of course, an inhibition can also be achieved with a combination of the mentioned exemplary embodiments.
  • nucleic acid-detecting Toll-like receptors may be included in the scope of the invention, which are recognized later than such.
  • other inhibitors may be used in addition to the combination of an inhibitor of IKKe / TBK-1 and an inhibitor of a toll-like receptor.
  • the inhibitor of IKKe / TBK-1 is one or more of the following inhibitors,
  • BX795 N - (3 - ((5-iodo-4 - ((3- (2-thienylcarbonyl) amino) propyl) amino) -2-pyrimidinyl) amino) phenyl) -1-pyrrolidine carboxamide, CAS 702675-74-9 );
  • BX320 N - (3 - ((5-bromo-2- (3- (pyrrolidine-1-carbonylamino) anilino) pyrimidin-4-yl) amino) propyl) -2,2-dimethyl propane diamine, CAS 702676-93 5);
  • MRT-67307 N- [3 - [[5-cyclopropyl-2 - [[3- (4-morpholinylmethyl) phenyl] amino] -4-pyrimidinyl] amino] propyl] -cyclobutanecarboxamide, CAS 1 190378-57-4) ; CYT387 (N- (cyanomethyl) -4- [2 - [[4- (4-morpholinyl) phenyl] amino] -4-pyrimidinyl] benzamide, CAS 1056634-68-4).
  • inhibitors can be used, which are not listed above, if they have an inhibitory effect on IKKe and / or TBK-1. Also included are inhibitors whose effect on IKKe and / or TBK-1 will be recognized at a later date.
  • the method according to the invention involves in particular the nucleic acid introduced by the transfection modified and / or
  • dsDNA and ssRNA have proven to be particularly preferred.
  • nucleic acids can also be used in combination, as is often necessary, for example, in "genome editing" according to the CRISPR / Cas9 method.
  • the genetic material is used in the case of DNA for the production of RNA and / or proteins. In the case of ssRNA, it serves to produce proteins. In the case of dsRNA, the genetic material serves to knock down a gene through RNA To achieve interference or to act as a microRNA.
  • antisense DNA or antisense RNA the nucleic acid serves to inhibit the translation of mRNA.
  • Modified nucleic acids are natural nucleic acids which have been modified by modification in their properties. These modifications may be, in particular, chemical changes which relate to the phosphate skeleton, and / or the sugars and / or the bases, in particular the stability of the nucleic acids to nucleases and
  • molecules can be covalently or non-covalently attached to the nucleic acids leading to new properties of the nucleic acids
  • Fluorescence labels or labels that direct the nucleic acids to a specific location in the cell or labels that mediate the passage of nucleic acids through membranes and thus make nucleic acids cell-like, for example. Examples of modifications are the exchange of
  • Oxygen to sulfur in the phosphate scaffold in the case of RNA the methylation of 2'-OH groups of the ribose, or the methylation of the bases.
  • Another example is the complete substitution of 2 ⁇ groups of RNA by fluorine to increase stability against nucleases.
  • Yet another example is the attachment of FITC (fluorescein isothiocyanate) as a fluorescent label to follow microscopically the path of the genetic material in the cell or the attachment of so-called NLS (nuclear localization signal, eg.
  • PKKKRKVG PKKKRKVG
  • any gene delivery system known to those skilled in the art can be selected.
  • any gene delivery system known to those skilled in the art can be selected.
  • another embodiment demonstrates, when preferred as a non-viral gene delivery system is preferred
  • Gencastersystem is used, which:
  • a cationic lipid a cationic polymer, or a cationic protein
  • the non-viral gene running system can also be based on a physical method such as electroporation, microinjection, magnetofection, ultrasound or a ballistic or hydrodynamic method.
  • composition may further comprise at least one non-viral gene delivery system, and / or one or more modified or unmodified nucleic acids.
  • Nucleic acids include.
  • a modular system for carrying out the above-discussed transfection method comprising at least a first inhibitor sub-composition comprising at least one of the inhibitors of IKKe and / or TBK-1 discussed above and a second inhibitor sub-composition comprising at least one of the inhibitors discussed above for at least one nucleic acid detecting Toll-like receptor.
  • Modular system also provide an inhibitor composition, the at least one inhibitor for IKKe and / or TBK-1 and at least one inhibitor for at least one nucleic acid-detecting Toll-like receptor.
  • Genetic delivery system and / or provide a nucleic acid composition having at least one modified or unmodified nucleic acid.
  • the inhibitor composition or at least one of
  • Inhibitor component compositions is a composition
  • Modular system one or more of the compositions or
  • Partial compositions form a combination composition with one or more other compositions or partial compositions.
  • all components may be present separately from each other, or in all combinatorially possible combinations together as a composition.
  • the components can either be separated from each other e.g. in glass or plastic containers, which are packaged together, or the components can be provided in pairs or more as a composition in respective containers.
  • composition according to the invention and / or the
  • modular system according to the invention can for carrying out the
  • composition according to the invention as a pharmaceutical composition.
  • FIG. 2 shows a graphic representation of transfection efficiencies according to a second exemplary embodiment.
  • Figures 1 and 2 show schematically comparative representations of transfection efficiencies achieved with the method of the invention and without the method of the invention.
  • transfection efficiency a significant increase in the transfection efficiency can be achieved by the treatment according to the invention of the cells before and / or during the transfection.
  • the transfection efficiency was measured indirectly via a luciferase enzyme encoded by the introduced nucleic acid. It is a so-called
  • Transfection efficiency the higher the amount of luciferase that can be detected in a culture vessel after lysis of the transfected cells, the greater the transfection efficiency.
  • the detection of the amount of luciferase takes place via an enzyme-substrate reaction in which a light quantum is released. These quanta of light can be obtained from suitable measuring devices, so-called
  • Luminometers are measured. Since the number of light quanta measured depends in particular on the time interval in which the measurement took place, this quantity of light quanta is also referred to as "relative light units.” For comparative studies, the measurement conditions must therefore be the same.
  • Receptor can be recorded a significant increase, which can not be explained by mere addition of the individual rates of increase for IKKe / TBK-1 inhibitor and an inhibitor for a nucleic acid-detecting Toll-like receptor alone. It is clearly a synergistic effect.
  • the first embodiment shown in Figure 1 relates to lipofection of HeLa cells with a commercially available transfection reagent (Rotifect Plus) treated before and during transfection with inhibitor BX795 for IKKe and TBK-1 and with chloroquine as inhibitor for TLR9.
  • Rotifect Plus commercially available transfection reagent
  • HeLa cells were seeded in a 48 well plate. In this case, a cell count of 1 * 10 5 cells per well in 250 ⁇ complete DMEM medium was plated (10% FCS). It was then incubated for 24 h in a CO2 incubator (10%).
  • Stock solutions were prepared from chloroquine and BX795 in a mixture of DMSO and water. Two hours before transfection, 4 wells each were filled with chloroquine or BX795 and 4 wells with both substances. With an appropriate amount of the two stock solutions, the concentration of the inhibitors in the culture medium of the cells was adjusted so that chloroquine was present in a concentration of 10 ⁇ and BX795 in a concentration of 0.5 ⁇ . Further, care was taken that the DMSO concentration did not exceed 1% v / v.
  • the transfection of all cells in the 48 well plate was 0.3 g pCMV-Luc and 1, 2 ⁇ Rotifect Plus were performed according to the manufacturer's instructions for the transfection reagent. It was then incubated for 24 h in a CO2 incubator (10%).
  • the efficiency of transfection was determined with a luciferase assay kit.
  • the assay was performed according to the manufacturer's instructions.
  • the second embodiment shown in Figure 2 relates to lipofection of HeLa cells treated before and during transfection with inhibitor BX795 for IKKe and TBK-1 and with quinacrine as inhibitor of TLR9.
  • the lipofection of the HeLa cells was carried out analogously to Example 1.
  • Transfection at least with at least one inhibitor for IKKe and / or TBK-1 and at least one inhibitor for at least one nucleic acid-detecting Toll-like receptor a significant increase in the transfection efficiency is recorded, which is based on a synergistic effect.

Abstract

Vorliegende Erfindung offenbart ein Transfektionsverfahren zum Einschleusen von Nukleinsäuren in eukaryotischen Zellen mittels eines nicht-virales Genliefersystem, wobei die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptoren behandelt werden, sowie eine Zusammensetzung und ein Baukastensystem für ein solches Verfahren.

Description

Transfektionsverfahren mit nicht-viralen Gen liefers vstemen
Umfeld der Erfindung
[0001 ] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Transfektionseffizienz von nicht-viralen Genliefersystemen, sowie eine
Zusammensetzung dafür und ein zugehöriges Baukastensystem.
Hintergrund der Erfindung
[0002] Das Einschleusen von Nukleinsäuren (DNA, RNA, etc.) in eukaryotische Zellen, auch als Transfektion bezeichnet, stellt eine Schlüsseltechnologie in der modernen Biotechnologie dar, da sie den Zugriff auf den zentralen
Steuerungsapparat einer Zelle und damit beispielsweise die Herstellung oder das Ausschalten bestimmter Proteine erlaubt. Die Transfektion mit DNA oder mRNA erlaubt beispielsweise die Expression (Herstellung) eines beliebigen Proteins, die Transfektion mit siRNA, Ribozymen oder Antisense Molekülen erlaubt, beispielsweise durch RNA-Interferenz, den„Knockdown" (Ausschalten) eines Gens bzw. eines Proteins. Aber auch microRNA kann in Zellen eingeschleust werden und es kann auf diese Weise Einfluss auf regulatorische Funktionen ausgeübt werden. Diese Schlüsseltechnologie findet sowohl in
Forschungslaboratorien, in der Medizin und bei der industriellen Erzeugung von Proteinen Anwendung. Nicht zuletzt sei auf die grundlegende Anwendung der Transfektion bei dem "Genome Editing" nach der CRISPR/Cas9 Methode erwähnt, welches erlaubt sehr gezielt das Genom einer Zelle zu verändern, hingewiesen.
[0003] Insbesondere ermöglicht diese Schlüsseltechnologie in humanen Zellen durch Mutation zerstörte Gene zu ersetzen und somit Fehlfunktionen zu heilen. Auch können beispielsweise Krebszellen durch entsprechende Suizidgene zum „Selbstmord" gezwungen werden. Der„Knock-down" eines Gens stellt eine weitere Möglichkeit dar, heilend zu wirken, z.B. indem wichtige Gene für
Angiogenese in Krebsgeschwüren stillgelegt werden. Unter Knock-down wird eine Abschwachung oder Ausschaltung der Translation einer mRNA zu einem Protein bei der Proteinbiosynthese verstanden. Viele Krankheiten werden durch eine Fehlsteuerung von Zellen ausgelöst, die mittels microRNA aufgehoben werden könnte.
[0004] Wie erfolgreich eine solche Transfektion ist, wird unter anderem über die sogenannte Transfektionseffizienz definiert. Unter einer Transfektionseffizienz versteht man dabei die Menge einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte Protein codiert, oder auch das Ausmaß eines Knockdowns einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von
Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches einen solchen Knockdown auslösen kann. Als genetisches Material findet insbesondere siRNA, Antisense-RNA, Ribozyme, Antisense-DNA oder DNA, die für siRNA oder Ribozyme codiert, Verwendung. Häufig wird die Transfektionseffizienz auch durch den Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten genetischen Materials in Folge von
Transfektionsprozessen zeigt, definiert.
[0005] Um Nukleinsäuren in Zellen einschleusen zu können, braucht man in der Regel Genliefersysteme, die zumindest die Membranbarriere der Zellen für die Nukleinsäure passierbar macht. Im Folgenden wird deshalb unter Transfektion eine Behandlung von eukaryotischen Zellen durch ein Genliefersystem und Nukleinsäuren verstanden.
[0006] Üblicherweise werden die vorhandenen Genliefersysteme in zwei Hauptgruppen unterteilt, nämlich virale Systeme und nicht-virale Systeme. [0007] Bei den insbesondere in der Gentherapieforschung bevorzugten viralen Systemen, werden Viren als Genliefersysteme angewendet. Da das Einbringen von Nukleinsäuren, insbesondere DNA oder RNA, in Fremdzellen ein integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist, wurde diese Fähigkeit durch einen natürlichen, evolutiven Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit verfeinert, dass es ein äußerst effektives Genliefersystem darstellt. Die eingesetzten Viren werden dabei durch Genmanipulation so verändert, dass sie keine pathogenen Eigenschaften mehr besitzen und sich nicht mehr reproduzieren können.
[0008] Nachteilig an den viralen Systemen ist jedoch, dass die Viren dem
Immunsystem eine große Angriffsfläche bieten, da das Immunsystem in einem ebenso evolutionären Anpassungsprozess Strategien entwickelt hat, sich den Viren zur Wehr zu setzen. Die Immunabwehr und die Aktivierung von Onkogenen durch zufällige Integration von genetischem Material in das Genom sind ungelöste Probleme, sodass es trotz jahrzehntelanger Forschung weltweit nur vereinzelt zugelassene Gentherapien gibt. In der Grundlagenforschung werden zwar auch häufig Viren eingesetzt, aber aufgrund des Sicherheitsrisikos und der aufwendigen Handhabung werden die viralen Systeme nur dort eingesetzt, wo es im
Wesentlichen keine Alternativen gibt.
[0009] Bei nicht-viralen Genliefersystemen werden allgemein keine natürlich vorkommenden Viren eingesetzt und sie werden nicht durch Rekombination genetischen Materials von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Diese nichtviralen Systeme können wiederum in zwei Untergruppen unterteilt werden, die auf chemischen Methoden basierenden Systeme und die auf physikalischen
Methoden basierenden Systeme.
[0010] Die auf chemischen Methoden basierenden nicht-viralen Genliefersysteme beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder Derivatisierung der Nukleinsäuren selbst, die sie zellgängig machen, oder umfassen Stoffe, die, beispielsweise über elektrostatische Kräfte oder
Wasserstoffbrückenverbindungen, Nukleinsäuren binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln können. Der Transport der Nukleinsäure durch die Zellmembran erfolgt in der Regel durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle, der sogenannten Endozytose.
[001 1 ] Stoffe, die eine Bindung der Nukleinsäuren ermöglichen, enthalten beispielsweise kationische Lipide, kationische Polymere, kationische Peptide. Diese kationischen Lipide und kationischen Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse spontan sogenannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei durch die
Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert, also in ihrer Größe minimiert. Diese Komplexe können durch die Zellen durch Endozytose aufgenommen werden. Auch werden manchmal Mischformen angewendet, bei welchen die Nukleinsäure durch kationische Polymere„vorkondensiert" wird und anschließend durch kationische Lipide zu einer Mischform aus Lipoplexen und Polyplexen komplexiert werden. Häufig werden dazu beispielsweise Polylysin, Polyarginin oder Polyethylenimin angewendet. Selbstverständlich können auch andere dem Fachmann bekannte kationische Lipide, Polymere und Peptide verwendet werden.
[0012] Die für eine chemisch-basierte nicht-virale Genliefermethode geeigneten Stoffe können aber auch Moleküle mit zumindest einer ersten und einer zweiten Domäne/Molekülteil sein. Dabei ist die erste Domäne als nukleinsäurebindende Domäne/Molekülteil ausgebildet. Unter einem nukleinsäurebindenden Molekülteil versteht man einen Bereich in einem Molekül, der eine Nukleinsäure,
insbesondere DNA und/oder RNA, kovalent oder über nicht kovalente
Wechselwirkungen, insbesondere elektrostatische Kräfte und
Wasserstoffbrückenbindungen bindet. Die zweite Domäne/Molekülteil enthält vorzugsweise einen Liganden. Dieser Ligand kann beispielsweise von einem Rezeptor auf der Zelloberfläche erkannt werden und durch diesen
Erkennungsprozess die Endozytose auslösen.
[0013] Alternativ kann dieser Ligand in der Lage sein, einen Membrantransfer auszulösen, d.h. einen Transport auf die andere Seite der Membran zu vermitteln. Unter Membrantransfer versteht man, dass ein Molekül von einer Seite der Membran auf die andere Seite gelangen kann. Die Liganden, die eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen können, können aber auch kovalent an das genetische Material gebunden werden, wenn dadurch die biologische Wirkung nicht oder nur wenig beeinträchtigt wird.
[0014] Die Stoffe können auch besonders formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen, oder auch mehrere Komponenten mit unterschiedlichen Funktionen umfassen.
[0015] Nicht-virale Genliefersysteme, die auf physikalischen Methoden basieren, lokalisieren das genetische Material in der Nähe der Zelle und nutzen Energie insbesondere in Form von thermischer, kinetischer, elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Als ein wichtiges Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem physikalischen Verfahren beruht sei die Elektroporation genannt. Bei diesem Verfahren werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden verbracht, an die ein geeigneter Spannungsverlauf angelegt wird. Auf diese Weise werden die Zellen einem elektrischen Puls ausgesetzt, der zur einer reversiblen Öffnung (Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können Nukleinsäuren in die Zelle eindringen.
[0016] Weitere wichtige physikalische Methoden sind Mikroinjektion,
hydrodynamische Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall benutzen. Darunter fallen auch Methoden, bei welchen die
Nukleinsäure nackt in verschiedene Organe bzw. Muskeln injiziert wird, was in Sonderfällen zu einer geringen Expression der entsprechenden Gene führen kann.
[0017] Kombinationsverfahren wie die Magnetofektion vereinen chemische und physikalische Methoden. Hier werden Nukleinsäuren chemisch auf magnetischen Nanoteilchen immobilisiert um sie durch einen magnetischen Feldgradienten auf der Oberfläche von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösen. [0018] Nachteilig an allen nicht-viralen Systemen ist jedoch, wie oben bereits bemerkt, dass ihre Effizienz nicht an die der viralen Systeme heranreicht. Da jedoch die virale Methode aufgrund der vielen Nachteile nur sehr eingeschränkt zur Gentherapie einsetzbar ist, wird unter den nicht-viralen Methoden nach entsprechend leistungsfähigen Alternativen gesucht.
[0019] Im Stand der Technik, beispielsweise der WO2009/065618 oder der WO2010/133369 wurde bereits festgestellt, dass das angeborene Immunsystem eine Barriere für eine erfolgreiche Transfektion darstellen kann, da die Zellen in der Lage sind über endosomale und cytosolische Rezeptoren Nukleinsäuren zu detektieren und daraufhin ihr physiologisches Verhalten zu ändern, mit dem Zweck einen mikrobiellen Angriff abzuwehren. Es ist deshalb im Stand der Technik vorgeschlagen worden, gezielt auf das Immunsystem einzuwirken und so die Transfektionseffizienz zu erhöhen.
[0020] Problematisch bei diesem Vorschlag ist jedoch, dass das angeborene Immunsystem in großen Bereichen einen redundanten Aufbau besitzt, das eine immense Anzahl an miteinander wechselwirkenden Mechanismen umfasst, die zum Teil noch nicht erforscht und deren Zusammenhänge noch nicht geklärt sind. Die Redundanz begründet sich in dem evolutionären Schlagabtausch
insbesondere zwischen Bakterien und Viren einerseits und den Eukaryonten andererseits. Sollte ein Signalstrang als Angriffsstrategie durch ein Pathogen unterbrochen werden, so ist die Zelle aufgrund des redundanten Aufbaus des angeborenen Immunsystems nicht schutzlos ausgeliefert. Als Konsequenz liefert die Unterbrechung eines Signalstranges in der Regel nur moderate Steigerungen der Transfektionseffizienz.
[0021 ] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, basierend auf einem Immunsystemsuppressionsmechanismus ein auf einem nicht-viralen
Genliefersystem beruhendes Transfektionsverfahren bereitzustellen, das eine Erhöhung der Transfektionseffizienz ermöglicht.
Beschreibung der Erfindung [0022] Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 , eine Zusammensetzung gemäß Patentanspruch 9, sowie ein Baukastensystem gemäß Patentanspruch 18 gelöst.
[0023] Erfindungsgemäß wird ein Transfektionsverfahren zum Einschleusen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen mittels eines nicht-viralen Genliefersystems vorgeschlagen, bei dem das nicht-virale Genliefersystem in seiner Leistungsfähigkeit dadurch verbessert wird, dass die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen
nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor behandelt werden.
[0024] Unter einem Toll-like (ähnliche) Rezeptor (kurz TLR, von engl, toll-like receptor) versteht man Proteine des angeborenen Immunsystems. Sie gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die der Erkennung von pathogenen Strukturen dienen und entsprechende Aktivierungen von Genen steuern. Hierdurch wird insbesondere die Aktivierung des antigen-spezifischen erworbenen
Immunsystems eingeleitet und moduliert. Durch die Toll-like Rezeptoren vermag das angeborene Immunsystem zwischen„selbst" und„nicht selbst" zu
unterscheiden. Genauer gesagt handelt es sich bei den TLRs um
Transmembranproteine mit einer extrazellulären,„leukin-reichen repeat" Domäne (LRR) und einer zytoplasmatischen Domäne, die derjenigen der IL-1 R Familie homolog ist. Die verschiedenen TLRs reagieren selektiv auf verschiedene molekulare virale und bakterielle Komponenten und steuern über eine
Signaltransduktionskaskade eine entsprechende Aktivierung von Genen. Dies geschieht zunächst über so genannte Adaptermoleküle und darauf folgend über Kinasen, die schließlich Transkriptionsfaktoren (z.B. NF-kappaB und die IRF- Familien) durch Phosphorylierung derselben oder entsprechende intrazelluläre Inhibitoren dieser Transkriptionsfaktoren aktivieren. Letztendlich werden neben einer Vielzahl spezifischer Gene, die eine antimikrobielle Wirkung haben, sogenannte Zytokine produziert. Zytokine sind wiederum notwendige Stimulatoren für das erworbene Immunsystem und damit auch ein Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem.
[0025] Bisher sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), wovon wiederum nur drei beim Menschen momentan als nukleinsauredetektierend gelten: TLR3 (lange dsRNA), TLR7 (ssRNA/dsRNA z.B. von RNA-Viren) und TLR9 (bakterielle/virale DNA).
[0026] IKKe und TBK-1 sind Kinasen, die eine wesentliche Rolle bei einer Signaltransduktionskaskade im angeborenen Immunsystem spielen, die einer Vielzahl von cytosolischen Rezeptoren nachgelagert ist und in der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren IRF3 und IRF7 endet. Die Kinase IKKe wird auch als IKKepsilon, IKappa Kepsilon, Ikappa Kinase epsilon oder IKK-3 bezeichnet. TBK-1 wird auch als TANK binding Kinase 1 bezeichnet. Da IKKe und TBK-1 zwei eng verwandte Kinasen sind, wirken Inhibitoren gegen IKKe in der Regel auch gegen TBK-1 und umgekehrt.
[0027] Unter einem Inhibitor wird erfindungsgemäß ein Molekül verstanden, das die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere eines Proteins verringern oder inhibieren kann. Dabei sind die Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder un modifizierte Nukleinsäuren oder kleine organische Moleküle, wobei auch geeignete siRNA, die die Expression eines Proteins unterbinden, als Inhibitoren aufgefasst werden können. In diesem Fall muss die siRNA
gegebenenfalls durch das Gen lief ersystem eingeschleust werden. Auch kann die inhibierende Wirkung dadurch zustande kommen, dass ein Molekül maskiert wird, das normalerweise durch ein Protein erkannt wird und dadurch eine biologische Wirkung auslöst. Die Wirksamkeit eines Inhibitors wird mittels des sogenannten IC5o-Wertes oder ECso-Wertes angegeben. Der ICso-Wert gibt die Konzentration eines Inhibitors an, die nötig ist um ein Target (z.B. Enzym, Zelle, Zellrezeptor, Mikroorganismus etc.) in vitro zu 50% zu blockieren. Der ECso-Wert, die effektive Konzentration, gibt diese benötigte Konzentration in vivo an. [0028] Zwar sind beide, die IKKe/TBK1 Kinase und die TLRs, als beeinflussende Faktoren für die Wirksamkeit des Immunsystem bekannt. Es hat sich jedoch völlig unerwarteter weise herausgestellt, dass Zellen, die mit einer Kombination aus einem Inhibitor für die Kinase IKKe und/oder die Kinase TBK-1 und einem Inhibitor für nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptoren behandelt werden, also bei denen die Wirkung von IKKe/TBK1 Kinasen und TLRs ausgeschaltet wird, eine synergistische Steigerung der Transfektionseffizienz bei der Anwendung nichtviraler Genliefersysteme zeigen. Dabei ist die Steigerung durch die Kombination größer, als die Summe der Steigerungen bei den einzelnen Komponenten.
[0029] Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel wird die
Transfektionseffizienz dieses Verfahren insbesondere dadurch gesteigert, dass ein Inhibitor für den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) verwendet wird. TLR9 ist ein Rezeptor für bakterielle DNA, bzw. für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA gehäuft (20 x häufiger als in Säugerzellen) auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert, wodurch es unterschieden werden kann. Ähnliches wie für bakterielle DNA gilt auch für virale DNA, die auch von TLR9 detektiert wird.
[0030] Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für
IKKe/TBK-1 ein Inhibitor mit einem ICso-Wert von weniger als 500 nM,
vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, verwendet und/oder als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor mit einem ECso-Wert von weniger als 1000 nM,
vorzugsweise weniger als 500 nM, am bevorzugtesten weniger als 200 nM, verwendet. Inhibitoren mit einem derartigen ICso-Wert bzw. ECso-Wert ermöglichen eine besonders gute Inhibition, die die Transfektionseffizienz signifikant steigert.
[0031 ] Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine und/oder der 4-Aminoquinoline, einschließlich derer Salze, verwendet. [0032] Unter der Gruppe der 4-Aminoquinolin werden Verbindungen und ihre Salze zusannnnengefasst die folgende Grundstruktur zeigen, wobei R1 bis R7 beliebige Substituenten sein können.
[0033] Unter der Gruppe der 9-Aminoacridine werden Verbindungen und ihre Salze zusannnnengefasst, die folgende Grundstruktur zeigen, wobei R1 bis R4 wiederum beliebige Substituenten sein können.
[0034] Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für mindestens einen Toll-like Rezeptor Quinacrin aus der Gruppe der 9
Aminoacridine und/oder Chloroquin aus der Gruppe der 4-Aminoquinoline verwendet.
Quinacrin:
Chloroquin:
[0035] Zwar wurde Chloroquin schon früher zur Steigerung der
Transfektionseffizienz bei Transfektionsprozessen verwendet, zeigte aber in der bisher untersuchten solitärer Verwendung ein sehr inkonsistentes Verhalten, so dass die Transfektionseffizienz nicht zuverlässig gesteigert werden konnte. Erst durch die erfindungsgemäße Kombination mit einem Inhibitor der IKKe/TBK-1 Kinase konnte eine zuverlässige und signifikante Steigerung der
Transfektionseffizienz erreicht werden.
[0036] Gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel werden als Inhibitoren folgende Verbindungen aus der Gruppe der 9-Aminoacridine und 4- Amino uinoline verwendet:
[0037] Auch diese Verbindungen zeigen in Kombination mit einem Inhibitor der IKKe/TBK-1 Kinase eine deutliche Steigerung der Transfektionseffizienz.
[0038] Alternativ kann als Inhibitor für einen Toll-like Rezeptor auch ein
Oligonukleotid verwendet werden, dessen Sequenz geeignet ist, Toll-like Rezeptoren zu inhibieren, oder es können auch Antikörper verwendet werden, die gegen Toll-like Rezeptoren gerichtet sind. Eine Inhibition lässt sich natürlich auch mit einer Kombination der genannten Ausführungsbeispiele erreichen.
[0039] Dabei können auch hier weitere Inhibitoren für nukleinsauredetektierende Toll-like Rezeptoren vom Rahmen der Erfindung umfasst sein, die erst später als solche erkannt werden. Zudem können zusätzlich zu der Kombination eines Inhibitors für IKKe/TBK-1 und eines Inhibitors für einen Toll-like Rezeptor auch weitere Inhibitoren verwendet werden.
[0040] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Inhibitor für IKKe/TBK-1 einer oder mehrere der folgenden Inhibitoren,
einschließlich deren Salze, verwendet:
BX795 (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl) amino) propyl) amino)-2- pyrimidinyl) amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1 -carbonylamino) anilino) pyrimidin-4-yl)amino) propyl)-2,2- dimethyl propanediamide, CAS 702676- 93-5);
Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-(2-methanesulfonyl- benzyloxy)-thiophene-2-carbonitrile, CAS 862812-98-4);
Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-((4-methylsulfonyl) phenyl) methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21 -2);
Amlexanox (2-Amino-7-(1 -methylethyl)-5-oxo-5H-[1 ]Benzopyrano[2,3- b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8);
MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4-morpholinylmethyl)phenyl]amino]- 4-pyrimidinyl]amino]propyl]-cyclobutanecarboxamide, CAS 1 190378-57-4); CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4- pyrimidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4).
[0041 ] Bei der vorteilhaften Verwendung dieser Inhibitoren ist eine Steigerung der Transfektionseffizienz deutlich zu sehen. [0042] Als weitere bekannte Inhibitoren für IKKe/TBK-1 können SU6668 (Sugen Inc.), MPI-0485520 (Myraid Pharma), MCCK1 , und der Amgen TBK 1 inhibitor (Compound II) (Ou et al.; Molecular Cell; 201 1 ; 41 ; 458-470) verwendet werden. In EP 1720864, WO 2009030890, WO 2010100431 , WO 2012059171 ,
WO002012161877, WO002012161879, WO002013034238, WO002013024282, WO002013075785, WO0020131 17285, WO002014189806, WO002014128486 WO002014093936, WO002015134171 , WO002016057338, US020150352108 und US020160015709 sind weitere IKKe/TBK-1 Inhibitoren aufgeführt, die ebenfalls Verwendung finden können.
[0043] Dabei können auch andere Inhibitoren verwendet werden, die nicht oben aufgeführt sind, falls sie eine inhibierende Wirkung auf IKKe und/oder TBK-1 aufweisen. Ebenfalls sind Inhibitoren umfasst, deren Wirkung auf IKKe und/oder TBK-1 erst zu einem späteren Zeitpunkt erkannt wird.
[0044] Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel des
erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der durch die Transfektion eingeschleusten Nukleinsäure insbesondere um modifizierte und/oder
unmodifizierte ssDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsRNA. Dabei hat sich als besonders bevorzugt dsDNA und ssRNA erwiesen. Dabei können auch verschiedene Typen von Nukleinsäuren kombiniert angewendet werden, wie es beispielsweise beim "Genome Editing" nach der CRISPR/Cas9 Methode häufig notwendig ist.
[0045] Dabei versteht man unter einer Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure, die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen, z.B. dsDNA und dsRNA, oder die aus einem Strang (einzelsträngig = ss) besteht, z.B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplementäre Bereiche aufweisen kann. Das genetische Material dient im Falle von DNA zur Erzeugung von RNA und/oder Proteinen. Im Falle von ssRNA dient es zur Erzeugung von Proteinen. Im Falle von dsRNA dient das genetische Material dazu einen Knockdown eines Gens durch RNA- Interferrenz zu erreichen oder als microRNA zu wirken. Als Antisense-DNA oder Antisense-RNA dient die Nukleinsäure der Inhibition der Translation von mRNA.
[0046] Als modifizierte Nukleinsäuren bezeichnet man natürliche Nukleinsäuren, die durch Modifikation in ihren Eigenschaften verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen insbesondere chemische Veränderungen sein, die das Phosphatgerüst, und/oder die Zucker und/oder die Basen betreffen, was insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren gegen Nukleasen und
Ribonukleasen erhöht und deren Erkennbarkeit durch nukleinsäuredetektierende Rezeptoren verringern soll.
[0047] Des Weiteren können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften der
Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer Verfolgbarkeit durch
Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente) oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise zellgängig machen. Beispiele für Modifikationen sind der Austausch von
Sauerstoff gegen Schwefel im Phosphatgerüst, im Falle von RNA die Methylierung von 2'-OH Gruppen der Ribose, oder die Methylierung der Basen. Ein weiteres Beispiel, ist die vollständige Substitution von 2ΌΗ Gruppen der RNA durch Fluor, um die Stabilität gegen Nukleasen zu erhöhen. Noch ein weiteres Beispiel ist das Anheften von FITC (fluorescein isothiocyanate) als Fluoreszenzlabel, um den Weg des genetischen Materials in der Zelle mikroskopisch verfolgen zu können oder das Anheften von sogenannten NLS (Nuclear localisation Signals, zB.
PKKKRKVG) um einen Transport in den Zellkern zu erreichen.
[0048] Als nicht virales Genliefersystem kann jedes dem Fachmann bekannte Genliefersystem gewählt werden. Insbesondere ist bevorzugt, wie ein weiteres Ausführungsbeispiel zeigt, wenn als nicht-virales Genliefersystem ein
Genliefersystem verwendet wird, das:
ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen
Membrantransfer auslösen kann; und/oder
eine Verbindung umfasst, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann.
[0049] Alternativ oder zusätzlich kann das nicht-virale Gen lief ersystem auch auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion, Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruhen.
[0050] Gemäß einem weiteren Aspekt vorliegender Erfindung wird ferner eine Zusammensetzung aus zumindest mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen
nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor bereitgestellt. Vorzugsweise kann die Zusammensetzung weiterhin zumindest ein nicht-virales Genliefersystem, und/oder eine oder mehrere modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren aufweisen.
[0051 ] Dabei können in der Zusammensetzung vorzugsweise einer oder mehrerer der oben diskutierten Inhibitoren, Genliefersysteme und/oder
Nukleinsäuren umfasst sein.
[0052] Gemäß einem weiteren Aspekt vorliegender Erfindung wird ferner ein Baukastensystem zur Durchführung des oben diskutierten Transfektionsverfahren mit zumindest einer ersten Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen der oben diskutierten Inhibitoren für IKKe und/oder TBK-1 umfasst, und einer zweiten Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen der oben diskutierten Inhibitoren für zumindest einen nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptor umfasst, bereitgestellt.
[0053] Alternativ kann gemäß diesem Aspekt der Erfindung das
Baukastensystem auch eine Inhibitorenzusammensetzung bereitstellen, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und zugleich mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst.
[0054] Zusätzlich kann das Baukastensystem eine
Genliefersystemzusammensetzung mit mindestens einem nicht-viralen
Genliefersystem, und/oder eine Nukleinsäurezusammensetzung mit mindestens einer modifizierten oder un modifizierten Nukleinsäure bereitstellen.
[0055] Die Inhibitorenzusammensetzung oder mindestens eine der
Inhibitorenteilzusammensetzungen ist dabei eine Zusammensetzung aus
Inhibitoren, wie oben diskutiert.
[0056] Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel können in dem
Baukastensystem eine oder mehrere der Zusammensetzungen oder
Teilzusammensetzungen eine Kombinationszusammensetzung mit einer oder mehreren anderen Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen bilden.
[0057] Das heißt, bei dem erfindungsgemäßen Baukastensystem können alle Komponenten getrennt voneinander vorliegen, oder in allen kombinatorisch möglichen Kombinationen als Zusammensetzung gemeinsam vorliegen. So können die Komponenten entweder getrennt voneinander z.B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder zu mehreren als Zusammensetzung in entsprechenden Behältern bereitgestellt werden.
[0058] Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder das
erfindungsgemäße Baukastensystem können zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden. Ferner kann die
erfindungsgemäße Zusammensetzung als pharmazeutische Zusammensetzung vorliegen. Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder ein Baukastensystem zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie, zum "Genome Editing" z.B. mittels CRISPR-Cas9 oder auch zur repetitiven
Transfektion von Zellen verwendet werden.
[0059] Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausführungsbeispiele sind in den Ansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen definiert. Weiterhin können die beschriebenen Merkmale einzeln oder in Kombination vorliegen. Zudem können, sofern nicht anders angegeben, Merkmale, die in Kombination beschrieben sind, als Einzelmerkmale oder in anderen Kombinationen als der angegebenen Kombination vorliegen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
[0060] Im Folgenden soll die Erfindung anhand von in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispielen näher beschrieben werden. Dabei sind die
Ausführungsbeispiele rein exemplarischer Natur und sollen nicht den
Schutzbereich der Anmeldung definieren. Dieser ist allein durch die anhängigen Ansprüche definiert.
Es zeigen:
Fig. 1 : eine graphische Darstellung von Transfektionseffizienzen gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel; und
Fig. 2: eine graphische Darstellung von Transfektionseffizienzen gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel.
Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen
[0061 ] Fig. 1 und Fig. 2 zeigen schematisch vergleichende Darstellungen von Transfektionseffizienzen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und ohne das erfindungsgemäße Verfahren erzielt werden.
[0062] Wie den Figuren zu entnehmen ist kann durch die erfindungsgemäße Behandlung der Zellen vor und/oder während der Transfektion eine deutliche Steigerung der Transfektionseffizienz erreicht werden. Die Transfektionseffizienz wurde indirekt über ein Luziferaseenzym gemessen, das von der eingeschleusten Nukleinsäure codiert wurde. Es handelt sich dabei um ein sogenanntes
Reportergensystem. Diese sind etablierte Systeme zum Nachweis der
Transfektionseffizienz. Je höher also die Menge an Luziferase ist, die in einem Kulturgefäß nach Lyse der transfizierten Zellen nachgewiesen werden kann, desto größer ist die Transfektionseffizienz. Der Nachweis der Menge von Luziferase erfolgt über eine Enzym-Substratreaktion, bei der ein Lichtquant freigesetzt wird. Diese Lichtquanten können von geeigneten Messgeräten, sogenannten
Luminometern gemessen werden. Da die Anzahl der gemessenen Lichtquanten, insbesondere von dem Zeitintervall abhängig ist, indem die Messung stattfand, wird diese Lichtquantenmenge auch als„relative light units" bezeichnet. Für vergleichende Studien müssen die Messbedingungen demnach gleich sein.
[0063] In den Figuren sind auf der X-Achse die unterschiedlichen Behandlungen der Zellen aufgetragen und auf der y-Achse die für die jeweiligen Behandlungen erzielte Transfektionseffizienz in [%]. Dabei wurden die Messwerte auf die
Transfektion ohne Inhibitoren normiert indem diese 100% gleichgesetzt wurde. Dabei ist bei beiden Beispielen bei der Behandlung durch den IKKe/TBK-1 Inhibitor und einem Inhibitor für einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like
Rezeptor eine signifikante Steigerung zu verzeichnen, die auch nicht durch bloße Addition der einzelnen Steigerungsraten für IKKe/TBK-1 Inhibitor und einem Inhibitor für einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor allein zu erklären ist. Es handelt sich also klar um einen synergistischen Effekt.
[0064] Zu den Figuren im Einzelnen:
[0065] Als allgemeines Material wurde folgendes verwendet:
1 . HeLa Zellen; ATTC CCL-2
2. Rotifect Plus, Carl Roth; Kat-Nr.: CL21 .2
3. 48 Well Platten; Cellstar; Greiner BioOne; Kat-Nr.: 677180
4. DMEM; High Glucose; Biowest, w/stable Glutamine/Sodiumpyruvat, Kat- Nr.: L103-500
5. Serum FBS Gold; PAN Biotech; Lot.Nr. P130914; Kat-Nr.: P40-37500 6. pCMV-luc, Plasmid Factory, Kat-Nr.: PF461
7. Luciferase Assay Kit, Promega
8. Dimethylsulfoxid (DMSO für die Molekularbiologie), Fluka; Kat-Nr.: 41639
9. (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl)amino)propyl)amino)-2- pyrimidinyl)amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide (BX795),
Merck4Biosciences, Kat-Nr.: 204001
10. Chloroquin-diphosphat; Fluka; Kat.-Nr.: C6628
1 1 . Quinacrin Dichlorid Hydrat; TCI; Kat.-Nr.: Q0056
[0066] Beispiel 1 - Fig. 1
Das in Fig. 1 gezeigte, erste Ausführungsbeispiel betrifft eine Lipofektion von HeLa Zellen mit einem handelsüblichen Transfektionsreagenz (Rotifect Plus), die vor und während der Transfektion mit dem Inhibitor BX795 für IKKe und TBK-1 und mit Chloroquin als Inhibitor für TLR9 behandelt wurden.
Die Lipofektion der HeLa Zellen wurde während eines 3-tägigen Zeitraums durchgeführt:
1. Tag: Es wurden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wurde eine Zellzahl von 1 * 105 Zellen pro Well in 250 μΙ komplettem DMEM-Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wurde 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
2. Tag:
Von Chloroquin und BX795 wurden Stocklösungen in einem Gemisch aus DMSO und Wasser hergestellt. 2 Stunden vor der Transfektion wurden jeweils 4 Wells mit Chloroquin oder BX795 und 4 Wells mit beiden Substanzen bestückt. Mit einer entsprechenden Menge der beiden Stocklösungen wurde die Konzentration der Inhibitoren in dem Kulturmedium der Zellen dabei so eingestellt, dass Chloroquin in einer Konzentration von 10 μΜ und BX795 in einer Konzentration von 0,5 μΜ vorlag. Weiter wurde darauf geachtet, dass die DMSO Konzentration 1 % v/v nicht überschritt. Die Transfektion aller Zellen in der 48 Well Platte wurde mit 0,3 g pCMV-Luc und 1 ,2 μΙ Rotifect Plus entsprechend den Herstellerangaben für das Transfektionsreagenz durchgeführt. Anschließend wurde 24 h in einem CO2- Inkubator (10%) inkubiert.
3. Tag:
Die Effizienz der Transfektion wurde mit einem Luciferase Assay Kit bestimmt. Der Assay wurde entsprechend den Vorgaben des Herstellers durchgeführt.
Ergebnisse in RLU (Mittelwerte von drei Tests)
ST = Standardtransfektion ohne BX795 und Chloroquin
BX795: C = 0,5 μΜ
Chloroquin: C = 10 μΜ
Die Steigerung durch die einzelne Anwendung von Chloroquin respektive BX795 gegenüber der Standardtransfektion beträgt 19% bzw. 256%. Die Steigerung durch eine kombinierte Anwendung beträgt mit 474% weit mehr als die Summe der Steigerungen bei einzelner Anwendung, d.h. bei der kombinierten Anwendung zeigt sich ein synergistischer Effekt.
[0067] Beispiel 2 - Fig. 2
Das in Fig. 2 gezeigte, zweite Ausführungsbeispiel betrifft eine Lipofektion von HeLa Zellen, die vor und während der Transfektion mit dem Inhibitor BX795 für IKKe und TBK-1 und mit Quinacrin als Inhibitor für TLR9 behandelt wurden.
Die Lipofektion der HeLa Zellen wurde analog Beispiel 1 durchgeführt.
Ergebnisse in RLU/ g Protein (Mittelwerte) 100% 141 % 385% 732%
ST = Standardtransfektion ohne BX795 und Quinacrin
BX795: C =0,5 μΜ
Quinacrin: C = 2,5 μΜ
Die Steigerung durch die einzelne Anwendung von Quinacrin respektive BX795 gegenüber der Standardtransfektion beträgt 41 % bzw. 285%. Die Steigerung durch eine kombinierte Anwendung beträgt mit 632% weit mehr als die Summe der Steigerungen bei einzelner Anwendung, d.h. bei der kombinierten Anwendung zeigt sich ein synergistischer Effekt.
[0068] Im allgemeinen kann also resümiert werden, dass vorteilhafterweise durch die erfindungsgemäße Behandlung der Zellen vor und/oder während der
Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor eine signifikante Steigerung der Transfektionseffizienz zu verzeichnen ist, die auf einem synergistischen Effekt beruht.

Claims

Ansprüche:
1 . Transfektionsverfahren zum Einschleusen einer oder mehrerer
Nukleinsäuren in eukaryotischen Zellen mittels eines nicht-viralen
Genliefersystems,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor, TLR, behandelt werden.
2. Transfektionsverfahren nach Anspruch 1 , wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest ein Inhibitor für TLR 9, den Toll-like Rezeptor 9, verwendet wird.
3. Transfektionsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei als Inhibitor für IKKe/TBK-1 ein Inhibitor mit einem ICso-Wert von weniger als 500 nM,
vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, verwendet wird; und/oder
als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor mit einem ECso-Wert von weniger als 1000 nM, vorzugsweise weniger als 500 nM, am bevorzugtesten weniger als 200 nM, verwendet wird.
4. Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der der 4-Aminoquinoline,
einschließlich deren Salze, verwendet wird, wobei die Verbindung folgende Grundstruktur
aufweist, wobei R1 bis R7 beliebig wählbar ist.
5. Transfektionsverfahren nach Anspruch 4, wobei als Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Chloroquin, einschließlich dessen Salze, verwendet wird mit R5 = Cl und R7 =
NHCHMe CH2)3NEt2 und dementsprechend folgender Struktur
und/oder als Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich deren Salze, verwendet wird mit R5 Cl und R7 = NHCH2CH(C6H4OMe)(CH2)2NEt2 und dementsprechend folgender Struktur:
und/oder als Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich deren Salze, verwendet wird mit R5 = NHCHMe(CH2)3NEt2, R1 = CeHs und dementsprechend folgend
6. Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine, einschließlich deren Salze, verwendet wird, wobei die Verbindung folgende Grundstruktur
aufweist, wobei R1 bis R4 beliebig wählbar sind.
7. Transfektionsverfahren nach Anspruch 6, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Quinacrin, einschließlich dessen Salze, verwendet wird mit R1 = OMe, R2 = H, R3 = Cl, R4 =
NHCHMe CH2)3NEt2 und dementsprechend folgender Struktur
8. Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 einer oder mehrere aus der Gruppe BX795 (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl) amino) propyl) amino)-2- pyrimidinyl) amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1 -carbonylamino) anilino) pyhmidin-4-yl)amino) propyl)-2,2- dimethyl propanediamide, CAS 702676- 93-5);
Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-(2-methanesulfonyl- benzyloxy)-thiophene-2-carbonithle, CAS 862812-98-4);
Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-((4-methylsulfonyl) phenyl) methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21 -2);
Amlexanox (2-Amino-7-(1 -methylethyl)-5-oxo-5H-[1 ]Benzopyrano[2,3- b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8);
MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4- morpholinylmethyl)phenyl]amino]-4-pyhmidinyl]amino]propyl]- cyclobutanecarboxamide, CAS 1 190378-57-4);
CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4- pyhmidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4);
einschließlich deren Salze, gewählt werden.
9. Zusammensetzung für ein Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die
Zusammensetzung zumindest mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung weiterhin umfasst:
a. ein nicht-virales Genliefersystem, und/oder
b. eine oder mehrere modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren.
1 1 . Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der mindestens eine Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor für TLR 9, den Toll-like Rezeptor 9, ist.
12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 1 1 , wobei der Inhibitor für IKKe/TBK-1 einen ICso-Wert von von weniger als 500 nM,
vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, aufweist; und/oder
der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor einen ECso- Wert von weniger als 1000 nM, vorzugsweise weniger als 500 nM, am
bevorzugtesten weniger als 200 nM, aufweist.
13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der der 4-Aminoquinoline, einschließlich deren Salze, umfasst, die folgende Grundstruktur
aufweist, mit R1 bis R7 beliebig wählbar.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Chloroquin,
einschließlich dessen Salze, umfasst mit R5 = Cl und R7 = NHCHMe(CH2)3NEt2 und dements rechend folgender Struktur
und/oder der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich dessen Salze, umfasst, mit R5 = Cl und R7 = NHCH2CH(C6H4OMe)(CH2)2NEt2 und dementsprechend folgender Struktur:
und/oder der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich dessen Salze, umfasst, mit R5 = OMe, R7 = NHCHMe CH2)3NEt2, R1 = CeHs und dementsprechend folgender Struktur:
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine, einschließlich dessen Salze, umfasst, die folgende Grundstruktur
aufweist, wobei R1 bis R4 beliebig wählbar sind.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Quinacrin, einschließlich dessen Salze, umfasst mit R1 = OMe, R2 = H, R3 = Cl, R4 = NHCHMe(CH2)3NEt2 und dementsprechend fol ender Struktur
17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei der Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 einen oder mehrere aus der Gruppe
BX795 (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl) amino) propyl) amino)-2- pyrimidinyl) amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1 -carbonylamino) anilino) pyrimidin-4-yl)amino) propyl)-2,2- dimethyl propanediamide, CAS 702676- 93-5);
Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-(2-methanesulfonyl- benzyloxy)-thiophene-2-carbonitrile, CAS 862812-98-4);
Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-((4-methylsulfonyl) phenyl) methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21 -2);
Amlexanox (2-Amino-7-(1 -methylethyl)-5-oxo-5H-[1 ]Benzopyrano[2,3- b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8);
MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4- morpholinylmethyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]amino]propyl]- cyclobutanecarboxamide, CAS 1 190378-57-4);
CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4- pyrimidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4);
einschließlich deren Salze, umfasst.
18. Baukastensystem für ein Transfektionsverfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Baukastensystem
zumindest eine erste Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 umfasst, und eine zweite Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptor umfasst, aufweist
oder, dass das Baukastensystem
eine Inhibitorenzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und zugleich mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst, aufweist.
19. Baukastensystem nach Anspruch 18, wobei die
Inhibitorenzusammensetzung oder mindestens eine der
Inhibitorenteilzusammensetzungen eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 17 ist.
20. Baukastensystem nach einem der Ansprüche 18 bis 19, wobei das Baukastensystem weiterhin umfasst:
a. eine Genliefersystemzusammensetzung mit mindestens einem nichtviralen Gen lief ersystem, und/oder
b. eine Nukleinsäurezusammensetzung mit mindestens einer modifizierten oder un modifizierten Nukleinsäure.
21 . Baukastensystem nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei eine oder mehrere der Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen eine
Kombinationszusammensetzung mit einer oder mehreren anderen
Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen bilden.
EP17751996.4A 2016-07-26 2017-06-27 Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen Withdrawn EP3490608A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102061013714 2016-07-26
PCT/DE2017/200056 WO2018019341A1 (de) 2016-07-26 2017-06-27 Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3490608A1 true EP3490608A1 (de) 2019-06-05

Family

ID=66284937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP17751996.4A Withdrawn EP3490608A1 (de) 2016-07-26 2017-06-27 Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen

Country Status (1)

Country Link
EP (1) EP3490608A1 (de)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10100586C1 (de) Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
DE60310944T3 (de) Weitere neue formen von interferierende rns moleküle
EP2217704B1 (de) Verfahren zur förderung der angiogenese, vaskularisierung oder gefässreparatur oder zur hemmung der tumorangiogenese
CN102482672B (zh) 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病
DE10100588A1 (de) Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens
EP2212425A2 (de) Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems
EP3199633B1 (de) Herabregulation der genexpression mittels nukleinsäure-beladener virus-ähnlicher partikel
WO2018019341A1 (de) Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen
CN107001627A (zh) 用于将核酸引入细胞的组合物
CN104313027A (zh) 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病
Ito et al. Effects of repeated electroconvulsive seizure on cell proliferation in the rat hippocampus
US20170216457A1 (en) Messenger rna nanoparticles and preparation method therefor
EP3490608A1 (de) Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen
WO2012089207A2 (de) Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend l-dna
EP2393504B1 (de) Ein l-ribozym enthaltende pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung von nebenwirkungen durch gabe von spiegelmeren
DE10211558A1 (de) Neue Formen RNAi
DE102007056488A1 (de) Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
DE102008023913A1 (de) Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
DE102013003869B4 (de) Verfahren zur gezielten Abtötung von Zellen durch zur mRNA-Anbindung ausgerichtete Nukleotid-Moleküle sowie Nukleotid-Moleküle und Applikationskit für solche Verwendung
DE102008016275A1 (de) Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
DE102020114183B4 (de) Mittel zur transfektion von nukleinsäuren in zellen
WO2010133369A1 (de) Transfektionsverfahren für nicht-virale genliefersysteme mit verbesserter wirksamkeit durch blockierung des angeborenen immunsystems
EP2281044B1 (de) Oligonukleotide zur hemmung und zum nachweis von humanen argonaute-proteinen
DE102004038535B4 (de) Zelluläre Einschleusung von Nukleinsäurewirkstoffen
DE10361917A1 (de) Verfahren zur Transfektion von Zellen

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20190213

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20210112