[0001] Stabilisierung von Nukleinsäuren in Zellmaterial-haltigen biologischen Proben
[0002] Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Puffers zur Stabilisierung von Zellmaterial-haltigen biologischen Proben unter Erhalt der Zellmorphologie des Zellmaterials sowie ein Verfahren zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in Zellmaterial-haltigen biologischen Proben unter Erhalt der Zellmorphologie des Zellmaterials.
[0003] Die Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Proben spielt eine immer größere Rolle in der biologischen, medizinischen und pharmakologischen Forschung und Diagnostik, da durch die Untersuchung der Nukleinsäuren einer Zelle ihre genetische Herkunft und funktionelle Aktivität bestimmt werden kann. Die Untersuchung der Ribonukleinsäuren (RNA), insbesondere der sog. messenger RNA (mRNA) einer Zelle erlaubt eine direkte Bestimmung der Genaktivität dieser Zelle mittels einer Genexpressionsanalyse, welche einen direkten Einblick in die Aktivität der Zelle zum Zeitpunkt der Entnahme liefern kann, da insbesondere von den Genen, die zu diesem Zeitpunkt transkribiert werden, mRNAs in der Zelle vorliegen. Eine quantitative Analyse der mRNA einer Zelle mittels moderner molekularbiologischer Methoden wie der quantitativen bzw. Echtzeit- Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR bzw. real-time RT- PCR) oder Genexpressions-Chip-Analysen ermöglicht beispielsweise die Erkennung exprimierter Gene zur Erkennung von Infektionen, Stoffwechselkrankheiten oder Krebs. Die Analyse der Desoxyribonukleinsäuren (DNA) einer Zelle mittels molekularbiologischer Methoden wie PCR oder Sequenzierung ermöglicht die Bestimmung genetischer Marker und den Nachweis genetischer Defekte. Die Analyse genomischer RNA und DNA kann darüber hinaus auch zum direkten Nachweis infektiöser Erreger wie Viren, Bakterien etc. eingesetzt werden.
[0004] Eine unabdingbare Voraussetzung für derartige Techniken der Nukleinsäureanalytik ist die sofortige Stabilisierung der Nukleinsäuren unmittelbar nach der Entnahme einer biologischen Probe aus ihrer natürlichen Umgebung. Dies gilt insbesondere für RNA, die bereits unmittelbar nach der Entnahme der
biologischen Probe aus ihrer Umgebung durch die ubiquitär vorkommenden sehr stabilen Ribonukleasen (RNasen) abgebaut werden kann. Da RNasen sehr aktive Enzyme sind, die im Gegensatz zu DNasen keine Cofaktoren benötigen, genügen selbst kleinste Mengen dieser Enzyme, um einen Großteil der in einer Probe enthaltenen RNA binnen kürzester Zeit abzubauen.
[0005] Des Weiteren unterliegt das Expressionsmuster einer Zelle einem schnellen turn-over, damit die Zelle auf eine Änderung der äußeren Umstände reagieren kann. Das Expressionsmuster kann sich direkt nach der Gewinnung der Probe rapide verändern. Durch ein Absinken der Temperatur, die Änderung des Gas-Gleichgewichts und die Verdünnung der Probe durch Antikoagulantien, welche die Gerinnung der Probe verhindern sollen, verändert sich vor allem bei Blutproben bspw. durch die Induktion von Streßgenen das Expressionsmuster der einzelnen Zellen unmittelbar nach der Entnahme. Nur wenn es gelingt, die ex vivo Geninduktion zu unterbinden, kann in einer aus ihrer natürlichen Umgebung entnommenen Probe das in vivo Transkriptionsprofil konserviert und analysiert werden. Insbesondere bei medizinischen Proben, die vielfach an einem Ort, bspw. in einer Arztpraxis entnommen werden und erst nach längerer Lagerung und Transport in einem Labor analysiert werden, ist daher eine Stabilisierung der Nukleinsäuren von immenser Bedeutung.
[0006] Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Ansätze zur Stabilisierung von Nukleinsäuren bekannt. Die Stabilisierung von RNA in Gewebe wird z.B. durch Ammoniumsulfat erreicht, welches schnell in die Zellen diffundieren kann und dort durch die Denaturierung zellulärer Proteine die Transkription und den Abbau von RNA durch RNasen vermindert (sogenannte RNAIater- Technologie). Allerdings lässt sich dieses Prinzip nicht auf Vollblut anwenden, welches eine der wichtigsten Proben darstellt, da Vollblutproben einen hohen Proteinanteil enthalten, welcher ein unlösliches Präzipitat mit dem Reagenz bildet. Eine weitere verbreitete Methode zur Stabilisierung von RNA aus Gewebeproben ist die Verwendung von Guanidiniumthiocyanat und ß-Mercaptoethanol, welches die Zellen lysiert und die darin enthaltenen Proteine denaturiert (D. Gillespie et al. Nucleic Acids Research, 1992, 20 (20), 5492).
[0007] Verfahren zur Stabilisierung von RNA in Blut, das neben einem großen Anteil an DNA und Proteinen insbesondere diverse intra- und extrazelluläre RNasen enthält, beruhen zurzeit auf der Lyse der Zellen und einer anschließenden Denaturierung der RNasen (US 06602718 B1 , US 06617170 B1 und US 6821789). Ein erheblicher Nachteil dieser Verfahren ist jedoch speziell beim Blut, dass durch die Lyse der Zellen die RNA verschiedener Zelltypen vermischt wird und so ein großer Hintergrund von unerwünschter RNA anschließend die Untersuchung der gewünschten RNA erschwert. Im Fall von Blut ist das im speziellen die hohe Menge an mRNA, die Hämoglobin codiert und aus den Erythrozyten stammt, die etwa 1000mal häufiger vorhanden sind als die Leukozyten.
[0008] Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand folglich darin, einen Puffer zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in Zellmaterial-haltigen biologischen Proben unter Erhalt der Zellmorphologie bereitzustellen, um eine anschließende Zellseparation zu ermöglichen, die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren zu stabilisieren, um den molekularen„Istzustand" zum Zeitpunkt der Probenentnahme möglichst zu erhalten und auch den Anteil von unerwünschten
Nukleinsäuren, inbesondere unerwünschter RNA, in der nach der anschließenden Lyse der Zellen zu untersuchenden Probe drastisch zu reduzieren.
[0009] Überraschenderweise wurde gefunden, dass ein wässriges System umfassend eine oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-(/V-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), 1 ,2-Dimethoxyethan, Natrium- salicylat, Hexaammoniumheptamolybdat, Glucosaminhydrochlorid, Indol, 2-(4- Hydroxyphenyl)ethanol und Tetrahexylammoniumchlorid, Nukleinsäuren in Zellmaterial-haltigen biologischen Proben unter Erhalt der Zellmorphologie des Zellmaterials stabilisiert. Gemäß der Erfindung kann als„wässriges System" hierfür jede auf Wasser basierende Lösung oder jeder Puffer verwendet werden, die/der geeignet ist, um Zellmaterial-haltige Proben zu suspendieren oder Teile daraus zu lösen, ohne Bestandteile der Probe zu denaturieren, solange die Lösung / der Puffer wenigstens eine der genannten Substanzen enthält. Das erfindungs-
gemäße wässrige System ist in der Lage, sowohl intra- als auch extrazelluläre Nukleinsäuren in Gegenwart von Zellmaterial zu stabilisieren. Die erfindungsgemäßen Lösungen/Puffer eignen sich weiterhin auch zur Stabilisierung von
Nukleinsäuren in Gegenwart von freien (extrazellulären) Nukleasen (DNasen und RNasen).
[0010] Bevorzugt umfasst das wässrige System MOPS oder eine Mischung von MOPS und mindestens einer weiteren Substanz, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend 1 ,2-Dimethoxyethan, Natriumsalicylat, Hexaammoniumheptamolybdat, Glucosaminhydrochlorid, Indol, 2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol und Tetrahexylammo- niumchlorid umfasst. Besonders bevorzugt umfasst das wässrige System MOPS oder eine Mischung von MOPS mit Natriumsalicylat und/oder Glucosaminhydrochlorid.
[0011] Die Konzentration der zur Stabilisierung verwendeten Substanz ist abhängig von der verwendeten Substanz. Die Konzentration von 3-(/V- Morpholino)propansulfonsäure in dem erfindungsgemäßen wässrigen System beträgt bevorzugt 1 bis 1000 mmol/l, besonders bevorzugt 25 bis 500 mmol/l, weiterhin bevorzugt 100 bis 300 mmol/l und insbesondere 200 mmol/l.
[0012] Enthält der Puffer Natriumsalicylat, so beträgt die Konzentration des
Natriumsalicylats in dem Puffer bevorzugt 1 - 1000 mg/ml, besonders bevorzugt 25 bis 500 mg/ml, weiterhin bevorzugt 200 bis 300 mg/ml und insbesondere 250 mg/ml. Enthält der Puffer Hexaammoniumheptamolybdat, so beträgt die Konzentration des Hexaammoniumheptamolybdats in dem Puffer bevorzugt 1 bis 300 mg/ml, besonders bevorzugt 50 bis 250 mg/ml, weiterhin bevorzugt 100 bis 200 mg/ml und insbesondere 150 mg/ml. Enthält der Puffer Glucosaminhydrochlorid, so beträgt die Konzentration des Glucosaminhydrochlonds bevorzugt 1 bis 300 mg/ml, besonders bevorzugt 25 bis 200 mg/ml, weiterhin bevorzugt 50 bis 150 mg/ml und insbesondere 100 mg/ml. Enthält der Puffer Indol, so beträgt die Konzentration des Indols bevorzugt 1 bis 300 mg/ml, besonders bevorzugt 25 bis 200 mg/ml, weiterhin bevorzugt 50 bis 150 mg/ml und insbesondere 100 mg/ml.
Enthält der Puffer 2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol, so beträgt die Konzentration des Indols bevorzugt 1 bis 300 mg/ml, besonders bevorzugt 25 bis 200 mg/ml, weiterhin bevorzugt 50 bis 150 mg/ml und insbesondere 100 mg/ml. Enthält der Puffer Tetrahexylammoniumchlorid, so beträgt die Konzentration des Indols bevorzugt 0.1 bis 50 mg/ml, besonders bevorzugt 0.5 bis 25 mg/ml, weiterhin bevorzugt 1 bis 10 mg/ml und insbesondere 5 mg/ml. Enthält der Puffer 1 ,2-Dimethoxyethan, so beträgt der Anteil des 1 ,2-Dimethoxyethans in dem Puffer bevorzugt 1 bis 20 vol% (Volumenprozent), bevorzugt 5 bis 15 vol% und insbesondere 10 vol%, entsprechend einer Konzentration des 1 ,2-Dimethoxyethans von bevorzugt 8.7 bis 174 mg/ml, besonders bevorzugt 43.5 bis 130.5 mg/ml und insbesondere 87 mg/ml. Die in diesem Absatz genannten Substanzen liegen in dem wässrigen System bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 3000 mg/ml, weiterhin bevorzugt 25 bis 2000 mg/ml, besonders bevorzugt 50 bis 1500 mg/ml und insbesondere 400 bis 850 mg/ml, bezogen auf die Gesamtkonzentration, vor.
[0013] Die erfindungsgemäße Lösung / der erfindungsgemäße Puffer kann darüber hinaus eine oder mehrere weitere Substanzen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend pH-Wert-Regulatoren wie Säuren oder Basen, Antikoagulantien und organische Lösungsmittel, umfassen. Beispielsweise kann der Puffer schwach basische Salze wie Natriumacetat, bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 200 mmol/l, besonders bevorzugt 25 bis 75 mmol/l enthalten. Geeignete Antikoagulantien sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Chelatbildner wie Heparin, Zitronensäure, Ethylendiamin-/V,/V,/V',/V -tetra- essigsäure (EDTA) und 1 ,2-Bis-(2-aminophenoxy)ethan-/V,/V,/\/',/\/ -tetraessigsäure (BAPTA) in Form der Säure, eines Alkalimetallsalzes oder Esters, die in der Lage sind, zweiwertige Metallionen wie Calciumionen zu komplexieren. Die Konzentration solcher Chelatbildner in dem erfindungsgemäßen Puffer beträgt bevorzugt 2 bis 100 mmol/l, besonders bevorzugt 2 bis 50 mmol/l und insbesondere 5 bis 15 mmol/l. Der erfindungsgemäße Puffer kann weiterhin organische Lösungsmittel wie beispielsweise DMSO enthalten, bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 250 mmol/l, besonders bevorzugt von 50 bis 200 mmol/l.
[0014] Der pH-Wert des erfindungsgemäßen wässrigen Systems beträgt bevorzugt 3 bis 7, weiter bevorzugt 3.5 bis 6.5, besonders bevorzugt 4 bis 6 und insbesondere 4.5 bis 5.5.
[0015] Als Zellmaterial-haltige biologische Probe wird im Sinne der Erfindung jede Probe bezeichnet, die Zellen enthält. Die Proben können beispielsweise aus tierischen oder pflanzlichen Geweben, Gewebe- oder Zellkulturen, Knochenmark, humanen und tierischen Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Sperma, Zerebrospinalflüssigkeit, Sputum und Abstrichen, Pflanzen, Pflanzenteilen und -extrakten, z. B. Säften, Pilzen, prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefen, fossilen oder mumifizierten Proben, Bodenproben, Klärschlamm, Abwässern und Lebensmitteln gewonnen werden. Bevorzugt umfasst die biologische Probe Blut, besonders bevorzugt Vollblut.
[0016] Der Begriff Nukleinsäuren bezeichnet im Sinne der Erfindung sowohl Ribonukleinsäuren (RNA) als auch Desoxyribonucleinsäuren (DNA). Die Abkürzungen RNA und DNA bezeichnen im Sinne der Erfindung sowohl ein einzelnes Nukleinsäuremolekül (eine Nukleinsäure) als auch eine Vielzahl von Nukleinsäuren. Bevorzugte Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind sämtliche Ribonukleinsäuren, insbesondere Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA), heterogene Kern-RNA (hnRNA), sog. small nuclear RNA (snRNA), sog. small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA (miRNA) und sog. anti- sense RNA.
[0017] Das erfindungsgemäße wässrige System ist in der Lage, Nukleinsäuren, insbesondere die instabile RNA in einer Probe mindestens 24 h bei Raumtemperatur, bevorzugt mindestens drei Tage bei Raumtemperatur zu stabilisieren. Der Begriff Raumtemperatur umfasst im Sinne der Erfindung bevorzugt Temperaturen von 22 ± 3 °C. Die Lagerfähigkeit der stabilisierten Probe bei Temperaturen unterhalb von 20 °C, beispielsweise bei 2 bis 8 °C ist entsprechend höher.
[0018] Im Sinne der Erfindung wird eine Probe als stabilisiert bezeichnet, wenn die Integrität der enthaltenen Nukleinsäuren nach Lagerung bei einer
gegebenen Temperatur für die angegebene Zeit höher ist, als die Integrität der Nukleinsäuren in einer (unstabilisierten) Vergleichsprobe, die aus derselben Quelle stammt und unter identischen Bedingungen, jedoch ohne Zusatz eines Stabilisierungspuffers, entnommen und gelagert wurde. Bevorzugt beträgt die Integrität der Nukleinsäuren in einer Probe, die im Sinne der Erfindung als stabilisiert bezeichnet wird, nach dreitägiger Lagerung (t = 72 h) bei Raumtemperatur mindestens 60% der Integrität der Nukleinsäuren zum Zeitpunkt des Versetzens mit dem erfindungsgemäßen Puffer (t = 0 h), besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere mindestens 95%. Verfahren zur Bestimmung der Integrität von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt. Im Falle von RNA beziehen sich die genannten prozentualen Werte auf die RNA Integritätsnummer (RIN), auf deren Bestimmung später näher eingegangen wird.
[0019] Die erfindungsgemäßen Puffer/Lösungen sind des Weiteren in der Lage, die ex vivo Genexpression in den stabilisierten Proben im Vergleich zu unstabilisierten Proben zu minimieren und so das in vivo Transkriptionsprofil zu konservieren. Somit kann der Zustand der Zellen zum Zeitpunkt der Probenentnahme weitgehend erhalten bleiben und trotz Lagerung zu einem späteren Zeitpunkt untersucht werden. Da Zellen außerhalb ihrer natürlichen Umgebung insbesondere das Expressionsmuster (und somit die Transscription) deutlich ändern können, bietet diese Stabilisierung der Nukleinsäuren und die Unterdrückung der ex vivo Genexpression die Möglichkeit der Lagerung entnommener Proben.
[0020] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in Zellmaterial-haltigen biologischen Proben unter Erhalt der Zellmorphologie des Zellmaterials, um Proben für wenigstens eines der nachfolgenden Verfahren zur Untersuchung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren bereitzustellen, ohne hierauf beschränkt zu sein: PCR, RT-PCR, elektro- phoretische Methoden, Mikroarrayanalysen, Markierung, Isolierung und/oder Detektion der Nukleinsäuren, umfassend das Versetzen der biologischen Probe mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuren-stabilisierenden wässrigen System.
[0021] Je schneller die Probe nach Entnahme aus ihrer natürlichen Umgebung mit dem erfindungsgemäßen wässrigen System versetzt wird, desto geringer ist das Ausmaß des Abbaus der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren und der ex vivo Geninduktion oder -repression. Bevorzugt wird die Probe unmittelbar nach Entnahme aus ihrer natürlichen Umgebung mit dem erfindungsgemäßen Puffer versetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe unmittelbar nach Entnahme aus ihrer natürlichen Umgebung in ein Gefäß, enthaltend das erfindungsgemäße wässrige System, überführt. Das verwendete Volumen des Puffers/ der Lösung ist hierbei von der Probe abhängig. Zur Stabilisierung von Vollblutproben wird die Probe mit einem Volumen des Puffers / der Lösung versetzt, das bevorzugt das 1 .5- bis 1 (Mache, besonders bevorzugt das 2- bis 5-fache des Volumens der Vollblutprobe beträgt.
[0022] Die in dem erfindungsgemäßen wässrigen System stabilisierten Nukleinsäuren können im Anschluss an die Lagerung nach bekannten Methoden markiert, prozessiert, isoliert und detektiert werden. Hierzu wird zunächst das in der Probe enthaltene Zellmaterial lysiert, und die dabei freigesetzten Nukleinsäuren werden mittels einer geeigneten Methode isoliert und gegebenenfalls gereinigt. Die hierzu geeigneten Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Die Lyse des Zellmaterials kann beispielsweise in dem kommerziell erhältlichen QIAzol- Lyse-Reagenz der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) gemäß des QIAzol Handbuches 10/2006 erfolgen. Beispielsweise durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion kann die in der lysierten Probe enthaltene RNA von der DNA und den Proteinen abgetrennt werden und durch anschließende Fällung mit Isopropanol aus der wässrigen Phase ausgefällt werden. Die Reinigung der RNA kann beispielsweise mittels der kommerziell erhältlichen RNeasy-Kits der Firma Qiagen erfolgen, oder auch mit Hilfe jedes anderen geeigneten Reinigungsverfahrens.
[0023] Die erhaltenen Nukleinsäuren können im Anschluss weiter prozessiert werden, bspw. im Falle von RNA mittels RT-PCR-Verfahren revers transkribiert werden und amplifiziert, im Falle von DNA mittels PCR-Verfahren amplifiziert werden und/oder mittels elektrophoretischer Methoden wie Northern Blotting (RNA) oder Southern Blotting (DNA) oder sog. Mikroarrays (Genchip-Analysen) untersucht werden. Der Begriff RT-PCR umfasst im Sinne der Erfindung insbe-
sondere auch sogenannte quantitative RT-PCR-Verfahren (qRT-PCR oder real- time RT-PCR), die eine Quantifizierung der erhaltenen mRNA ermöglichen.
[0024] Die Integrität der erhaltenen RNA wurde mit Hilfe elektrophoretischer Methoden bestimmt. Zum einen wurden klassische Gelelektrophoresen an denaturierenden Agarosegelen vorgenommen. Bei intakter RNA zeigt ein solches Gel nach Anfärben mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Ethidiumbromid oder SYBR Green zwei intensiv fluoreszierende, scharf getrennte Banden, die den ribosomalen RNAs 28 S und 18 S entsprechen, sowie ggf. weitere Banden geringerer Intensität. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität der 28 S rRNA Bande zur 18 S rRNA Bande beträgt bei intakter RNA etwa 2:1 .
[0025] Ferner wurden unter Verwendung des Agilent 2100 Bioanalyzers der Firma Agilent elektrophoretische Untersuchungen der erhaltenen RNA an Mikro- chips vorgenommen. Mit Hilfe eines in die Bioanalyzer-Software implementierten Algorithmus wurde die RNA-Integritätsnummer (RIN) bestimmt, die ein System zur Quantifizierung der RNA-Qualität darstellt, das neben der Intensität der 28 S und der 18 S rRNA-Bande eine Reihe weitere Faktoren berücksichtigt und so eine zuverlässigere Aussage über die Integrität der RNA ermöglicht als dies eine rein visuelle Abschätzung der Intensität auf einem Gel vermag. Auf Basis der ribosomalen Untereinheiten 28 S- zu 18 S rRNA und deren Verhältnis unter Einbeziehung degradierter Abbauprodukte wird von der Software ein RIN-Wert auf einer Skala von 1 bis 10 ermittelt. Der Zahlenwert 1 entspricht hierbei einer vollständig degradierten RNA, während der Zahlenwert 10 einer vollständig intakten RNA entspricht. Aus der so ermittelten Integrität der rRNA wird auf die Integrität der mRNA geschlossen.
[0026] Durch die erfindungsgemäßen Puffer werden darüber hinaus keine qPCR-lnhibitoren während der Aufarbeitung in die Probe eingetragen bzw. in ihr zurückgehalten. Ferner sind die erfindungsgemäßen Puffer geeignet, die ex vivo Geninduktion in den stabilisierten Proben zu minimieren. Dies wurde mittels qRT- PCR-Untersuchungen der RNA, die nach Lagerung der Probe in den erfindungsgemäßen Puffern nach bekannten Methoden isoliert wurde, nachgewiesen. Zur
Quantifizierung der Ergebnisse wurde die dem Fachmann bekannte AACT- Methode verwendet, bei der die Expression der Zielgene (im vorliegenden Fall c-fos und I L-1 ß) mit der eines nicht-regulierten Referenzgens normalisiert wird (im vorliegenden Fall wurde 18 S rRNA verwendet).
[0027] Das erfindungsgemäße Verfahren kann des Weiteren einen Schritt zur immunohistologischen Markierung einzelner Zelltypen in einer Probe, die unterschiedliche Zelltypen enthält, umfassen, die vor einer Untersuchung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren mit den oben genannten Techniken wie PCR, RT-PCR, elektrophoretischen Methoden oder Mikroarray-Analysen durchgeführt wird. Da die Stabilisierungspuffer der vorliegenden Erfindung die Zellmorphologie des Zellmaterials erhalten, ermöglicht die vorliegende Erfindung die immunohisto- logische Markierung, Untersuchung und/oder Separation einzelner Zelltypen, bevor durch anschließende Lyse des Zellmaterials die in den Zellen enthaltenen Nukleinsäuren freigesetzt werden. So können die Zellen beispielsweise auch noch nach einer mehrtägigen Lagerung bei Raumtemperatur mit spezifischen Antikörpern markiert und detektiert werden. Da auf diese Weise spezifisch einzelne gewünschte Zelltypen von der Vielzahl der weiteren in einer biologischen Probe enthaltenen Zelltypen abgetrennt werden können, wird so die nachfolgende Untersuchung der Nukleinsäuren des gewünschten Zelltyps beispielsweise durch Techniken wie PCR, RT-PCR, elektrophoretische Methoden oder Mikroarray-Analysen erheblich vereinfacht.
[0028] Bevorzugt erfolgt die immunohistologische Markierung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die eine UVA/is-spektroskopische Detektion des Antigen-Antikörper-Konjugats ermöglichen.
[0029] In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Verfahren weiterhin einen Schritt zur Selektion und Separation einzelner Zelltypen aus einer Probe, die unterschiedliche Zelltypen enthält, der vor der Untersuchung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren mit Hilfe der oben genannten Verfahren wie PCR, RT- PCR, elektrophoretischen Methoden oder Mikroarray-Analysen durchgeführt wird.
[0030] Das Verfahren ermöglicht beispielsweise die durchflusszytometrische Analyse des stabilisierten Zellmaterials. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie kann innerhalb von sehr kurzer Zeit eine Vielzahl von Zellen auf Einzelzellniveau bezüglich ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften charakterisiert werden. Aus diesem Grund wird diese Technik routinemäßig unter anderem in der Häma- tologie und Immunologie, beispielsweise zur Diagnose und zur Beurteilung des Krankheitsverlaufes bzw. des Therapieerfolges diverser Erkrankungen und Virusinfektionen wie bspw. von Leukämie oder HIV-Infektionen eingesetzt.
[0031] Das Prinzip der Durchflußzytometrie beruht auf der Untersuchung der optischen Eigenschaften der Zellen, die in einer Messeinheit einzeln einen Laserstrahl passieren. Zum einen wird mit Hilfe von Photomultipliern die Lichtstreuung und -brechung untersucht, die eine den Laserstrahl kreuzende Zelle verursacht. Die Menge des gestreuten Lichtes ist abhängig von der Größe der Zelle und ihrer Komplexität. Beispielsweise streuen Granulozyten, die eine raue Oberfläche besitzen, deutlich mehr Licht als T-Lymphozyten, die eine glatte Oberfläche besitzen. Das Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC) korreliert mit dem Volumen der Zelle, während das Seitwärtsstreulicht (sidewards scatter, SSC), gemessen in einem Winkel von 90°, von der Granularität der Zelle, der Struktur und Größe ihres Zellkernes sowie der Menge an Vesikeln in der Zelle abhängt. Anhand dieser Parameter können die Zelltypen des Blutes in Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten unterschieden werden. Des weiteren ermöglicht die Durchflusszytometrie auch die Bestimmung der Zellanzahl in einer Probe und eine Trennung der einzelnen Zelltypen.
[0032] Neben der Streuung kann im Durchflusszytometer aber auch die Emission von Fluoreszenzfarbstoffen detektiert und quantifiziert werden. Bei der fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie, vielfach auch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (fluorescence activated cell sorting, FACS) genannt, werden die Zellen vor der durchflusszytometrischen Analyse zuerst mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, der spezifisch an bestimmte Bestandteile der Zelle bindet. Die interkalierenden Farbstoffe 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und
Propidiumbromid binden beispielsweise an die DNA einer Zelle und ermöglichen über die Messung der Fluoreszenzintensität eine Bestimmung des DNA-Gehaltes der Zelle. Die Zellen können auch mit einem spezifischen Antikörper markiert werden, der entweder selbst einen Fluoreszenzfarbstoff trägt (direkte Immunofluoreszenz) oder der in einem zweiten Schritt nach Bindung an das Antigen mit einem fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper markiert wird (indirekte
Immunofluoreszenz). Durch Verwendung von CD3-Antikörpern, die mit dem Fluo- reszenzfarbstoff Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markiert sind (CD3-FITC- Antikörper), können beispielsweise spezifisch reife T-Lymphozyten markiert und per Durchflusszytometrie detektiert, gezählt und separiert werden. Durch Verwendung mehrerer Laserquellen können zudem bei Anwendung mehrerer Antikörper diverse Merkmale zeitgleich detektiert und als Auswahlkriterien zur nachfolgenden Separation der markierten Zellen genutzt werden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt daher die Selektion und Separation der Zelltypen bevorzugt mittels fluoreszenzbasierter Durchflusszytometrie.
Beschreibung der Abbildungen
[0033] Abbildung 1 zeigt die Elektropherogramme zweier RNA-Proben, die a) in einem erfindungsgemäßen wässrigen System in Gegenwart von lysiertem Blut (linke Spalte) bzw. b) in einer unstabilisierten wässrigen Lösung ohne lysier- tes Blut (Positivkontrolle, rechte Spalte) jeweils 24 Stunden, 3 und 7 Tage bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die RNA-Integritätsnummer (RIN), welche mit Hilfe eines Software-implementierten Algorithmus ermittelt wurde, ist ebenfalls in dem jeweiligen Elektropherogramm angegeben.
[0034] Abbildung 2 zeigt einen Vergleich der Integrität von RNA, die aus Blutproben isoliert wurde, die 2, 24 bzw. 72 h in einem MOPS-Puffer des pH- Wertes 5 bzw. in kommerziell erhältlichen PAXgene bzw. EDTA-haltigen Probengefäßen gelagert wurde.
[0035] Abbildung 3 zeigt das mittels qRT-PCR ermittelte relative c-fos Transkriptionsprofil einer Probe, die in einem EDTA-haltigen Puffer gelagert wurde (oberes Diagramm) im Vergleich mit dem einer Probe, die in einem MOPS-Puffer des pH-Wertes 5 gelagert wurde (unteres Diagramm).
[0036] Abbildung 4 zeigt das mittels qRT-PCR ermittelte relative IL-1 ß Transkriptionsprofil einer Probe, die in einem EDTA-haltigen Puffer gelagert wurde (oberes Diagramm) im Vergleich mit dem einer Probe, die in einem MOPS-Puffer des pH-Wertes 5 gelagert wurde (unteres Diagramm).
[0037] Abbildung 5 zeigt die Elektrophorese-Gele von RNA, die aus Vollblutproben nach vierundzwanzigstündiger Lagerung bei Raumtemperatur gewonnen wurden. Ganz links ist eine Abbildung des Elektrophoresegels von RNA gezeigt, die aus einer unstabilisiert gelagerten Blutprobe isoliert wurde, während die in den Gelen II bis V untersuchte RNA in erfindungsgemäßen Stabilisierungspuffern gelagert wurde (II: Puffer enthaltend MOPS, pH 5; III: Puffer enthaltend MOPS und 250 mg/ml Natriumsalicylat, pH 5; IV: Puffer enthaltend MOPS und 100 mg/ml Glucosaminhydrochlorid, pH5; V: Puffer enthaltend MOPS und
250 mg/ml Natriumsalicylat sowie 100 mg/ml Glucosaminhydrochlorid, pH 5).
[0038] Abbildung 6 zeigt die mittels durchflusszytometrischer Untersuchungen erhaltenen Streulicht-Dot-Plots a) einer nicht erfindungsgemäß stabilisierten Vollblutprobe, die zuvor 24 h bei 4 °C in einem kommerziell erhältlichen Citrat- puffer gelagert wurde und b) einer Vollblutprobe, die zuvor 24 h in einem erfindungsgemäßen Puffer des pH Wertes 5 enthaltend MOPS und 100 mg/ml Glucosaminhydrochlorid gelagert wurde. Links sind die Dot-Plots der Proben vor der Färbung mit spezifischen Antikörper dargestellt, in der Mitte die Dot-Plots nach Markierung der Leukozyten mit CD3-FITC, und rechts sind jeweils die Histogramme der CD3-FITC-markierten Leukozyten dargestellt.
X-Achse: Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht, FSC) y-Achse: Sideward Scatter (Seitwärtsstreulicht, SSC) [0039] Beispiele
[0040] Beispiel 1 : Stabilisierung von RNA in Gegenwart von lysiertem Blut
[0041] Als Basispuffer wurde eine Lösung von 200 mmol/l MOPS, 50 mmol/l Natriumacetat und 10 mmol/l EDTA in RNase-freiem Wasser (pH 5) verwendet. Dieser Basispuffer wurde mit den in Tabelle 1 angegebenen Substanzen versetzt. 800 μΙ der verschiedenen Pufferkompositionen wurden mit 6 g RNA, die zuvor mit Hilfe des kommerziell erhältlichen RNeasy Kits der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) aus Jurkat-Zellen isoliert worden war, versetzt und nach Zugabe von lysiertem Blut, das freie aktivierte RNasen enthält, für eine vorgegebene Zeit inkubiert. Als Vergleichsprobe (Positivkontrolle) wurde 6 g RNA ohne lysiertes Blut in einer unstabilisierten wässrigen Lösung für jeweils den gleichen Zeitraum inkubiert.
[0042] Nach jeweils 1 Stunde, 1 Tag bzw. 3, 5 und 7 Tagen wurden die Proben gemäß des QIAzol Handbuches 10/2006 unter Verwendung des QIAzol Lyse-Reagenzes der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) lysiert, und die enthaltene RNA wurde unter Verwendung eines RNeasy Kits der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) isoliert. Hierzu wurde die Probe mit 2.5 ml QIAzol-Reagenz der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) und 500 μΙ Chloroform versetzt und 15 min bei 12000 rpm zentrifugiert. Die obere Phase wurde vorsichtig abgenommen und mit 2.5 ml Ethanol versetzt. Zur Anbindung der RNA an die RNeasy Mini-Säule der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) wurden die Säule mit dem Lysat beladen und 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. 500 μΙ RW1 -Puffer der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) wurden auf die Säule pipettiert, und die Säule wurde 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. 80 μΙ einer Mischung von 10 μΙ Dnase I Lösung und 70 μΙ RDD-Puffer der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) wurden auf die Säule pipettiert, und die Säule wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend
wurden erneut 500 μΙ RW1 -Puffer der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) auf die Säule pipettiert, und die Säule wurde 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Die Säule wurde zweimal mit 1 ml RPE-Buffer gewaschen (1 min bei 8.000 rpm) und anschließend zum Trocknen 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Zur Elution der RNA
5 wurden 100 μΙ Rnase-freies Wasser auf die Säule pipettiert, die Säule wurde 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Das Eluat enthielt die gereinigte RNA. Diese wurde über ein denaturierendes Agarose/Formaldehyd-Gel mittels Anfärbung mit SYBR Green nachgewiesen. Als zur Stabilisierung geeignete Puffer wurden die betrachtet, bei denen auch nach 3, be- i o vorzugt nach 5, insbesondere bevorzugt nach 7 Tagen Lagerung in Gegenwart lysierten Bluts noch sowohl 28 S rRNA als auch 18 S rRNA auf dem Agarosegel nachweisbar war. Besonders die Puffer, für die ein Intensitätsverhältnis der beiden Banden (28 S : 18 S) von ungefähr 2:1 erhalten blieb, wurden als stabilisierend bezeichnet. Hierbei erwiesen sich insbesondere die in Tabelle 1 aufgeführten Lö- i5 sungen als geeignet, RNA in Gegenwart freier aktiver RNasen länger als 24 h bei Raumtemperatur zu stabilisieren.
[0043] Tabelle 1
Stabilisierungspuffer Zusammensetzung
Puffer 1 Basispuffer + 10 vol% 1 ,2-Dimethoxyethan, pH 4
Puffer 2 250 mg Natriumsalicylat pro ml Basispuffer
Puffer 3 150 mg Hexaammoniumheptamolybdat pro ml Basispuffer
Puffer 4 100 mg Glucosamin Hydrochlorid pro ml Basispuffer
Puffer 5 100 mg Indol pro ml Basispuffer
Puffer 6 100 mg 2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol pro ml Basispuffer
Puffer 7 5 mg Tetrahexylammoniumchlorid pro ml Basispuffer
Puffer 8 250 mg Natriumsalicylat und 100 mg Glucosamin Hydrochlorid pro ml Basispuffer
[0044] Die Integrität der erhaltenen RNA wurde mit Hilfe des Bioanalyzers 2100 der Firma Agilent Technologies (Böblingen, Deutschland) bestimmt. Exemplarisch ist ein Vergleich der in Puffer 2 stabilisierten Probe mit der unstabilisierten Probe (Positivkontrolle) in Abbildung 1 dargestellt. Bereits nach 24 h ist in dem Elektropherogramm der Positivkontrolle ein deutliches Rauschen der Grundlinie (baseline) zwischen der 18 S und der 28 S rRNA Bande bei 43 s bzw. 50 s (sog. Interregion) zu erkennen, welches charakteristisch für einen Abbau der RNA in der Probe ist. Die RIN der Positivkontrolle betrug nach 24 h nur noch 9.0, während die RNA der in dem erfindungsgemäßen Puffer 2 stabilisierten Probe eine RIN von 10.0 aufwies.
[0045] Nach dreitägiger Lagerung der Proben bei Raumtemperatur war in der Positivkontrolle die Intensität der 28 S Bande bereits geringer als die Intensität der 18 S Bande, und die RIN betrug lediglich 6.5. In der mit dem erfindungsgemäßen Puffer stabilisierten Probe war lediglich eine geringe Zunahme des Rauschens zu erkennen, und die RIN betrug weiterhin 10.0. Selbst nach einer siebentätigen Lagerung bei Raumtemperatur sind in der stabilisierten Probe die 18 S und die 28 S rRNA Bande noch als separate Banden mit einem Intensitätsverhältnis von 28 S : 18 S = 1 .8 erkennbar (RIN 6.8), während im Elektropherogramm der Kontrolle keine diskrete 28 S Bande mehr zu erkennen war (RIN 4.5). Die Werte de anderen in Tabelle 1 aufgeführten Pufferlösungen ergaben eine ähnlich gute Stabilisierung der Proben.
[0046] Beispiel 2: Amplifizierung der stabilisierten RNA mittels quantitativer RT-PCR [0047] Um sicherzustellen, dass durch die erfindungsgemäßen Stabilisierungspuffer keine qPCR-lnhibitoren während der Aufarbeitung in die Probe einge-
tragen bzw. in ihr zurückgehalten wurden oder die in den Puffern verwendeten Substanzen selbst als Inhibitoren wirkten und dass die erfindungsgemäßen Puffer ferner dazu geeignet sind, die ex vivo Geninduktion zu minimieren, wurde ein Teil der erhaltenen RNA unter Verwendung kommerziell erhältlicher Primer für GAPDH der Firma Operon Biotechnologie Inc. (Huntsville, Alabama, USA) mittels einer qRT-PCR nach einem Standard-Protokoll der Firma Applied Biosystems Inc. (Fo- ster City, California, USA) amplifiziert.
[0048] Hierzu wurde ein Teil der unter Beispiel 1 erhaltenen RNA (6 g) mit jeweils 2.5 ml lysierten Blutes dreier unterschiedlicher Spender vermischt und anschließend mit 5 ml des Basispuffers versetzt bzw. in kommerziell erhältliche PAXgene-Probengefäße und EDTA-haltige Probengefäße gegeben. Unmittelbar nach dem Vermischen der Proben mit dem Puffer (0 h), sowie nach Lagerung der Proben in dem Puffer für zwei Stunden (2 h), einen bzw. drei Tage (24 h bzw. 72 h) bei Raumtemperatur wurde die in den Proben enthaltene RNA gemäß des QIAzol Handbuches 10/2006 unter Verwendung des QIAzol Lyse-Reagenzes und des RNeasy Kits der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) isoliert. Alle Untersuchungen wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt.
[0049] Die Integrität der erhaltenen RNA eines Spenders (Spender 3) wurde mit Hilfe des Agilent Bioanalyzers 2100, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Hierbei zeigte sich, dass die Integrität der RNA, die aus der in dem erfindungsgemäßen Puffer gelagerten Probe gewonnen wurde, höher ist als die Integrität der RNA, die aus den in PAXgene bzw. in EDTA gelagerten Proben isoliert wurde.
[0050] Die Menge der aus 2.5 ml Blut isolierten RNA wurde für die in dem MOPS-Puffer bzw. in EDTA gelagerten Proben nach Verdünnung mit Wasser (Faktor 7.5) durch photometrische Bestimmung der Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 260 nm ermittelt. Die Reinheit der erhaltenen RNA wird über die photometrische Bestimmung des Verhältnisses der Lichtabsorption bei 260 nm zu derjenigen bei 280 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben, wobei jeweils die Mittelwerte der Doppelbestimmungen angegeben sind.
[0051] Tabelle 2
Spender Methode Zeit A260/A280 Gesamtausbeute pro 2.5 ml Blut
[h] [mg]
1 EDTA 0 2.1 4.36
2 2.05 8.55
24 2.2 9.44
72 2.1 5.97
MOPS pH 5 0 2.1 11.02
2 2.1 7.16
24 2.15 7.06
72 2.05 5.12
2 EDTA 0 1.9 5.45
2 1.95 4.26
24 2.05 3.40
72 1.9 2.94
MOPS pH 5 0 1.95 4.32
2 1.9 3.53
24 1.85 2.31
72 2.0 2.94
3 EDTA 0 2.0 12.05
2 2.05 10.16
24 2.1 7.99
72 2.0 6.17
MOPS pH 5 0 2.0 9.77
2 1 .85 3.47
24 2.1 1 1.22
72 2.0 6.63
[0052] Die relative Expression von c-fos und IL-1 ß wurde für die in Tabelle 2 angegebenen Proben mittels der AAC-r-Methode relativ zur Expression der 18 S rRNA untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefasst und in Abbildung 3 und 4 bzw. 5 und 6 verdeutlicht.
[0053] Tabelle 3: Auswirkung der Lagerungsbedingungen auf die Transkription von c-fos
Spender Methode Zeit [h] CT (c-fos) CT (18 S ACT (18S- ΔΔΟτ (to-tx) rRNA) c-fos)
1 EDTA 0 27.27 25.43 -1 .84 0
27.27 25.34 -1 .93 0
2 24.16 25.76 1 .60 -3.44
24.04 25.53 1.49 -3.42
24 22.47 25.83 3.36 -5.20
22.29 25.91 3.62 -5.55
72 27.89 27.48 -0.41 -1.43
25.71 25.86 0.15 -2.08
MOPS pH 5 0 26.89 25.88 -1.01 0
27.06 25.18 -1.88 0
2 26.63 25.37 -1.26 0.25
27.01 25.61 -1.40 -0.48
24 24.21 25.76 1.55 -2.56
24.70 25.46 0.76 -2.64
72 27.35 27.30 -0.05 -0.96
26.00 25.73 -0.27 -1.61
EDTA 0 26.76 25.43 -1.33 0
27.72 25.02 -2.70 0
2 24.78 25.18 0.40 -1.73
24.92 24.64 -0.28 -2.42
24 23.03 24.74 1.71 -3.04
23.12 24.17 1.05 -3.75
72 24.56 27.56 3.00 -4.33
24.68 24.75 0.07 -2.77
MOPS pH 5 0 27.17 24.66 -2.51 0
26.70 24.22 -2.48 0
2 27.19 24.94 -2.25 -0.26
27.76 24.52 -3.24 0.76
24 24.14 24.66 0.52 -3.03
24.18 24.79 0.61 -3.09
72 25.57 24.61 -0.96 -1 .55
25.51 25.30 -0.21 -2.27
EDTA 0 26.51 24.08 -2.43 0
27.45 25.02 -2.43 0
2 23.93 25.14 1 .21 -3.64
23.56 24.86 1 .30 -3.73
24 21.41 24.68 3.27 -5.70
21.97 25.03 3.06 -5.49
72 28.53 24.38 -4.15 1 .72
26.49 24.12 -2.37 -0.06
MOPS pH 5 0 27.20 25.52 -1 .68 0
27.51 25.27 -2.24 0
2 26.1 1 24.39 -1 .72 0.04
27.34 25.02 -2.32 0.08
24 23.98 24.77 0.79 -2.47
24.51 24.68 0.17 -2.41
72 25.69 25.14 -0.55 -1 .13
25.71 25.22 -0.49 -1 .75
[0054] Tabelle 4: Auswirkung der Lagerungsbedingungen auf die Transkription von IL-1 ß
Spender Methode Zeit [h] CT (IL-1 ß) CT (18 S ACT (18S- ΔΔΟτ (to-tx) rRNA) IL-1 ß)
1 EDTA 0 24.53 22.34 -2.19 0
24.68 22.30 -2.38 0
2 24.17 23.08 -1 .09 -1 .10
24.09 23.40 -0.69 -1 .69
24 25.1 1 22.49 -2.62 0.43
25.21 22.56 -2.65 0.27
72 29.13 23.31 -5.82 3.63
29.26 23.04 -6.22 3.84
MOPS pH 5 0 24.87 22.18 -2.69 0
25.08 22.51 -2.57 0
2 24.33 21.97 -2.36 -0.33
24.31 22.14 -2.17 -0.40
24 25.48 22.18 -3.30 0.61
25.35 22.89 -2.46 -0.1 1
72 27.34 24.13 -3.21 0.52
26.22 23.44 -2.78 0.21
2 EDTA 0 26.21 21.72 -4.49 0
26.29 22.08 -4.21 0
2 26.35 22.37 -3.98 -0.51
26.51 22.34 -4.17 -0.04
24 28.79 21.98 -6.81 2.32
28.43 22.19 -6.24 2.03
72 32.53 22.24 -10.29 5.60
32.28 23.84 -8.44 4.23
MOPS pH 5 0 25.51 21.54 -3.97 0
26.03 21.72 -4.31 0
2 25.80 21.81 -3.99 0.02
25.72 21.58 -4.14 -0.17
24 27.22 21.67 -5.55 1 .58
26.99 22.10 -4.89 0.58
72 27.53 21.57 -5.96 1 .99
28.02 21.55 -6.47 2.16
EDTA 0 24.84 23.64 -1 .20 0
25.45 23.43 -2.02 0
2 24.47 23.78 -0.69 -0.51
24.44 23.65 -0.79 -1 .23
24 26.43 24.02 -2.41 1 .21
26.61 23.65 -2.96 0.94
72 29.37 24.23 -5.14 3.94
29.80 24.31 -5.49 3.47
MOPS pH 5 0 25.22 23.62 -1 .60 0
25.14 23.48 -1 .66 0
2 24.13 23.83 -0.30 -1 .30
24.53 23.78 -0.75 -0.91
24 25.46 23.35 -2.1 1 0.51
24.88 23.58 -1.30 -0.36
72 26.28 23.38 -2.90 1.30
26.12 23.56 -2.56 0.90
[0055] Die CT-Werte für c-fos und IL-ß1 wie auch für 18 S rRNA zum Zeitpunkt t = 0 h sind jeweils vergleichbar für beide Puffer. Dies zeigt, dass durch die Verwendung des MOPS-Puffers keine qPCR-lnhibitoren während der Aufarbeitung in die Probe eingetragen bzw. in ihr zurückgehalten wurden oder die in den Puffern verwendeten Substanzen selbst als Inhibitoren wirkten.
[0056] Das c-fos Transkriptionslevel der EDTA-gelagerten Proben sank bei einer Lagerungszeit von bis zu 24 h zunächst stark ab (AAC-r-Werte bis zu -5.55), was auf einen Abbau der RNA schließen lässt, stieg mit längerer Lagerungsdauer dann aber vermutlich aufgrund einer ex vivo Geninduktion wieder stark an. In den MOPS-stabilisierten Proben sank das c-fos Transkriptionslevel hingegen deutlich schwächer ab, und eine nennenswerte ex vivo Geninduktion war auch in einem Zeitraum von 24 h nicht zu beobachten.
[0057] Auch im Bezug auf das IL-1 ß Transkriptionslevel war in den EDTA- gelagerten Proben eine deutliche Zunahme der AAC-r-Werte über die Zeit zu beobachten, während das Transkriptionslevel in den MOPS-stabilisierten Proben auch nach 72 h in deutlich geringerem Maße gestiegen war.
[0058] Beispiel 3: Mikroskopische Untersuchung des Zellmaterials in Vollblutproben nach Stabilisierung
[0058] 2.5 ml Blut wurden mit 5 ml verschiedener Stabilisierungspuffer versetzt und 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blutproben, von denen eine a) nicht mit einem Stabilisierungspuffer versetzt wurde bzw. jeweils eine b) in einer
MOPS-Pufferlösung des pH-Wertes 4, c) in dem Basispuffer (MOPS, pH 5), d) in einem 1 ,2-Dimethoxyethan-haltigen Puffer (Puffer 1 in Tabelle 1 ), e) einem Natri- umsalicylat-haltigen Puffer (Puffer 2), f) einem Glucosamin Hydrochlorid-haltigen Puffer (Puffer 4) und g) einem Natriumsalicylat und Glucosamin Hydrochlorid enthaltenden Puffer (Puffer 8) inkubiert wurde, wurden anschließend 5 min bei 1000 x g zentrifugiert, und der Überstand wurde bis auf 2.5 ml dekantiert. Um die Qualität des Zellmaterials beurteilen zu können, wurden die Proben anschließend unter dem Mikroskop untersucht. Bei Betrachtung der Zellen unter dem Mikroskop war zu erkennen, dass die Zellen, welche in den erfindungsgemäßen Puffern gelagert wurden, auch nach einer Lagerung von 24 h bei RT noch intakt waren, während die nicht stabilisierten Zellen in deutlich erkennbarem Umfang nicht mehr der ursprünglichen Zellmorphologie entsprachen und teilweise lysiert waren. Insbesondere in den Puffern b) und c), e) und g) waren sogar intakte Granulozyten zu erkennen.
[0059] Beispiel 4: Lyse der Zellen und gelelektrophoretische Untersuchung der RNA
[0059] Weitere, ebenso wie in Beispiel 3 für 24 h in verschiedenen Stabilisierungspuffern gemäß Tabelle 1 gelagerten Proben wurden gemäß der bekannten Protokolle unter Verwendung des QIAzol-Lyse-Reagenzes lysiert. Die in der lysierten Probe enthaltene RNA wurde mittels einer Phenol/Chloroform-Extraktion isoliert und mittels eines RNeasy Kits (Qiagen) gereinigt. Anschließend wurde die gereinigte RNA mittels eines denaturierenden Agarosegels nach Anfärbung mit SYBR Green untersucht. Alle Untersuchungen wurden doppelt durchgeführt.
[0060] Die Ergebnisse der Gelelektrophorese sind in Abbildung 5 dargestellt. Ganz links ist eine Abbildung des Elektrophoresegels der RNA gezeigt, die aus einer 24 h bei Raumtemperatur unstabilisiert gelagerten Blutprobe isoliert wurde, während die in den Gelen II bis V untersuchte RNA in erfindungsgemäßen Stabilisierungspuffern gelagert wurde (II: Basispuffer; III: Puffer 2, pH 5; IV: Puffer 4, pH5; V: Puffer 8). Während die aus der unstabilisiert gelagerten Blutprobe gewonnene RNA im Gel nur noch schwach erkennbar ist und auch das Intensitäts-
Verhältnis der 28 S rRNA Bande zur 18 S rRNA Bande bereits deutlich kleiner als 2:1 ist, sind in den Gelen der aus den stabilisierten Proben gewonnen RNA beide Banden deutlich in einem Signalverhältnis 28 S: 18 S von etwa 2:1 erkennbar.
[0061] Beispiel 5: Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) der stabilisierten Zellen
[0062] Je 2.5 ml Blut wurden mit 5 ml der unterschiedlichen Stabilisierungspuffer gemäß Tabelle 1 versetzt und 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die in der Probe enthaltenen Zellen wurden anschließend mittels eines CD3-FITC- Antikörpers nach einem Standardprotokoll markiert (Versetzen der Probe mit 10- 20 vol% CD3-FITC, Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur im Dunkeln, Lyse der Erythrozyten, Zentrifugieren, Waschen mit PBS-Puffer, erneutes Zentri- fugieren, Versetzen der Probe mit 1 % Paraformaldehydlösung in PBS) und mit Hilfe eines
FACSCalibur der Firma BD Biosciences (San Jose, California, USA) durchfluss- zytometrisch analysiert.
[0063] Hierbei erwiesen sich insbesondere Pufferlösungen des pH-Wertes 5 enthaltend (i) MOPS (Basispuffer), (ii) MOPS und 250 mg/ml Natriumsalicylat (Puffer 2), (iii) MOPS und 100 mg/ml Glucosaminhydrochlorid (Puffer 4) und (iv) 10 vol% 1 ,2-Dimethoxyethan in einem MOPS-haltigen Puffer (Puffer 1 ) als sehr gut geeignet, die Vollblutproben unter Erhalt der Zellmorphologie bei Raumtemperatur zu stabilisieren, so dass auch nach Lagerung der Probe eine zellspezifische Markierung der Zellen mit Antikörpern sowie eine anschließende fluoreszenzaktivierte Zellsortierung möglich war. Dies ist in Abbildung 6 durch einen Vergleich einer nicht stabilisierten Probe (a), die 24 h bei 4 °C in einem Citratpuffer gelagert wurde, mit einer Probe, die 24 h in dem Glucosaminhydrochlorid-haltigen MOPS- Puffer inkubiert wurde (b), verdeutlicht. Links sind jeweils die per FACS-Analyse erhaltenen Dot-Plots der Blutproben vor der Markierung mit CD3-FITC und in der Mitte die Dot-Plots der CD3-F ITC-markierten Blutproben dargestellt, die das für Leukozyten typische Muster aufweisen. Hieraus ist zu erkennen, dass das erfindungsgemäße System die Zellen nicht lysiert. Die rechten Abbildungen zeigen die
für die Proben a) und b) erhaltenen Histogramme nach Markierung der Leukozyten mit CD3-FITC. Es ist eindeutig zu erkennen, dass die in dem erfindungsgemäßen Puffer gelagerten Zellen intakt sind, so dass sie sich mit spezifischen Antikörpern färben und per FACS-Analyse untersuchen lassen. X-Achse: Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht, FSC) y-Achse: Sideward Scatter (Seitwärtsstreulicht, SSC)