DE102009012874B4

DE102009012874B4 - Mikroskop, insbesondere Laser Scanning Mikroskop

Info

Publication number: DE102009012874B4
Application number: DE102009012874.3A
Authority: DE
Inventors: Ralf Wolleschensky
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2017-08-17
Anticipated expiration: 2029-03-13
Also published as: DE102009012874A1; US8699130B2; US20110317258A1; WO2010102767A1

Abstract

Mikroskop zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter Lichtstrahlung, mit einem Detektionstrahlengang zur Detektion von Spektralanteilen der Lichtstrahlung in mehreren Detektionskanälen, wobei im Detektionstrahlengang ein in seinem Verlauf bezüglich durch ihn reflektierter und transmittierter Wellenlängenanteile veränderlicher Langpaß- oder Kurzpaßfilter angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Reflektor, der einen Parallelversatz der reflektierten Strahlung und eine Rückreflektion in Richtung des Wellenlängenfilters im reflektierten oder transmittierten Wellenlängenanteil erzeugt, angeordnet ist und den vom Wellenlängenfilter reflektierten oder transmittierten Wellenlängenanteilen nach mindestens einer Rückreflektion und einer weiteren Reflektion oder Transmission durch den Wellenlängenfilter Detektoren zugeordnet sind.

Description

Stand der Technik
In einem Laser Scanning Mikroskop nach dem Stand der Technik (1) gelangt Licht der Lichtquellen (Laser A–D) über einen Strahlteiler (MDB), die Scanner, die Scanoptik, die Tubuslinse und das Objektiv punktförmig auf die Probe. In der Probe wird beispielsweise Fluoreszenzlicht angeregt, welches durch das Objektiv aufgesammelt wird und wiederum auf den Strahlteiler gelangt. Der Strahlteiler ist so ausgelegt, dass dieser das Fluoreszenzlicht aufgrund der gegenüber der Anregungswellenlänge veränderten Spektraleigenschaften transmittiert, so dass das Detektionslicht mit einer Pinholeoptik durch konfokale Blenden (PH 1–4) fokussiert wird und im Anschluss auf Detektor (PMT 1–4) gelangt. Vor jedem Detektor ist in einem Fluoreszenzmikroskop ein Emissionsfilter (EF 1–4) zur Unterdrückung des Anregungslichtes vorgesehen. Die Aufspaltung in die einzelnen Detektionskanäle erfolgt mittels Nebenfarbteiler (DBS1–4). Zur Anpassung der spektralen Eigenschaften der Detektionskanäle werden nach dem Stand der Technik verschiedene Emissionsfilter oder Nebenfarbteiler, die sich beispielsweise auf einem Rad befinden, eingeschwenkt. Mit Hilfe der Scanner wird der Beleuchtungsspot über die Probe gerastert. Die Probensignale werden in einem Rechner zu einem Bild zusammengesetzt.
Nähere Details zum Stand der Technik sind in „Handbook of biological confocal microscopy”, Kapitel 9, Editor J. P. Pawley, Plenum Press, 1995 zu finden. Es sind verschiedene Anordnungen zur spektrallabhängigen Beeinflussung des Detektionslichtes bekannt, die alle Nachteile aufweisen:
In DE 19835068A1 kann jeweils über winkelabhängige Interferenzfilter nur eine Wellenlänge oder ein Band eingestellt werden.
DE19835070A1 beschreibt eine reine Kombination von Verlaufsfiltern die jeweils nur eine Wellenlänge oder ein Band einstellen.
In DE 10 2004 029 733 A1 werden zwei Bandpaßfilter benötigt. Schon beim Einsatz von 3 Detektionskanälen wären 4 Filter und vier anzusteuernde und zu justierende Bewegungen erforderlich.
In DE 10 2006 034 908 A1 wird nur in zwei Strahlengänge aufgespalten, mit einer begrenzten Flexibilität, wenn der Aufwand gering gehalten werden soll.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Anordnung zu ermöglichen, die eine flexible spektrale Strahltrennung des Detektionslichts mit hoher Effizienz in verschiedene Detektionskanäle erlaubt, so dass die Spektraleigenschaften der Detektionskanäle an die Spektraleigenschaften der Fluoreszenz des Farbstoffes angepasst werden kann. Hierbei sollen keine Spektralanteile zwischen angrenzenden Bändern verloren gehen. Durch Reduktion der mechanischen und optischen Komponenten soll die Anordnung die Abbildungseigenschaften im Vergleich zum Stand der Technik zu einem niedrigeren Preis realisierbar sein. Diese Aufgaben werden durch ein Mikroskop gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beinhaltet eine Anordnung zur flexiblen Einstellung von Detektionskanälen zur effizienten Detektion in konfokaler Bildgebung insbesondere in einem Laser Scanning Mikroskop. Die Anordnung wird beispielhaft anhand einer mehrkanaligen Detektion erläutert.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch den Einsatz eines variablen Langpassfilters realisiert. Dieser ist in schematisch dargestellt. Er zeichnet sich in seinen Spektraleigenschaften dadurch aus, dass sich die so genannte cut-off Wellenlänge entlang der z Richtung verändert. Die cut-off Wellenlänge („Abschneidewellenlänge”) bezeichnet hier die Wellenlänge, bei der die Transmission genau 50% der maximalen Transmission ist. In ist diese Wellenlänge mit lambda_c bezeichnet. zeigt beispielhaft eine Abhängigkeit der cut-off Wellenlänge vom Ort z. Hier steigt die cut-off Wellenlänge linear an.
In ist beispielhaft eine Detektionsanordnung zur flexiblen Trennung der Fluoreszenzstrahlung in 3 Detektionskanäle gezeigt. Das Licht aus Richtung der Probe gelangt auf den variablen Langpassfilter (F). Er ist in einem Winkel zur optischen Achse angeordnet. Dadurch können reflektierte oder transmittierte Lichtanteile platzsparend zu Detektoren außerhalb der optischen Achse gelangen. Er weist hier beispielhaft einen kontinuierlichen Anstieg der cut-off Wellenlänge von unten nach oben auf. Er ist als Hochpassfilter ausgebildet, d. h. Licht oberhalb der cut-off Wellenlänge wird transmittiert und Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge reflektiert.
Spektralanteile oberhalb der cut-off Wellenlänge (1) treten also durch F hindurch in Richtung eines Dachkantenprismas (DK1). Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge (1) gelangt reflektiert in Richtung eines zweiten Dachkantenprismas (DK2). Beide Dachkantenprismen sind entlang der x bzw. der y Achse, jeweils senkrecht zur optischen Achse, beweglich angeordnet. Hierdurch kann der von DK1, DK2 beeinflusste Wellenlängenbereich eingestellt werden. Die Detektoren können vorteilhaft gekoppelt mit verschoben werden. Durch die Dachkantenprismen wird das Licht räumlich parallel versetzt jeweils in sich zurückgespiegelt und gelangt wiederum auf den Langpassfilter (F). Das Licht aus Richtung DK1 trifft auf den Langpassfilter am Ort der cut-off Wellenlänge (3). Licht oberhalb der cut-off Wellenlänge (3) und oberhalb der Wellenlänge (1) wird in Richtung Detektor (b) transmittiert. Das Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge (3), ebenfalls oberhalb der Wellenlänge (1) wird von F in Richtung Detektor (c) reflektiert. Das Licht, das in Richtung DK2 reflektiert wurde und unterhalb der cut-off Wellenlänge 1 liegt, trifft nach Durchlaufen von DK2 auf den Langpassfilter am Ort der cut-off Wellenlänge (2). Licht oberhalb der cut-off Wellenlänge (2) und unterhalb der Wellenlänge (1) wird in Richtung Detektor (a) transmittiert. Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge (2) gelangt (reflektiert) in Richtung eines Detektors d.
zeigt einen Tiefpassfilter F1 der einen kontinuierlichen Anstieg der cut-off Wellenlänge von unten nach oben aufweist, wobei jeweils die Wellenlänge oberhalb der cut-off Wellenlänge reflektiert und Wellenlängen unterhalb der cut-off Wellenlänge transmittiert werden.
Im Prinzip ist die Anordnung zur Darstellung in 3a spiegelbildlich aufgebaut. Am Ort der cut-off Wellenlänge 1 wird Licht einer Wellenlänge unterhalb 1 in Richtung DK3 transmittiert und gelangt an der Stelle 2 zurück auf F1. Dort werden Wellenlängenanteile kleiner (2) in Richtung eines Detektors f transmittiert und Anteile größer (2) und unterhalb (1) in Richtung eines Detektors g reflektiert. Anteile oberhalb der Wellenlänge (1) werden an F1 reflektiert und gelangen über DK4 an die Stelle (3) von F1, wo Anteile kleiner (3) aber größer (1) in Richtung Detektor e transmittiert werden und Anteile größer (3) in Richtung eines Detektors h reflektiert werden.
zeigt am Beispiel 3a) die Spektralbereiche (dargestellt als Kasten), die von den einzelnen Detektoren (a–d) detektiert werden. Jeweils eingezeichnet sind die cut-off Wellenlängen (1–3). Durch Verschieben des Langpassfilters (F) entlang z in einem Winkel zur optischen Achse kann die Lage der cut-off Wellenlänge (1) verändert werden. Durch Verschieben der DK1 bzw. 2 wird die Lage der cut-off Wellenlängen (3) bzw. (2) beeinflusst. Somit können beliebige Breiten und Lagen der Bänder (a–c) realisiert werden. Besonders vorteilhaft ist es, dass hierbei die Bänder (d), (a), (c) und (b) ohne spektrale Lücke direkt aneinandergrenzen. Somit gehen keine spektralen Fluoreszenzanteile bei der spektralen Zerlegung in die Detektionskanäle verloren.
zeigt die Detektionsanordnung in einem Laser Scanning Mikroskop. Das Detektionslicht (z. B. Fluoreszenz) wird analog der in beschriebenen Anordnung nach dem Stand der Technik in der Probe angeregt. Durch das Objektiv (O) gesammeltes Probenlicht gelangt über die Tubuslinse (TL), die Scanoptik (SO), die Scanner (SC) in Richtung des Hauptfarbteilers (MDB). Dieser transmittiert vorzugsweise das Probenlicht in Richtung der Pinholeoptik (PO). Durch PO wird das Licht in ein konfokales Pinhole (PH) fokussiert. Eine weitere Optik (L) kollimiert das Licht nach dem Pinhole. Danach gelangt es in die anhand beschriebene Detektionsanordnung.
Die erfindungsgemäße Anordnung wurde beispielhaft anhand von 4 Detektionskanälen und unter Verwendung eines variablen Langpassfilters erläutert. Durch entsprechende Rückspiegelung mit weiteren Dachkantenprismen eines Detektionskanals können die Anzahl der Detektionskanäle erweitert werden. Zusätzlich kann nach Anpassung der DK (Verdrehung um 180°) statt dem Langpassfilter auch ein Kurzpassfilter verwendet werden (3b).

Claims

Mikroskop zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter Lichtstrahlung, mit einem Detektionstrahlengang zur Detektion von Spektralanteilen der Lichtstrahlung in mehreren Detektionskanälen, wobei im Detektionstrahlengang ein in seinem Verlauf bezüglich durch ihn reflektierter und transmittierter Wellenlängenanteile veränderlicher Langpaß- oder Kurzpaßfilter angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Reflektor, der einen Parallelversatz der reflektierten Strahlung und eine Rückreflektion in Richtung des Wellenlängenfilters im reflektierten oder transmittierten Wellenlängenanteil erzeugt, angeordnet ist und den vom Wellenlängenfilter reflektierten oder transmittierten Wellenlängenanteilen nach mindestens einer Rückreflektion und einer weiteren Reflektion oder Transmission durch den Wellenlängenfilter Detektoren zugeordnet sind.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Langpaß- oder Kurzpaßfilter ein variabler Kantenfilter ist, der entlang seiner Längenausdehnung eine unterschiedliche Aufteilung in transmittierte und reflektierte Wellenlängenanteile aufweist.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Filter eine interferometrische Beschichtung aufweist.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Filter entlang seines Verlaufs eine veränderliche cut-off-Wellenlänge aufweist, die das Verhältnis von Wellenlängenanteilen, die reflektiert werden, und von Wellenlängenanteilen, die transmittiert werden, bestimmt.
Mikroskop nach Anspruch 4, wobei der Filter entlang der Richtung der veränderlichen cut-off-Wellenlänge verschiebbar ist.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Reflektor senkrecht zur Einfallsrichtung des Lichts verschiebbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 6, wobei dem Reflektor ein verschiebbarer Detektor zugeordnet ist.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Reflektor ein Dachkantenprisma oder -spiegel ist.