WO2022195963A1 - ミクログリアｍ１極性化抑制剤及び医薬組成物 - Google Patents

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WO2022195963A1
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polarization
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gene
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通仁 河野
達也 渥美
皓平 狩野
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国立大学法人北海道大学
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Definitions

  • the present invention provides an agent for suppressing M1 polarization of microglia containing a substance that suppresses the expression of Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon (IKBKE) or inhibits kinase activity, a pharmaceutical composition, and suppression of IKBKE expression.
  • IKBKE Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon
  • Microglia are tissue macrophages that exist in the central nervous system and account for about 10% of all cells in the central nervous system. Microglia, like other macrophages, have plasticity that allows them to drastically change their morphology and function in response to local environmental signals. Microglia are roughly classified into damaging M1 type and protective M2 type. M1-type microglia (M1 microglia) have high antigen-presenting ability and phagocytic ability, secrete inflammatory cytokines, and contribute to the removal of pathogens such as bacteria and viruses and damaged tissues. M2-type microglia (M2 microglia) play a role in wound healing and immune tolerance by secreting anti-inflammatory cytokines and growth factors.
  • M1 microglia and M2 microglia control neuroinflammation by balancing each other.
  • inflammation increases and nerve cells are damaged, leading to the onset or progression of symptoms of various nervous system diseases including neurodegenerative diseases. considered to be connected. Therefore, regulation of microglial M1 polarization is of interest as a new therapeutic target for neurological diseases.
  • Systemic Lupus Erythematosus is one of the representative autoimmune diseases that frequently develops in young women and is associated with life prognosis. SLE is associated with various organ lesions, but among them, the pathology of Neuropsychiatric syndrome of SLE (NPSLE) is still unknown, and no clear treatment strategy has been established. Running late.
  • immunosuppressive therapy steroid therapy, cyclophosphamide pulse therapy, etc.
  • antithrombotic therapy low-dose aspirin, warfarin, etc.
  • symptomatic therapy antiepileptic drugs, antipsychotic drugs, antianxiety drugs, NSAIDs, etc.
  • triptan preparations etc.
  • Non-Patent Document 1 NPSLE pathology
  • the present inventors discovered that inhibition of IKBKE (Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon), a kinase involved in the NF- ⁇ B pathway, led to M1 polarization of microglia, that is, the microglial phenotype changed to M1 type. It was found that the polarization can be suppressed.
  • IKBKE Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon
  • Item 1 A microglial M1 polarization inhibitor containing a substance that suppresses the expression of Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon (IKBKE) or inhibits kinase activity.
  • IKBKE Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon
  • Item 2. The agent according to Item 1, wherein the substance is a nucleic acid that suppresses the expression of IKBKE.
  • Item 3 The agent according to Item 1, wherein the substance is a specific antibody against IKBKE or a derivative thereof.
  • Item 4 The agent according to Item 1, wherein the substance is malachite green oxalate (MCCK1), amlexanox, DMXD-011, MPI-0485520, SR8185, 200A or 200B.
  • Item 5. A microglial M1 polarization inhibitor containing a substance that suppresses the expression of Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B
  • a pharmaceutical composition for treating a disease or condition associated with M1 polarization of microglia comprising the agent according to any one of Items 1 to 4.
  • Item 6. For the treatment of neuropsychiatric lupus, multiple sclerosis, neuromyelitis optica, neurodegenerative diseases and symptoms associated therewith, epilepsy, cerebral infarction, autism spectrum disorders, mood disorders or schizophrenia, according to Item 5.
  • pharmaceutical composition of Item 7. The pharmaceutical composition of Item 5 or Item 6 for treatment of neuropsychiatric lupus.
  • Item 8. A method for evaluating microglia M1 polarization inhibitory activity of a test substance, using IKBKE expression inhibition or kinase activity inhibition as an index.
  • Item 9 Including determining the microglial M1 polarization inhibitory activity of the test substance by comparing the IKBKE gene promoter activity, IKBKE gene expression, or IKBKE protein expression in the presence and absence of the test substance.
  • Item 10 Incubating a test substance with a cell containing a nucleic acid having a marker gene under the control of a promoter region that controls the expression of the IKBKE gene; Measuring the intensity of a signal derived from the marker gene in the cell; Measured marker A step of comparing the intensity of the gene-derived signal with the intensity of the marker gene-derived signal in the absence of the test substance; 10. A method according to clause 8 or clause 9, comprising the step of determining.
  • Item 11 The step of incubating a test substance with cells capable of expressing the IKBKE gene or protein; the step of measuring the intensity of the IKBKE gene- or protein-derived signal in said cells; A step of comparing the intensity of the IKBKE gene- or protein-derived signal with the intensity of the IKBKE gene- or protein-derived signal in the absence of the test substance; and a step of determining the test substance that reduces the intensity of the IKBKE gene- or protein-derived signal as a substance having microglial M1 polarization inhibitory activity.
  • Item 9. The method of item 8 or 9, comprising: Item 12.
  • the method according to Item 8 comprising determining the microglia M1 polarization inhibitory activity of the test substance by comparing the kinase activity of IKBKE in the presence and absence of the test substance.
  • Item 13 The step of incubating a test substance with IKBKE, a substrate, and ATP; the step of measuring the intensity of a signal that varies with phosphorylation of the substrate; a step of comparing the intensity of the signal that varies with phosphorylation of the substrate in the absence of the substance; Item 13.
  • a method according to Item 12, comprising the step of determining that the substance has an antiviral activity.
  • M1 polarization of microglia can be suppressed by suppressing the expression or activity of IKBKE, and diseases or conditions associated with M1 polarization of microglia can be treated.
  • the microglial M1 polarization inhibitory activity of a test substance can be evaluated.
  • MRL/MpJ-Faslpr/J MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr)-derived microglial inflammatory cytokine (TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ ) is a graph showing gene expression levels.
  • IKBKE gene expression levels and inflammatory cytokines (TNF- ⁇ , IL) in microglia from MRL/lpr mice with cytokine stimulation (IFN ⁇ or TNF ⁇ alone) in the presence of IKBKE-specific siRNA (ikbke si1 or ikbke si2) or control siRNA -1 ⁇ ) is a graph showing gene expression levels.
  • IKBKE gene expression levels and inflammatory cytokine (TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ ) gene expression levels in MRL/lpr mouse-derived microglia stimulated with cytokines in the presence of IKBKE-specific siRNA (ikbke si1 or ikbke si2) or control siRNA is a graph showing Fig.
  • FIG. 3 is a graph showing cognitive function (preference index in novel object recognition test) of MRL/lpr mice to which MCCK1 was intracerebroventricularly administered.
  • FIG. 2 shows representative Fluoro-Jade C-stained images of the hippocampus of MRL/lpr mice to which MCCK1 was intracerebroventricularly administered (left side of the figure) and a graph showing the number of Fluoro-Jade C-positive cells (right side of the figure).
  • a graph (right side of the figure) showing the ratio of AM-positive cells.
  • the present invention provides a microglial M1 polarization inhibitor containing a substance that suppresses IKBKE expression or inhibits kinase activity.
  • IKBKE Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon; also abbreviated as IKK-I, IKK- ⁇
  • IKK-I Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon; also abbreviated as IKK-I, IKK- ⁇
  • IKBKE suppresses the expression of IKBKE or inhibits its kinase activity. It is a kind of kinase and is known to be involved in NF- ⁇ B activation.
  • IKBKE is also involved in the phosphorylation of IRF3 and IRF7 and has been shown to contribute to the activation of type I interferons.
  • the nucleotide sequence of human IKBKE gene is NCBI Reference Sequence: NC_000001.11, the nucleotide sequence of IKBKE mRNA is NM_014002.4, NM_001193321.2 and NM_001193322.2, and the amino acid sequence of IKBKE protein corresponding to the mRNA is NP_054721. 1, NP_001180250.1 and NP_001180251.1.
  • a substance that suppresses IKBKE expression or inhibits kinase activity is also referred to herein as an IKBKE inhibitory substance, and includes both substances that suppress IKBKE expression and substances that inhibit IKBKE kinase activity.
  • a substance that suppresses the expression of IKBKE or inhibits the kinase activity means a substance that has the ability to suppress the expression of IKBKE or inhibit the kinase activity.
  • nucleic acids that suppress the expression of IKBKE include nucleic acids that can suppress transcription of mRNA from the IKBKE gene (IKBKE mRNA), nucleic acids that can degrade IKBKE mRNA, and nucleic acids that can suppress protein translation from IKBKE mRNA.
  • examples include nucleic acids that can be designed and produced by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the IKBKE gene or the nucleotide sequence of IKBKE mRNA, antisense nucleic acids, or nucleic acids that cause RNA interference, such as siRNA, shRNA or miRNA may be mentioned.
  • siRNAs examples include Applied Biosystems, Silencer Select Pre-designed siRNA s80670 and s80671 for mice, and Applied Biosystems, Silencer Select Pre-designed siRNAs, s18536, s18537 and s18538 for humans (all from Thermo Fisher ) can be mentioned.
  • miRNAs examples include mouse mmu-miR-155-5p (miRBase accession number MIRT002347), human hsa-miR-155-5p (miRBase accession number MIRT003484), hsa -miR-296-5p (miRBase accession number MIRT006572) and hsa-miR-124-3p (miRBase accession number MIRT022344).
  • part of the base sequence of the DNA capable of inducing the transcription of an antisense nucleic acid or a nucleic acid that causes RNA interference by placing it under the control of an appropriate expression promoter, and the base sequence of the antisense nucleic acid or the nucleic acid that causes RNA interference is modified.
  • Nucleic acids that are functionally equivalent to antisense nucleic acids or nucleic acids that cause RNA interference are also included in the nucleic acids that suppress the expression of IKBKE according to the present invention. Modifications for improving stability against nuclease degradation include 2'O-methylation, 2'-F, 4'-thiolation, and the like.
  • chimeric RNAs in which part of the ribonucleotides of the RNA that suppresses IKBKE expression is replaced with corresponding deoxyribonucleotides or nucleotide analogues are also included in nucleic acids that suppress IKBKE expression.
  • Nucleotide analogs include, for example, 5-position modified uridine or cytidine, such as 5-(2-amino)propyluridine, 5-bromouridine, etc.; 8-position modified adenosine or guanosine, such as 8-bromoguanosine; deaza nucleotides, Examples include 7-deaza-adenosine and the like; O- or N-alkylated nucleotides such as N6-methyladenosine and the like. There are no particular restrictions on the type or number of modified or substituted bases, as long as they do not lose the ability to suppress the expression of the target molecule.
  • a nucleic acid that suppresses the expression of IKBKE can be artificially synthesized using genetic recombination technology or chemical synthesis technology. Genetic recombination methods, methods for chemically synthesizing nucleic acids, methods for synthesizing unnatural bases, and methods for synthesizing nucleic acids containing these are well known to those skilled in the art.
  • a specific antibody against IKBKE can also be referred to as an antibody that preferentially binds IKBKE over non-target proteins, or an antibody that has a higher binding affinity for IKBKE.
  • a specific antibody to IKBKE binds IKBKE with an affinity that is at least 5 times stronger, preferably at least 10 times stronger, more preferably at least 100 times stronger, most preferably at least 1000 times stronger than binding to a non-target protein. It can be an antibody that A specific antibody against IKBKE may also be an antibody that binds IKBKE with a dissociation constant of 10 -7 M, preferably 10 -8 M, more preferably 10 -9 M.
  • a specific antibody against IKBKE can originate from any species including, for example, mouse, rat, shark, rabbit, pig, hamster, camel, llama, goat or human.
  • the specific antibody can also be of any class (eg IgG, IgE, IgM, IgD or IgA) and subclass of immunoglobulin molecule, but is preferably IgG.
  • the specific antibody against IKBKE may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • a specific antibody can also be a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • a derivative of a specific antibody against IKBKE is an antigen-binding fragment defined as a partial fragment of an antibody derived from a specific antibody against IKBKE and retaining the ability to specifically bind to an antigen, such as Fab (fragment of antigen binding), Fab ', F(ab')2, single chain Fv, disulfide stabilized Fv, peptides containing CDRs, and the like, but are not limited to these.
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab ' fragment of antigen binding
  • F(ab')2 single chain Fv
  • disulfide stabilized Fv peptides containing CDRs, and the like, but are not limited to these.
  • IKBKE is prepared by genetic recombination based on the amino acid sequence of human IKBKE or the base sequence of the DNA encoding it, and by immunizing a suitable animal with this as an antigen, the B cells of the animal are further transformed into myeloma cells. can be produced by fusing with to obtain a hybridoma.
  • a specific antibody against IKBKE or a derivative thereof may be an antibody-drug conjugate further conjugated with another drug.
  • Another example of a substance that inhibits the kinase activity of IKBKE is a compound that inhibits the kinase activity of IKBKE.
  • These compounds need only bind to the protein molecule of IKBKE and inhibit its enzymatic activity, and are not required to control the expression of IKBKE.
  • Such compounds are well known to those skilled in the art and include malachite green oxalate (also called MCCK1), amlexanox, DMXD-011 (under development by Domainex), MPI-0485520 (under development by Myrexis), , SR8185, 200A and 200B (all three of these compounds are Li J. Huang et. al., (2014) Int. J.
  • MPI-0485520 5-[2-[(2-oxo-1,3-dihydroindol-5-yl)amino]pyrimidin-4-yl]-2-pyrrolidin-1-ylbenzonitrile
  • SR8185 N-[3-[[4-[3-Cyano-4-(1-pyrrolidinyl)phenyl]-2-pyrimidinyl]amino]phenyl]-1-pyrrolidinecarboxamide
  • 200A 4-[[4-[3-Cyano-4-(1-pyrrolidinyl)phenyl]-2-pyrimidinyl]amino]-N-(1-methylethyl)benzamide
  • 200B N-[3-[[4-[3-Cyano-4-(1-pyrrolidinyl)phenyl]-2-pyrimidinyl]amino]phenyl]-N,N-dimethylurea
  • Microglia are known to change their morphology and function according to local environmental factors. Unstimulated microglia are normally in a resting state called M0 type (M0 microglia), but upon receiving an external stimulus, they can be polarized into two different phenotypes, broadly classified as M1 type or M2 type. )do.
  • M1 microglia are induced by stimulating microglia with cytokines such as IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, or bacterial-derived components such as LPS.
  • M1 microglia have high antigen-presenting ability and phagocytic ability, and also produce inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6, and effector molecules such as nitric oxide and reactive oxygen species. This allows M1 microglia to exert functions that facilitate the elimination of pathogens and cancer cells, as well as the removal of damaged tissue.
  • M2 microglia are induced by various stimuli such as IL-4, IL-13, TLR agonists, IL-1R, IL-10, TGF- ⁇ and glucocorticoids.
  • M2 microglia promotes tissue repair through the production of anti-inflammatory cytokines such as IL-10 and TGF- ⁇ , and also exerts the function of suppressing immune responses.
  • M1 microglia and M2 microglia can be defined using known molecular markers that characterize each.
  • molecular markers of M1 microglia include cell surface markers such as CD36, CD68, CD80, CD86, cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6, nitric oxide synthase iNOS (inducible nitric oxide synthase).
  • molecular markers of M2 microglia include cell surface markers such as CD206 and CD163, cytokines such as TGF- ⁇ and IL-10, chemokines such as CXCL2, and arginine-degrading enzyme Arginase-1 involved in ornithine production. can be done.
  • Microglial polarization refers to the state in which either the M1 or M2 phenotype becomes dominant in the microglial cell population.
  • the state in which one of the phenotypes is dominant refers to a state in which the number of microglia having one phenotype is greater than the number of microglia having the other phenotype, or Elevated expression of molecular markers indicative of microglia with Polarization may be a state in which one phenotype is dominant over the other phenotype, and does not necessarily involve a decrease in the number of microglial cells of the other phenotype or a decrease in the expression of molecular markers.
  • microglial M1 polarization inhibitor (hereinafter also simply referred to as the M1 polarization inhibitor) in the present invention suppresses the change of the M0 or M2 microglial phenotype to the M1 type, or By changing the microglial phenotype to the M0 or M2 type, it is possible to suppress the polarization of the microglial cell population to the M1 type.
  • In vitro treatment of microglia with an M1 polarization inhibitor can be performed by contacting the microglia with the M1 polarization inhibitor, typically by culturing the microglia in medium containing the M1 polarization inhibitor.
  • the medium to be used is not limited as long as it can culture microglia, and examples thereof include DMEM, MEM, ⁇ -MEM, and RPMI1640. Culture conditions such as culture temperature and culture time may also be those commonly used for microglia culture.
  • the treatment of microglia with an M1 polarization inhibitor in vivo can be performed by administering the M1 polarization inhibitor, preferably in the form of a pharmaceutical composition described below, to a subject for whom inhibition of M1 polarization of microglia is desired. .
  • microglial M1 polarization after treatment can be confirmed by a decrease in the number of M1 microglial cells in the microglial cell population or by a decrease in the expression of M1 microglial molecular markers.
  • a microglial M1 polarization inhibitor containing a substance other than an IKBKE inhibitor can also be called a microglial M1 polarization inhibitory composition.
  • microglial M1 polarization inhibitors described above can be utilized in medicaments for the treatment of diseases or conditions associated with microglial M1 polarization. Accordingly, the present invention further provides a pharmaceutical composition containing the microglial M1 polarization inhibitor described above, which pharmaceutical composition is used for the treatment of diseases or conditions associated with microglial M1 polarization. be able to.
  • microglial M1 polarization Diseases or conditions involving microglial M1 polarization include diseases or conditions caused by microglial M1 polarization, diseases or conditions exacerbated by microglial M1 polarization, and microglial M1 polarization as a result of disease or exacerbation.
  • a disease or condition that causes Examples of diseases or conditions with microglial M1 polarization include neuropsychiatric manifestations associated with SLE (NPSLE); multiple sclerosis, neuromyelitis optica; dementia of the Alzheimer's type, dementia with Lewy bodies, frontotemporal dementia.
  • Parkinson's disease Parkinson's syndrome
  • neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis
  • symptoms such as dementia associated with neurodegenerative diseases
  • epilepsy cerebral infarction
  • Autism spectrum disorders such as depression, bipolar disorder and anxiety disorders
  • schizophrenia schizophrenia
  • the disease or condition associated with microglial M1 polarization is NPSLE.
  • NPSLE is a general term for neuropsychiatric symptoms associated with SLE, and is classified into the following 19 symptoms by the American College of Rheumatology.
  • Microglial M1 polarization inhibitors and pharmaceutical compositions provided by the present invention are effective in treating at least one of the following symptoms of NPSLE.
  • Neurological symptoms/localized symptoms aseptic meningitis, cerebrovascular disorders, demyelinating diseases, headache, movement disorders (chorea), myelopathy, convulsive psychiatric symptoms/diffuse symptoms: acute confusional state (delirium), anxiety Disorders, cognitive disorders, mood disorders, lupus psychosis-peripheral neurological symptoms
  • Treatment of a disease or symptom means all types of medical interventions that are permissible when applying pharmaceuticals for the purpose of treatment, amelioration, amelioration, prevention, etc. of a disease or symptom.
  • Treatment of a disease or condition includes, for example, slowing or arresting progression of the disease or condition, regression or disappearance of lesions, prevention of onset or recurrence, and the like.
  • the pharmaceutical composition contains an effective amount of an IKBKE inhibitor.
  • effective amount means an amount effective for treating diseases or symptoms associated with M1 polarization, and subject age, sex, body weight, specific disease or symptoms, dosage form, administration route and other conditions. etc., can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition contains, in addition to the IKBKE inhibitor, other agents for the treatment of diseases or conditions associated with microglial M1 polarization, or pharmaceutically acceptable additives such as buffers, stabilizers, preservatives. , excipients, and the like.
  • pharmaceutically acceptable additives are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art within the scope of their ordinary ability.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is arbitrary, and examples include oral agents (tablets, capsules, powders, granules, fine granules, pills, suspensions, emulsions, liquids, syrups, etc.), injections, and infusions. It can be an agent or the like.
  • the administration route of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and is appropriately determined according to the dosage form. In the case of parenteral preparations, administration routes include intravascular administration (preferably intravenous administration), subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intracerebroventricular administration, and intrathecal administration.
  • the pharmaceutical composition can be used in combination with other means effective for the treatment of diseases or conditions associated with microglial M1 polarization.
  • the pharmaceutical composition may be used in subjects in need of treatment of a disease or condition associated with microglial M1 polarization, e.g., rodents, including mice, rats, hamsters, guinea pigs, primates, including humans, chimpanzees, rhesus monkeys, pigs, It applies to mammals such as livestock including cattle, goats, horses and sheep, and pets including dogs and cats.
  • a disease or condition associated with microglial M1 polarization e.g., rodents, including mice, rats, hamsters, guinea pigs, primates, including humans, chimpanzees, rhesus monkeys, pigs, It applies to mammals such as livestock including cattle, goats, horses and sheep, and pets including dogs and cats.
  • a preferred subject is a human.
  • the present invention also provides a method for treating a disease or condition associated with microglial M1 polarization, comprising administering an effective amount of an IKBKE inhibitor to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides a method for evaluating microglial M1 polarization inhibitory activity of a test substance, using IKBKE expression inhibition or kinase activity inhibition as an index.
  • microglial M1 polarization inhibitory activity using IKBKE expression inhibition as an index was conducted by comparing IKBKE gene promoter activity, IKBKE gene expression, or IKBKE protein expression in the presence and absence of the test substance to be evaluated. , when the promoter activity, gene expression, or protein expression is reduced in the presence of the test substance, it can be determined that the substance has microglial M1 polarization-suppressing activity.
  • the evaluation method includes the step of incubating a test substance with a cell containing a nucleic acid having a marker gene under the control of a promoter region that controls the expression of the IKBKE gene; The step of measuring the intensity; the step of comparing the measured intensity of the marker gene-derived signal with the intensity of the marker gene-derived signal in the absence of the test substance; A step of determining that the substance has microglial M1 polarization inhibitory activity.
  • the promoter region that controls the expression of the IKBKE gene is preferably a human IKBKE promoter region. al., Oncogene (2013) 32, 151-159, the region shown in supplement Figure S1 (both GRCh38/hg38) and the like can be used.
  • the marker gene is not particularly limited as long as the expression induction of the gene can be detected, for example, a gene encoding a fluorescent protein such as GFP or a chemiluminescent protein such as luciferase, or a drug resistance gene or auxotrophy of cells Genes that confer a phenotypic change on cells, such as genes that can complement , can be used.
  • a cell containing a nucleic acid having a marker gene under the control of the IKBKE promoter region is prepared, for example, by recombining the nucleotide sequence of the genomic region encoding IKBKE in a microglia cultured cell line with the nucleotide sequence encoding the marker gene. be able to. It can also be produced by constructing an expression vector containing a human IKBKE promoter region and a marker gene recombined under its control based on the human genome nucleotide sequence information and introducing the expression vector into cells.
  • Incubation can be performed by coexisting the cells and the test substance in a medium or buffer solution in an appropriate container. Conditions such as incubation temperature and time may be conditions that allow the cell to express the marker gene.
  • the medium or buffer may further contain substances that induce the expression of the IKBKE gene or protein, such as inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6, LPS, and the like.
  • Measurement of marker gene-derived signals can be performed by a method suitable for the marker gene used.
  • the method of evaluation comprises the steps of: incubating a test substance with cells capable of expressing the IKBKE gene or protein; measuring the intensity of the IKBKE gene or protein-derived signal in said cells; comparing the intensity of the IKBKE gene or protein-derived signal with the intensity of the IKBKE gene or protein-derived signal in the absence of the test substance; and a step of determining that the substance has an anti-oxidation activity.
  • Cells capable of expressing the IKBKE gene or protein preferably express the human IKBKE gene or protein.
  • human-derived microglial cultured cell lines and cultured cell lines into which the human IKBKE gene is incorporated can be used. .
  • Incubation can be performed by coexisting the cells and the test substance in a medium or buffer solution in an appropriate container.
  • Conditions such as incubation temperature and time may be conditions that allow the cells to express the IKBKE gene or protein.
  • the medium or buffer may further contain substances that induce the expression of the IKBKE gene or protein, such as inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6, LPS, and the like.
  • IKBKE gene-derived signals can be measured by general methods that can detect and quantify specific gene expression, such as hybridization using base sequence information of the IKBKE gene, quantitative PCR, and RNA-Seq. can.
  • the IKBKE protein-derived signal should be measured by ELISA using a specific antibody against IKBKE, immunological detection methods such as Western blotting, and other general methods that can detect and quantify specific protein expression. can be done.
  • Evaluation of microglia M1 polarization inhibitory activity using IKBKE kinase activity as an index compared the kinase activity of IKBKE in the presence and absence of the test substance to be evaluated. can be determined by determining that the substance has microglial M1 polarization-suppressing activity when the is decreased.
  • the evaluation method includes the steps of: incubating a test substance with IKBKE, a substrate, and ATP; measuring the intensity of a signal that varies with phosphorylation of the substrate; comparing the intensity of the signal that varies with the intensity of the signal that varies with phosphorylation of the substrate in the absence of the test substance; and comparing the two signal intensities to reduce the phosphorylation of the substrate.
  • the substrate may be any peptide that can be phosphorylated by the serine/threonine kinase IKBKE.
  • IKBKE substrates such as I ⁇ B ⁇ , IRF3, and IRF7, and partial peptides thereof can be used.
  • the substrate may be labeled with a labeling substance such as a fluorescent substance or radioactive isotope.
  • Incubation can be carried out by coexisting the test substance with IKBKE, substrate and ATP in a buffer solution in an appropriate container.
  • Conditions such as incubation temperature and time may be conditions that allow IKBKE to exert its kinase activity.
  • signals that fluctuate with substrate phosphorylation include signals derived from phosphorylated substrates and signals derived from ATP that remains unused in the phosphorylation reaction. These signals can be measured by an immunological detection method using an anti-phosphorylated antibody, an ATP detection method using a luminescence method, or other general methods capable of detecting and quantifying kinase activity.
  • the signal to be measured is a signal that increases with phosphorylation of the substrate, such as a signal derived from a phosphorylated substrate, a test substance that reduces the intensity of the signal compared to the control (i.e., in the absence of the test substance) It is a substance that reduces substrate phosphorylation, that is, inhibits the kinase activity of IKBKE, and can be determined to have microglial M1 polarization inhibitory activity.
  • the test substance that increased the signal intensity compared to the control is a substance that reduces substrate phosphorylation, that is, inhibits the kinase activity of IKBKE, and can be determined to have microglial M1 polarization inhibitory activity.
  • Example 1 Suppression of microglial M1 polarization by suppressing the expression or activity of IKBKE MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice exhibiting symptoms of NPSLE such as anxiety and abnormal behavior were used as NPSLE models.
  • MRL/MpJ-Faslpr/J mice exhibiting symptoms of NPSLE such as anxiety and abnormal behavior were used as NPSLE models.
  • MRL/MpJ-Faslpr/J mice exhibiting symptoms of NPSLE such as anxiety and abnormal behavior were used as NPSLE models.
  • MRL/MpJ-Faslpr/J MRL/MpJ-Faslpr/J mice exhibiting symptoms of NPSLE such as anxiety and abnormal behavior were used as NPSLE models.
  • M1 polarization was confirmed as an indicator of increased gene expression levels of inflammatory cytokines (TNF ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ ).
  • microglia culture medium DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 U/mL penicillin and 50 ⁇ g/mL streptomycin.
  • /F12 medium (Gibco), seeded in a 48-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells/well, and cultured for 48 hours.
  • Cytokines mouse IFN ⁇ 25 ng/mL, mouse IFN ⁇ 20 ng/mL mL, mouse TNF ⁇ 10 ng/mL and mouse IL-6 30 ng/mL (both Biolegend)
  • LPS 100 ng/mL was added to the medium, and MCCK1 dissolved in PBS (Sigma, 1 ⁇ M) or PBS or amlexanox (Abcam, 100 ⁇ M) dissolved in DMSO or DMSO was added and incubated for 6 hours.
  • Quantitative PCR of Tnf (Mm00443258m1), Il6 (Mm00446190m1), and Il1b (Mm00434228m1) was performed under the conditions and analyzed by the ⁇ Ct method. Gusb (Mm01197698m1) was used as an internal standard.
  • Microglia prepared in 1-1 were suspended in microglial culture medium, seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells/well, and siRNA solution (18 ⁇ l per well of Opti-MEM (Thermo Fisher) and 0.5 ⁇ l of Opti-MEM (Thermo Fisher) and 0.5 ⁇ L of 5 ⁇ M siRNA solution) and transfection reagent (0.28 ⁇ l per well of Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)) were added to each well and incubated for 48 hours. After serum starvation for 2 hours, 20 ng/mL mouse IFN ⁇ or 10 ng/mL mouse TNF ⁇ was added to the medium as a stimulating factor and incubated for 6 hours. Cells were harvested and quantitative PCR was performed in the same manner as in 1-2.
  • Microglia prepared in 1-1 were suspended in microglial culture medium, seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells/well, and siRNA solution (18 ⁇ l per well of Opti-MEM (Thermo Fisher) and 0.5 ⁇ l of Opti-MEM (Thermo Fisher) and 0.5 ⁇ L of 5 ⁇ M siRNA solution) and transfection reagent (0.28 ⁇ l per well of Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)) were added to each well and incubated for 48 hours.
  • siRNA solution 18 ⁇ l per well of Opti-MEM (Thermo Fisher) and 0.5 ⁇ l of Opti-MEM (Thermo Fisher) and 0.5 ⁇ L of 5 ⁇ M siRNA solution
  • transfection reagent (0.28 ⁇ l per well of Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)
  • mice IFN ⁇ 25 ng/mL mouse IFN ⁇ , 20 ng/mL mouse IFN ⁇ , 10 ng/mL mouse TNF ⁇ , and 30 ng/mL mouse IL-6 as stimulating factors. and incubated for 6 hours. Cells were harvested and quantitative PCR was performed in the same manner as in 1-2.
  • Example 2 Suppression of microglial M1 polarization and improvement of pathology in NPSLE model mice by inhibition of IKBKE activity
  • Six-week-old female MRL/lpr mice were anesthetized by inhalation of isoflurane, the scalp was incised, and the skull was drilled. rice field.
  • a short subcutaneous tunnel was made from the scalp incision to the midscapular region, and a subcutaneous pocket was prepared on the back of the mouse at the midscapular region to house the osmotic pump.
  • the incised skin was sutured.
  • a novel object recognition test was performed on the 12th and 13th days after surgery. Mice were allowed to freely explore the box for 10 min to habituate the mice. Twenty-four hours later, two identical objects (plastic toys; about 2 cm long, 3 cm wide, and 5 cm high) were placed in the box and the mice were allowed to explore freely for 5 minutes. One hour later, one of the objects in the box was changed to a novel object, and the subjects were allowed to explore freely for 5 minutes as the main test. The rate of novel object exploration time (preference index; novel object exploration time / 20 x 100%) was calculated until the total exploration time for two objects reached 20 seconds, and 50% or more was considered good cognitive function. The position of the object was set at exactly the same position during training and in the final test.
  • mice On the 14th day after surgery, the mice were euthanized under anesthesia and perfused with PBS. Brains were harvested after an additional 4% paraformaldehyde perfusion. The brain was fixed with 4% PFA for 24 hours, replaced with 30% sucrose-containing PBS for 48 hours, and then embedded with optimal cutting temperature (OCT) compound. 30 ⁇ m thick sections were prepared with a cryostat (Leica CM 1850) and stained using the free-floating method. The prepared sections were washed with Tween 20-containing PBS (PBS-T), added with 0.3% triton/5% bovine serum albumin (BSA)-containing PBS, and blocked at room temperature for 1 hour.
  • PBS-T Tween 20-containing PBS
  • BSA bovine serum albumin
  • rabbit anti-mouse Iba1 antibody (Wako, 019-19741) and rat anti-mouse CD68 antibody (Bio-rad, MCA1957) diluted with PBS containing 0.3% triton/2% BSA were added and incubated overnight at 4°C. After washing with PBS-T, a secondary antibody diluted with 0.3% triton/2% BSA-containing PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Sections were affixed to glass slides and mounted with Vectashield Mounting Medium containing DAPI (Vector laboratories, H-1200). The hippocampus was observed using a fluorescence microscope (Keyence BZ-710).
  • FJC Fluoro-Jade C
  • Example 3 Decrease in Microglial Phagocytic Ability by Inhibition of IKBKE Activity
  • the established microglial cell line BV2 was suspended in a culture medium (DMEM medium (Gibco) supplemented with 5% fetal bovine serum, 50 U/mL penicillin and 50 ⁇ g/mL streptomycin).
  • the cells were turbid, seeded in a 96-well plate at 2.5 ⁇ 10 5 cells/well, and cultured for 24 hours.
  • As stimulating factors 25 ng/mL mouse IFN ⁇ , 20 ng/mL mouse IFN ⁇ , 10 ng/mL mouse TNF ⁇ , and 30 ng/mL mouse IL-6 were added to the medium and dissolved in PBS.
  • MCCK1 (Sigma, 1.5 ⁇ M) or PBS was added.
  • pHrodo TM Red Zymosan Bioparticles TM Conjugate for Phagocytosis (Invitrogen) was added to 50 ⁇ g/ml, and continuous imaging was performed for 6 hours using a time-lapse module (Keyence BZ-H3KT) of a fluorescence microscope (Keyence BZ-X8000). gone.

Abstract

本発明は、Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon（IKBKE）の発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質を含有するミクログリアのM1極性化を抑制する剤、当該剤を含むミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置のための医薬組成物、及びIKBKEの発現抑制又はキナーゼ活性阻害を指標とした被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を評価する方法を提供する。

Description

ミクログリアＭ１極性化抑制剤及び医薬組成物
　本発明は、Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon（IKBKE）の発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質を含有するミクログリアのM1極性化を抑制する剤、医薬組成物、及びIKBKEの発現抑制又はキナーゼ活性阻害を指標とした被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を評価する方法に関する。
　ミクログリアは、中枢神経系に存在する組織マクロファージであり、中枢神経系における全細胞の10％程度を占めている。ミクログリアは、他のマクロファージと同様、局所の環境シグナルに応答してその形態や機能を大きく変化させることができる可塑性を有する。ミクログリアは大別して、傷害性のM1型と保護性のM2型に分類される。M1型のミクログリア（M1ミクログリア）は高い抗原提示能と貪食能を有しており、炎症性サイトカインを分泌し、バクテリアやウイルス等の病原体や損傷組織の除去に寄与している。M2型のミクログリア（M2ミクログリア）は抗炎症性サイトカインや増殖因子の分泌によって損傷の治癒や免疫寛容といった役割を担っている。
　M1ミクログリアとM2ミクログリアは、互いにバランスを取り合って神経炎症を制御している。これらのミクログリア間のバランスが崩れてM1ミクログリアが過剰に活性化されると、炎症が亢進して神経細胞が傷害され、神経変性疾患を始めとする様々な神経系疾患の発症又は症状の進展につながるものと考えられている。したがって、ミクログリアのM1極性化の制御は、神経系疾患の新たな治療ターゲットとして注目されている。
　全身性エリテマトーデス（Systemic Lupus Erythematosus）は、若年女性に多く発症する、生命予後にもかかわる代表的自己免疫疾患のひとつである。SLEは様々な臓器病変を伴うが、その中でも精神神経ループス（Neuropsychiatric syndrome of SLE、NPSLE）の病態は未だ不明で、明確な治療戦略も確立しておらず、SLEの臓器病変の中でも最も研究が遅れている。
　NPSLEに対しては、免疫抑制療法（ステロイド療法、シクロフォスファミドパルス療法等）、抗血栓療法（低用量アスピリン、ワーファリン等）、対症療法（抗てんかん薬、抗精神病薬、抗不安薬、NSAID／トリプタン製剤等）等による治療が行われているが、治療抵抗性の症例も多い。そのような難治例の場合、時に高次機能障害等の後遺症を来すこともあり、病態の解明と新たな治療が求められている。
　近年、SLE患者において、神経細胞のシナプスが異常に活性化したミクログリアによって貪食されることが明らかにされ、ミクログリアのNPSLE病態への関与が示唆されている（非特許文献１）。しかしながら、ミクログリアをターゲットとしたNPSLE治療薬は未だ報告されていない。
Schwarts N. et. al., Nat. Rev. Rheumatol. (2019) 15(3):137-152.
　本発明者らは、NF-κB経路に関与するキナーゼの一種であるIKBKE（Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon）を阻害することでミクログリアのM1極性化、すなわちミクログリアのフェノタイプがM1型に極性化することを抑制し得ることを見出した。
　本開示は、以下を提供する：
項１　Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon（IKBKE）の発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質を含有する、ミクログリアのM1極性化抑制剤。
項２　前記物質が、IKBKEの発現を抑制する核酸である、項１に記載の剤。
項３　前記物質が、IKBKEに対する特異抗体又はその誘導体である、項１に記載の剤。
項４　前記物質が、マラカイトグリーンシュウ酸塩（MCCK1）、アンレキサノクス、DMXD-011、MPI-0485520、SR8185、200A又は200Bである、項１に記載の剤。
項５　項１～項４のいずれか一項に記載の剤を含有する、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置のための医薬組成物。
項６　精神神経ループス、多発性硬化症、視神経脊髄炎、神経変性疾患及びこれに伴う症状、てんかん、脳梗塞、自閉スペクトラム症、気分障害又は統合失調症の処置のための、項５に記載の医薬組成物。
項７　精神神経ループスの処置のための、項５又は項６に記載の医薬組成物。
項８　IKBKEの発現抑制又はキナーゼ活性阻害を指標とした、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を評価する方法。
項９　被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるIKBKE遺伝子のプロモーター活性、IKBKE遺伝子の発現又はIKBKEタンパク質の発現を比較することで、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を判定することを含む、項８に記載の方法。
項１０　被験物質を、IKBKE遺伝子の発現を制御するプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞と共にインキュベートするステップ；前記細胞におけるマーカー遺伝子由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたマーカー遺伝子由来シグナルの強度を、被験物質非存在下でのマーカー遺伝子由来シグナルの強度と比較するステップ；及びマーカー遺伝子由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む、項８又は項９に記載の方法。
項１１　被験物質を、IKBKE遺伝子又はタンパク質を発現することができる細胞と共にインキュベートするステップ；前記細胞におけるIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を被験物質非存在下でのIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度と比較するステップ；及びIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む、項８又は項９に記載の方法。
項１２　被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるIKBKEのキナーゼ活性を比較することで、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を判定することを含む、項８に記載の方法。
項１３　被験物質をIKBKE、基質及びATPと共にインキュベートするステップ；基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度を測定するステップ；測定された基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度を、被験物質非存在下での基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度と比較するステップ；及び前記両シグナル強度の比較により基質のリン酸化を低減させることが確認できた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む、項１２に記載の方法。
　本発明によると、IKBKEの発現抑制又は活性阻害によってミクログリアのM1極性化を抑制することができ、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置を行うことができる。また、IKBKEの発現を抑制する能力又はIKBKEのキナーゼ活性を阻害する能力を指標とすることで、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を評価することができる。
MCCK1（0.1、0.5又は1 μM）の存在下又は非存在下でLPS又はサイトカイン刺激を加えたNPSLEモデルマウスであるMRL/MpJ-Faslpr/J（MRL/lpr）由来ミクログリアの炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-1β）遺伝子発現量を示すグラフである。 アンレキサノクス（100、300又は600 μM）の存在下又は非存在下でLPS刺激を加えたMRL/lprマウス由来ミクログリアの炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-6、IL-1β）遺伝子発現量を示すグラフである。 IKBKE特異的siRNA（ikbke si1又はikbke si2）又は対照siRNAの存在下でサイトカイン刺激（IFNγ又はTNFα単独）を加えたMRL/lprマウス由来ミクログリアのIKBKE遺伝子発現量及び炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-1β）遺伝子発現量を示すグラフである。 IKBKE特異的siRNA（ikbke si1又はikbke si2）又は対照siRNAの存在下でサイトカイン刺激を加えたMRL/lprマウス由来ミクログリアのIKBKE遺伝子発現量及び炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-1β）遺伝子発現量を示すグラフである。 MCCK1を脳室内投与したMRL/lprマウスの認知機能（新奇物体認識試験におけるPreference index）を示すグラフである。 MCCK1を脳室内投与したMRL/lprマウスの海馬の代表的なIba1及びCD68免疫染色画像（図上段）、及び全Iba1陽性細胞中のIba1陽性CD68陽性細胞の比率を示すグラフ（図下段）である。 MCCK1を脳室内投与したMRL/lprマウスの海馬の代表的なFluoro-Jade C染色画像（図の左側）及びFluoro-Jade C陽性細胞数を示すグラフ（図の右側）である。 MCCK1の存在下又は非存在下でpHrodo標識粒子を貪食させた株化ミクログリア細胞BV2のCalcein AM及びpHrodo染色画像（図の左側）、及び全Calcein AM陽性細胞中のpHrodo標識粒子を含有するCalcein-AM陽性細胞の比率を示すグラフ（図の右側）である。
　以下に示す説明は、代表的な実施形態又は具体例に基づくことがあるが、本発明はそのような実施形態又は具体例に限定されるものではない。また、タンパク質及び遺伝子に関する説明は、特に断らない限り、ヒト由来のタンパク質及び遺伝子を例として行うが、本発明において利用されるタンパク質及び遺伝子はヒト由来のものに限定されず、また本発明の適用対象はヒトに限定されない。
　本発明は、IKBKEの発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質を含有する、ミクログリアのM1極性化抑制剤を提供する。
IKBKEの発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質
　IKBKE（Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon; IKK-I, IKK-εとも略される）は、NF-κB阻害タンパク質IκBαをリン酸化するIκBキナーゼの一種であり、NF-κBの活性化への関与が知られている。IKBKEはまた、IRF3及びIRF7のリン酸化にも関与しており、I型インターフェロンの活性化にも寄与することが示されている。ヒトのIKBKE遺伝子の塩基配列はNCBI Reference Sequence: NC_000001.11として、IKBKE mRNAの塩基配列はNM_014002.4、NM_001193321.2及びNM_001193322.2として、前記mRNAに対応するIKBKEタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれNP_054721.1、NP_001180250.1及びNP_001180251.1として登録されている。
　IKBKEの発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質は、本明細書中でIKBKE阻害物質とも呼ばれ、IKBKEの発現を抑制する物質及びIKBKEのキナーゼ活性を阻害する物質の両方を包含する。IKBKEの発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質は、IKBKEの発現を抑制する能力又はキナーゼ活性を阻害する能力を有する物質を意味する。
　IKBKEの発現を抑制する物質の１つの例は、IKBKEの発現を抑制する核酸である。IKBKEの発現を抑制する核酸は、IKBKE遺伝子からのmRNA（IKBKE mRNA）の転写を抑制することができる核酸、IKBKE mRNAを分解することができる核酸、及びIKBKE mRNAからのタンパク質翻訳を抑制することができる核酸を包含し、これらの例としては、IKBKE遺伝子の塩基配列又はIKBKE mRNAの塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンス核酸、又はRNA干渉を引き起こす核酸、例えばsiRNA、shRNA若しくはmiRNAを挙げることができる。siRNAの例としては、マウスに対してはApplied Biosystems, Silencer Select Pre-designed siRNA s80670及びs80671を、ヒトに対してはApplied Biosystems, Silencer Select Pre-designed siRNA, s18536、s18537及びs18538（いずれもThermo Fisher）を挙げることができる。また、miRNAの例としては、マウスに対してはmmu-miR-155-5p（miRBaseアクセッション番号MIRT002347）を、ヒトに対してはhsa-miR-155-5p（miRBaseアクセッション番号MIRT003484）、hsa-miR-296-5p（miRBaseアクセッション番号MIRT006572）及びhsa-miR-124-3p（miRBaseアクセッション番号MIRT022344）を挙げることができる。
　また、適当な発現プロモーターの制御下に置かれることでアンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸を転写誘導することのできるDNA、及びアンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸も、アンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸と機能的に等価な核酸として、本発明にいうIKBKEの発現を抑制する核酸に包含される。ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、2'O-メチル化、2'-F化、4'-チオ化等を挙げることができる。
　さらに、IKBKEの発現を抑制するRNAのリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラRNAもまた、IKBKEの発現を抑制する核酸に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジン又はシチジン、例えば5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等；8位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン等；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ-アデノシン等；O-又はN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン等を挙げることができる。修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、ターゲット分子の発現を抑制する能力を失わない限り、特に制限はない。
　IKBKEの発現を抑制する核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法は、当業者に周知である。
　IKBKEのキナーゼ活性を阻害する物質の１つの例は、IKBKEに対する特異抗体又はその誘導体である。IKBKEに対する特異抗体は、非標的タンパク質よりもIKBKEに優先的に結合する抗体、又はIKBKEに高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。IKBKEに対する特異抗体は、非標的タンパク質との結合よりも少なくとも5倍強い、好ましくは少なくとも10倍強い、より好ましくは少なくとも100倍強い、最も好ましくは少なくとも1000倍強い親和性を有してIKBKEに結合する抗体であり得る。IKBKEに対する特異抗体はまた、10-7M、好ましくは10-8M、より好ましくは10-9Mの解離定数を有してIKBKEに結合する抗体であってもよい。
　IKBKEに対する特異抗体は、例えばマウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを包含する任意の種を起源とすることができる。また特異抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例としてIgG、IgE、IgM、IgD又はIgA）及びサブクラスのものであることができるが、IgGであることが好ましい。
　本発明において、IKBKEに対する特異抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また特異抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。
　IKBKEに対する特異抗体の誘導体は、IKBKEに対する特異抗体に由来する、抗原と特異的に結合する能力を保持した抗体の部分断片として定義される抗原結合性断片、例えばFab（fragment of antigen binding）、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（single chain Fv)、ジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv）及びCDRを含むペプチド等であり得るが、これらには限定されない。
　IKBKEに対する特異抗体及びその誘導体は、当業者に公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ヒトIKBKEのアミノ酸配列又はこれをコードするDNAの塩基配列に基づいて遺伝子組み換え手法によりIKBKEを作製し、これを抗原として適当な動物に免疫することで、さらに当該動物のB細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得ることで作製することができる。ハイブリドーマ法については、例えばMeyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Kaithamana et al. (1999) J.Immunol. 163:5157-5164等を参照されたい。IKBKEに対する特異抗体又はその誘導体は、さらに他の薬物と結合した抗体薬物複合体であってもよい。
　IKBKEのキナーゼ活性を阻害する物質の別の例は、IKBKEのキナーゼ活性を阻害する化合物である。これらの化合物は、IKBKEのタンパク質分子に結合してその酵素活性を阻害する能力を有するものであればよく、IKBKEの発現制御を伴うことは必要とされない。このような化合物は当業者に周知であり、その例としては、マラカイトグリーンシュウ酸塩（MCCK1とも呼ばれる）、アンレキサノクス、DMXD-011（Domainexにより開発中）、MPI-0485520（Myrexisにより開発中）や、SR8185、200A及び200B（これら３つの化合物はいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLi J. Huang et. al., (2014) Int. J. Cancer, 134 (8): 1972-80に開示されている）等を挙げることができる。また、米国特許出願公開US2013/0267491及び対応する米国特許US 8,962,609（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるIKKε及び／又はTBK-1阻害活性を示すピリミジン化合物も例として挙げることができる。
MPI-0485520:
5-[2-[(2-oxo-1,3-dihydroindol-5-yl)amino]pyrimidin-4-yl]-2-pyrrolidin-1-ylbenzonitrile
SR8185:
N-[3-[[4-[3-Cyano-4-(1-pyrrolidinyl)phenyl]-2-pyrimidinyl]amino]phenyl]-1-pyrrolidinecarboxamide
200A:
4-[[4-[3-Cyano-4-(1-pyrrolidinyl)phenyl]-2-pyrimidinyl]amino]-N-(1-methylethyl)benzamide
200B:
N-[3-[[4-[3-Cyano-4-(1-pyrrolidinyl)phenyl]-2-pyrimidinyl]amino]phenyl]-N,N-dimethylurea
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
ミクログリアのM1極性化抑制
　ミクログリアは、局所的な環境要因に応じてその形態や機能を大きく変化させることが知られている。刺激を受けていないミクログリアは、通常、M0型と呼ばれる休止状態にあるが（M0ミクログリア）、外部刺激を受けることで、大別してM1型又はM2型の２つの異なるフェノタイプへと極性化（polarize）する。
　M1ミクログリアは、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-6等のサイトカイン又はLPS等の細菌由来成分でミクログリアを刺激することによって誘導される。M1ミクログリアは高い抗原提示能と貪食能を有し、加えてTNF-α、IL-1β、IL-6等の炎症性サイトカイン、一酸化窒素や活性酸素種等のエフェクター分子を産生する。これにより、M1ミクログリアは病原体やがん細胞の排除を促進し、また損傷組織の除去を促進する機能を発揮する。
　対照的に、M2ミクログリアは、IL-4、IL-13、TLRアゴニスト、IL-1R、IL-10、TGF-β、グルココルチコイドといった種々の刺激によって誘導される。M2ミクログリアは、IL-10等の抗炎症性サイトカインやTGF-βの産生を通じて組織修復を促進し、また免疫応答を抑制する機能を発揮する。
　M1ミクログリア及びM2ミクログリアは、それぞれを特徴づける公知の分子マーカーを指標として定義することができる。M1ミクログリアの分子マーカーの例としては、CD36、CD68、CD80、CD86等の細胞表面マーカー、TNF-α、IL-1β及びIL-6等のサイトカイン、一酸化窒素合成酵素iNOS（inducible nitric oxide synthase）を挙げることができる。またM2ミクログリアの分子マーカーの例としては、CD206、CD163等の細胞表面マーカー、TGF-β、IL-10等のサイトカイン、CXCL2等のケモカイン、オルニチン産生に関与するアルギニン分解酵素Arginase-1を挙げることができる。
　ミクログリアの極性化とは、ミクログリアの細胞集団においてM1型又はM2型のいずれかのフェノタイプが優勢な状態になることをいう。ここで、いずれかのフェノタイプが優勢な状態とは、いずれか一方のフェノタイプを有するミクログリアの細胞数が他方のフェノタイプを有するミクログリアの細胞数よりも多い状態や、いずれか一方のフェノタイプを有するミクログリアの指標となる分子マーカーの発現が上昇している状態を包含する。なお、極性化は、一方のフェノタイプが他方のフェノタイプに対して優勢な状態であればよく、他方のフェノタイプのミクログリアの細胞数減少や分子マーカー発現低下を必ずしも伴うものではない。
　本発明におけるミクログリアのM1極性化抑制剤（以下、単にM1極性化抑制剤ともいう）は、M0型若しくはM2型のミクログリアのフェノタイプがM1型に変化することを抑制することによって、又はM1型ミクログリアのフェノタイプをM0型若しくはM2型に変化させることによって、ミクログリアの細胞集団がM1型に極性化されることを抑制することができる。
　インビトロでのM1極性化抑制剤によるミクログリアの処理は、M1極性化抑制剤をミクログリアと接触させることによって、典型的にはM1極性化抑制剤を含む培地中でミクログリアを培養することによって行うことができる。使用する培地は、ミクログリアを培養することができるかぎり制限はなく、例えばDMEM、MEM、α-MEM、RPMI1640を挙げることができる。培養温度、培養時間等の培養条件もまた、ミクログリアの培養に通常用いられるものであればよい。
　インビボでのM1極性化抑制剤によるミクログリアの処理は、好ましくは後述の医薬組成物の形態のM1極性化抑制剤を、ミクログリアのM1極性化抑制が望まれる対象に投与することで行うことができる。
　処理後のミクログリアのM1極性化抑制は、ミクログリア細胞集団におけるM1ミクログリア細胞数の減少によって、又はM1ミクログリア分子マーカーの発現低下によって確認することができる。
　IKBKE阻害物質以外の物質を含有するミクログリアM1極性化抑制剤は、ミクログリアのM1極性化抑制用組成物と呼ぶこともできる。
医薬組成物
　上述のミクログリアM1極性化抑制剤は、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置のための医薬において利用することができる。したがって、本発明はさらに、上述のミクログリアM1極性化抑制剤を含有する医薬組成物を提供するものであり、当該医薬組成物は、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置のために用いることができる。
　ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状とは、ミクログリアのM1極性化に起因する疾患又は症状、ミクログリアのM1極性化により増悪される疾患又は症状、及び罹患又は増悪の結果としてミクログリアのM1極性化を生じる疾患又は症状をいう。ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の例としては、SLEに伴う精神神経症状（NPSLE）；多発性硬化症、視神経脊髄炎；アルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、パーキンソン症候群、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患；神経変性疾患に伴う認知症等の症状；てんかん；脳梗塞；自閉症、広汎性発達障害、アスペルガー症候群等の自閉スペクトラム症；うつ病、双極性障害、不安障害等の気分障害；統合失調症を挙げることができる。
　好ましい実施形態において、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状はNPSLEである。NPSLEはSLEに伴う精神神経症状の総称であり、アメリカリウマチ学会により以下の19の症状への分類がなされている。本発明により提供されるミクログリアM1極性化抑制剤及び医薬組成物は、NPSLEの下記症状のうちの少なくとも１つの症状の処置に有効である。
－中枢神経症状（7種の神経症状／局在性症状（focal NPSLE）、5種の精神症状／びまん性症状（diffuse NPSLE））
神経症状/局在性症状：無菌性髄膜炎、脳血管障害、脱髄疾患、頭痛、運動障害（舞踏病）、脊髄症、痙攣
精神症状／びまん性症状：急性錯乱状態（せん妄）、不安障害、認知障害、気分障害、ループス精神病
－末梢神経症状
急性炎症性脱髄性多発神経炎、自律神経障害、（多発性）単神経炎、重症筋無力症、脳神経障害、神経叢炎、多発神経炎
　本明細書において用いられる疾患又は症状の処置とは、疾患又は症状の治療、寛解、改善、予防等を目的とする医薬の適用の際に許容される全てのタイプの医学的介入を意味する。疾患又は症状の処置は、例えば、疾患又は症状の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を包含する。
　本発明において、医薬組成物は、有効量のIKBKE阻害物質を含有する。ここで「有効量」とは、M1極性化を伴う疾患又は症状の処置に有効な量を意味し、対象の年齢、性別、体重、具体的な疾患又は症状、剤形、投与経路その他の条件等に応じて当業者により適宜決定される。
　医薬組成物は、IKBKE阻害物質に加えて、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患若しくは症状の処置のための他の薬剤、又は薬学的に許容される添加剤、例えば緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤等を含むことができる。薬学的に許容される添加剤は当業者に周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で適宜選択して使用することができる。
　医薬組成物の剤形は任意であり、例えば、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤等）、注射剤、輸液剤等であることができる。また医薬組成物の投与経路は特に限定されず、剤形に応じて適宜決定される。非経口製剤である場合、投与経路としては、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、脳室内投与、髄腔内投与等を挙げることができる。
　医薬組成物は、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置のために有効な他の手段と組み合わせて用いることができる。
　医薬組成物は、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置が必要とされる対象、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物に適用される。好ましい対象は、ヒトである。
　本発明はまた、その必要がある対象に有効量のIKBKE阻害物質を投与することを含む、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状を処置するための方法を提供する。ここで用いられる用語の定義や説明は、上で述べたとおりである。
評価方法
　本発明はまた、IKBKEの発現抑制又はキナーゼ活性阻害を指標とした、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を評価する方法を提供する。
　IKBKEの発現抑制を指標としたミクログリアM1極性化抑制活性の評価は、評価対象である被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるIKBKE遺伝子のプロモーター活性、IKBKE遺伝子発現又はIKBKEタンパク質発現を比較し、被験物質の存在下で前記プロモーター活性、遺伝子発現又はタンパク質発現が低下した場合に当該物質はミクログリアM1極性化抑制活性を有すると判定することによって行うことができる。
　一つの例示的実施形態において、評価方法は、被験物質を、IKBKE遺伝子の発現を制御するプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞と共にインキュベートするステップ；前記細胞におけるマーカー遺伝子由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたマーカー遺伝子由来シグナルの強度を、被験物質非存在下でのマーカー遺伝子由来シグナルの強度と比較するステップ；及びマーカー遺伝子由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む。
　IKBKE遺伝子の発現を制御するプロモーター領域（IKBKEプロモーター領域）は、ヒトのIKBKEプロモーター領域であることが好ましく、例えば、ヒトゲノム領域chr 1:206,469,380-206,473,337、又はchr 1:206,469,044-206,471,154（J. Guo et al., Oncogene (2013) 32, 151-159のsupplement Figure S1に示される領域）（いずれもGRCh38 / hg38）の塩基配列等を使用することができる。
　マーカー遺伝子は、当該遺伝子の発現誘導を検出し得るものであれば特に制限はなく、例えばGFP等の蛍光タンパク質やルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質をコードする遺伝子、又は薬剤耐性遺伝子や細胞の栄養要求性を補完することができる遺伝子等の細胞にフェノタイプ変化を与える遺伝子等を利用することができる。
　IKBKEプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞は、例えば、ミクログリア培養細胞株中のIKBKEをコードするゲノム領域の塩基配列を、マーカー遺伝子をコードする塩基配列に組み換えることで作製することができる。また、ヒトゲノム塩基配列情報を元にして、ヒトIKBKEプロモーター領域とその制御下に組み換えたマーカー遺伝子とを含む発現ベクターを構築し、細胞に当該発現ベクターを導入することで作製することもできる。
　インキュベーションは、適当な容器内の培地又は緩衝液中で、前記細胞と被験物質とを共存させることにより行うことができる。インキュベーションの温度、時間等の条件は、細胞がマーカー遺伝子を発現することができる条件であればよい。培地又は緩衝液は、IKBKE遺伝子又はタンパク質の発現を誘導する物質、例えばTNF-α、IL-1β、IL-6等の炎症性サイトカインやLPS等をさらに含んでもよい。
　マーカー遺伝子由来シグナルの測定は、用いられるマーカー遺伝子に適した方法によって行うことができる。
　別の例示的実施形態において、評価方法は、被験物質を、IKBKE遺伝子又はタンパク質を発現することができる細胞と共にインキュベートするステップ；前記細胞におけるIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を被験物質非存在下でのIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度と比較するステップ；及びIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む。
　IKBKE遺伝子又はタンパク質を発現することができる細胞は、ヒトのIKBKE遺伝子又はタンパク質を発現することが好ましく、例えばヒト由来のミクログリア培養細胞株や、ヒトIKBKE遺伝子を組み込んだ培養細胞株を用いることができる。
　インキュベーションは、適当な容器内の培地又は緩衝液中で、前記細胞と被験物質とを共存させることにより行うことができる。インキュベーションの温度、時間等の条件は、細胞がIKBKE遺伝子又はタンパク質を発現することができる条件であればよい。培地又は緩衝液は、IKBKE遺伝子又はタンパク質の発現を誘導する物質、例えばTNF-α、IL-1β、IL-6等の炎症性サイトカインやLPS等をさらに含んでもよい。
　IKBKE遺伝子由来シグナルの測定は、IKBKE遺伝子の塩基配列情報を利用したハイブリダイゼーション、定量的PCR、RNA-Seqその他の、特定の遺伝子発現を検出し定量することのできる一般的な方法によって行うことができる。また、IKBKEタンパク質由来シグナルの測定は、IKBKEに対する特異抗体を用いたELISA、ウェスタンブロッティング等の免疫学的検出法その他の、特定のタンパク質発現を検出し定量することができる一般的な方法によって行うことができる。
　IKBKEのキナーゼ活性を指標としたミクログリアM1極性化抑制活性の評価は、評価対象である被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるIKBKEのキナーゼ活性を比較し、被験物質の存在下でキナーゼ活性が低下した場合に当該物質はミクログリアM1極性化抑制活性を有すると判定することによって行うことができる。
　一つの例示的実施形態において、評価方法は、被験物質をIKBKE、基質及びATPと共にインキュベートするステップ；基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度を測定するステップ；測定された基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度を、被験物質非存在下での基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度と比較するステップ；及び前記両シグナル強度の比較により基質のリン酸化を低減させることが確認できた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む。
　基質は、セリン／スレオニンキナーゼであるIKBKEによってリン酸化され得るペプチドであればよく、例えばIκBα、IRF3、IRF7等のIKBKEの公知の基質やその部分ペプチドを用いることができる。基質は、蛍光物質や放射性同位体等の標識物質で標識されていてもよい。
　インキュベーションは、適当な容器内の緩衝液中で、被験物質とIKBKE、基質及びATPとを共存させることにより行うことができる。インキュベーションの温度、時間等の条件は、IKBKEがキナーゼ活性を発揮できる条件であればよい。
　基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの例は、リン酸化された基質に由来するシグナルや、リン酸化反応に用いられずに残存したATPに由来するシグナルである。これらのシグナルの測定は、抗リン酸化抗体を用いた免疫学的検出法、発光法によるATP検出法その他、キナーゼ活性を検出し定量することができる一般的な方法によって行うことができる。
　測定されるシグナルがリン酸化基質由来シグナルのように基質のリン酸化に伴って増加するシグナルである場合、コントロール（すなわち被験物質非存在下）に比べてシグナルの強度を低減させた被験物質は、基質のリン酸化を低減させる、すなわちIKBKEのキナーゼ活性を阻害する物質であり、ミクログリアM1極性化抑制活性を有するものと判定することができる。また、測定されるシグナルが残存ATP由来シグナルのように基質のリン酸化に伴って減少するシグナルである場合、コントロール（すなわち被験物質非存在下）に比べてシグナルの強度を増加させた被験物質は、基質のリン酸化を低減させる、すなわちIKBKEのキナーゼ活性を阻害する物質であり、ミクログリアM1極性化抑制活性を有するものと判定することができる。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１　IKBKEの発現抑制又は活性阻害によるミクログリアM1極性化の抑制
　不安や異常行動といったNPSLEの症状を呈するMRL/MpJ-Faslpr/J（MRL/lpr）マウスをNPSLEモデルとして使用して、IKBKEの発現抑制又は活性阻害がNPSLEマウス由来ミクログリアのM1極性化に及ぼす影響を評価した。ミクログリアのM1極性化は、炎症性サイトカイン（TNFα、IL-6、IL-1β）の遺伝子発現量の増加を指標として確認した。
1-1. ミクログリアの調製
　生後1～3日のMRL/lprマウス（The Jackson laboratory）から採取した脳を細断し、Neural Tissue Dissociation Kit (P)(Miltenyi Biotec)を用いて酵素消化した。消化後の脳組織をMACS bufferで懸濁し、CD11b microbeads(Miltenyi Biotec)を用いて磁気細胞分離でミクログリアを抽出した。
1-2. IKBKEのキナーゼ活性阻害剤がミクログリアのM1極性化に及ぼす影響の評価
　選別後のミクログリアをミクログリア培養培地（10％ウシ胎児血清、50 U/mLペニシリン及び50μg/mL ストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地（Gibco）に懸濁し、48 wellプレートに1×105 cells/wellとなるように播種して48時間培養した。刺激因子としてサイトカイン（マウスIFNα 25 ng/mL、マウスIFNγ 20 ng/mL、マウスTNFα 10 ng/mL及びマウスIL-6 30 ng/mL（いずれもBiolegend））又はLPS 100 ng/mL（Sigma）を培地に添加し、さらにPBSに溶解したMCCK1（Sigma、1μM）又はPBS、もしくはDMSOに溶解したアンレキサノクス（Abcam、100μM）又はDMSOを添加して、6時間インキュベートした。
　細胞を回収してRNeasy plus mini kit（Qiagen）を用いてTotal RNAを調製し、super script VILO（Invitrogen）を用いた逆転写反応によってTotal RNAからcDNAを調製した。Taq-Man Gene Expression Assay（Applied Biosystems）によるReal-time-PCR法で、95℃10秒間の初期変性、95℃5秒間の変性、60℃30秒間のアニーリング及び伸長反応の2ステップを40サイクル行う条件で、Tnf (Mm00443258m1)、Il6 (Mm00446190m1)、Il1b(Mm00434228m1)の定量的PCRを行い、ΔΔCt法にて解析した。内部標準としてはGusb (Mm01197698m1)を使用した。
　データはn=6で取得し、平均値±標準偏差で示した。統計ソフトGraphPad Prismを用いて、Dunnett検定によって群間の有意差を検証し、p値0.05未満を群間の有意差（*P <0.05、** P<0.01、*** P<0.001、**** P<0.0001）とした。
　結果を図１及び図２に示す。LPS刺激により上昇したTNFα及びIL-1βの遺伝子発現量は、MCCK1の添加濃度に依存して減少した（図１下段）。サイトカイン刺激時においても、LPS刺激時よりは弱いものの同様の傾向が観察された（図１上段）。アンレキサノクスを用いた場合も、MCCK1と同様に、TNFα、IL-6及びIL-1β遺伝子発現量はアンレキサノクス濃度依存的な減少を示した（図２）。
1-3. IKBKEに対するsiRNAがミクログリアのM1極性化に及ぼす影響の評価
　IKBKEの発現をノックダウンするsiRNAとしてmouse si-IKBKE（ikbke si1: s80670、ikbke si2: s80671、いずれもThermo Fisher）を、ネガティブコントロールとしてmouse si-nontarget（Ambion Silencer select 4390843）を用いて以下の実験を行った。
　1-1で調製したミクログリアをミクログリア培養培地に懸濁し、96 wellプレートに1×105 cells/wellとなるように播種し、siRNA溶液（1ウェルあたり18μlのOpti-MEM（Thermo Fisher）及び0.5 μLの5 μM siRNA溶液）及びトランスフェクション試薬（1ウェルあたり0.28μlのLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific））を各ウェルに添加して48時間培養した。2時間の血清飢餓処理の後、刺激因子としてマウスIFNγを 20 ng/mL又はマウスTNFαを10 ng/mLになるように培地に添加し、6時間インキュベートした。細胞を回収し、1-2と同様の手法で定量的PCRを行った。
　結果を図３に示す。サイトカイン刺激により上昇したTNFα及びIL-1βの遺伝子発現量は、IKBKEに対するsiRNAの添加により減少した。
　また、4種類のサイトカインを含有するサイトカインカクテルを刺激因子として用いて、同様の試験を行った。1-1で調製したミクログリアをミクログリア培養培地に懸濁し、96 wellプレートに1×105 cells/wellとなるように播種し、siRNA溶液（1ウェルあたり18μlのOpti-MEM（Thermo Fisher）及び0.5μLの5μM siRNA溶液）及びトランスフェクション試薬（1ウェルあたり0.28μlのLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific））を各ウェルに添加して48時間培養した。2時間の血清飢餓処理の後、刺激因子としてマウスIFNαを25 ng/mL、マウスIFNγを20 ng/mL、マウスTNFαを10 ng/mL及びマウスIL-6を30 ng/mLとなるように培地に添加し、6時間インキュベートした。細胞を回収し、1-2と同様の手法で定量的PCRを行った。
　結果を図４に示す。IFNγ又はTNFα単独で刺激した上記試験と同様、4種類のサイトカインによる刺激で上昇したTNFα及びIL-1βの遺伝子発現量も、IKBKEに対するsiRNAの添加により減少した。
　以上の結果から、IKBKEの発現抑制又は活性阻害は、NPSLEマウス由来ミクログリアのM1極性化を抑制することが示された。
実施例２　IKBKEの活性阻害によるNPSLEモデルマウスにおけるミクログリアM1極性化抑制及び病態改善
　6週齢の雌性MRL/lprマウスをイソフルランの吸入によって麻酔した後、頭皮を切開し、頭蓋骨にドリルで穴をあけた。予めMCCK1（300 ng/ml、PBS溶液）又はPBSを充填したアルゼット浸透圧ポンプ（型番2002、流量 0.5 ml/hr）に取り付けられたL字型カニューレを、マウス側脳室（bregma、anteroposterior：-0.5 mm、mediolateral：+1.1 mm、dorsoventral：-2.5 mm）に脳定位固定装置（ナリシゲ）を用いて挿入し、歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。頭皮切開から肩甲骨中央部まで短い皮下トンネルを作成し、マウス背部の肩甲骨中央部に皮下ポケットを準備して、浸透圧ポンプを収容した。切開した皮膚を縫合した。
　術後12日目及び13日目に新奇物体認識試験を行った。ボックス内をマウスに10分間自由に探索させマウスを訓化した。24時間後にボックスに全く同一の物体（プラスチック玩具；縦2 cm、横3 cm、高さ5 cm程度）を2つ入れ、マウスに5分間自由に探索させた。1時間後にボックス内の物体のうち1つを新奇物体に変更し、本試験として5分間自由に探索させた。2つの物体の総探索時間が20秒に達するまでの、新奇物体探索時間の割合（Preference index；新奇物体探索時間／20×100％）を求め、50％以上を認知機能良好とした。物体の位置は訓化時、本試験共に全く同じ位置に設置した。
　データはn=11で取得し、平均値±標準偏差で示した。統計ソフトGraphPad Prismを用いて、Studentのt検定によって群間の有意差を検証し、p値0.05未満を群間の有意差とした。
　結果を図５に示す。MCCK1を脳室内投与したマウスは、対照の溶媒投与マウスよりも高いPreference indexを示した。この結果から、IKBKEの活性阻害はNPSLEモデルマウスの認知機能を改善することが示された。
　術後14日目に麻酔下でマウスを安楽死処理し、PBS灌流を行った。さらに4%パラホルムアルデヒド灌流を行った後、脳を採取した。脳は4%PFAで24時間固定し、30%スクロース含有PBSで48時間置換した後にoptimal cutting temperature（OCT）コンパウンドで包埋した。クライオスタット（Leica CM 1850）で30μm厚の切片を作成し、フリーフローティング法を用いて染色を行った。作成した切片をTween 20含有PBS（PBS-T）で洗浄し、0.3% triton・5%ウシ血清アルブミン（BSA）含有PBSを添加し、室温で1時間ブロッキングした。次に0.3% triton・2%BSA含有PBSで希釈したウサギ抗マウスIba1抗体（Wako, 019-19741）、ラット抗マウスCD68抗体（Bio-rad, MCA1957）を添加、4℃で一晩インキュベートした。次にPBS-Tで洗浄し、0.3% triton・2%BSA含有PBSで希釈した二次抗体を添加、2時間室温で放置した。切片をスライドガラスに張り付け、DAPI含有Vectashield Mounting Medium（Vector laboratories, H-1200）でマウントした。蛍光顕微鏡（Keyence BZ-710）を用いて海馬を観察した。
　結果を図６に示す。MCCK1を脳室内投与したマウスでは、溶媒を投与したマウスと比較して、海馬の全ミクログリア（Iba1陽性細胞）に対するM1ミクログリア（Iba1陽性かつCD68陽性の細胞）の比率が減少することが確認され、IKBKEの活性阻害によってミクログリアのM1極性化が抑制されることが示された。
　また、クライオスタット（Leica CM 1850）を用いて、採取した脳の10μm厚切片を作成し、FJC 157 ready-to-dilute staining kit（TR-100-FJ, Biosensis）の製品プロトコールに従って、変性ニューロンに特異的に結合する蛍光色素であるFluoro-Jade C（FJC）での染色を以下の操作によって行った。作成した切片をスライドガラスに貼り付け、水酸化ナトリウムと80％エタノール（1：9）で2分間水和した。蒸留水で洗浄後、過マンガン酸カリウム溶液で5分間incubateした。蒸留水で洗浄後、FJC溶液で10分間incubateした。洗浄後、DPX mountant （Sigma Aldrich）でマウントし、蛍光顕微鏡（Keyence BZ-710）を用いて海馬を観察した。データはn=4で取得し、平均値±標準偏差で示した。統計ソフトGraphPad Prismを用いて、Studentのt検定によって群間の有意差を検証し、p値0.05未満を群間の有意差とした。
　結果を図７に示す。MCCK1を脳室内投与したマウスでは、溶媒を投与したマウスと比較して、海馬の変性ニューロン数が減少することが確認され、IKBKEの活性阻害によってニューロン変性が抑制されることが示された。
実施例３　IKBKEの活性阻害によるミクログリアの貪食能の低下
　株化ミクログリア細胞BV2を培養培地（5％ウシ胎児血清、50 U/mLペニシリン及び50μg/mL ストレプトマイシンを添加したDMEM培地（Gibco））に懸濁し、96 wellプレートに2.5×105 cells/wellとなるように播種して24時間培養した。刺激因子として、マウスIFNαを25 ng/mL、マウスIFNγを20 ng/mL、マウスTNFαを10 ng/mL及びマウスIL-6を30 ng/mLとなるように培地に添加し、さらにPBSに溶解したMCCK1（Sigma、1.5μM）又はPBSを添加した。同時に、pHrodoTM Red Zymosan BioparticlesTM Conjugate for Phagocytosis（invitrogen）を50μg/mlになるように添加し、蛍光顕微鏡（Keyence BZ-X8000）のタイムラプスモジュール（Keyence BZ-H3KT）を用いて6時間連続撮像を行った。撮像完了後、Calcein AMを6.25μg/mlになるように添加し、15分incubateして生細胞染色を行った。Calcein AMとpHrodoの画像を撮像し、生細胞中の貪食細胞の比率を算出し、貪食能の評価を行った。データはn=4で取得し、平均値±標準偏差で示した。統計ソフトGraphPad Prismを用いて、Dunnett検定によって群間の有意差を検証し、p値0.05未満を群間の有意差とした。
　結果を図８に示す。サイトカイン刺激によって増加したpHrodo標識粒子を含有する生細胞（Calcein AM陽性細胞）の比率は、MCCK1の共存下では減少することが確認され、IKBKEの活性阻害によってミクログリアの貪食能が低下することが示された。

 

Claims (13)

  1. 　Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Epsilon（IKBKE）の発現を抑制する又はキナーゼ活性を阻害する物質を含有する、ミクログリアのM1極性化抑制剤。
  2. 　前記物質が、IKBKEの発現を抑制する核酸である、請求項１に記載の剤。
  3. 　前記物質が、IKBKEに対する特異抗体又はその誘導体である、請求項１に記載の剤。
  4. 　前記物質が、マラカイトグリーンシュウ酸塩（MCCK1）、アンレキサノクス、DMXD-011、MPI-0485520、SR8185、200A又は200Bである、請求項１に記載の剤。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の剤を含有する、ミクログリアのM1極性化を伴う疾患又は症状の処置のための医薬組成物。
  6. 　精神神経ループス、多発性硬化症、視神経脊髄炎、神経変性疾患及びこれに伴う症状、てんかん、脳梗塞、自閉スペクトラム症、気分障害又は統合失調症の処置のための、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　精神神経ループスの処置のための、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
  8. 　IKBKEの発現抑制又はキナーゼ活性阻害を指標とした、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を評価する方法。
  9. 　被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるIKBKE遺伝子のプロモーター活性、IKBKE遺伝子の発現又はIKBKEタンパク質の発現を比較することで、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を判定することを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　被験物質を、IKBKE遺伝子の発現を制御するプロモーター領域の制御下にマーカー遺伝子を有する核酸を含む細胞と共にインキュベートするステップ；前記細胞におけるマーカー遺伝子由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたマーカー遺伝子由来シグナルの強度を、被験物質非存在下でのマーカー遺伝子由来シグナルの強度と比較するステップ；及びマーカー遺伝子由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　被験物質を、IKBKE遺伝子又はタンパク質を発現することができる細胞と共にインキュベートするステップ；前記細胞におけるIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を測定するステップ；測定されたIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を被験物質非存在下でのIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度と比較するステップ；及びIKBKE遺伝子又はタンパク質由来シグナルの強度を低減させた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む、請求項８又は９に記載の方法。
  12. 　被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれにおけるIKBKEのキナーゼ活性を比較することで、被験物質のミクログリアM1極性化抑制活性を判定することを含む、請求項８に記載の方法。
  13. 　被験物質をIKBKE、基質及びATPと共にインキュベートするステップ；基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度を測定するステップ；測定された基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度を、被験物質非存在下での基質のリン酸化に伴って変動するシグナルの強度と比較するステップ；及び前記両シグナル強度の比較により基質のリン酸化を低減させることが確認できた被験物質を、ミクログリアM1極性化抑制活性を有する物質と判定するステップを含む、請求項１２に記載の方法。

     
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