DE102015203606C5 - Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure von zytologischen Proben in flüssigen Konservierungsmitteln, die Formaldehyd enthalten - Google Patents

Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure von zytologischen Proben in flüssigen Konservierungsmitteln, die Formaldehyd enthalten Download PDF

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Abstract

[0100] Verfahren, Zusammensetzung, Kit und System zur Isolation amplifizierbarer Nukleinsäure aus zytologischen Proben, die in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel konserviert wurden. Die Methode basiert auf der Verwendung von 2-Imidazolidon und einem Proteaseenzym, wie z.B. Proteinase K, bei erhöhten Temperaturen. Es ist von Vorteil, dass RNA isoliert und als Template für Nukleinsäureamplifikationsreaktionen verwendet werden kann.

Description

  • Bezugnahme auf verwandte Anmeldungen
  • Die vorliegende Anmeldung beansprucht Vorrang vor der amerikanischen Patenanmeldung Nr. 61/946,637 , die am 28. Februar 2014 eingereicht wurde, der amerikanischen Patentanmeldung Nr. 61/969,052 , die am 21. März 2014 eingereicht wurde, und PCT/US14/00064 , die am 21. März 2014 eingereicht wurde, die alle für jegliche Zwecke durch Bezugnahme vollständig mit einbezogen werden.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung fällt in das Gebiet der Biotechnik. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure von zytologischen Abstrichen oder Proben, die in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel fixiert wurden, wobei sich isolierte RNA zur Verwendung als Vorlage bei Nukleinsäureamplifikationsverfahren eignet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Laborpersonal, das an der Molekularanalyse von Nukleinsäure arbeitet, die von mit Formaldehyd fixierten Proben isoliert wurde, weiß, dass für die Verwendung von Proben dieser Art gewisse Einschränkungen bestehen. Dies geht darauf zurück, dass Formaldehyd und bestimmte andere chemische Fixiermittel Protein und Nukleinsäuren chemisch modifizieren. Es ist bekannt, dass die Modifikationen die Brauchbarkeit von Nukleinsäure bei nachfolgenden Analysen beeinträchtigen.
  • Besondere Schwierigkeiten ergeben sich durch die gut bekannte chemische Modifikation von DNA, RNA und Proteinen. Masuda et al., (Nucleic Acids Res., 27:4436-4443 (1999)) untersuchten nämlich den Grund, warum mit Formalin fixierte Proben unzulängliches Material für molekularbiologische Applikationen darstellen. Die Autoren zeigten, dass, während Bearbeitung mit Proteinase K feste Gewebe auflöste und RNA-Extraktion ermöglichte, die extrahierte RNA nur beschränkt als PCR-Template verwendet werden konnte. Eine weitere Untersuchung zeigte einen chemischen Zusatz von Monomethylolgruppen (-CH2OH) zu allen vier Basen sowie Nachweis für Adenindimerisation durch Methylenbrückenbildung. Gewisse Modifikationen konnten durch Temperaturerhöhung im formalinfreien Puffer umgekehrt werden. Aufgrund der Instabilität von RNA ist jedoch die Verwendung hoher Temperaturbedingungen möglicherweise nicht wünschenswert.
  • Frühere Vorgehen zur Bearbeitung von mit Formaldehyd fixierten Proben lieferten gewisse Erfolge. So beschrieben z.B. Khripin et al., in der veröffentlichten amerikanischen Patentanmeldung 2011/0196146 A1 die Verwendung von Hydrazin und Hydrazid enthaltenden, Formaldehyd fangenden Verbindungen während der Isolierung von Nukleinsäuren von Zellenmaterial in einem flüssigen Konservierungsmittel für Zytologieproben, das Formaldehyd enthielt (z.B. Semicarbazid; Thiosemicarbazid; Carbazid; Thiocarbazid; N-Aminoguanidin und Salze dieses, einschließlich Hydrochloridsalze; N,N-Diaminoguanidin und Salze dieses, einschließlich Dihydrochloridsalze; Acetylhydrazid; Adipinsäuredihydrazid; Bernsteinsäuredihydrazid; Ameisensäurehydrazid; Maleinsäuredihydrazid; Malonsäuredihydrazid; Benzolsulfonylhydrazid; Tosylhydrazid; Methylsulfonylhydrazid). Anstelle der Verwendung von Nukleinsäureamplifikation zur Messung der Nukleinsäureintegrität verwendeten die Erfinder ein hybrides Abfangprotokoll, bei dem ein Cocktail von RNA-Sonden zu isolierter Nukleinsäure hybridisierte. Danach folgte Antikörperbindung an RNA:DNA-Hybride und nachfolgende Signalamplifikationsverfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von DNA-Zielnukleinsäuren. Khripin et al. verweisen sogar auf U.S. 6,228,578 zwecks Anweisung zum Nukleinsäurenachweis, wo dieses Dokument eine Bearbeitung von Nukleinsäureproben mit einer starken Base und hoher Temperatur beschreibt - Bedingungen, die bekannterweise RNA hydrolysieren. Somit befassen sich Khripin et al., nicht damit, dass Nukleinsäuren zur Verwendung als Templates in Nukleinsäure- amplifikationsreaktionen geeignet gemacht werden, und liefern zudem nicht ausreichend Information, um den Nachweis von Ziel-RNA von in Formaldehyd fixierten Proben zu ermöglichen.
  • Die hierin beschriebenen Methoden befassen sich mit dem Bedarf für rapide und effiziente Isolierung intakter Nukleinsäure, wie z.B. RNA, für Zytologieproben, die in flüssigen Konservierungsmitteln, die Formaldehyd enthalten, konserviert wurden.
  • Zusammenfassung der beanspruchten Erfindung
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verarbeitung einer Probe, zu dem gehört, dass eine klinische Probe in ein flüssiges Konservierungsmittel für Zytologieproben, das Formaldehyd enthält, gegeben wird. Der erste Schritt des Verfahrens ist die Kombination der Probe mit einem Proteaseenzym und 2-Imidazolidon oder einem anderen Formaldehydfänger zur Erstellung einer Reaktionsmischung. Danach folgt Inkubation der Reaktionsmischung bei erhöhter Temperatur für einen Zeitraum, der lang genug ist, um chemische Modifikation von Nukleinsäure durch Formaldehyd, die in der Probe vorhanden sein könnte, umzukehren. Erfindungsgemäß enthalten die Nukleinsäuren RNA, die Temperatur des Inkubationsschritts beträgt 85-100°C und der Inkubationsschritt dauert nicht mehr als 30 Minuten an. Durch diesen Schritt wird zumindest ein Teil der chemischen Modifikation, die durch die Reaktion zwischen Formaldehyd und entweder Nukleinsäuren oder Proteinen verursacht wird, umgekehrt wird. So können z.B. chemische Vernetzungen zerstört werden. Danach folgt ein Schritt zur Isolation einer Nukleinsäure von der Reaktionsmischung nach dem Schritt der Inkubation, wobei die isolierte Nukleinsäure RNA ist. Zum Schluss folgt ein Schritt der Durchführung einer Amplifikationsreaktion in vitro unter Verwendung der Nukleinsäure vom Isolationsschritt als Templates.
  • Bei einigen Methoden setzt die Umkehrung Nukleinsäuren in den Proben frei, die durch Formaldehyd zur Vernetzung mit Polypeptiden in der Probe induziert wurden. Bei einigen Methoden befreit die Protease die Nukleinsäuren von durch Formaldehyd induzierter Vernetzung und 2-Imidazolidon hemmt die neue Vernetzung zwischen Nukleinsäuren und Polypeptiden in der Probe.
  • Bei einigen Verfahren befand sich die zytologische Probe für 7-120 Tage vor Durchführung des Schritts der Kombination von Probe, Protease und Formaldehydfänger (Schritt (a)) im flüssigen Konservierungsmittel.
  • Bei einigen Verfahren dauert der Schritt der Inkubation zwischen 5 Minuten und 30 Minuten oder der Schritt der Inkubation dauert nicht länger als 15 Minuten.
  • Bei einigen Verfahren ist der Ertrag amplifizierter Nukleinsäure, die beim Schritt der Durchführung der Amplifikationsreaktion in vitro (Schritt (d)) erhalten wurde, höher als in den Kontrollamplifikationsreaktionen in vitro, bei denen entweder die Proteinase oder 2-Imidazolidon weggelassen wurde. Bei einigen Verfahren ist der Ertrag der amplifizierten Nukleinsäure, die im Schritt der Durchführung der Amplifikationsreaktion in vitro (Schritt (d)) erhalten wurde, mindestens 10% höher als die Kontrollamplifikationen, bei denen entweder Proteinase oder 2-Imidazolidon weggelassen wurde. Bei einigen Methoden sind mindestens 90% der Nukleinsäuremoleküle in der Probe nach dem Schritt der Inkubation nicht vernetzt.
  • Bei einigen Methoden ist die Endkonzentration von 2-Imidazolidon vor dem Inkubationsschritt 1-5- oder 2-5-mal in Mol größer als die endgültige maximale Konzentration des Formaldehyds. Bei einigen Methode ist die Proteinase Proteinase K und in einer Konzentration von 4,3 bis 43 U/ml vorhanden. Bei einigen Verfahren beträgt die Temperatur des Inkubationsschritts 85-95°C. Bei einigen Verfahren beträgt die Temperatur des Inkubationsschritts 91-95° C. Bei einigen Verfahren beträgt die Temperatur des Inkubationsschritts 90° C.
  • Bei einigen Verfahren werden die Proteinase und der Formaldehydfänger gleichzeitig mit der Probe vereint. Bei einigen Verfahren wird die Proteinase vor dem Formaldehydfänger mit der Probe vereint. Bei einigen Verfahren wird der Formaldehydfänger vor der Proteinase mit der Probe vereint.
  • Bei einigen Verfahren ist die Amplifikation eine durch Transkription vermittelte Amplifikation, eine Einzelprimer-Nukleinsäureamplifikation, eine auf einer Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation, eine Polymerasekettenreaktion, eine Strangverdrängungsamplifikation, eine sich selbst unterhaltende Sequenzreplikation oder eine DNA- Ligasekettenreaktion. Bei den Verfahren enthalten die Nukleinsäuren RNA. Bei den Verfahren ist die isolierte Nukleinsäure RNA.
  • Bei einigen Verfahren wird die Nukleinsäure durch einen Abfangassay isoliert, wobei die Fängersonde zu der zu isolierenden Nukleinsonde und einer immobilisierten Sonde hybridisiert. Bei einigen Verfahren wird die immobilisierte Sonde an einer magnetischen Kugel immobilisiert.
  • Bei einigen Verfahren ist die Assaypositivität der amplifizierten Nukleinsäure höher als die Assaypositivität amplifizierter Nukleinsäure, die von einer Reaktionsmischung erhalten wurden, bei der entweder die Proteinase oder der Formaldehydfänger weggelassen wurde. Bei einigen Verfahren ist die Assaypositivität der amplifizierten Nukleinsäure mindestens 12% höher als die Assaypositivität amplifizierter Nukleinsäure, die von einer Reaktionsmischung erhalten wurden, bei der entweder die Proteinase oder 2-Imidazolidon weggelassen wurde. Bei einigen Verfahren beträgt die Assaypositivität der beim Schritt der Durchführung der Amplifikationsreaktion in vitro erhaltenen, amplifizierten Nukleinsäure (Schritt (d)) nach 21 Tagen ungefähr 95%.
  • Bei einigen Verfahren ist die isolierte Nukleinsäure humaner Papillomavirus (HPV)-RNA-Zielnukleinsäure. Bei einigen Verfahren ist die Probe eine Zervixzellenprobe.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung mit den folgenden Bestandteilen: 2-Imidazolidon; Proteinase K; EDTA und ein pH-Puffer.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Kit zur Bearbeitung einer zytologischen Probe, die in einem flüssigen Konservierungsmittel, das Formaldehyd enthält, konserviert wurde. Zum Kit gehört ein erstes Fläschchen mit einem lyophilisierten Proteinase-K-Enzym. Das Kit enthält zudem ein zweites Fläschchen mit einem Rekonstitutionspuffer zur Rekonstitution des lyophilisierten Proteinase-K-Enzyms. Dieser Rekonstitutionpuffer enthält eine Menge eines pH-Puffers, eine Menge EDTA und eine Menge 2-Imidazolidon.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein System zur Bearbeitung von Nukleinsäure enthaltenden, zytologischen Proben, die in einem flüssigen Konservierungsmittel, das Formaldehyd enthält, konserviert wurden, wobei das System zur Isolierung von RNA eingerichtet ist. Zu den Systemkomponenten gehören: ein programmierbarer Regler, eine Pipettiervorrichtung in Kommunikation mit dem programmierbaren Regler, eine erste Halterung für ein Reaktionsfläschchen und eine zweite Halterung für ein Reagenzfläschchen. Entsprechend diesem Aspekt der Erfindung wird der programmierbare Regler durch Softwareanweisungen konfiguriert, die veranlassen, dass die Pipettiervorrichtung eine Aliquote Flüssigkeit aus dem Reagenzfläschchen in das Reaktionsfläschchen überträgt, wenn das Reagenzfläschchen eine Lösung bestehend aus 2-Imidazolidon, Proteinase K, EDTA und einem pH-Puffer enthält. Abgesehen von diesen Komponenten kann das Reaktionsfläschchen eine in Formaldehyd konservierte Probe entsprechend der nachfolgenden Beschreibung enthalten, die vor oder nach den anderen Komponenten eingeführt wird. Dieselbe oder eine andere Pipettiervorrichtung kann zur Einführung der Probe in das Reaktionsfläschchen verwendet werden, wobei der programmierbare Regler optional von der Software konfiguriert wird, um die Pipettiervorrichtung zu aktivieren. Zum System kann zudem eine Heizvorrichtung zum Erwärmen des Reaktionsfläschchens und dessen Inhalts für einen kontrollierten Zeitraum gehören, was optional vom durch geeignete Software konfigurierten programmierbaren Regler geregelt wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
    • ist ein Balkendiagramm, das den Prozentsatz der Positivität im HPV-RNA-Amplifikations- und Nachweisassay, der unter Verwendung von In-Vitro-Transkription durchgeführt wurde, zeigt. Die drei beim Verfahren verwendeten Bedingungen waren: (1) die zytologischen Proben wurden in flüssigem THINPREP-Konservierungsmittel konserviert (ausgefüllte Balken); (2) die zytologischen Proben wurden in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel konserviert und mit Proteinase-K-Enzym bearbeitet (diagonal schraffierte Balken) und (3) die zytologischen Proben wurden in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel konserviert und mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase-K-Enzym bei erhöhten Temperaturen bearbeitet (offene Balken).
    • Die sind Balkendiagramme, die den Prozentsatz der Positivität im HPV-RNA-Amplifikations- und Nachweisassay zeigen, der unter Verwendung humaner Zelllinien, die unterschiedliche HPV-Typen enthalten, durchgeführt wurde. zeigt Ergebnisse, die unter Verwendung von SiHa-Zellen erhalten wurden, die HPV 16 enthielten. zeigt Ergebnisse, die unter Verwendung von HeLa-Zellen erhalten wurden, die HPV 18 enthielten. zeigt Ergebnisse, die unter Verwendung von MS751-Zellen erhalten wurden, die HPV 45 enthielten. Auf den zeigen offene Balken jeweils den Prozentsatz der Positivität an (linke Skala) und dicke horizontale Linien zeigen das durchschnittliche Signal-/Grenzverhältnis an (rechte Skala).
    • Die sind Liniendiagramme, die den Prozentsatz positiver Reaktionen (vertikale Achse) als Zeitfunktion (Anzahl der Tage der Lagerung in flüssigem, Formaldehyd enthaltendem Konservierungsmittel für zytologische Proben) anzeigen. Beide Diagramme zeigen Ergebnisse von Verfahren, die unter Verwendung von 30 Zellen/Reaktion durchgeführt wurden. zeigt Ergebnisse, die unter Verwendung von SiHa-Zellen erhalten wurden. zeigt Ergebnisse, die unter Verwendung von HeLa-Zellen erhalten wurden. Die verschiedenen Linien zeigen Bearbeitung mit nur Proteinase K (■) und mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase K (♦) an.
    • ist ein Liniendiagramm, das den Prozentsatz der Positivität als Funktion der Lagerzeit bei 2-8°C anzeigt. Die Linien repräsentieren Ergebnisse von klinischen Proben die zu 1:10 (♦) und 1:100 (■) verdünnt wurden.
    • ist eine diagrammatische Darstellung der Hauptelemente eines Arbeitsablaufbeispiels.
    • zeigt einen möglichen Reaktionsmechanismus von Formaldehyd, Proteinase K und 2-Imidazolidon.
  • Definitionen
  • Wenn nicht anders angegeben, dann haben die hierin verwendeten wissenschaftlichen und technischen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie allgemein von Fachleuten aus dem Bereich der Molekularbiologie basierend auf der technischen Literatur, wie z.B. dem Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. Ausgabe (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY) oder anderen, bekannten, technischen Veröffentlichungen im Bereich der Molekularbiologie, verstanden werden. Wenn nicht anders angegeben, dann sind die hierin verwendeten oder betrachteten Verfahren standardmäßige Verfahren, die im Bereich der Molekularbiologie allgemein bekannt sind.
  • Alle Patente, Anmeldungen, veröffentlichte Anmeldungen sowie andere Veröffentlichungen, auf die hierin Bezug genommen wird, werden durch Bezugnahme in ihrer Gänze mit einbezogen. Wenn eine in diesem Abschnitt gegebene Definition einer gegebenen Definition in den Patenten, Anmeldungen, veröffentlichten Anmeldungen und anderen Veröffentlichungen, die hierin durch Bezugnahme inkorporiert werden, widerspricht oder anderweitig nicht mit dieser übereinstimmt, dann gilt die in diesem Abschnitt gegebene Definition anstelle der Definition, die hier durch Bezugnahme inkorporiert wurde.
  • Entsprechend der Verwendung hierin bedeuten „ein/eine“ „mindestens ein/eine“ oder „eine/eine oder mehr“.
  • Annähernde Ausdrücke, wie sie hierin in der gesamten Spezifikation und den Ansprüchen verwendet werden, können verwendet werden, um quantitative oder qualitative Darstellungen zu modifizieren, die zulässigerweise variieren könnten, ohne dass es zu einer Änderung in der grundlegenden Funktion kommt, auf die sich beziehen. Dementsprechend ist ein Wert, der durch einen Begriff wie z.B. „ungefähr“ oder „annähernd“ modifiziert wird, nicht auf den genauen, spezifizierten Werte beschränkt und kann Werte einbeziehen, die vom spezifizierten Wert abweichen.
  • Zur Klarstellung, „Formaldehyd“ in seiner Grundform (CH2O), ist ein Gas. Die Flüssigkeit, die als „Formalin“ bezeichnet wird, ist eigentlich eine Mischung aus Formaldehydgas und Wasser. Entsprechend der Verwendung hierin kann sich „Formaldehyd“ auf das Molekül (CH2O) beziehen, das in einer wässrigen Lösung gelöst ist.
  • Entsprechend der Verwendung hierin bezieht sich „flüssige Zytologie“ auf Flüssigkeit basierende, gynäkologische Probennahme, wobei ein zytologischer Abstrich, der auf die übliche Weise mit einem der Abstrichinstrumente vorgenommen wurde, anstatt auf einen Glasträger aufgetragen zu werden, in ein Fläschchen mit flüssigem Konservierungsmittel oder „Fixierlösung“ gegeben wird. Die konservierte Probe kann für mikroskopische oder Molekularanalyse verwendet werden.
  • Entsprechend der Verwendung hierin ist eine „Probe“ etwas, als ein bestimmtes Beispiel genommen wurde. Zu biologischen Proben gehören Gewebe oder Material von einem lebenden oder toten Organismus, die einen Analyten, wie z.B. einen Nukleinsäureanalyten enthalten können. Zu bevorzugten biologischen Proben gehören Gewebe der Atemwege, Exudate (z.B., bronchoalveoläre Lavage), Biopsie, Sputum, peripheres Blut, Plasma, Serum, Lymphknoten, gastrointestinales Gewebe, Fäzes, Urin und andere Flüssigkeiten, Gewebe und anderes Material. Sehr bevorzugte biologische Proben sind u.a. Zellen, die vom Muttermund genommen wurden, wie sie z.B. durch einen PAP-Abstrich erhalten werden.
  • Entsprechend der Verwendung hierin bezieht sich der Begriff „Sample/Probe“ auf einen Teil oder eine Menge von Material zur Verwendung in Tests, wobei dieser Anteil Information über das Gebilde/die Quelle, dem/der er entnommen wurde, geben kann. Samples/Proben können von beliebigen Quellen stammen, wie z.B. biologische Proben oder Umweltquellen.
  • Entsprechend der Verwendung hierin bezieht sich der Begriff „Nukleinsäure“ auf eine Polynukleotidverbindung, die Oligonukleotide enthält, die aus Nukleosiden oder Nukleosidanaloga bestehen, die stickstoffhaltige heterozyklische Basen oder Basenanaloga haben, die kovalent durch standardmäßige Phosphodiesterbindungen oder andere Bindungen verbunden sind. Zu Nukleinsäuren gehören RNA, DNA, chimäre DNA-RNA-Polymere oder Analoga dieser.
  • Mit „Analytnukleinsäure“ ist ein Polynukleotid von Interesse gemeint, das nachgewiesen oder quantifiziert werden soll. Erfindungsgemäß ist die Analytnukleinsäure RNA. Das Genom eines bestimmten Virus wäre ein Beispiel für eine Analytnukleinsäure.
  • Entsprechend der Verwendung hierin ist eine „Testprobe“ eine Probe, die auf das Vorhandensein einer bestimmten Analytnukleinsäure untersucht werden soll.
  • Entsprechend der Verwendung hierin beziehen sich „erhöhte“ Temperaturbedingungen auf eine Temperatur, die höher als Raumtemperatur ist. Erhöhte Temperaturen beim Inkubationsschritt liegen im Bereich von 85°C-100°C, manchmal im Bereich von 85-98°C, 85-95°C, 90-95°C, 91-95°C oder 91-99°C und manchmal von ungefähr 90°C. Die Verwendung von Temperaturen von z.B. 85 -98°C, 90°C oder 91-95 °C kann zu vermehrter Assayempfindlichkeit führen, wie dies an späterer Stelle näher definiert wird, was überrascht, weil Proteinase K einer zunehmenden Denaturierung unterzogen wird, wenn die Temperatur über 65°C erhöht wird, und aufgrund exzessiver Denaturierung normalerweise nicht zur Verwendung bei Temperaturen über 85°C oder 90°C empfohlen würde. Obwohl die Anwendung der Erfindung nicht von der Erkenntnis des Mechanismus für diesen unerwarteten Vorteil durch höhere Temperaturen abhängt, könnte dieses Ergebnis andeuten, dass die Förderung des Auffangens von Formaldehyd durch 2-Imidazolidon bei erhöhten Temperaturen eine gewisse Reduktion der Proteinase-K-Aktivität mehr als ausgleicht. In allen diesen Fällen werden Reaktionsmischungen, die eine klinische Zytologieprobe in einem flüssigen Konservierungsmittel, 2-Imidazolidon, Protease, EDTA und pH-Puffer enthalten, bevorzugt für einen Zeitraum von 10 Minuten bis 30 Minuten und bevorzugt 10 Minuten bis nicht länger als 20 Minuten und manchmal bis zu 15 Minuten oder ungefähr 15 Minuten höheren Temperaturen ausgesetzt.
  • Ein „Amplikon“ ist ein Polynukleotidprodukt einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion in vitro, wobei eine Zielnukleinsäuresequenz als Template zur Synthese von Kopien oder Amplifikationsprodukten diente.
  • Mit „Ziel“ oder „Zielnukleinsäure“ ist eine Nukleinsäure gemeint, die eine Sequenz enthält, die amplifiziert, nachgewiesen und/oder quantifiziert werden soll. Eine Zielnukleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, ist bevorzugt zwischen zwei entgegengesetzt ausgerichteten Oligonukleotiden positioniert und enthält einen Anteil der Zielnukleinsäure, der für jedes der Oligonukleotide komplementär ist.
  • Mit „Amplifikation“ oder „Nukleinsäureamplifikation“ oder „In-Vitro-Nukleinsäureamplifikation“ und ähnlich ist ein bekanntes Verfahren zum Erhalt mehrfacher Kopien gemeint, wobei RNA- und DNA-Äquivalente einer Zielnukleinsäuresequenz oder deren Ergänzung oder Fragmente dieser mit einbezogen werden.
  • Zur Unterstützung des Verständnisses einiger der hierin beschriebenen Ausführungen wird das TMA-Verfahren, das an früherer Stelle detailliert beschrieben wurde (z.B. amerik. Pat. Nr. 5,399,491 , 5,554,516 und 5,824,518 ) hier kurz zusammengefasst. BeimTMA, liegt eine Zielnukleinsäure, welche die zu amplifizierende Sequenz enthält, in Form einer einsträngigen Nukleinsäure vor (z.B. ssRNA or ssDNA). Eine jegliche herkömmliche Methode zur Konversion einer zweisträngigen Nukleinsäure (z.B. dsDNA) in eine einsträngige Nukleinsäure kann verwendet werden. Ein Promoter-Primer bindet sich spezifisch an der Zielsequenz an die Zielnukleinsäure und eine reverse Transkriptase (RT) verlängert das 3'-Ende des Promoter-Primers, indem sie den Zielstrang als Template zur Erstellung einer cDNA-Kopie verwendet, was zu einem RNA:cDNA-Duplex führt. RNase-Aktivität (z.B. RNase H des RT-Enzyms) verdaut die RNA des RNA:cDNA-Duplex und ein zweiter Primer bindet sich spezifisch an die Zielsequenz in der cDNA nach dem Promoter-Primer-Ende. Danach synthetisiert die RT einen neuen DNA-Strang durch Verlängerung des 3'-Endes des zweiten Primers unter Verwendung der cDNA als Template zur Erstellung einer dsDNA, die eine funktionelle Promotersequenz enthält. Für den funktionellen Promoter spezifische RNA-Polymerase leitet Transkription ein, um ungefähr 100 bis 1000 RNA-Transkripte (amplifizierte Kopien oder Amplika) zu erzeugen, die komplementär zum ursprünglichen Zielstrang sind. Der zweite Primer bindet sich spezifisch an seine Zielsequenz in jedem Amplikon und die RT erstellt eine cDNA vom Amplikon-RNA-Template, um einen RNA:cDNA-Duplex zu erzeugen. RNase verdaut die Amplikon-RNA vom RNA:cDNA-Duplex und die zielspezifische Sequenz des Promoter-Primers bindet sich an ihre komplementäre Sequenz in der neu synthetisierten DNA und die RT verlängert das 3'-Ende des Promoter-Primers sowie das 3'-Ende der cDNA, um eine dsDNA zu erzeugen, die einen funktionellen Promoter enthält, an den sich die RNA-Polymerase bindet und zusätzliche Amplika transkribiert, die komplementär zum Zielstrand sind. Autokatalytische Zyklen, die diese Schritte wiederholt während der Reaktion verwenden, liefern eine ungefähr milliardenfache Amplifikation der ursprünglichen Zielsequenz. Amplika können während der Amplifikation (Echtzeitdetektion) oder am Endpunkt der Reaktion(Endpunktdetektion) durch Verwenden einer Sonde nachgewiesen werden, die sich spezifisch an eine in den Amplika enthaltene Sequenz bindet. Das Erkennen eines Signals infolge der gebundenen Sonden deutet auf das Vorhandensein der Zielnukleinsäure in der Probe hin.
  • Entsprechend der Verwendung hierin kann die/der „Feststellung/Nachweis“ der amplifizierten Produkte durch Anwenden eines jeglichen bekannten Verfahrens erfolgen. So können z.B. amplifizierte Nukleinsäuren mit einer Oberfläche assoziiert werden, die eine feststellbare, physikalische Veränderung aufweist (z.B. eine elektrische Veränderung). Amplifizierte Nukleinsäuren können in der Lösungsphase oder durch Konzentration dieser in oder auf einer Matrix und Feststellen von Labeln, die mit ihnen assoziiert werden (z.B. einem Interkalationsstoff wie Ethidiumbromid) nachgewiesen werden. Bei weiteren Nachweisverfahren werden Sonden komplementär zu einer Sequenz im amplifizierten Produkt verwendet und sie weisen das Vorhandensein des Sonden-Produkt-Komplexes nach oder verwenden einen Komplex von Sonden zur Amplifikation des von den amplifizierten Produkten festgestellten Signals (z.B. amerik. Pat. Nrn. 5,424,413, 5,451,503 und 5,849,481). Bei anderen Nachweismethoden wird eine Sonde verwendet, bei der die Signalerzeugung mit dem Vorhandensein der Zielsequenz verbunden ist, weil es nur dann zu einer Signaländerung kommt, wenn sich die markierte Sonde an ein amplifiziertes Produkt bindet, wie das bei einem molekularen Leuchtfeuer, einer molekularen Fackel oder einer Hybridisierungs-Switch-Sonde der Fall ist (z.B. amerik. Pat. Nr. 5,118,801 , 5,312,728 , 5,925,517 , 6,150,097 , 6,361,945 , 6,534,274 , 6,835,542 , 6,849,412 und 8,034,554 ; sowie amerik. Veröff. Nr. 2006/0194240 A1 ). Solche Sonden verwenden typisch ein Label (z.B. Fluorophor), das an einem Ende der Sonde angebracht ist, und eine interagierende Verbindung (z.B. Quencher) an einer anderen Stelle der Sonde, um Signalproduktion vom Label zu hemmen, wenn sich die Sonde in einer Konformation („geschlossen“) befindet, die anzeigt, dass sie nicht zum amplifizierten Produkt hybridisiert ist, wobei jedoch ein feststellbares Signal erzeugt wird, wenn die Sonde zum amplifizierten Produkt hybridisiert ist, was ihre Konformation (zu „offen“) ändert. Die Feststellung eines Signals von direkt oder indirekt markierten Sonden, die sich spezifisch mit dem amplifizierten Produkt assoziieren, weist auf das Vorhandensein der Zielnukleinsäure hin, die amplifiziert wurde.
  • Entsprechend der Verwendung hierin ist eine „Sonde“ ein Oligonukleotid, das spezifisch zu einer Zielsequenz in einer Nukleinsäure hybridisiert, bevorzugt eine amplifizierte Nukleinsäure, unter Bedingungen, welche Hybridisierung fördern, um ein nachweisbares Hybrid zu bilden.
  • Entsprechend der Verwendung hierin bedeutet der Begriff „Kontaktieren“ das Zusammenbringen von zwei oder mehr Komponenten. Kontaktieren kann durch Mischen aller Komponenten in einer flüssigen oder halbflüssigen Mischung erzielt werden. Kontaktieren kann auch erzielt werden, wenn eine oder mehrere Komponenten auf einer festen Fläche, wie z.B. einem festen Gewebeabschnitt oder einem Substrat, in physischen Kontakt mit einer oder mehreren anderen Komponenten gebracht werden.
  • Entsprechend der Verwendung hierin bezieht sich der Begriff „Target-Capture“ auf die selektive Trennung einer Zielnukleinsäure von anderen Komponenten einer Probenmischung, wie Zellfragmenten, Organellen, Proteinen, Lipiden Kohlenhydraten oder anderen Nukleinsäuren. Ein Target-Capture-System kann spezifisch sein und selektiv eine vorbestimmte Zielnukleinsäure von anderen Probenbestandteilen trennen (z.B. durch Verwenden einer Nukleinsäuresequenz, die für die beabsichtigte Zielnukleinsäure spezifisch ist) oder sie kann nicht-spezifisch sein und selektiv Zielnukleinsäure von anderen Probenbestandteilen durch Verwenden anderer Merkmale des Ziels trennen (z.B. einem physischen Merkmal der Zielnukleinsäure, durch das sie sich von anderen Probenbestandteilen unterscheidet, die dieses physische Merkmal nicht aufweisen, wie z.B. Hybridisierung zu einer nicht-spezifischen Nukleinsäuren, Bindung an einen porösen kugelförmigen Glaspartikel, Erfassung und Elution in einer mit Kieselerde gefüllten Säule). Bevorzugte Target-Capture- Verfahren für Nukleinsäurehybridisierung und Zusammensetzungen wurden bereits detailliert beschrieben (amerik. Pat. Nr. 5,750,338 , 6,060,246 , 6,110,678 , 6,534,273 und 7993,853 ; sowie amerik. Veröff. Nr. 2008/0286775 A1 ). Bevorzugte Target-Capture-Ausführungsformen verwenden ein Target-Capture-Oligonukleotid in einer Lösungsphase und eine immobilisierte Capture-Sonde, die an einer Stütze angebracht ist, um einen Komplex mit der Zielnukleinsäure zu bilden, und das erfasste Ziel von den anderen Komponenten trennt.
  • Entsprechend der Verwendung hierin bezieht sich der Begriff „Target-Capture-Oligonukleotid“ auf zumindest ein Nukleinsäureoligonukleotid, das eine Zielnukleinsäure und eine immobilisierte Capture-Sonde überbrückt oder sich mit diesen verbindet, in dem es die Teile eines Bindungspaars verwendet, wie z.B. komplementäre Nukleinsäuresequenzen oder Biotin und Streptavidin. Bei einem Vorgehen bindet sich das Target-Capture-Oligonukleotid nicht spezifisch an die Zielnukleinsäure und immobilisiert sie auf einer festen Stütze. Bei einem anderen Vorgehen bindet sich eine zielspezifische Sequenz (TS, d.h. „target-specific‟) des Target-Capture-Oligonukleotids spezifisch an eine Sequenz in der Zielnukleinsäure. Bei beiden Vorgehen gehört zum Target-Capture-Oligonukleotid eine immobilisierte, die Capture-Sonde bindende Region, die sich an eine immobilisierte Capture-Sonde (z.B. durch spezifische Interaktion des Bindungspaars) bindet. Bei Ausführungen, bei denen die TS-Sequenz und die immobilisierte, die Capture-Sonde bindende Region beide Nukleinsäuresequenzen sind, können sie kovalent miteinander verbunden sein oder sich an unterschiedlichen Oligonukleotiden befinden, die durch einen oder mehrere Linker verbunden sind.
  • Eine „immobilisierte Capture-Sonde“ bietet eine Möglichkeit zur Verbindung eines Target-Capture-Oligonukleotids mit einer soliden Stütze. Die immobilisierte Capture-Sonde ist ein Basensequenzerkennungsmolekül, das mit der soliden Stütze verbunden ist, was Trennung des gebundenen Zielnukleotids von nicht gebundenem Material ermöglicht. Eine jegliche bekannte, solide Stütze kann verwendet werden, wie z.B. Matrizen und in Lösung freie Partikel. Beispiele für solide Stützen können Nitrozellulose, Nylon, Glas, Polyacrylat, Mischpolymere, Polystyrol, Silanpolypropylen und bevorzugt magnetisch anziehbare Partikel sein. Zu besonders bevorzugten Stützen zählen magnetische Kugeln, die monodispers sind (d.h. einheitlich in Größe ± ungefähr 5%), was konstante Ergebnisse liefert, was bei Verwendung in einem automatisierten Assay besonders vorteilhaft ist. Die immobilisierte Capture-Sonde kann direkt (z.B. über eine kovalente Anbindung oder ionische Wechselwirkung) oder indirekt mit der soliden Stütze verbunden sein. Zu üblichen Beispielen nützlicher solider Stützen gehören magnetische Partikel oder Kügelchen.
  • Entsprechend der Verwendung hierin beziehen sich die Begriffe „trennen“ oder „purifizieren“ alle auf die Entfernung von einem oder mehreren Bestandteilen einer Mischung, wie z.B. einer Probe, von einem oder mehreren Bestandteilen in der Mischung. Zu Probenbestandteilen gehören Nukleinsäuren in einer allgemein wässrigen Lösungsphase, zu der Zellenfragmente, Protein, Kohlenhydrate, Lipide und andere Bestandteile gehören können. Bevorzugte Ausführungen trennen oder entfernen mindestens 70% bis 80%, noch bevorzugter ungefähr 95%, der Zielnukleinsäure von anderen Bestandteilen in der Mischung.
  • Mit „Kit“ ist eine zusammengestellte Kombination von Materialien gemeint, die typisch zur Verwendungen miteinander gedacht sind. Zu Kits entsprechend der Erfindung können Anweisungen oder andere Information in „greifbarer“ Form (z.B. gedruckte Information, elektronisch auf einem Computer-lesbaren Medium aufgezeichnete oder anderweitig auf einem maschinenlesbarem Medium aufgezeichnete Information, wie z.B. ein Barcode zum Speichern numerischer Werte) gehören.
  • Mit „bestehend wesentlich aus“ ist gemeint, dass ein/zusätzliche Bestandteil/e, Zusammensetzung/en oder Verfahrensschritt/e, welche die grundlegenden und neuen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ändern, bei der vorliegenden Erfindung mit einbezogen werden können. Jede/r oder alle Bestandteil/e, Zusammensetzung/en oder Verfahrensschritt/e, die eine wesentliche Auswirkung auf die grundlegenden und neuen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung haben, sind bei diesem Begriff nicht mit eingeschlossen.
  • Wenn nicht anderweitig durch den Zusammenhang erkennbar, weist „um, etwa, ungefähr“ auf Variationen hin, die bei der Genauigkeit, mit der ein Wert gemessen werden kann, impliziert sind.
  • „Umkehren" von Modifikationen von DNA bezieht sich auf die Befreiung von DNA von Modifikationen, die durch Formaldehyd induziert wurden, besonders Vernetzung mit Polypeptiden. Das Umkehren kann teilweise oder komplett sein und kann oder kann nicht zur Wiederherstellung der DNA in ihren genauen Zustand vor Eintreten von Formaldehyd-induzierten Modifikationen führen.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Hierin werden Verfahren, Systeme, Zusammensetzungen und Kits zur Isolierung von Nukleinsäuren von Zytologieabstrichen/-proben beschrieben, die in flüssigen Konservierungsmitteln, die Formaldehyd enthalten, konserviert/fixiert wurden. Kurz gefasst stützt sich das beschriebene Vorgehen auf das Kontaktieren einer Aliquote der Probe, d.h. der Zellprobe im flüssigen Konservierungsmittel, mit einer Kombination von 2-Imidazolidon und einem Proteaseenzym. In der hoch bevorzugten Ausführung ist die Protease das Proteinase-K-Enzym. Die Mischung kann dann unter Bedingung hoher Wärme inkubiert werden, um freies Formaldehyd zu deaktivieren und zumindest einen Teil der chemischen Modifikationen von Nukleinsäure, die durch Formaldehyd verursacht wurden, umzukehren. Es ist vorteilhaft, dass das Vorgehen im Vergleich zu früheren Verfahren schnell ist und Nukleinsäure, einschließlich RNA, liefert, die effizient isoliert (z.B. durch Capture-Sonden-Hybridisierung), reverstranskribiert (wenn gewünscht) und in vitro amplifiziert werden kann.
  • Einführung und Überblick
  • Die hierin beschriebenen Methoden ermöglichen den Nachweis von Nukleinsäure-Targets, die in zytologischen Abstrichen/Proben, die in flüssigen Konservierungsmitteln, die Formaldehyd enthalten, vorhanden sein können. Solche biologischen Proben können über erhebliche Zeiträume aufbewahrt werden, bevor sie analysiert werden (z.B. mindestens 1, 2, 7, 14, 30, 50 oder 100 Tage oder 7-120 Tage). Während der Lagerung kann Formaldehyd Modifikationen der Nukleinsäuren in der Probe induzieren, besonders die Erzeugung von Vernetzungen mit in der Probe vorhandenen Polypeptiden. Diese Modifikationen hemmen nachfolgende Bearbeitung der DNA, einschließlich ihrer Fähigkeit zur Hybridisierung (z.B. mit einer Capture-Sonde) oder Amplifikation. Modifikationen, einschließlich von Vernetzungen, können durch Bearbeitung mit einer Protease, wie z.B. Proteinase K, aufgehoben werden. Bearbeitung mit einer Protease kann die Anzahl der Nukleinsäuremoleküle, die zur Erfassung und/oder Modifikation verfügbar sind, erhöhen und letztendlich mehr Amplifikationsprodukt und/oder eine niedrigere Nachweisschwelle eines bestimmten Ziels ergeben. Diese vorteilhaften Auswirkungen von Protease werden durch gleichzeitige Bearbeitung der Probe mit 2-Imidazolidon gesteigert. Das 2-Imidazolidon fungiert als Formaldehydfänger, d.h. es reagiert mit Formaldehyd auf eine Weise, dass es dieses unfähig oder zumindest erheblich reduziert fähig zur Induzierung von Vernetzungen zwischen Nukleinsäuren und Polypeptiden macht. Obwohl 2-Imidazolidon im Großteil der nachfolgenden Beschreibung als Beispiel für einen und als bevorzugter Formaldehydfänger verwendet wird, können andere Formaldehydfänger, wie sie in der Hintergrundinformation beschrieben werden, verwendet werden, und dies besonders in Ausführungen, die bei Temperaturen von 85°C oder höher durchgeführt werden, es sei der Zusammenhang erfordert es anderweitig. Durch Entfernung von reaktivem Formaldehyd kann das 2-Imidazolidon Polypeptide hemmen, einschließlich von Polypeptiden, die durch Wirkung der Protease an der Bildung oder erneuten Bildung von Vernetzungen mit Nukleinsäuren in der Probe gehindert werden. Das 2-Imidazolidon kann durch Entfernen von Formaldehyd zudem die Protease vor Inaktivierung schützen. Obwohl 2-Imidazolidon schon früher als Formaldehydfänger beschrieben wurde, ist es überraschend, dass seine potentielle Hemmung der Bildung neuer Vernetzungen für einen kurzen Inkubationszeitraum zu wesentlich verbesserter Verfügbarkeit von Nukleinsäuren zur Erfassung, Amplifikation und nachfolgender Bearbeitung führt, wenn man den langen Zeitraum bedenkt, über den Proben gelagert werden können, bevor Protease und 2-Imidazolidon hinzukommen. Es ist zudem überraschend, dass die Gegenwart von 2-Imidazolidon selbst die Fähigkeit von Nukleinsäuren für Erfassung, Amplifikation oder andere Nukleinsäurehybridisierungen nicht beeinträchtigt, da einige Imidazoline bekannte Nukleinsäuredenaturierungsmittel sind.
  • Die Verfahren werden für RNA verwendet. RNA kann u.a. mRNA, rRNA, hnRNA, tRNA oder virale RNA sein. RNA setzt aufgrund ihrer chemischen Instabilität, einschließlich Instabilität bei hohen Temperaturen, strengere Anforderungen für Probenbearbeitung. Daher wurden Verfahren zur Isolierung von RNA verfolgt, um die neue Methode der Probenpräparation unter strengsten Bedingungen zu demonstrieren.
  • Ein Modellsystem zum Einholen gynäkologischer, zytologischer Abstriche/Proben unter Verwendung eines Formaldehyd enthaltenden, flüssigen Konservierungsmittels wurde verwendet, um das Isolierverfahren für die Isolierungsmethode für Nukleinsäure zu illustrieren. In der Praxis umfasst das System zunächst das Einholen eines Abstrichs von Zervixzellen, Übertragen der genommenen, zytologischen Zellenprobe in das flüssige SUREPATH-Konservierungsmittel (SUREPATH ist ein eingetragenes Warenzeichen derTriPath Imaging, Inc.) und Bearbeitung der konservierten Zellen zwecks nachfolgender molekularer Tests. Die molekularen Tests in diesem Fall erforderten Amplifikation in vitro und Nachweis von humanem Papillomavirus-(HPV)-RNA-Zielnukleinsäuren.
  • HPV wird mit der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs assoziiert und dieser Nachweis exprimierter HPV-RNA ist als diagnostischer und Überwachungsassay besonders wertvoll. Molekulares HPV-Testen im Bereich der Zytologie wird heute sogar für Gebärmutterhalskrebsvorsorge und Patientenmanagement empfohlen. Demzufolge wird argumentiert, dass flüssiges PAP-Testen ein Beispiel für ein Assaysystem wäre, das von verbesserter Gewinnung von amplifizierbarer RNA durch verbesserte Bearbeitung von in Formalin oder anderen flüssigen, Formaldehyd-enthaltenden Konservierungsmitteln konservierten zytologischen Proben profitieren würde. Hinzu kommt, dass automatisierte Testverfahren basierend auf Amplifikation von Nukleinsäure in vitro gefolgt von Nachweis von HPV-spezifischen Amplifikationsprodukten ebenfalls profitieren würden.
  • Der APTIMA® HPV Assay ist ein kommerziell erhältlicher mehrfacher Nukleinsäuretest, der E6/E7 mRNA von 14 Hochrisiko-Gentypen (z.B. Kat. Nr. 303585, Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) feststellt. Zu den 14 festgestellten Hochrisiko-Genotypen gehören HPV 16, HPV 18 und HPV 45. Der APTIMA HPV 16 18/45 Genotype Assay ist ein Nukleinsäureamplifikationstest in vitro für den quantitativen Nachweis und die Differenzierung zwischen den Typen 16 und 18 oder 45 (z.B. Kat. Nr. 303234, Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA). Diese Assays, die sich auf Target-Capture unter Verwendung von Nukleinsäurehybridisierung stützen, wurden zur Verwendung mit zytologischen Zervixproben demonstriert, die in flüssigem THINPREP®-Konservierungsmittel, das kein Formaldehyd enthält, konserviert wurden. Diese Assays wurden zudem zur Verwendung mit in flüssigem SUREPATH®-Reagenz konservierten zytologischen Proben demonstriert, nachdem sie zunächst mit einen Probentransportmedium (Specimen Transport Medium, STM) verbunden und dann mit einem Reagenz bearbeitet wurden, das relative hohe Spiegel von Proteinase-K-Enzym (180 U/Reaktion) enthält. Flüssiges SUREPATH®-Konservierungsmittel enthält Formaldehyd, Ethanol, Methanol und Isopropanol. Während in THINPREP konservierte Proben unter Verwendung eines Nukleinsäureamplifikations- und -nachweisassay rapide zum Testen bearbeitet werden können, erfordern in SUREPATH® konservierte Proben eine Verdauung mit Proteinase-K für zwei Stunden bei 65°C. Dieses Erfordernis kompromittiert die Nützlichkeit des letzteren Konservierungsmittels. Durch die nachfolgend beschriebene, verbesserte Methode können in flüssigem SUREPATH®-Konservierungsmittel konservierte zytologische Proben unter Verwendung von weniger Enzymreagenz und einer Inkubationszeit von lediglich 15 Minuten bearbeitet werden.
  • Bevorzugte Reagenzzusammensetzungen
  • Die beschriebene Methode zur Präparation von Nukleinsäure von zytologischen Proben aus flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmitteln stützt sich auf die kombinierte Verwendung eines Proteaseenzyms und 2-Imidazolidon. Die beschriebene Methode stützt sich weiterhin auf die Verwendung eines Proteaseenzyms bei hoher Temperatur. Bei einem bevorzugten Vorgehen liegt das Proteaseenzym in einer lyophilisierten Form vor, die unter Verwendung einer Pufferlösung, die 2-Imidazolidon enthält, rekonstituiert wird. Der Rekonstitutionspuffer enthält bevorzugt zudem EDTA. In einer stark bevorzugten Ausführung ist das Proteaseenzym das Proteinase-K-Enzym, von dem bekannt ist, dass es seine Aktivität im breiten Bereich von pH 4,.0 - pH 12,0 beibehält. Der pH-Wert des Puffers zur Rekonstitution des Proteaseenzyms fällt jedoch bevorzugt in den Bereich von ungefähr pH 7,5 bis ungefähr pH 8,5. Dieser Bereich erlaubt optimale Enzymaktivität, während die RNA immer noch vor hydrolytischer Spaltung geschützt wird, die unter stark alkalischen Bedingungen auftritt. Noch bevorzugter enthält der bei der Rekonstitution verwendete Puffer einen Tris-Puffer mit einem pH von ungefähr 8,0.
  • Die endgültigen Konzentrationen der Hauptreagenzbestandteile, wenn diese mit einem optimalen Verdünnungsmittel und dem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel für zytologische Proben verbunden werden, fallen innerhalb der bevorzugten Bereiche. Das optimale Verdünnungsmittel kann eine Pufferlösung sein, die ein Detergens enthält, das Zellmembranen auflöst. Beispiele für Detergenzien sind u.a. anionische Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und Lithiumlaurylsulfat (LLS). Andere Detergenzien, wie die nichtionischen Detergenzien, können ebenfalls nützlich sein. Es ist von Vorteil, dass die starken ionischen Detergenzien Proteine denaturieren können und sie somit zu besseren Zielen für Proteolyse durch das Proteinase-K-Enzym machen. Die endgültige Konzentration (nach Molarität) von 2-Imidazolidon in der Reaktionsmischung wird bevorzugt so gewählt, dass sie in einen Bereich fällt, der das 1-fache bis 5-fache oder bevorzugter 2-fache bis 5-fache der endgültigen Maximalkonzentration des Formaldehyds ausmacht. Die endgültige Konzentration von 2-Imidazolidon wird durch Mol bestimmt, die über das Volumen der Reaktionsmischung zugefügt werden, nachdem alle Reagenzien zugefügt wurden. In anderen Worten, es erfolgt kein Abzug für Formaldehyd, das bei der Induzierung der Vernetzung vor der Inkubation bei Wärme verbraucht wurde. Wenn z.B. eine Reaktionsmischung, die durch Kombination von 1 ml flüssigem Konservierungsmittel für zytologische Proben (z.B. unter Einbeziehung einer Zellenprobe), 2,9 ml eines Verdünnungsmittels und 0,3 ml eines Reagenz einschließlich 2-Imidazolidon, Proteinase-K-Enzym, EDTA und Puffer vorbereitet wurde, eine endgültige Formaldehydkonzentration von ungefähr 28 mM aufweist, dann würde die endgültige Konzentration von 2-Imidazolidon bei einem 2-fachen Überschuss ungefähr 50 mM bis ungefähr 60 mM betragen. Es ist von Vorteil, dass die endgültige Konzentration von Proteinase-K-Enzym in der vorliegende Formulierung relativ zur der Menge reduziert werden kann, die anderweitig verwendet würde, wenn 2-Imidazolidon nicht vorhanden ist. Obwohl die praktische Anwendung der Erfindung nicht vom Verständnis eines bestimmten Wirkungsmechanismus abhängt, wird davon ausgegangen, dass Proteinase-K zur Verdauung von Aminbindungen dient, welche Proteine mit Methylbrücken verbinden, wodurch Nukleinsäure freigesetzt wird und diese für Target-Capture im von Hybridisierung abhängigen Target-Capture-Schritt zugänglich macht, der in den APTIMA® Assays von Gen-Probe Incorporated oder anderen ähnlichen Assays verwendet wird. Praktischerweise fällt die endgültige Konzentration von Proteinase-K-Enzym bevorzug in den Bereich von ungefähr 80 U/ml bis ungefähr 4 U/ml oder von ungefähr 70 U/ml bis ungefähr 4 U/ml oder von ungefähr 60 U/ml bis ungefähr 4 U/ml oder von ungefähr 50 U/ml bis ungefähr 4 U/ml oder von ungefähr 40 U/ml bis ungefähr 4 U/ml oder von ungefähr 30 U/ml bis ungefähr 4 U/ml oder von ungefähr 20 U/ml bis ungefähr 4 U/ml oder von ungefähr 15 U/ml bis ungefähr 8 U/ml oder von ungefähr 12 U/ml bis ungefähr 9 U/ml. Die endgültige Konzentration von Proteinase-K-Enzym fällt bevorzugt in den Bereich von ungefähr 43 U/ml bis ungefähr 4,3 U/ml, wobei eine Konzentration von ungefähr 10-11 U/ml stark bevorzugt wird. Ein Reaktionsvolumen von 4,2 ml würde praktischerweise von ungefähr 80 U/ml bis ungefähr 20 U/ml Proteinase-K-Enzym oder von ungefähr 70 U/ml bis ungefähr 30 U/ml Proteinase-K-Enzym oder von ungefähr 60 U/ml bis ungefähr 30 U/ml Proteinase-K-Enzym oder von ungefähr 50 U/ml bis ungefähr 30 U/ml Proteinase-K-Enzym mit einschließen. Ein Reaktionsvolumen von 4,2 ml (oder ungefähr 4 ml) schließt bevorzugt von ungefähr 40 U bis ungefähr 50 U oder ungefähr 40 U bis ungefähr 48 U oder ungefähr 40 U bis ungefähr 46 U oder ungefähr 40 U bis ungefähr 44 U oder ungefähr 42 U bis ungefähr 44 U oder ungefähr 43 U Proteinase-K-Enzym mit ein. Ein Reaktionsvolumen von 4,2 ml (oder ungefähr 4 ml) schließt praktischerweise von ungefähr 30 mM bis ungefähr 70 mM 2-Imidazolidon oder von ungefähr 40 mM bis ungefähr 60 mM 2-Imidazolidon mit ein. Ein Reaktionsvolumen von 4,2 ml (oder ungefähr 4 ml) schließt bevorzugt von ungefähr 50 mM bis ungefähr 60 mM 2-Imidazolidon oder ungefähr 50 mM bis ungefähr 55 mM 2-Imidazolidon mit ein, wobei ungefähr 53 mM besonders bevorzugt wird. Die endgültige Konzentration von EDTA fällt bevorzugt in den Bereich von 10 mM bis 100 mM, bevorzugter in den Bereich von 10 mM bis 50 mM und noch bevorzugter in den Bereich von 30 mM bis 40 mM. Die endgültige Konzentration der Puffersubstanz ist, basierend auf der Struktur der Substanz, variabel, reicht jedoch aus, um ausreichende Pufferkapazität zu liefern, um zu gewährleisten, dass die in der Probe enthaltene RNA durch alkalische Hydrolyse nicht wesentlich degradiert wird. Die Anforderung kann durch Anwendung einer endgültigen Pufferkonzentration im Bereich von mindestens 10 mM bis ungefähr 500 mM, bevorzugter bis ungefähr 250 mM, noch bevorzugter bis ungefähr 100 mM und noch bevorzugter bis ungefähr 50 mM erfüllt werden. Ein stark bevorzugter endgültiger Konzentrationsbereich für die Puffersubstanz in der Reaktionsmischung vor Inkubation bei erhöhter Temperatur ist 10 mM bis 50 mM.
  • Die Probe kann in jeglicher Reihenfolge mit Protease und 2-Imidazolidon gemischt werden. So können z.B. die Protease und 2-Imidazolidon gleichzeitig mit der Probe gemischt werden. Als Alternative kann zuerst die Protease mit der Probe gefolgt von 2-Imidazolidon gemischt werden oder umgekehrt.
  • Sowohl der Rekonstitutionspuffer als auch die lyophilisierte Protease können Bestandteil eines Kits sein und können kurz vor Gebrauch vermischt werden. Das heißt, ein Endverwender des Kits kann das lyophilisierte Enzym rekonstituieren, um das Enzymreagenz vorzubereiten, das z.B. 2-Imidazolidon, Proteinase-K-Enzym, EDTA und pH-Puffer enthält. Eine einzelne Lösung des Reagenzkits enthält bevorzugt 2-Imidazolidon, EDTA und pH-Puffer, jedoch nicht das Proteinase-K-Enzym. Das Proteinase-K-Enzym ist bevorzugt in einem separaten Fläschchen des Kits verpackt, wobei das Enzym in Form eines Lyophilisats vorliegt.
  • Bevorzugte Vorgehensweisen zur Target-Anreicherung
  • Vor Einleitung der Amplifikationsreaktion könnte es wünschenswert sein, dass die Zielnukleinsäure zunächst unter Verwendung einer Target-Capture-Methode angereichert oder isoliert wird. Bei einer bevorzugten Vorgehensweise werden Nukleinsäuren aus der Reaktionsmischung, die nach Zugabe eines Reagenz einschließlich 2-Imidazolidon and Proteinase-K-Enzym bei einer erhöhten Temperatur inkubiert wurden, mit einer soliden Stütze kontaktiert, nachdem auf dieser eine immobilisierte Sonde aufgetragen wurde. Entsprechend einer Ausführung hybridisieren die Zielnukleinsäuren, nachdem sie durch Bearbeitung mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Protease unter erhöhter Temperatur in Gegenwart von EDTA und pH-Puffer bearbeitet wurden, direkt auf die immobilisierte Capture-Sonde auf sequenzspezifische Weise. Bei einer anderen Ausführung dient eine „Target-Capture-Sonde“ zur Überbrückung der soliden, durch die Stütze immobilisierten Capture-Sonde und der zu amplifizierenden Zielnukleinsäure. Allgemeine Eigenschaften dieses Vorgehens werden durch Weisburg et al., in U.S. 6,534,273 beschrieben, wobei die Beschreibung in diesem Dokuments hier durch Verweisung mit einbezogen wird. Ungeachtet dessen, welche Vorgehensweise gewählt wird, sollte es klar sein, dass Hybridisierung unter Einschluss der zu amplifizierenden Zielnukleinsäure ein wesentliches Merkmal des Verfahrens ist.
  • Eine Variante des Target-Capture-Vorgehens, die in Verbindung mit den hierin beschriebenen Methoden verwendet werden kann und die sich auf nichtspezifische Hybridisierung zum zu amplifizierenden Ziel verlässt, wurde in der amerikanischen Patentanmeldung US 2008/0286775 A1 veröffentlicht, wobei die Beschreibung in diesem Dokument hier durch Verweisung mit einbezogen wird. Entsprechend des Vorgehens der nichtspezifischen Hybridisierung umfasst die Capture-Sonde zumindest eine Sequenz, die alternative Basenpaarungseigenschaften für die Zielnukleinsäure im Vergleich zur standardmäßigen Basenpaarung aufweist (d.h. G:C und A:T/U-Bindung). Die durch dieses nichtspezifische Hybridisierungsverfahren purifizierte Zielnukleinsäure kann RNA, die zumindest teilweise einsträngig ist, sein. Es sollte wiederum klar sein, das dieses sequenzunabhängige Target-Capture-Vorgehen sich immer noch auf Nukleinsäurehybridisierung verlässt.
  • Die vorliegenden Daten zeigen, dass Target-Capture trotz der Gegenwart von 2-Imidazolidon auftreten kann und berichten, dass einige Imidazoline Denaturierung von Nukleinsäuren verursachen.
  • Bevorzugte Methoden zur Nukleinsäureamplifikation
  • Zu Beispielen von Amplifikationsverfahren, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, gehören, jedoch nicht ausschließlich: Transkription-vermittelte Amplifikation (TMA), Einzelprimer-Nukleinsäureamplifikation, sequenzbasierte Nukleinsäureamplifikation (NASBA), Polymerasekettenreaktion (PCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), Self-sustained Sequence Replication (3SR), DNA-Ligase-Kettenreaktion (LCR) sowie Amplifikationsmethoden, die selbst-replizierende Polynukleotidmoleküle und Replikationsenzyme wie MDV-1 RNA und Q-Beta-Enzym verwenden. Methoden zur Durchführung dieser verschiedenen Amplifikationsverfahren können jeweils im amerikanischen Patent Nr. 5,399,491 , in der amerikanischen Patentanmeldung Seriennr. 11/213,519 , der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP 0 525 882 , U.S. Patent Nr. 4,965,188 , im amerikanischen Patent Nr. 5,455,166 , in Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 (1990), in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 89/09835 , im amerikanischen Patent Nr. 5,472,840 und in Lizardi et al., Trends Biotechnol. 9:53-58 (1991) gefunden werden. Die Beschreibungen in diesen Dokumente, welche die Durchführung der Nukleinsäureamplifikationsreaktionen beschreiben, werden hiermit durch Verweisung mit einbezogen.
  • Reaktionsmechanismus
  • Obwohl die praktische Anwendung der vorliegenden Methoden nicht von einem Verständnis des Mechanismus abhängt, zeigt einen möglichen Reaktionsmechanismus, der den Methoden zugrunde liegt. Unter sauren Bedingungen kann Formaldehyd 2 mit den nukleophilen, funktionalen Gruppen von Nukleotiden oder Polypeptiden reagieren. Die Elimination von Wasser erzeugt dann ein reaktives Imin 4. Ein zweites Nukleotid kann dann mit dem Imin reagieren, um das Dimer 5 zu bilden. Proteinase K, eine Serinprotease, hydrolysiert und spaltet den Stickstoff-Methylen-Linker. Diese Spaltung kann die beginnenden Nukleotide und Formaldehyd regenerieren. 2-Imidazolidon, ein Formaldehydfänger, kann mit zwei Formaldehydmolekülen reagieren, um eine Imidazolidon-Methanol-Verbindung 7 zu erzeugen. Diese Reaktion verhindert effektiv, dass das Formaldehyd erneut mit entweder den freigesetzten Nukleotiden oder Polypeptiden reagiert.
  • Sensitivität
  • Die Bearbeitung einer Probe mit Protease und 2-Imidazolidon, wie gerade beschrieben, kann zur Umkehrung von mehr Modifikationen bei Nukleinsäuren in der Probe, insbesondere Vernetzungen, Freisetzung von mehr Nukleinsäuren von vernetzten Polypeptiden, größerem Ertrag erfasster Nukleinsäure, größerem Ertrag amplifizierter Nukleinsäuren und verbesserter Assaysensitivität (d.h. eine niedrigere Schwelle von Ziel-DNA muss für das Ziel vorhanden sein) führen. Derartige Verbesserungen können im Vergleich zu anderweitig vergleichbaren Kontrollen, bei denen die Protease oder das 2-Imidazolidon oder beide weggelassen wird/werden, gemessen werden. Verbesserung zeigt bevorzugt sowohl im Vergleich mit einer Kontrolle, bei der die Protease weggelassen wurde, und mit einer Kontrolle, bei der das 2-Imidazolidon weggelassen wurde. Verbesserung bedeutet eine Verbesserung ausreichender Größe, die über typische Experimentvariation hinausgeht (p < 0,05). So kann z.B. bei einigen Verfahren die Bearbeitung zu einer Verbesserung von mindestens 5%, 10%, 20% oder 30% beim Ertrag von Nukleinsäuren ohne Vernetzungen oder erfassten Nukleinsäuren oder amplifizierten Nukleinsäuren führen. Das Vorhandensein von Vernetzungen kann durch Assays, die nach Molekülgewicht trennen, wie z.B. Gelelektrophorese oder verschiedene Arten von Säulenchromatographie, beurteilt werden. Bei einigen Verfahren führt die Bearbeitung dazu, dass mindestens 50, 60, 70, 80 oder 90% der Nukleinsäuremoleküle von Vernetzungen mit Polypeptiden befreit werden und somit möglicherweise einem Hybridisierungs-Capture-Assay oder einer Amplifikation unterzogen werden. Bei einigen Verfahren führt die Bearbeitung zu einer höheren Assaypositivität (oder niedrigeren Nachweisschwelle), was bedeutet, dass einige Proben nach Bearbeitung entsprechend der gegenwärtigen Methoden ein positives Ergebnis liefern (Zielnukleinsäure vorhanden) im Vergleich zu den Kontrollbearbeitungen, bei denen entweder Protease oder 2-Imidazolidon weggelassen wird.
  • Bevorzugte Ausführungen
  • Die nachfolgenden Beispiele beschreiben experimentelle Verfahren, die durchgeführt wurden, um die Vorteile der Bearbeitung von zytologischen Abstrichen/Proben in einem Formaldehyd enthaltenden, flüssigen Konservierungsmittel mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase-K-Enzym bei erhöhter Temperatur zu zeigen. Bei einer bevorzugten Ausführung wird diese Kombination in Gegenwart von Tris-Puffer und EDTA verwendet. In allen Fällen diente das flüssige, zytologische SUREPATH-Konservierungsmittel als das flüssige Modellkonservierungsmittel, das Formaldehyd enthält. In den nachfolgenden Beschreibungen bezieht sich eine „Lösung zur Rückgängigmachung der Modifikation (eine sog. Demodifier-Lösung) auf eine pH-Pufferlösung (pH 8,0), zu der EDTA (500 mM) und 2-Imidazolidon (im Bereich von 740 mM bis 750 mM) gehörten. Zu bevorzugten Puffer zur Verwendung in der Demodifier-Lösung gehört Tris-Puffer. Entsprechend der Verwendung hierin bezieht sich „Probentransportmedium“ (STM) auf eine phosphatgepufferte Detergenslösung, die, zusätzlich zu lysierenden Zellen, freigesetzte RNAs schützt, indem sie die Aktivität von RNasen hemmt, die in der dem Test unterzogenen Probe aktiv sein können. Bevorzugte Detergenzien, die im STM verwendet werden können, sind u.a. Natriumdodecylsulfat (SDS) und Lithiumlaurylsulfat (LLS), wobei LLS etwas mehr bevorzugt wird. Wenn zytologische Proben in flüssigem, Formaldehyd enthaltendem Konservierungsmittel mit der Demodifier-Lösung und Proteinase-K-Enzym verbunden werden sollen, dann kann lyophilisiertes Enzym praktischerweise mit der Demodifier-Lösung rekonstituiert werden und eine Aliquote der rekonstituierten Enzymlösung kann einem Reaktionsgefäß, das das flüssigen Konservierungsmittel für zytologische Proben enthält, zugegeben werden.
  • Beispiel 1 beschreibt Verfahren zur Beurteilung analytischer Sensitivität des experimentellen Systems durch Testen von Platten, die In-Vitro-Transkripte für jeden der 14 hochriskanten HPV-Genotypen enthielten. Der Erfolg der Bearbeitungsmethode für Nukleinsäure bei Bearbeitung mit 2-Imidazolidon und Proteinase K unter erhöhten Temperaturbedingungen wurde durch den Nachweis von HPV RNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Assays gemessen. Wie nachfolgend angezeigt, zeigten die Ergebnisse, dass die Bearbeitungsbedingungen die Amplifikation und den Nachweis von HPV-RNAs nicht kompromittierten.
  • Beispiel 1
  • Feststellen der analytischen Sensitivität eines HPV-Assays unter Verwendung synthetischer Transkripts
  • In vitro synthetisierte Transkripts dienten als Templates zur Amplifikation in herkömmlichen TMA-Reaktionen, die unter Verwendung eines APTIMA HPV-Assay zur Amplifikation und zum Nachweis von HPV-RNA durchgeführt wurden. Die für jeden verschiedenen HPV-Typus verwendete Transkriptkopienummer entspricht der Nachweisgrenze (LOD) für den APTIMA HPV-Assay, die in Vorverfahren unter Verwendung von zytologischen Proben, die in flüssigem THINPREP-Konservierungsmittel (d.h. dem Modell, dass kein Formaldehyd enthält) konserviert worden waren, festgelegt worden war. Die LOD ist die Kopiekonzentration, die zu einer Mindestpositivität von mindestens 95% bei allen getesteten Proben führt. In diesem Fall wurden alle In-Vitro-Transkripts entsprechend bei 20 bis 600 Kopien/Reaktion verwendet.
  • Es wurde drei verschiedene Bedingungen zur Probenbearbeitung getestet. Zunächst wurden In-Vitro-Transkripts in flüssigen THINPREP®-Zytologieproben in STM zugegeben (1 ml Proben und 2,9 ml STM) und dann entsprechend den Anweisungen des Herstellers des APTIMA® HPV Assays bearbeitet. Als Zweites wurden In-Vitro-Transkripts klinischen, HPV-negativen, zytologischen, in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel konservierten Restproben in STM zugegeben (1 ml Proben und 2,9 ml STM). Aliquoten (jeweils 3,9 ml) der Mischung wurden mit 100 µl Proteinase-K-Reagenz verbunden (1,8 U/µl Proteinase K in Tris-Puffer (pH 8,0), Natriumazid und CaCl2) und dann für 2 Stunden bei 65 °C inkubiert. Nach dem Schritt der Enzymverdauung wurden die Mischungen entsprechend den Anweisungen des Herstellers des APTIMA HPV Assays bearbeitet. Und schließlich wurden, wie im zweiten Fall, In-Vitro-Transkripts klinischen, HPV-negativen, zytologischen, in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel konservierten Restproben in STM zugegeben. (In diesem Fall wurden jeweils 3,9 ml Aliquoten jeder Proben-STM-Mischung mit 0,3 ml eines Proteinase-K-Enzymreagenz verbunden, das 2-Imidazolidon in Tris-EDTA-Puffer enthielt. Dieses Reagenz wurde durch Rekonstitution lyophilisierter Proteinase K unter Verwendung der Demodifier-Lösung hergestellt. Die endgültigen Mischungen enthielten 36 mM EDTA, 36 mM Tris-HCl, ungefähr 53 mM 2-Imidazolidon und 43 U of Proteinase-K-Enzym. Die Mischungen wurden 15 Minuten lang bei 90°C inkubiert und dann entsprechend den Anweisungen des Herstellers des APTIMA HPV Assays bearbeitet. Nach der Amplifikation und dem Nachweis von HPV-RNA wurde die Häufigkeit des positiven HPV-Nachweises unter den Replikaten verglichen.
  • zeigt die Ergebnisse der Beurteilung der analytischen Sensitivität, die unter Verwendung von In-Vitro-Transkripts durchgeführt wurde. Die Assaypositivität für die zytologischen Proben, die in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel konserviert worden waren, betrug mindestens 95% für 11 der 14 HPV-Genotypen, wobei 3 Genotypen, HPV 56, 58 und 59, jeweils 93,3, 91,7 und 90% Positivität lieferten. Diese Ergebnisse glichen denjenigen, die für in flüssigem THINPREP-Konservierungsmittel konservierten, zytologischen Proben erhalten worden waren, und waren gleich oder besser als für die zytologischen Proben, die in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel konserviert und dann nur mit Proteinase-K-Enzym bearbeitet worden waren. Hierdurch wurde die Nützlichkeit des HPV-Testsystems bestimmt und gezeigt, dass die Verwendung der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase-K-Enzym unter erhöhten Temperaturbedingungen die Amplifikation in vitro und Nachweisreaktionen nicht wesentlich hinderte.
  • Beispiel 2 beschreibt Verfahren, die für die Beurteilung der analytischen Sensitivität des APTIMA HPV-Assays verwendet wurden, indem eine Platte mit humanen Zellen, die HPV enthielten getestet wurde. Die Verfahren wurden allgemein in Beispiel 1 beschrieben, mit Ausnahme, dass: (1) HPV-exprimierende Zelllinien anstelle von In-Vitro-Transkripts verwendet wurden und (2) die Proben in Gegenwart des Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittels für einen längeren Zeitraum inkubiert wurden.
  • Beispiel 2
  • Feststellen der analytischen Sensitivität eines HPV-Assays unter Verwendung humaner Zelllinien, die HPV enthalten
  • Humane Zelllinien, die HPV enthielten, wurden zytologische Mischproben in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel versetzt, 7 Tage bei 25°C gelagert und dann in halblogarithmischen Verdünnungen (3 bis 30 Zellen/Reaktion) getestet, nachdem sie entweder mit der Kombination der Demodifier-Lösung und Proteinase K 15 Minuten lang bei 90°C oder nur Proteinase K für 2 Stunden bei 65°C bearbeitet worden waren. Wie bei Beispiel 1 wurde die Kombination von Demodifier-Lösung und Proteinase K praktischerweise als einzelne Aliquote bereitgestellt, indem lyophilisierte Proteinase K mit Demodifier-Lösung rekonstituiert wurde. Es ist natürlich nicht notwendig, dass die Reagenzien auf diese Weise verbunden werden. Bei diesem Verfahren verwendete Zellen waren: (1) SiHa-Zellen (die HPV16 exprimieren); (2) HeLa-Zellen (die HPV 18 exprimieren) und (3) MS751-Zellen (die HPV 45 exprimieren). HPV-Nukleinsäuren wurden wiederum erfasst, amplifiziert und unter Verwendung des APTIMA HPV-Assays entsprechend den Herstelleranweisungen nachgewiesen. Die Positivität der Proben, die unter den beiden Bedingungen bearbeitet worden waren, wurde verglichen.
  • Die zeigen die analytische Sensitivität, die unter Verwendung von Zelllinien, die 7 Tage bei 25°C in flüssigem, zytologischen SUREPATH-Konservierungsmittel gelagert wurden, erhalten wurde. Die Assaypositivität für alle drei HPV-positiven Zelllinien in Proben, die der Kombination von Demodifier-Lösung und Proteinase-K-Enzym bearbeitet worden waren, betrug mindestens 95% bei Konzentrationen von jeweils 30, 10 und 30 Zellen/Reaktion für jeweils SiHa-, HeLa- und MS751-Zellen. Diese Ergebnisse waren ähnlich oder besser als die Ergebnisse, die unter Verwendung von zytologischen Proben erhalten wurde, die 7 Tagen bei 25°C in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel gelagert worden und dann nur mit Proteinase-K-Enzym bearbeitet worden waren. Der dramatischsten Unterschiede wurden in den Versuchen beobachtet, die HeLa-Zellen in der niedrigsten eingegebenen Zellenzahl enthielten. Es bestand ein statistisch bedeutender Vorteil für die Bearbeitung der Proben unter Verwendung von 2-Imidazolidon in Kombination mit Proteinase K und hoher Temperatur.
  • Beispiel 3 beschreibt Verfahren, die zeigten, wie die kombinierte Verwendung von 2-Imidazolidon und Proteinase K unter erhöhten Temperaturbedingungen zu verbesserter Rückgewinnung amplifizierbarer Nukleinsäure aus zytologischen Proben führte, die für längere Zeiträume in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel gelagert wurden. Wie nachfolgend erörtert, war der Unterschied in RNA-Rückgewinnung im Vergleich zu Proben, die nur mit Proteinase K bearbeitet wurden, bei verlängerten Zeiträumen am auffälligsten.
  • Beispiel 3
  • Verbesserung der Rückgewinnung amplifizierbarer mRNA aus zytologischen Zellproben, die in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel gelagert wurden
  • Zur Nachahmung klinischer Proben wurden zehn zytologische Mischproben in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel, die vorher unter Verwendung des APTIMA HPV-Assays als HPV-negativ bestimmt worden waren, in die Hälfte geteilt und mit entweder SiHa- oder HeLa-Zellen versetzt. Alle Teströhrchen wurden unverdünnt für bis zu 42 Tage bei 25°C gelagert. Aliquoten von jeder Mischprobe wurden an jedem Testtag in einer 1:2.9 SUREPATH:STM-Matrix auf eine endgültige Zellkonzentration von 30 und 100 Zellen/Reaktion verdünnt. Die Proben wurden entweder durch Bearbeitung mit nur Proteinase K für 2 Stunden bei 65°C oder mit der Kombination von Demodifier-Lösung und Proteinase K (wobei die Kombination als einzelne Aliquote von mit Demodifier-Lösung rekonstituierter Proteinase K zugegeben wurde) für 15 Minuten bei 90°C bearbeitet. Es wurden wiederum HPV-Nukleinsäuren unter Verwendung des APTIMA HPV-Assays entsprechend den Herstelleranweisungen erfasst, amplifiziert und nachgewiesen.
  • Die zeigen Ergebnisse, welche die Vorteile der Probenbearbeitung unterstützen, zu der Bearbeitung mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase K unter erhöhten Temperaturbedingungen im Vergleich zur Bearbeitung mit nur Proteinase K gehörte. Alle Ergebnisse während dieser Studie waren gültig. Mit 30 Zellen pro Reaktion behielten sowohl SiHa- als auch HeLa-Zellen, die mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase K (z.B. Proteinase K, die mit Demodifier-Lösung rekonstituiert wurde) bearbeitet wurden, bis zum 14. Tag 100% Positivität bei. Über diese Lagerzeit hinaus verbesserte die Kombinationsbearbeitung die Rückgewinnung amplifizierbarer RNA in größerem Umfang als die Bearbeitung mit nur Proteinase K. Bei 100 Zellen/Reaktion behielten HeLa-Zellen 100% Positivität bis zum 28. Tag, während SiHa-Zellen bis zum 21. Tag 100% positiv blieben (Daten nicht angezeigt).
  • Beispiel 4 beschreibt das Verfahren, das eingesetzt wurde, um zu zeigen, dass klinische zytologische Proben, die in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel gelagert wurden, mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase K unter erhöhten Temperaturbedingungen bearbeitet werden konnten, um, ungeachtet des Zeitraums, für den die klinische Probe gelagert worden war, wesentlich konstante Mengen an RNA zu ergeben.
  • Beispiel 4
  • Kombinierte Bearbeitung ermöglicht effiziente Rückgewinnung von RNA bei klinischen Proben über längere Lagerzeiten
  • Dreißig bestätigte HPV-positive, klinische, zytologische Proben in flüssigem SUREPATH-Konservierungsmittel, die von einer zugeteilten Gruppe erhalten wurden, wurden in dieser Studie ausgewertet. Eine Aliquote (0,5 ml) jeder Probe wurde zu 2,9 ml STM gegeben und dann zu 1:10 und 1:100 in einer 0,5:2,9 SP:STM-Matrix verdünnt. Die Verdünnungen wurden bei 4°C gelagert und zu verschiedenen Zeitpunkten über 120 Tage mit dem APTIMA HPV Assay (N=4 für jede Probe, 120 Gesamtreplikate pro Zeitpunkt) getestet. An jedem Testtag wurden 1ml-Aliquoten der Proben mit 2,9 ml STM und 0,3 ml eines Reagenz, das in Demodifier-Lösung rekonstituierte Proteinase K enthielt, zu einer endgültigen Konzentration von 143 U/ml Proteinase K gemischt. Die Mischungen wurden 15 Minuten lang bei 90°C inkubiert, bearbeitet, um Nukleinsäuren durch ein Target-Capture-Protokoll zu isolieren, und mit dem APTIMA HPV-Assay in einem automatisierten Testgerät getestet.
  • zeigt Ergebnisse, die zeigen, dass klinische zytologische Proben, die in einem flüssigen Konservierungsmittel, das Formaldehyd enthält, konserviert werden, mit der Kombination von 2-Imidazolidon und Proteinase K unter erhöhten Temperaturbedingungen für einen kurzen Zeitraum bearbeitet werden konnten, um eine wesentlich konstante Rückgewinnung von RNA zu liefern. Alle Proben, die zu 1:10 verdünnt worden waren, behielten mindestens 97,5% Positivität nach 120 Tagen Lagerung bei 4°C. Die Positivität für alle 30 Proben, die zu 1:100 verdünnt wurden, reichte von 74,2% bis 87,5% über den Zeitraum der Studie, wobei keine beständige Abnahme in der Positivität beobachtet wurde.
  • Beispiel 5
  • Rückgewinnung von RNA aus klinischen, zytologischen Proben in flüssigem SurePath - Medium durch Bearbeitung mit Proteinase K oder mit Proteinase K, 2-Imidazolidon und Hochtemperaturinkubation
  • Dreihundertneunzig zytologische Proben in flüssigem SurePath-Medium wurden von Frauen genommen, die infolge eines abnormen PAT-Tests, einem vorherigen positiven HPV-Assayergebnis oder einer ärztlichen Überweisung aus anderen Gründen einer kolposkopischen Nachuntersuchung unterzogen wurden. Zwei (2) 1-ml-Aliquoten von jeder genommenen Probe wurden entfernt und separat mit 3 mL STM-Puffer in einem APTIMA-Transportteströhrchen (Gen-Probe Incorporated, Kat. Nr. 101738A) verbunden. Die separaten Aliquoten von jeder Probe wurden dann einer ersten Aufbereitung oder einer zweiten Aufbereitung unterzogen. Bei der ersten Aufbereitung wurden 180 U Proteinase K in 100 Mikroliter in einem Puffer einem Reaktionsgefäß zugegeben, während bei einer zweiten Aufbereitung 43 U Proteinase K und 300 Mikroliter einer 2-Imidazolidon/Tris-EDTA-Lösung zugegeben wurden, wie dies allgemein in Beispiel 1 beschrieben wird. Demzufolge wurde jede klinische Probe der ersten Aufbereitung und der zweiten Aufbereitung unterzogen. Die Probenaliquoten, die der ersten Aufbereitung unterzogen wurden, wurden dann 2 Stunden bei 65°C inkubiert. Die Probenaliquoten, die der zweite Aufbereitung unterzogen wurden, wurden dann 15 Minuten lang bei 90°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die bearbeiteten Proben unter Verwendung des Gen-Probe-HPV-Nachweisassays für sowohl das Tigris-Instrument und das Panther-Instrument (jeweils Kat. Nr. 303012 & 303585) auf HPV-RNA geprüft. Diese Nachweisassays wurden allgemein entsprechend den Herstelleranweisungen durchgeführt.
  • Ergebnisse von diesen HPV-Nachweisassays wurden in Krankheitsstatus basierend auf Biopsieergebnissen, nämlich <CIN2 und CIN2+, unterteilt. Patienten mit unzulänglichen Biopsieergebnissen wurden bei den nachfolgenden Tabellen nicht einbezogen. Ergebnisse, die unter Verwendung des APTIMA HPV-Assays auf dem Tigris-System erhalten wurden, werden auf den Tabellen 1 & 2 gezeigt. Ergebnisse, die unter Verwendung des APTIMA HPV-Assays auf dem Panther-System erhalten wurden, werden auf den Tabellen 3 & 4 gezeigt. Tabelle 1
    <CIN 2 1. Aufb. Tigris
    + - Insgesamt
    2. Aufb. Tigris + 95 31 126
    - 2 149 151
    Total 97 180 277
    Tabelle 2
    CIN 2+ 1. Aufb. Tigris
    + - Insgesamt
    2. Aufb. Tigris + 31 1 32
    - 0 8 8
    Total 31 9 40
    Tabelle 3
    <CIN 2 1. Aufb. Panther
    + - Insgesamt
    2. Aufb. Panther + 98 28 126
    - 1 152 153
    Total 99 180 279
    Tabelle 4
    CIN 2+ 2. Aufb. Panther
    + - Insgesamt
    2. Aufb. Panther + 30 2 32
    - 0 8 8
    Total 30 10 40
  • Wie diese Ergebnisse zeigen, ist die Rückgewinnung von Nukleinsäuren aus einer Probe, die mit einem Vernetzungsmittel, wie demjenigen, das man in SurePath vorfindet, vorbearbeitet wurde, größer, wenn sie mit Proteinase K, 2-Imidazolidon bearbeitet und für 15 Minuten bei 90°C inkubiert wird (2. Aufbereitung), als die Rückgewinnung bei Bearbeitung mit Proteinase K und Inkubation für 2 Stunden bei 65°C (1. Aufbereitung).
  • Beispiel 6
  • Temperaturabhängigkeit
  • Zielpräparation: Teströhrchen, die mit HPV18-infizierte HeLa-Zellen enthielten, wurden bei 37°C aufgetaut und in einem Teströhrchen zusammengegeben. Dem Teströhrchen wurde Phosphat-gepufferte Salzlösung hinzugegeben und das Röhrchen wurde in einer Zentrifuge bei 1100 rcf geschleudert, um ein Zellenpellet zu bilden. Der Überstand wurde dann durch Pipettieren entfernt. Eine Mischprobe einer HPV-negativen, klinischen SurePath®-Probe, die von Zellenpellets erhalten wurde (NCPP), wurde zugegeben, um eine klinische SurePath-Probe zu simulieren. Das Röhrchen mit den HeLa-Zellen und NCPP wurde umgekehrt, um das Pellet zu zerbrechen, und bei 25°C inkubiert (Konzentration: 1000 Zellen/mL). Nach 0, 7 und 14 Tagen wurde dem Röhrchen eine Aliquote entnommen, STM wurde hinzugeben und eine Verdünnung auf eine Endkonzentration von 10 Zellen/Reaktion durchgeführt (endgültiges Verhältnis von NCPP:STM 1:2,9). Die Röhrchen wurden bearbeitet (siehe nächster Abschnitt) und unter Verwendung eines APTIMA® HPV-Assays entsprechend den Herstelleranweisungen getestet.
  • Bearbeitungsmethoden: Nach Inkubation bei 25°C und STM-Zugabe (siehe vorheriger Abschnitt) wurden die Röhrchen in 3 Gruppen unterteilt: Wärme: 300 µL TE (Konzentration in Röhrchen: 36 mM Tris, 36 mM EDTA) wurden den Reaktionsgefäßen zugegeben. Die Röhrchen wurden mit einem Deckel versehen, für 15 Minuten in ein 90°C Wasserbad gegeben und mit einem APTIMA HPV-Assay getestet. PK: 50 mg Proteinase K wurde in 1 mL Fast-Express-Verdünnungsmittel aufgelöst. 100 µL der PK-Lösung wurden den Reaktionsgefäßen zugegeben (180 Einheiten Proteinase K pro Röhrchen). Die Röhrchen wurden mit einem Deckel versehen, für 2 Stunden in ein 65°C Wasserbad gegeben und unter Verwendung eines APTIMA HPV-Assays getestet. Wärme + PK: 50 mg Proteinase K wurde in 12 mL TE aufgelöst. 300 µL der TE+PK-Lösung wurde den Reaktionsgefäßen zugegeben (Konzentration im Röhrchen: 36 mM Tris, 36 mM EDTA, 45 Einheiten PK). Die Röhrchen wurden mit einem Deckel versehen, für 15 Minuten in ein 90°C Wasserbad gegeben und mit einem APTIMA HPV-Assay entsprechend den Herstelleranweisungen getestet. Die Ergebnisse sind auf Tabelle 5 zu sehen. Tabelle 5
    Zeitpunkt Wärme PK Wärme +PK
    T0 100% 100% 100%
    T7 60% 85% 90%
    T14 25% 50% 75%
    N=20
  • Diese Daten zeigen, dass die kombinierte Bearbeitung am effektivsten bei Proben war, die einer langen Lagerung ausgesetzt waren. Hinzu kommt, dass mit Proteinase K bei hoher Temperatur bearbeitete Proben zu einer größeren Rückgewinnung führten, als bei denjenigen, die mit Proteinase K bei niedriger Temperatur oder nur mit hoher Temperatur bearbeitet wurden.
  • Beispiel 7
  • Formaldehydfänger, Proteinase K und hohe Temperatur
  • Die Ziele wurden wesentlich wie im obigen Beispiel 6 beschrieben präpariert. Kurz gesagt, HeLa-Zelllinien (HPV-18 +), SiHa-Zelllinien (HPV-16 +), MS751-Zelllinien (HPV-45+) und Trichomonas-Zelllinien (Trichomonas +) wurden 7 Tage in SurePath-Lösung inkubiert. Nach 7 Tagen wurde dann eine Aliquote jeder SurePath-Zellprobe in Aufbereitung verbunden, wie es auf Tabelle 6 zu sehen ist. Tabelle 6
    Aufbereitung Formulierung*
    1 Proteinase K
    2 Proteinase K and Tris/EDTA
    3 Proteinase K, Tris/EDTA and 1X 2-Imidazolidon**
    4 Proteinase K, Tris/EDTA and 2X 2-Imidazolidon**
    5 Proteinase K, Tris/EDTA und Bernsteinsäuredihydrazid

    * HeLa- und SiHa-Zellen wurden in Gegenwart von 180 U Proteinase K und in Gegenwart von 45 U Proteinase K inkubiert.
    ** 1X und 2X beziehen sich auf die molare Konzentration von 2-Imidazolidon in der Lösung. 1X bedeutet, dass die molare Konzentration in etwa der des Formaldehyds in der Lösung entsprach; 2X bedeutet, dass siezweimal so hoch wie dies des Formaldehyds war.
  • Die verbundenen Lösungen wurden dann entweder für 15 Minuten oder für 2 Stunden und bei einer Temperatur von entweder 65 ° C oder 90 ° C inkubiert. Die Inkubationsbedingungen sind auf Tabelle 7 ersichtlich. Tabelle 7
    Bearbeitung Zelllinie Aufbereitung Temperatur Zeit
    1 HeLa 1 65° C 2 Stunden
    2 HeLa 2 90° C 15 Minuten
    3 HeLa 3 90° C 15 Minuten
    4 HeLa 4 90° C 15 Minuten
    5 HeLa 5 90° C 15 Minuten
    6 SiHa 1 65° C 2 Stunden
    7 SiHa 2 90° C 15 Minuten
    8 SiHa 3 90° C 15 Minuten
    9 SiHa 4 90° C 15 Minuten
    10 SiHa 5 90° C 15 Minuten
    11 MS715 1 65° C 2 Stunden
    12 MS715 2 90° C 15 Minuten
    13 MS715 5 90° C 15 Minuten
    14 Trichomonas 1 65° C 2 Stunden
    15 Trichomonas 2 90° C 15 Minuten
    16 Trichomonas 4 90° C 15 Minuten
  • Nach Inkubation wurden die Proben untersucht, um die Rückgewinnung von Nukleinsäure durch die verschiedenen Bearbeitungsformen zu bestimmen. Bei einem ersten Assay wurden 3 Zellen/Reaktion der HeLa-Zellen aus den Aufbereitungen 1-4 und 10 Zellen/Reaktion der SiHa-Zellen aus den Aufbereitungen 1-4 (siehe Tabelle 7) unter Verwendung eines APTIMA HPV-Nachweisassays (Katalognr. 303585, Gen-Probe Incorporated) allgemein entsprechend den Herstelleranweisungen untersucht. Bei einem zweiten Assay wurden 0,05 Zellen/Reaktion der Trichomonas-Zellen aus den Aufbereitungen 1, 2 & 4 (siehe Tabelle 7) unter Verwendung eines APTIMA Trichomonas-Vaginalis-Assays (Katalognr. 303563, Gen-Probe Incorporated) allgemein entsprechend den Herstelleranweisungen untersucht. Bei einem dritten Assay wurden jeweils 3 Zellen/Reaktion der HeLa-, SiHa- und MS751-Zellen aus den Aufbereitungen 1, 2 & 5 (siehe Tabelle 7), die jeweils mit 45 U Proteinase K inkubiert wurden unter Verwendung eines APTIMA HPV-Nachweisassays (Kat.Nr. 303585, Gen-Probe Incorporated) allgemein entsprechend den Herstelleranweisungen untersucht. Bei einem vierten Assay wurden jeweils 3 Zellen/Reaktion der HeLa-, SiHa- und MS751-Zellen aus den Aufbereitungen 1, 2 & 5 (siehe Tabelle 7), die jeweils mit 45 U of Proteinase K inkubiert wurden unter Verwendung eines APTIMA HPV-Genotypisierungsassays (Katalognr. 303234, Gen-Probe Incorporated) allgemein entsprechend den Herstelleranweisungen untersucht. Die Ergebnisse sind auf den Tabellen 8 bis 11 ersichtlich. Tabelle 8
    HPV-Nachweisassay und 180 U Proteinase K
    Bearbeitung Zelllinie Aufbereitung Temp Zeit % Positiv
    Erster Assay
    1 HeLa 1 65°C 2 Stunden 33%
    2 HeLa 2 90°C 15 Minuten 73%
    3 HeLa 3 90°C 15 Minuten 78%
    4 HeLa 4 90°C 15 Minuten 83%
    6 SiHa 1 65°C 2 Stunden 80%
    7 SiHa 2 90°C 15 Minuten 83%
    8 SiHa 3 90°C 15 Minuten 92%
    9 SiHa 4 90°C 15 Minuten 90%
    Tabelle 9
    Trichomonas-vaginalis-Assay und 180 U Proteinase K
    Bearbeitung Zelllinie Aufbereitung Temp Zeit % Positiv
    Zweiter Assay
    14 Trichomonas 1 65°C 2 Stunden 33%
    15 Trichomonas 2 90°C 15 Minuten 67%
    16 Trichomonas 4 90°C 15 Minuten 97%
    Tabelle 10
    HPV-Nachweisassay und 45 U Proteinase K
    Bearbeitung Zelllinie Aufbereitung Temp Zeit % Positiv
    Dritter Assay
    1 HeLa 1 65° C 2 Stunden 30%
    2 HeLa 2 90° C 15 Minuten 40%
    5 HeLa 5 90°C 15 Minuten 85%
    6 SiHa 1 65°C 2 Stunden 75%
    7 SiHa 2 90°C 15 Minuten 70%
    10 SiHa 5 90°C 15 Minuten 90%
    11 MS715 1 65°C 2 Stunden 15%
    12 MS715 2 90°C 15 Minuten 30%
    13 MS715 5 90°C 15 Minuten 30%
    Tabelle 11
    HPV-Genotypisierungsassay and 46 U Proteinase K
    Bearbeitung Zelllinie Aufbereitung Temp Zeit % Positiv
    Vierter Assay
    1 HeLa 1 65°C 2 Stunden 30%
    2 HeLa 2 90°C 15 Minuten 40%
    5 HeLa 5 90°C 15 Minuten 85%
    6 SiHa 1 65°C 2 Stunden 75%
    7 SiHa 2 90°C 15 Minuten 70%
    10 SiHa 5 90°C 15 Minuten 90%
    11 MS715 1 65°C 2 Stunden 15%
    12 MS715 2 90°C 15 Minuten 30%
    13 MS715 5 90°C 15 Minuten 30%
  • Diese Daten zeigen, dass zytologische Proben in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel mit der Kombination eines Formaldehydfängers, Proteinase K und bei erhöhter Temperatur für einen kurzen Zeitraum bearbeitet werden können, um eine wesentlich konstante Rückgewinnung von RNA zu erzielen. Diese Daten zeigen zudem Formulierungen, die Proteinase K enthalten, die bei hohen Temperaturen nützlich sind, von denen bekannt ist, dass sie Proteinase K denaturieren und inaktivieren und von denen zudem bekannt ist, dass sie RNA zerstören und dennoch im Vergleich zur Rückgewinnung bei niedrigeren Temperaturen eine überlegene Nukleinsäurerückgewinnung liefern. Diese Daten zeigen außerdem, dass Formulierungen, die eine Rückgewinnung von Nukleinsäuren aus einer Formalin enthaltenden Lösung ermöglichen, eine reduzierte Proteasekonzentration verwenden.
  • Beispiel 8
  • Prozentsatz der RNA-Rückgewinnung aus einer Probe nach 7-tägiger SurePath-Bearbeitung Treatment
  • Der folgende Assay wurde durchgeführt, um den Prozentsatz der RNA-Rückgewinnung aus Proben zu bestimmen, die 7 Tage lang mit einem SurePath®-Reagenz bearbeitet worden waren, wobei die Proben 15 Minuten lang bei einer Reihe hoher Temperaturen mit Proteinase K bearbeitet wurden. Die Proben wurden wesentlich wie in Beispiel 7 beschrieben präpariert. Kurz gesagt, HeLa-Zelllinien (HPV-18 +) und SiHa-Zelllinien (HPV-16 +) wurden 7 Tage bei 25° C in Surepath® inkubiert. Nach 7 Tagen wurde eine Aliquote von jeder SurePath® -Zellenprobe mit der Aufbereitung 3 verbunden, wie dies auf der obigen Tabelle 6 ersichtlich ist. Die verbundenen Lösungen wurden dann bei verschiedenen Temperaturen 15 Minuten lang inkubiert und dann unter Verwendung eines APTIMA HPV-Assays, wie auf Tabelle 12 angezeigt, geprüft. Tabelle 12
    Temperatur % Positive HeLa @ 3 Zellen/Reaktion % Positive SiHa @ 10 Zellen/Reaktion
    85 °C 88% 95%
    90 °C 85% 93%
    95 °C 98% 95%
  • Der folgende Assay wurde durchgeführt, um den Prozentsatz der RNA-Rückgewinnung aus Proben zu bestimmen, die 7 Tage lang mit einem SurePath®-Reagenz bearbeitet worden waren, wobei die Proben für eine Reihe kurzer Inkubationszeiten bei 90°C mit Proteinase K bearbeitet wurden. Die Proben wurden wesentlich wie in Beispiel 7 beschrieben präpariert. Kurz gesagt, HeLa-Zelllinien (HPV-18 +) und SiHa-Zelllinien (HPV-16 +) wurden 7 Tage bei 25 °C in Surepath® inkubiert. Nach 7 Tagen wurde eine Aliquote von jeder SurePath® -Zellenprobe mit der Aufbereitung 3 verbunden, wie dies auf der obigen Tabelle 6 ersichtlich ist. Die verbundenen Lösungen wurden dann bei 90°C mehrere Minuten lang inkubiert und dann unter Verwendung eines APTIMA HPV-Assays, wie auf Tabelle 13 angezeigt, geprüft. Tabelle 13
    Zeit % Positive HeLa @ 3 Zellen/Reaktion % Positive SiHa @ 10 Zellen/Reaktion
    13 Minuten 80% 93%
    15 Minuten 85% 93%
    17 Minuten 93% 90%
    20 Minuten 95% 95%
  • Der folgende Assay wurde durchgeführt, um den Prozentsatz der RNA-Rückgewinnung aus Proben zu bestimmen, die 7 Tage lang mit einem SurePath®-Reagenz bearbeitet worden waren, wobei die Proben für eine Inkubationszeit von 15 Minuten bei 90°C mit einer Reihe von Proteinase-Konzentrationen bearbeitet wurden. Die Proben wurden wesentlich wie in Beispiel 7 beschrieben präpariert. Kurz gesagt, HeLa-Zelllinien (HPV-18 +) und SiHa-Zelllinien (HPV-16 +) wurden 7 Tage bei 2° C in Surepath® inkubiert. Nach 7 Tagen wurde eine Aliquote von jeder SurePath® -Zellenprobe mit der Aufbereitung 3 verbunden, wie dies auf der obigen Tabelle 6 oben ersichtlich ist, mit der Ausnahme, dass die auf Tabelle 14 aufgeführten Proteinase-K-Konzentrationen .... Die verbundenen Lösungen wurden dann bei 90°C für 15 Minuten inkubiert und dann unter Verwendung eines APTIMA HPV-Nachweisassays, wie auf Tabelle 14 angezeigt, geprüft. Tabelle 14
    U Proteinase K % Positive HeLa @ 3 Zellen/Reaktion % Positive SiHa @ 10 Zellen/Reaktion
    39.6 U 83% 90%
    43.0 U 83% 93%
    46.4 U 85% 90%
  • Der folgende Assay wurde durchgeführt, um den Prozentsatz der RNA-Rückgewinnung aus Proben zu bestimmen, die 7 Tage lang mit einem SurePath®-Reagenz bearbeitet worden waren, wobei die Proben für 15 Minuten bei 90°C mit einer Reihe von 2-Imidazolidon-Konzentrationen bearbeitet wurden. Die Proben wurden wesentlich wie in Beispiel 7 beschrieben präpariert. Kurz gesagt, HeLa-Zelllinien (HPV-18 +) und SiHa-Zelllinien (HPV-16 +) wurden 7 Tage bei 25 °C in Surepath® inkubiert. Nach 7 Tagen wurde eine Aliquote von jeder SurePath® -Zellenprobe mit der Aufbereitung 3 verbunden, wie dies auf Tabelle 6 ersichtlich ist. Die verbundenen Lösungen wurden dann 15 Minuten lang bei 90°C inkubiert und dann unter Verwendung eines APTIMA HPV-Assays, wie auf Tabelle 15 angezeigt, geprüft. Tabelle 15
    mM 2-Imidazolidon % Positive HeLa @ 3 Zellen/Reaktion % Positive SiHa @ 10 Zellen/Reaktion
    26.6 mM 78% 95%
    47.9 mM 80% 93%
    53.2 mM 83% 93%
    58.6 mM 75% 90%
    106.5 mM 75% 90%

    Die Anzahl der Replikate für alle Assays betrug 40.
  • Beispiel 9
  • Arbeitsablauf einschließlich der Inkorporierung der Bearbeitung von zytologischen Proben, die in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel konserviert wurden
  • Beispiel 9 beschreibt einen typischen Ablauf für die Bearbeitung klinischer Proben. Eine klinische zytologische Probe, die durch einen Abstrich genommen wurde, wird in ein Röhrchen gegeben, das ein flüssiges, Formaldehyd enthaltendes Konservierungsmittel enthält, wonach das Röhrchen mit einem Deckel sicher verschlossen wird. Hierfür kann flüssiges SUREPATH-Konservierungsmittel für zytologische Proben als flüssiges Konservierungsmittel verwendet werden. Im flüssigen Inhalt des Röhrchens dispergiertes Zellenmaterial wird dann zwecks Testens, einschließlich molekularer Analyse von Nukleinsäure, zu einem klinischen Labor gebracht. Im klinischen Labor wird eine Aliquote des Röhrchens mit einer Aliquote eines Verdünnungsmittels, wie z.B. eine gepufferten Detergenslösung, gemischt. Ein Beispiel für ein bevorzugtes Verdünnungsmittel ist eine phosphatgepufferte Detergenslösung. Das bei dieser Applikation verwendete Detergens ist bevorzugt ein anionisches Detergens, wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Lithiumlaurylsulfat (LLS). Diese Mischung wird dann mit 2-Imidazolidon und einer Protease verbunden. Bei der hierfür verwendeten Protease kann es sich um das Proteinase-K-Enzym handeln. Bei einem vereinfachten Vorgehen wird lyophilisierte Proteinase K in einer Lösung rekonstituiert, die einen pH-Puffer, EDTA und 2-Imidazolidon enthält. Der pH-Puffer kann ein Tris-Puffe sein und die rekonstituierte Enzymlösung kann einen pH von ungefähr 8,0 haben. Die endgültige Mischung, welche die verdünnte klinische Probe, das 2-Imidazolidon und das Proteaseenzym enthält, wird dann für zwischen 5 Minuten und 30 Minuten auf eine erhöhte Temperatur erwärmt. Die Mischung wird bevorzugt für ungefähr 15 Minuten bis auf ungefähr 90°C erwärmt. Die Nukleinsäure in der Probe ist somit zur Purifikation geeignet und wird als Template bei einer Amplifikationsreaktion in vitro verwendet. So wird RNA z.B. durch Erfassung auf eine solide Stütze purifiziert, z.B. durch Verwendung sequenzspezifischer Hybridisierung auf einen immobilisierten Nukleinsäurestrang und dann in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion amplifiziert. Bei der Nukleinsäureamplifikationsreaktion kann es sich um eine Transkription-vermittelte Amplifikationsreaktion (TMA) handeln. Amplifikationsprodukte werden einer sequenzspezifischen Hybridisierungssonde kontaktiert, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer bestimmten Zielsequenz nachzuweisen. Bei der bestimmten Zielsequenz kann es sich um eine HPV-Zielsequenz handeln. Der Ablauf wird auf gezeigt.
  • Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf eine Reihe spezifischer Beispiele und Ausführungen dieser beschrieben. Für Fachleute in diesem Bereich werden sich nach Prüfung der vorhergehenden, detaillierten Beschreibung natürlich eine Reihe unterschiedlicher Ausführungen der vorliegenden Erfindung anbieten. Der eigentliche Umfang der vorliegenden Erfindung wird daher durch Bezugnahme auf die anhängenden Ansprüche bestimmt. Wenn aus dem Zusammenhang nicht anderweitig ersichtlich, dann kann jede Ausführung, jeder Aspekt, jeder Schritt oder jede Eigenschaft der Erfindung mit einer/einem beliebigen anderen verwendet werden.

Claims (35)

  1. Ein Verfahren zur Bearbeitung einer Probe, die eine klinische, zytologische Probe in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel enthält, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht: (a) Verbinden der Proben mit einem Proteaseenzym und einem Formaldehydfänger zur Erzeugung einer Reaktionsmischung; (b) Inkubieren der Reaktionsmischung bei einer erhöhten Temperatur für einen Zeitraum, der zur Umkehrung der chemischen Modifikationen von Nukleinsäure ausreicht, die in der zytologischen Probe durch Formaldehyd im flüssigen Konservierungsmittel eingebunden sein kann, wobei die Nukleinsäuren RNA enthalten, die Temperatur des Inkubationsschrittes 85-100 °C beträgt und der Schritt der Inkubation nicht mehr als 30 Minuten andauert; (c) Isolieren einer Nukleinsäure aus der Reaktionsmischung nach dem Inkubationsschritt, wobei die isolierte Nukleinsäure RNA ist; und (d) Durchführen einer Amplifikationsreaktion in vitro unter Verwendung der Nukleinsäure von den Isolierschritten als Templates.
  2. Das Verfahren entsprechend Anspruch 1, bei dem der Formaldehydfänger 2-Imidazolidon ist.
  3. Das Verfahren entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei die Umkehrung Nukleinsäure in der Probe freisetzt, deren Vernetzung mit Polypeptiden in der Probe durch Formaldehyd induziert worden war.
  4. Das Verfahren entsprechend Anspruch 2 oder 3, wobei die Protease die Nukleinsäure aus der Formaldehyd-induzierten Vernetzung freisetzt und 2-Imidazolidon die Induktion neuer Vernetzungen zwischen Nukleinsäure und Polypeptiden in der Probe hemmt.
  5. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zytologische Probe vor Durchführung von Schritt (a) sich 7-120 Tage im flüssigen Konservierungsmittel befand.
  6. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt der Inkubation zwischen ungefähr 5 und 30 Minuten andauert.
  7. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt der Inkubation nicht mehr als 15 Minuten andauert.
  8. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ertrag der amplifizierten Nukleinsäure nach Schritt (d) höher als bei den Kontrollamplifikationen ist, bei denen entweder die Proteinase oder 2-Imidazolidon weggelassen wird.
  9. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ertrag der amplifizierten Nukleinsäure nach Schritt (d) ungefähr 10 % höher als jede der Kontrollamplifikationen ist, bei denen entweder die Proteinase oder 2-Imidazolidon weggelassen wird.
  10. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens 90 % der Nukleinsäuremoleküle in der Probe nach dem Schritt der Inkubation frei von Vernetzungen sind.
  11. Das Verfahren entsprechend einer der Ansprüche 2-10, wobei die endgültige Konzentration von 2-Imidazolidon vor der Inkubation das 1-fache bis 5-fache in Mol der endgültigen Maximalkonzentration des Formaldehyds ausmacht.
  12. Das Verfahren entsprechend Anspruch 11, wobei die endgültige Konzentration von 2-Imidazolidon vor der Inkubation das 2-fache bis 5-fache in Mol der endgültigen Maximalkonzentration des Formaldehyds ausmacht.
  13. Das Verfahren entsprechend Anspruch 11 oder 12, wobei die Proteinase Proteinase-K und in einer Konzentration von 4,3 bis 43 U/ml vorhanden ist.
  14. Das Verfahren entsprechend Anspruch 1, wobei die Temperatur des Inkubationsschritts 85-95 °C beträgt.
  15. Das Verfahren entsprechend Anspruch 14, wobei die Temperatur des Inkubationsschritts 91-95 °C beträgt.
  16. Das Verfahren entsprechend Anspruch 1, wobei die Temperatur ungefähr 90 °C beträgt.
  17. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proteinase und der Formaldehydfänger gleichzeitig mit der Probe verbunden werden.
  18. Das Verfahren entsprechend einem der Ansprüche 1-16, wobei die Proteinase vor dem Formaldehydfänger mit der Probe verbunden wird.
  19. Das Verfahren entsprechend Anspruch 1, wobei der Formaldehydfänger vor der Proteinase mit der Probe verbunden wird.
  20. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Amplifikation eine Transkription-vermittelte Amplifikation, Einzelprimer-Nukleinsäureamplifikation, sequenzbasierte Nukleinsäureamplifikation, Polymerasekettenreaktion, Strangverdrängungsamplifikation, Self-sustained Sequence Replication oder DNA-Ligase-Kettenreaktion ist.
  21. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure durch einen Capture-Assay isoliert wird, wobei eine Capture-Sonde zur zu isolierenden Nukleinsäure und zu einer immobilisierten Sonde hybridisiert.
  22. Das Verfahren entsprechend Anspruch 21, wobei die immobilisierte Sonde an einer magnetischen Kugel immobilisiert wird.
  23. Das Verfahren entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Assaypositivität amplifizierter Nukleinsäure nach Schritt (d) höher als die Assaypositivität der amplifizierten Nukleinsäuren ist, die aus der Reaktionsmischung erhalten werden, bei der entweder Proteinase oder der Formaldehydfänger weggelassen werden.
  24. Das Verfahren entsprechend Anspruch 23, wobei die Assaypositivität der amplifizierten Nukleinsäure nach Schritt (d) mindestens ungefähr 12 % höher ist als die Assaypositivität der amplifizierten Nukleinsäuren ist, die aus der Reaktionsmischung erhalten werden, bei der entweder Proteinase oder 2-Imidazolidon weggelassen werden.
  25. Das Verfahren entsprechend Anspruch 23, wobei die Assaypositivität der amplifizierten Nukleinsäure nach Schritt (d) nach 21 Tagen ungefähr 95 % beträgt.
  26. Das Verfahren entsprechend Anspruch 1, wobei die isolierte Nukleinsäure humane Papillomavirus-(HPV)-RNA-Zielnukleinsäure ist.
  27. Das Verfahren entsprechend Anspruch 26, wobei die Probe eine Zervixzellenprobe ist.
  28. Eine Zusammensetzung bestehend aus: (a) 2-Imidazolidon (b) Proteinase K (c) EDTA (d) einem pH-Puffer
  29. Ein Kit zur Bearbeitung einer zytologischen Probe, die in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel konserviert wurde, wobei das Kit aus Folgenden besteht: (a) einem ersten Fläschchen mit einem lyophilisierten Proteinase-K-Enzym, (b) einem zweiten Fläschchen mit einem Rekonstitutionspuffer zur Rekonstitution des lyophilisierten Proteinase-K-Enzyms, wobei der Rekonstitutionpuffer eine Menge eines pH-Puffers, eine Menge EDTA und eine Menge 2-Imidazolidon enthält.
  30. Ein System zur Bearbeitung RNA enthaltender, zytologischer Proben, die in einem flüssigen, Formaldehyd enthaltenden Konservierungsmittel konserviert wurden, wobei das System zur Isolierung von RNA eingerichtet ist und folgende Komponenten umfasst: eine programmierbare Steuerung; eine Pipettiervorrichtung in Kommunikation mit der programmierbaren Steuerung; eine erste Halterung für ein Reaktionsfläschchen; eine zweite Halterung für ein Reaktionsfläschchen und ein Heizelement, wobei die programmierbare Steuerung durch Softwareanweisungen so konfiguriert wird, dass sie verursacht, dass die Pipettiervorrichtung eine Aliquote der Flüssigkeit aus dem Reagenzglas in das Reaktionsfläschchen überträgt, wenn das Reaktionsfläschchen eine Lösung enthält, die einen Formaldehydfänger, Proteinase K, EDTA und einen pH-Puffer enthält, und wobei die programmierbare Steuerung durch Softwareanweisungen so konfiguriert ist, dass sie veranlasst, dass das Heizelement das Erwärmen des Reaktionsfläschchens auf eine Temperatur von ungefähr 85 °C bis 95 °C für eine Dauer von nicht mehr als 30 Minuten bewirkt.
  31. Das System entsprechend Anspruch 30, wobei das Reagenz im Reaktionsfläschchen 2-Imidazolidon als Formaldehydfänger enthält.
  32. Das System entsprechend Anspruch 31, wobei das Reagenz im Reaktionsfläschchen eine Konzentration von 42 bis 45 U Proteinase K enthält.
  33. Das System entsprechend Anspruch 30, wobei die programmierbare Steuerung durch Softwareanweisungen so konfiguriert ist, dass sie veranlasst, dass das Heizelement das Erwärmen des Reaktionsfläschchens auf eine Temperatur von ungefähr 90 °C bis 95 °C bewirkt.
  34. Das System entsprechend Anspruch 33, wobei die programmierbare Steuerung durch Softwareanweisungen so konfiguriert ist, dass sie veranlasst, dass das Heizelement das Erwärmen des Reaktionsfläschchens auf eine Temperatur von ungefähr 90 °C bis 95 °C für einen Zeitraum von 15 Minuten bis 30 Minuten bewirkt.
  35. Das System entsprechend Anspruch 34, wobei das Reagenz im Reaktionsfläschchen eine Konzentration von 42 bis 45 U Proteinase K enthält.
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