DE102008029458B4 - Verfahren zum Aufzeichnen von Impulssignalen - Google Patents

Abstract

Verfahren zum Aufzeichnen von Impulssignalen eines Eingangskanals eines Mikroskops (10), der mit einer vorgegebenen Abtastfrequenz auf Impulssignale abgetastet wird, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Periode der Abtastfrequenz ein das betreffende Abtastergebnis repräsentierendes Bit zugeordnet wird und diese Abtastergebnis-Bits aufeinanderfolgend in einem Datenblock gespeichert werden und die Abtastung simultan zu einem Pixeltakt erfolgt, der niedriger ist als die Abtastfrequenz, wobei, wenn eine Flanke des Pixeltakts zu einem Flankenzeitpunkt (PT) identifiziert wird, das zu dem Flankenzeitpunkt (PT) gehörige Abtastergebnis-Bit markiert wird.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufzeichnen von Impulssignalen eines Eingangskanals eines Mikroskops, insbesondere eines konfokalen Mikroskops oder eines Laser-Scanning-Mikroskops, der mit einer vorgegebenen Abtastfrequenz auf Impulssignale abgetastet wird.
• Die Erfindung wird vorzugsweise für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl. „fluorescence correlation spectroscopy“; FCS) verwendet, insbesondere für die abtastende Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl. „scanning FCS“; S-FCS) mittels eines Laser-Scanning-Mikroskops (LSM). Bei FCS und S-FCS werden einzelne Fluoreszenzemissionen mit photonenzählenden Detektoren aufgenommen, deren Antwortsignal mit einer vorgegebenen Abtastfrequenz digitalisiert wird. Die Antwortsignale sind kurze Impulssignale. Das Auftreten eines Impulssignals wird nachfolgend als Impulssignalereignis bezeichnet. Die zeitliche Dichte der Ereignisse ist dabei gering. Als photonenzählende Detektoren können beispielsweise Photovervielfacher (engl. „photomultiplier“; PMT) oder Lawinenphotodioden (engl. „avalanche photodiode“; APD) verwendet werden.
• Im Stand der Technik ist ein Verfahren zum Aufzeichnen von Impulssignalen zweier Eingangskanäle für FCS beispielsweise aus DE 199 51 188 A1 bekannt, deren Offenbarung hier soweit als möglich einbezogen wird. In einer ersten Variante werden nach der Detektion eines Ereignisses in mindestens einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers der aktuelle Zustand aller Eingangskanäle zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Größe abgespeichert. In einer zweiten Variante werden nach der Detektion eines Ereignisses in mindestens einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers die Zustände aller Eingangskanäle im Abtastzyklus, in dem das Ereignis stattgefunden hat, und für eine vorgegebene Anzahl an Abtastzyklen nach Eintritt des ersten Ereignisses zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten vorhergehenden Speicherung charakterisierenden Größe abgespeichert.
• Diese Art der Aufzeichnung hat durch die Verschachtelung der Zustände aller Eingangskanäle die Nachteile, dass die absoluten Zeitpunkte, zu denen die einzelnen Ereignisse aufgetreten sind, aus den gespeicherten Daten nicht rekonstruiert werden können und dass die Anzahl der gleichzeitig nutzbaren Eingangskanäle durch die Breite der Speicherregister, in denen die digitalisierten Eingangskanäle abgebildet sind, prinzipiell beschränkt ist.
• Nachfolgend sind beispielhaft weitere Dokumente des Standes der Technik genannt. Aus der DE 199 51 188 A1 ist ein Verfahren zur Aufzeichnung von Impulssignalen mehrerer, mindestens zweier Eingangskanäle bekannt, wobei die mehreren Eingangskanäle mit vorgegebener Abtastfrequenz auf aufgetretene Ereignisse abgetastet werden. Nach der Detektion eines Ereignisses in mindestens einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers werden der aktuelle Zustand aller Eingangskanäle in einem Speicherregister zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Größe abgespeichert.
• Die US 5 787 132 A betrifft eine Datenerfassungseinheit mit Mitteln zum Empfang von Daten. Die Daten sind kodiert und enthalten ein Zeitsignal. Weiterhin sind Mittel vorhanden, mit denen synchronisierte Zeitsignale erzeugt werden. Diese werden zur Dekodierung der empfangenen Daten verwendet.
• Ein Verfahren zur Datenverarbeitung erhaltener digitaler Daten eines Kommunikationssystems ist in der US 6 662 339 B1 beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte der Identifizierung einer Kontrollinformation, die einem Datenpaket empfangener digitaler Daten zugeordnet ist. Durch mindestens einen partiellen Vergleich der Kontrollinformation und einer dem Datenpaket ebenfalls zugeordneten Dekodierungsvorschrift wird eine Fehlerinformation generiert und dem Datenpaket zugeordnet.
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu verbessern, so dass der Zeitbezug der einzelnen Ereignisse rekonstruiert werden kann. Dabei soll auch eine prinzipiell unbeschränkte Anzahl von Eingangskanälen verwendet werden können.
• Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist.
• Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
• Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass jeder Periode der Abtastfrequenz ein das betreffende Abtastergebnis repräsentierendes Bit zugeordnet wird und diese Abtastergebnis-Bits aufeinanderfolgend in einem dem jeweiligen Eingangskanal zugeordneten Datenblock gespeichert werden. Bei der Abtastung findet beispielsweise eine 1-Bit-Digitalisierung der Impulssignale statt, so dass sich als Abtastergebnis für jede Abtastperiode ein jeweiliges Bit ergibt, das angibt, ob in der betreffenden Abtastperiode ein Impulssignalereignis aufgetreten ist. Andere Formen der Abtastung sind möglich, beispielsweise kann die Digitalisierung mit einer Auflösung von mehr als einem Bit erfolgen, wobei die Abtastergebnis-Bits durch Vergleiche mit einem vorgegebenen Schwellwert ermittelt werden. Die Abtastung erfolgt simultan zu einem Pixeltakt, der niedriger ist als die Abtastfrequenz, wobei, wenn eine Flanke des Pixeltakts zu einem Flankenzeitpunkt identifiziert wird, das zu dem Flankenzeitpunkt gehörige Abtastergebnis-Bit markiert wird.
• Diese Verknüpfung ermöglicht die abtastperiodengenaue Synchronisation zwischen einem Pixeltakt und den einzelnen Ereignissen der Eingangskanäle. Dadurch können Korrelationen pixelgenau berechnet und dargestellt werden. Die Markierung des zu dem Flankenzeitpunkt gehörigen Abtastergebnis-Bit kann auf unterschiedliche Weise erfolgen, beispielsweise durch ein vorangestelltes oder nachgestelltes eindeutiges Synchronisationsidentifikationsbitmuster, das auf andere Weise nicht zustande kommen kann.
• Durch die erfindungsgemäße fortlaufende Zuordnung und blockweise Speicherung der Abtastergebnis-Bits ist der Zeitpunkt jedes Impulssignalereignisses relativ zum Beginn des Datenblocks anhand der bekannten Abtastfrequenz einfach durch Zählen der vor dem betreffenden Abtastergebnis-Bit liegenden Abtastergebnis-Bits ermittelbar, deren Anzahl der Anzahl der bis dahin vergangenen Abtastperioden entspricht. Dies gilt auch über mehrere aufeinanderfolgende Datenblöcke hinweg. Wird der erste Datenblock mit dem Beginn der Abtastung begonnen, so kann auf diese Weise im Rahmen der Messung auch der absolute Zeitbezug rekonstruiert werden. Durch die blockweise Zuordnung zu dem Eingangskanal und Speicherung ohne Verschachtelung kann prinzipiell eine beliebige Anzahl von Eingangskanälen simultan aufgezeichnet werden.
• Es ist dabei möglich, die Abtastergebnis-Bits in dem Datenblock unmittelbar oder nur mittelbar aufeinanderfolgend zu speichern. Zweckmäßigerweise werden die Abtastergebnis-Bits unmittelbar aufeinanderfolgend gespeichert, um den Speicherbedarf zu minimieren. Es ist alternativ denkbar, zwischen den Abtastergebnis-Bits beispielsweise Füllbits (engl. „padding bits“) einzufügen, um den Datenstrom bündig mit Byte- oder Wortgrenzen auszurichten oder um die Berechnung von Prüfsummen zu vereinfachen. Auch ist es beispielsweise möglich, für bestimmte Übertragungsprotokolle Zwischenbits einzufügen, die das Entstehen von für die Übertragung ungünstigen Bitmustern vermeiden. Füllbits oder andere Zwischenbits sollten zweckmäßigerweise nur an definierten Stellen im Bitstrom gespeichert werden, damit sie mit geringem Aufwand von den Nutzdaten unterschieden werden können. Auf diese Weise können insbesondere eindeutige Identifikationsbitmuster für zwischen die Abtastereignis-Bits eingeschobene Daten realisiert werden.
• Vorzugsweise werden die Abtastergebnis-Bits wortweise zusammengefasst gespeichert (nachfolgend als Ereigniswörter bezeichnet), wobei eine vorgegebene Menge von Bits eines solchen Ereigniswortes freigehalten und mit einem ersten Identifikationsbitmuster versehen wird. Die wortweise Speicherung ermöglicht die einfache Handhabung und Übertragung des Datenblocks mit einem Digitalrechner.
• Besonders bevorzugt sind Verfahrensausgestaltungen, in denen anstelle einer Folge von Bits, die ausschließlich ereignislose Perioden repräsentieren, die Länge dieser Folge gespeichert wird. Die Länge kann beispielsweise die Anzahl der ersetzten Bits sein. Indem die ereignislosen Perioden durch eine Längenangabe ersetzt werden, wird die Datenmenge erheblich reduziert, da in FCS-Messungen nur wenige Impulsereignisse, also lange ereignislose Perioden auftreten. Beispielsweise kann bei einer 14-Bit-breiten Längenangabe das Datenaufkommen in den ereignislosen Perioden um einen Faktor von bis zu 2¹⁴=16384 reduziert werden.
• Des weiteren wird vorzugsweise die Länge der ereignislosen Folge als Wort (nachfolgend als Leerlaufwort bezeichnet) gespeichert, wobei eine vorgegebene Menge von Bits dieses Leerlaufworts freigehalten und mit einem zweiten Identifikationsbitmuster versehen wird. Dadurch kann die Länge der ersetzten Bitfolge ohne weiteren Aufwand beispielsweise in der Einheit „ersetzte Ereigniswörter“ gespeichert werden. Es ist aber auch möglich, die Längenangabe in einer von der Ereigniswortlänge unabhängigen Einheit anzugeben, so dass beispielsweise eine Längenangabe von „eins“ einer Folge von beispielsweise 8, 16, 20, 32 oder 64 ereignislosen Abtastergebnis-Bits entspricht. In allen Fällen können lange ereignislose Zeiträume effizienter aufgezeichnet werden. Beispielsweise sind bei einer Längeneinheit von 14 Bits, also dem Inhalt eines ersetzten Ereignisworts, für denselben ereignislosen Zeitraum um den Faktor 14 weniger Ersatzwörter erforderlich. Bei einer Längeneinheit von 32 Bits sind beispielsweise um den Faktor 32 weniger Ersatzwörter nötig.
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zum Markieren eines zu einem Flankenzeitpunkt gehörigen Abtastergebnis-Bits vor oder nach dem Ereigniswort, das das zu dem Flankenzeitpunkt gehörige Abtastergebnis-Bit enthält, die Bitposition des zugehörigen Abtastergebnis-Bits innerhalb dieses Ereigniswortes gespeichert. Diese Verknüpfung ermöglicht die abtastperiodengenaue Synchronisation zwischen einem Pixeltakt und den einzelnen Ereignissen der Eingangskanäle. Dadurch können Korrelationen pixelgenau berechnet und dargestellt werden.
• Vorzugsweise wird dabei die Bitposition als Wort (nachfolgend als Synchronisationswort bezeichnet) gespeichert, wobei eine vorgegebene Menge von Bits dieses Synchronisationswortes freigehalten und mit einem dritten Identifikationsbitmuster versehen wird. Dies ermöglicht eine hohe Effizienz der Speicherung mit Pixeltaktsynchronisation.
• Vorteilhafterweise wird die Abtastung zu einem Flankenzeitpunkt des Pixeltakts begonnen. Dadurch kann auf ein Synchronisationswort zu Beginn des Datenblocks verzichtet werden.
• Vorzugsweise werden am Anfang des Datenblocks eine Länge des Datenblocks, und insbesondere eine Eingangskanalidentifikation sowie insbesondere eine Prüfsumme über den Datenblock gespeichert. Dadurch kann die Übertragung des Datenblocks zu einem Steuerrechner mit geringem Aufwand durchgeführt werden. Eine Eingangskanalidentifikation erlaubt es, mindestens zwei Eingangskanäle simultan abzutasten und für jeden der Eingangskanäle einen separater Datenblock zu speichern und auf demselben Weg zum Steuerrechner zu übertragen. Eine Prüfsumme hilft, Übertragungsfehler zu minimieren.
• Zweckmäßigerweise weist jedes Wort eine Länge von 8, 16, 32 oder 64 Bit auf.
• Die Erfindung umfasst auch ein Computerprogramm, das zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Verfahrensansprüche eingerichtet ist sowie eine ebensolche Steuereinheit. Sie umfasst des weiteren ein Fluoreszenzdetektionsmodul für ein konfokales Mikroskop, insbesondere ein Rastermikroskop, mit einer solchen Steuereinheit und mindestens zwei Detektionskanälen als Eingangskanäle. Ein konfokales Mikroskop, insbesondere Rastermikroskop, kann alternativ auch mit einer integrierten Steuereinheit und mindestens zwei Detektionskanälen als Eingangskanäle versehen sein.
• Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
• In den Zeichnungen zeigen:
• 1 ein Schema eines ersten Mikroskops zur Anwendung des Aufzeichnungsverfahrens,
• 2 ein Schema eines zweiten Mikroskops in perspektivischer Darstellung,
• 3 ein Ablaufdiagramm des Aufzeichnungsverfahrens und
• 4 eine Folge von Eingangskanalzuständen sowie den korrespondierenden Teil des resultierenden Datenblocks.
• In allen Zeichnungen haben übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
• 1 zeigt beispielhaft ein einfaches konfokales Mikroskop 10, bei dem der von einem oder mehreren Lasern 11 emittierte Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv 13 hoher numerischer Apertur in eine Probe 12 fokussiert wird. Das Anregungsvolumen in der Probe 12 beträgt dabei nur wenige Femtoliter. Die in der Probe 12 erzeugte Fluoreszenzstrahlung wird vom Objektiv 13 wieder aufgesammelt, mittels eines Hauptfarbteilers 15 vom Anregungslicht getrennt und nachfolgend mittels eines Nebenfarbteilers 14 zwei separaten Detektionskanälen zugeführt. In jedem der beiden Detektionskanäle ist eine konfokale Lochblende 16 vorgesehen, die beide in einer zur Fokusebene des Objektivs 13 konjugierten Ebene angeordnet sind. Nach Transmission durch die konfokalen Blenden 16 wird das in jedem Detektionskanal enthaltene Lichtsignal von hochempfindlichen Detektoren 18, die zum Nachweis einzelner Photonen ausgelegt sind, detektiert. Die konfokalen Blenden 16 stellen dabei sicher, dass auch das Volumen in der Probe 12, aus dem Fluoreszenzstrahlung detektiert wird, die geringe Größe des Anregungsvolumens aufweist. Aufgrund des sehr kleinen Anregungs- und Detektionsvolumens treten in beiden Detektionskanälen Impulssignale auf, die im wesentlichen aus einzelnen Impulsen mit längeren Impulsabständen bestehen.
• Die elektrischen Signale der beiden Detektoren 18 werden einer Steuereinheit 19 als Eingangskanäle zugeführt. Aus den auf diese Weise detektierten Fluoreszenzereignissen sollen in einem Steuerrechner 21 im Rahmen einer FCS- oder S-FCS-Auswertung Korrelationen (beispielsweise Autokorrelationen oder Kreuzkorrelationen) berechnet werden. Zu diesem Zweck ist die Steuereinheit 19 über einen LVDS-Bus (engl. „low voltage differential signaling“) mit einer Peripherieschnittstelle 20 verbunden, die ihrerseits über einen Ethernet-Bus mit dem Steuerrechner 21 verbunden ist. Die detektierten Fluoreszenzereignisse müssen folglich über beide Busse übertragen werden. Es ist daher zweckmäßig, die übertragene Datenmenge pro Zeiteinheit zu minimieren.
• In der Steuereinheit 19 werden die Detektorsignale mit einer Auflösung von einem Bit digitalisiert, wobei die Eingangskanäle mit einer variablen Abtastfrequenz f von beispielsweise 66 MHz auf Impulssignale abgetastet werden. Der Wert jedes dieser Abtastergebnis-Bits gibt an, ob in der zugehörigen Abtastperiode von etwa 15 ns Dauer ein Impulssignal vom Detektor registriert wurde, mit anderen Worten, ob in dieser Zeit ein Impulssignalereignis aufgetreten ist. Beispielsweise kann ein Wert von 1 (wahr) ein Impulssignal und ein Wert von 0 (falsch) eine ereignislose Periode repräsentieren, oder umgekehrt. Für jeden Eingangskanal ist ein separates vierzehnstufiges Schieberegister (nicht abgebildet) vorgesehen. In jedem Takt der Abtastfrequenz wird das Schieberegister um ein Bit nach links verschoben und das aktuelle Abtastergebnis-Bit in die freigewordene unterste Stufe geschrieben. Die Schieberegister sind beispielsweise in den Adressbereich einer Zentraleinheit (engl. „central processing unit“; CPU) der Steuereinheit 19 eingeblendet, so dass sie mit einem einzelnen Befehl ausgelesen werden können. In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann anstelle einer CPU beispielsweise ein programmierbarer integrierter Schaltkreis (engl. „field programmable gate array“; FPGA) verwendet werden, in den die Schieberegister integriert sind.
• Die Zentraleinheit der Steuereinheit 19 führt einen ersten Zeiger auf einen ersten Speicherbereich eines Wahlzugriffspeichers (engl. „random access memory“; RAM) der Steuereinheit 19 und einen zweiten Zeiger auf einen zweiten Speicherbereich. Im ersten Speicherbereich baut die Zentraleinheit sukzessive einen ersten, zum ersten Eingangskanal gehörigen Datenblock auf. Im zweiten Speicherbereich baut sie sukzessive einen zweiten, zum zweiten Eingangskanal gehörigen Datenblock auf. Die Datenblöcke werden bei einer Wortbreite von 16 Bit wortweise erweitert. In beiden Datenblöcken wird zunächst im ersten Wort das Mikroskop 1 als LVDS-Absender gespeichert und beide Zähler inkrementiert. Das jeweils zweite Wort wird zunächst durch Inkrementieren beider Zähler freigehalten. Die ersten beiden Wörter werden als LVDS-Kopf (engl. „header“) bezeichnet. Nach dem LVDS-Kopf werden in jedem Datenblock die FCS-Daten des betreffenden Eingangskanals wortweise gespeichert. Nach jedem gespeicherten Wort wird der betreffende Zähler inkrementiert, so dass er auf das nächste noch ungenutzte Wort zeigt.
• Die FCS-Datenwörter können beispielsweise folgendermaßen zusammengesetzt sein:

  (15:14)	(13:0)	Erläuterungen
  112	13 - SYNC 11:0 - LVDS-Adresse	Start eines Datenblocks mit Synchronisations-information und LVDS-Adresse des Eingangskanals
  	13 - SYNC	Synchronisationsinformation mit Angabe der
  102	3:0 - Anzahl der gültigen FCS-Bits	Bitposition der Pixeltaktflanke im nachfolgenden Ereigniswort (MSB-bündig).
  012	FCS-Muster	Vierzehn Abtastergebnis-Bits
  002	Pausenzähler	Anzahl ereignisloser Abtastperioden mit einem Wert zwischen 15 und 214-1

• Die FCS-Datenwörter sind untergliedert in Identifikationsbits (15:14) und Datenbits (13:0). Beispielsweise werden die zwei höchstwertigen Bits als Identifikationsbits und die vierzehn niederwertigsten Bits als Datenbits verwendet. Es können somit 2²=4 verschiedene Arten von FCS-Datenwörtern unterschieden werden. Wie im betrachteten Ausführungsbeispiel kann bei mehreren Eingangskanälen das erste FCS-Datenwort eines Blocks mit dem beispielhaften Bitidentifikationsmuster 11₂ in den vierzehn Datenbits eine Kanalidentifikationsnummer des betreffenden Eingangskanals enthalten.
• Die Zentraleinheit verwaltet einen mit Null initialisierten Abtasttakt-Zähler, der in jeder Abtastperiode inkrementiert wird. Erreicht der Abtasttakt-Zähler die Anzahl der Datenbits (und damit die Breite des Schieberegisters, hier also vierzehn), so speichert die Zentraleinheit den Inhalt der Schieberegister, sofern darin zumindest ein Bit das Auftreten ein Impulssignalereignisses anzeigt (hier also den Wert „wahr“ hat), in dem jeweiligen Datenblock, und zwar in den Datenbits von jeweiligen FCS-Datenwörtern mit dem beispielhaften Bitidentifikationsmuster 01₂ („Ereigniswörter“). Handelt es sich um vierzehn ereignislose Abtastperioden (haben hier also alle Bits den Wert „falsch“), so wird stattdessen ein jeweiliger, zu dem betreffenden Eingangskanal gehöriger (mit Null initialisierter) Pausenzähler um vierzehn erhöht. In beiden Fällen wird der Abtasttakt-Zähler anschließend zurückgesetzt.
• Die beiden Pausenzähler weisen eine beispielhafte Breite von jeweils vierzehn Bit auf. Läuft einer der Pausenzähler über, so wird im betreffenden Datenblock an der aktuellen Zeigerposition ein FCS-Datenwort mit dem beispielhaften Bitidentifikationsmuster 00₂ („Leerlaufwort“) gespeichert, das in den Datenbits den Stand des betreffenden Pausenzählers enthält. Auch wenn die Messung beendet wird (beispielsweise durch einen Benutzer), wird für jeden Pausenzähler, der größer als Null ist, ein solches FCS-Datenwort in den betreffenden Datenblock geschrieben. Das Bitidentifikationsmuster 10₂ wird hingegen in diesem Ausführungsbeispiel nicht verwendet. Es kann zur Synchronisation mit einem simultanen Pixeltakt dienen.
• Die Speicherung von 00₂- und 01₂-FCS-Datenwörtern wird wiederholt bis entweder ein Datenblock eine vorgegebene Maximallänge erreicht oder bis die Messung beendet ist. Dann wird der betreffende Datenblock beziehungsweise beide Datenblöcke abgeschlossen. Zu diesem Zweck wird in den oberen vier Bits des zweiten Worts des betreffenden Datenblocks eine Prüfsumme über den jeweiligen Datenblock und in den unteren acht Bits die Länge dieses Datenblocks in Worten gespeichert. Die Länge kann beispielsweise aus dem erreichten jeweiligen Zählerstand abzüglich der Anfangsadresse des betreffenden Speicherbereichs ermittelt werden.
• Jeder abgeschlossene Datenblock wird über den LVDS-Bus zur Peripherieschnittstelle 20 übertragen, die nach Überprüfung der Prüfsumme die ersten beiden Wörter des Datenblocks entfernt. Daraufhin überträgt sie ihn über den Ethernet-Bus zum Steuerrechner 21, auf dem er dekodiert und weiterverarbeitet werden. Sofern die Messung noch nicht beendet ist, wird die Aufzeichnung in der Steuereinheit 19 fortgesetzt, indem der betreffende Speicherbereichszähler auf das dritte Wort des betreffenden Datenblocks zurückgesetzt und der betreffende Pausenzähler mit Null initialisiert wird. Wahlweise kann die Übertragung über Ethernet entfallen und die Auswertung vor Ort erfolgen.
• Anstelle von 16-Bit-Worten kann die Aufzeichnung auch mit 8-, 32- oder 64-Bit-Worten durchgeführt werden. Anstelle von zwei Identifikationsbits pro Wort können auch drei oder mehr Identifikationsbits verwendet werden. Die Anzahl der Datenbits pro Wort reduziert sich entsprechend. Unabhängig davon kann die blockweise Kodierung der Abtastergebnis-Bits auf entsprechende Weise mit drei, vier und mehr Eingangskanälen durchgeführt werden. Für jeden Eingangskanal wird ein Datenblock gespeichert und gesondert zum Steuerrechner 21 übertragen. Es ist auch möglich, neben einem oder mehreren erfindungsgemäß blockweise kodierten Eingangskanälen auch einen oder mehrere Eingangskanäle mit dem in DE 199 51 188 A1 beschrieben Aufzeichnungsverfahren zu kodieren.
• 2 zeigt einen schematischen Ausschnitt des Strahlengangs eines komplexeren konfokalen Mikroskops 10 mit beispielsweise vier oder alternativ (nicht abgebildet) bis zu sechzehn oder mehr FCS-Eingangskanälen (nur zwei davon sind abgebildet). Es handelt sich um ein Laser-Scanning-Mikroskop 10.
• Mittels einer Mikroskopeinheit M (hier ein inverses Mikroskop zur Beobachtung einer auf einem in x-, y und z-Richtung verstellbaren Tisch 27 befindlichen Probe 12 über ein unterhalb der Probe 12 angeordnetes Objektiv 13 und eine Tubuslinse TL) wird mit Hilfe eines Scanmoduls S Licht aus einer Laserlichtquelle 11A mit einer oder mehreren Wellenlängen direkt oder durch eine Lichtleitfaser 22 über eine Kollimationsoptik 23 sowie einem Hauptfarbteiler 15A in die Probe 12 fokussiert. Die Scannerspiegel 25 erlauben das Ablenken des Lichtstrahles in x- und y-Richtung. Unterschiedliche Probenschichten können durch die vertikale Verstellung des Probentisches 27 oder des Objektives 13 erfolgen.
• Das von der Probe kommende Licht durchläuft wieder die Scannerspiegel 25 und wird mittels der Nebenfarbteiler 14A den PMT-Detektoren 18A zugeordnet und über eine Steuereinheit 19 in elektrische Signale zur Auswertung in einem Steuerrechner 21 umgewandelt. Die Steuereinheit 19 und der Steuerrechner 21 sind über einen LVDS-Bus verbunden. In alternativen Ausgestaltungen (nicht abgebildet) kann auch hier ein weiterer Bus wie ein Ethernet zwischengeschaltet sein. Die mittels der Detektoren 18A gemessenen Signale werden zur Gewinnung von Bildinformationen genutzt. Um die gemessenen Signale Bildpunkten (engl. „pixel“) zuordnen zu können, wird ein Pixeltakt erzeugt. Es kann sich bei dem Pixeltakt beispielsweise um ein Rechtecksignal mit einer Frequenz von 2,5 MHz handeln.
• Mit Hilfe einer Strahlumschaltungseinheit 28, beispielsweise eines ein- und ausschwenkbaren Vollspiegels oder teildurchlässigen Spiegels, wird Licht aus einer weiteren Laserlichtquelle 11B mit einer oder mehreren Wellenlängen mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektionsmoduls F über einen Hauptfarbteiler 15B in die Probe 12 fokussiert. Die Lichtquellen 11A und 11B können auch identisch sein und über geeignete Umlenk- und Schaltelemente (nicht abgebildet) in die Module S beziehungsweise F eingekoppelt werden. Auf diese Weise kann S-FCS realisiert werden.
• Das von der Probe 12 kommende Fluoreszenzlicht wird durch Nebenfarbteiler 14B den FCS-Detektoren 18B zugeleitet und von der Steuereinheit 19 zur Auswertung in elektrische Signale umgewandelt und die resultierenden Impulssignale durch Abtastung (engl. „sampling“) digitalisiert und den Abtastperioden zugeordnet. Jeder Detektor 18B stellt dabei einen separaten Eingangskanal dar. Die Abtastung erfolgt bei einer variablen Frequenz f von beispielsweise 80 MHz simultan zu dem für alle Eingangskanäle einheitlichen Pixeltakt von 2,5 MHz. Die auf diese Weise ermittelten Abtastergebnis-Bits werden wie zu 1 beschrieben in separaten Datenblöcken (einer pro Eingangskanal) aufgezeichnet und dem Steuerrechner 21 blockweise übermittelt. Jeder Eingangskanal wird dabei mit einer eigenen Kanalidentifikationsnummer im jeweils ersten FCS-Datenwort des jeweiligen Datenblocks gekennzeichnet. Alternativ könnte diese Kennzeichnung in ungenutzten Bits in einem der beiden Wörter des LVDS-Kopfs in einem zusätzlichen Wort im LVDS-Kopf oder nach den FCS-Datenwörtern gespeichert werden.
• Die Steuereinheit 19 weist zur Synchronisation mit dem Pixeltakt beispielsweise eine elektronische Auslöseschaltung zur Überwachung des Pixeltakts auf, die bei Identifikation einer ansteigenden Flanke eine Unterbrechungsanforderung (engl. „interrupt request“; IRQ) in der Zentraleinheit (beispielsweise ein FPGA) der Steuereinheit 19 auslöst. Als Reaktion darauf sichert die Zentraleinheit den gegenwärtigen Stand des Pixeltakt-Zählers in eine gesonderte Speicherstelle, die mit einem ungültigen Wert initialisiert und bei jedem Zurücksetzen des Pixeltakt-Zählers wieder mit einem ungültigen Wert beschrieben wird. Die gesonderte Speicherstelle wird stets dann ausgelesen, wenn der Pixeltakt-Zähler seinen Maximalwert (also die Breite des Schieberegisters, hier vierzehn) erreicht. Ergibt das Auslesen der gesonderten Speicherstelle einen gültigen Wert, so prüft die Zentraleinheit zunächst, ob einer der Pausenzähler größer als Null ist. Für jeden Eingangskanal, auf dessen Pausenzähler das zutrifft, speichert die Steuereinheit 19 im betreffenden Datenblock den derzeitigen Pausenzähler so, als ob im betreffenden Schieberregister ein Impulssignalereignis registriert wäre. Anschließend speichert die Steuereinheit 19 in jedem Datenblock jeweils ein FCS-Datenwort mit dem beispielhaften Identifikationsbitmuster 01₂ („Synchronisationswort“), das in den Datenbits den aus der gesonderten Speicherstelle ausgelesenen Wert enthält. Der Wert gibt die Nummer des Bits an, in dessen Abtastperiode die positive Flanke des Pixeltakts fiel. Die Numerierung kann beispielsweise entweder beim niedrigstwerten Bit (engl. „least significant bit“; LSB) oder beim höchstwertigen Bit (engl. „most significant bit“; MSB) beginnen. Die Bit-Angabe der Pixeltaktflanke bezieht sich auf das unmittelbar anschließend zu speichernde Ereignis- oder Leerlaufwort. Zu diesem Zweck wird das Aufzeichnungsverfahren fortgesetzt wie zu 1 beschrieben.
• Die übermittelten Impulssignale werden im Steuerrechner 21 zur FCS-Analyse verwendet. Je nach Anzahl der installierten Detektionskanäle kann es sich um Auto- oder Kreuzkorrelationsanalysen handeln. Hierbei werden am aktuellen Probenort beispielsweise Diffusionszeiten, Teilchenzahlen, Lebensdauern und/oder Anteile von Komponenten ermittelt. Durch die Integration des Fluoreszenzdetektionsmoduls F in das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop 10 ergibt sich durch die abtastperiodengenaue Verknüpfung von Abtastereignis-Bits und Pixeltaktflankenzeitpunkten die Möglichkeit, FCS-Analyseergebnisse von Messungen an verschiedenen Probenorten mit hoher Genauigkeit zu einem bildhaften Ergebnis zu kombinieren. Dadurch können FCS-Messorte probenschonend mit hoher Genauigkeit festgelegt und andererseits auch FCS-Analysenergebnisse von Messungen an verschiedenen Orten zur Bildgebung verwendet werden. Beispielsweise ist es möglich, über unterschiedliche Farbgebung eine farbige flächenhafte oder räumliche Darstellung von Diffusionszeiten oder anderer Analysenergebnisse in Abhängigkeit vom Messort zu erzeugen. Weiterhin kann durch speichermäßige Zuordnung das aufgenommene FCS-Bild beispielsweise als Zusatzfarbe bildlich mit kanalweise andersfarbigen LSM-Bildern verknüpft werden. Es können auch FCS/LSM Differenz- oder Quotientenbilder oder anderweitige Kombinationen gebildet und dargestellt werden.
• Die maßgeblichen bei der Aufzeichnung von der Steuereinheit 19 ausgeführten Schritte werden in 3 rekapituliert.
• In 4 zeigt Teilfigur A eine Beispielsequenz von Abtastergebnis-Bits eines einzelnen Eingangskanals „0“ und Teilfigur B den resultierenden Datenblock, wobei das aufzeichnende Mikroskop die LVDS-Bus-Identifikation 810₁₆ aufweist. Bei jedem gesetzten Abtastergebnis-Bit ist symbolisch ein Signalimpuls E eingezeichnet. Die Zeitpunkte, an denen eine steigende Pixeltaktflanke PT identifiziert wird, sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
• Mit der als Beispiel verwendeten Schieberegisterbreite und Datenbitanzahl von vierzehn können in einem Datenblock minimal (ohne Pausenzähler) 255x14=3570 Abtastergebnis-Bits kodiert und übertragen werden. Daraus ergibt sich im Falle einer Abtastfrequenz von 80 MHz eine Gesamtzeit pro Datenblock von 44,625 µs. Für die Übertragung der Daten über den LVDS-Bus ergibt sich eine Datenmenge von (255+2)x2 Bytes. Für die Übertragung dieser Datenmenge in Echtzeit, also in 44,625 µs, wird eine Bandbreite von 11,6 MByte/s benötigt. Bei einem LVDS-Bustakt von 60 MHz beträgt die maximale Bandbreite 120 MByte/s, so dass maximal 10 erfindungsgemäß kodierte FCS-Eingangskanäle gleichzeitig übertragen werden können. Mehr Eingangskanäle (beispielsweise 16) können beispielsweise verwendet werden, indem die Abtastfrequenz herabgesetzt wird.
• Bezugszeichenliste

10

Konfokales Mikroskop

11

(A, B) Laser

12

Probe

13

Mikroskopobjektiv

14

(A, B) Nebenfarbteiler

15

(A, B) Hauptfarbteiler

16

Konfokale Blende

18

(A, B) PMT-Detektor

19

Steuereinheit

20

Peripherieschnittstelle

21

Steuerrechner

22

Lichtwellenleiter

23

Kollimationsoptik

24

Strahlvereiniger

25

Scannerspiegel

26

Scan-Objektiv

27

Probentisch

28

Strahlumschaltungseinheit

E

Signalimpuls

PT

Pixeltaktflankenzeitpunkt

M

Mikroskopeinheit

S

Scanmodul

F

Fluoreszenzdetektionsmodul

Claims (14)

1. Verfahren zum Aufzeichnen von Impulssignalen eines Eingangskanals eines Mikroskops (10), der mit einer vorgegebenen Abtastfrequenz auf Impulssignale abgetastet wird, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Periode der Abtastfrequenz ein das betreffende Abtastergebnis repräsentierendes Bit zugeordnet wird und diese Abtastergebnis-Bits aufeinanderfolgend in einem Datenblock gespeichert werden und die Abtastung simultan zu einem Pixeltakt erfolgt, der niedriger ist als die Abtastfrequenz, wobei, wenn eine Flanke des Pixeltakts zu einem Flankenzeitpunkt (PT) identifiziert wird, das zu dem Flankenzeitpunkt (PT) gehörige Abtastergebnis-Bit markiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtastergebnis-Bits in dem Datenblock unmittelbar oder nur mittelbar aufeinanderfolgend gespeichert werden.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtastergebnis-Bits wortweise zusammengefasst gespeichert werden, wobei eine vorgegebene Menge von Bits eines solchen Wortes freigehalten und mit einem ersten Identifikationsbitmuster versehen wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei anstelle einer Folge von Bits, die ausschließlich ereignislose Perioden repräsentieren, die Länge dieser Folge gespeichert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der ereignislosen Folge als Wort gespeichert wird, wobei eine vorgegebene Menge von Bits dieses Wortes freigehalten und mit einem zweiten Identifikationsbitmuster versehen wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zum Markieren eines zu einem Flankenzeitpunkt (PT) gehörigen Abtastergebnis-Bits vor oder nach dem Wort, das das zu dem Flankenzeitpunkt (PT) gehörige Abtastergebnis-Bit enthält, die Bitposition des zugehörigen Abtastergebnis-Bits innerhalb dieses Worts gespeichert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bitposition als Wort gespeichert wird, wobei eine vorgegebene Menge von Bits dieses Wortes freigehalten und mit einem dritten Identifikationsbitmuster versehen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtastung zu einem Flankenzeitpunkt (PT) begonnen wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass am Anfang des Datenblocks eine Länge des Datenblocks, und eine Eingangskanalidentifikation sowie eine Prüfsumme über den Datenblock gespeichert werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Wort eine Länge von 8, 16, 32 oder 64 Bit aufweist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Eingangskanäle simultan abgetastet werden und für jeden der Eingangskanäle ein separater Datenblock gespeichert wird.
12. Steuereinheit (19), eingerichtet zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Verfahrensansprüche.
13. Fluoreszenzdetektionsmodul für ein konfokales Mikroskop (10) oder ein Laser-Scanning-Mikroskop (10), mit einer Steuereinheit (19) nach Anspruch 12 und mindestens zwei Detektionskanälen als Eingangskanäle.
14. Konfokales oder Laser-Scanning-Mikroskop (10) mit einer Steuereinheit (19) nach Anspruch 12 und mindestens zwei Detektionskanälen als Eingangskanäle.

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