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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und Verfahren zur kontinuierlichen zeitaufgelösten Einzelphotonenregistrierung aus einer Mehrzahl von Detektionskanälen, insbesondere für Anwendungen in der zeitaufgelösten Fluoreszenzspektroskopie.
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Stand der Technik
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Zeitkorreliertes Einzelphotonenzählen (time correlated single photon counting, TCSPC) ist eine leistungsfähige Methode für empfindliche zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen bis hinab zur Einzelmolekülspektroskopie. Die Methode beruht auf der exakten zeitlichen Erfassung einzelner Photonen, z. B. eines Fluoreszenzsignals. Eine Beschreibung von TCSPC findet sich in
DE 197 02 914 C2 , bzw.
WO 1998/023941 A2 .
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Ursprünglich wurde die Methode hauptsächlich mit dem Ziel der Bestimmung von Fluoreszenz-Lebensdauern eingesetzt. Hierbei reduziert sich die Aufgabe der zeitlichen Erfassung einzelner Photonen auf eine wiederholte Differenzmessung zwischen dem Zeitpunkt der Fluoreszenzanregung (z. B. durch kurze Laserpulse) und dem Zeitpunkt der Detektion eines Fluoreszenzphotons. Während die einzelnen Differenzen zunächst zufällig sind, erhält man mit dem Histogramm vieler solcher Differenzen eine zeitaufgelöste Repräsentation des Fluoreszenzzerfalls. Die Zeitmessung erfolgt auf elektrischen Puls-Signalen, die im Falle der Photonen von geeigneten Einzelphotonendetektoren geliefert werden, und im Falle der Fluoreszenz-Anregungspulse oft direkt z. B. vom Anregungslasersystem bereitgestellt werden. Letztere Signale werden auch als Synchronisationssignale bezeichnet.
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Die praktisch relevanten Fluoreszenzlebensdauern, z. B. in der Bioanalytik, liegen in der Größenordnung von 0,5 bis 100 Nanosekunden. In der Analyse ist allerdings nicht nur die mittlere Fluoreszenzlebensdauer, sondern auch die genaue Form des Fluoreszenzzerfalls von Bedeutung, z. B. bei der Unterscheidung gemischter Spezies oder bei der Untersuchung von Rotationsprozessen.
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Die Zeitmessung für die einzelnen Photonen erfolgt üblicherweise mit Hilfe schneller elektronischer Schaltungen, die eine Zeitauflösung bis in den einstelligen Pikosekundenbereich erlauben. Die historisch verbreitetste Lösung dafür ist die Kombination so genannter Zeit-Amplituden-Konverter (time to amplitude converter, TAC) mit einer nachfolgenden Analog-Digital-Wandlung. In der jüngeren Zeit dominieren dagegen sogenannte Zeit-Digital-Wandler (time to digital converter, TDC), die bei ähnlichen Auflösungen erheblich längere Zeitspannen messen könen und meist durch eine Quarzreferenz dauerhaft kalibriert sind (Kalisz, 2004).
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Nachdem für ein Photon ein digitales Zeitdifferenzergebnis ermittelt wurde, muss im Folgenden nur noch die korrespondierende Zelle eines Histogrammspeichers inkrementiert werden. Dies wird üblicherweise ebenfalls durch schnelle Elektronik direkt in Hardware realisiert.
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Da die Histogrammbildung über Zeitdifferenzen für die Aufzeichnung von Fluoreszenzzerfällen ausreichend ist, wird nur eine ”lokale” Zeitinformation zwischen einem Anregungspuls und dem nächsten Photon ausgewertet, die im Bereich von Pikosekunden bis Nanosekunden liegt. Diese ”lokale” Auswertung der Zeitinformation begrenzt dabei auch die Menge an Information, welche aus einem Experiment gewonnen werden kann.
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Obwohl diese Art der Anwendung heute noch wichtig ist, kann aus einem Experiment mit zeitlicher Erfassung von Photonenereignissen oft viel mehr Information gewonnen werden, wenn man die Zeitinformation nicht nur ”lokal” gewinnt und auswertet, sondern jedes Ereignis auf einer ganzheitlichen Zeitspur über die Dauer des gesamten Experiments erfasst. Dadurch ist nach dem Experiment eine Auswertung unter unterschiedlichen Gesichtspunkten möglich. Z. B. können auf diese Weise die gewonnen Fluoreszenzdaten sowohl mittels TCSPC hinsichtlich der Fluoreszenz-Lebensdauer ausgewertet werden, als auch mittels Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) hinsichtlich Diffusion und damit räumlichen Dimensionen.
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Diese Vorgehensweise hat sich erfolgreich als ”zeitgestempelte” Aufzeichnung von Einzelphotonen etabliert, d. h. jedes registrierte Ereignis wird als Datensatz (Ereignisdatensatz) zusammen mit einem Zeitstempel gespeichert, der den genauen Zeitpunkt der Erfassung enthält. Durch die Aufzeichnung aller dieser Datensätze im Laufe eines Experiments erhält man eine vollständige Erfassung aller gemessenen Ereignisse. Damit sind fortgeschrittene und neue Anwendungen wie Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildaufzeichnung mit großen Bildformaten (Koberling et al., 2003) sowie die Fluoreszenz-Lebensdauer-Korrelationsspektroskopie (Gregor et al., 2007) möglich geworden.
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Entsprechende Geräte, die den neuesten Stand der Technik repräsentieren, gestatten die Zeitstempelung mit Pikosekunden-Auflösung.
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So beschreiben Wahl et al. (1998) die Verwendung der ”zeitgestempelten” Aufzeichnung von Photonen und deren Weiterverarbeitung in Echtzeit zur Fluoreszenz-Lebenszeit-Berechnung und Einzelmoleküldetektion. Um dabei eine möglichst hohe Genauigkeit über die gesamte Dauer des Experiments zu gewährleisten, wird die pikosekundengenaue Zeit des Ereignisses immer relativ zu einem langsameren Zeittakt angegeben. Der Ereignisdatensatz enthält daher neben der pikosekundengenauen Zeit des TDCs immer noch die zugehörige ”real-time” Zeit, relativ zum Beginn des Experiments. Diese Methode wird als time-tagged time-resolved (TTTR) bezeichnet. Dadurch ist es möglich, den genauen Zeitpunkt jedes Ereignisses über die gesamte Dauer des Experiments aufzuzeichnen.
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Koberling et al. (2003) beschreiben die Anwendung von TCSPC mit TTTR für zwei Wellenlängen. Die Aufzeichnung mittels TTTR eignet sich dabei auch dazu, andere Daten, wie beispielsweise die Positionsdaten des aktuellen Messpunkts in einem konfokalen Fluoreszenzmikroskops, als zeitmarkierte Ereignisse zu erfassen, die als eigene Ereignisdatensätze eingefügt werden können.
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Dadurch sind alle zur Auswertung der Daten relevanten Daten zusammen verfügbar und werden direkt auf dem angeschlossenen Rechner gespeichert. Nach dem Experiment können sie unter verschiedenen Gesichtspunkten ausgewertet werden.
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Eine Anordnung von zwei Kanälen, welche TTTR mit zwei unabhängigen Kanälen realisiert, beschreiben Wahl et al. (Wahl et al., 2007). Dabei arbeiten zwei TDCs mit einer gemeinsamen Zeitbasis. Dadurch konnte beispielsweise die Totzeit des Gesamtsystems eliminiert werden. Eine Erweiterung durch einen dritten Kanal war bei dem geschilderten System nicht möglich.
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Existierende Lösungen, die mehrere Detektionskanäle durch Multiplexing mit einer einzigen Zeitmesseinheit verbinden, beschrieben in
DE 4339784 A1 , sind auf Anwendungsfälle mit geringer Wahrscheinlichkeit des gleichzeitigen Eintreffens von Photonenereignissen auf mehr als einem Kanal beschränkt, da anderenfalls keine eindeutige Zuordnung zu einem Kanal möglich ist. Die Kanäle sind daher nicht unabhängig, und es entstehen Artefakte bei Korrelationsmessungen. Prinzipbedingt sind der möglichen Kanalzahl enge Grenzen gesetzt. Weiterhin sind Anwendungen mit hohen Zählraten, wie z. B. die optische Tomographie, stark eingeschränkt. Darüber hinaus muss jedem Kanal separat ein Synchronisationssignal von der zugehörigen Anregungslichtquelle zugeführt werden.
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Existierende Lösungen, die mehrere unabhängige Kanäle bereitstellen, werden bisher auf zwei Wegen realisiert: Im ersten Falle betreibt man mehrere klassische TCSPC-Elektroniken parallel (Becker et al., 2001). Hierbei stellt jede Einheit einen Kanal dar. Aus jeder Einheit entstehen separate Datenströme, die durch den verarbeitenden Rechner wieder zusammengeführt werden und geordnet werden müssen. Dies schränkt die Echtzeitauswertung der Daten, z. B. in Form von Korrelationsanalysen, erheblich ein.
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Im zweiten Falle realisiert man mehrere Kanäle integriert als eine Einheit mit einer bestimmten Anzahl von Kanälen im einstelligen Bereich. Produkte auf dem Markt sind derzeit z. B. B & H DPC-230, Agilent TC890 oder SENSL HRMTime. Auch dieser Ansatz ist limitiert im Sinne der Skalierbarkeit. Versucht man, mehrere dieser Einheiten parallel zu betreiben, besteht erneut das Problem getrennter Datenströme, die nachträglich sortiert werden müssen.
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Eine gemeinsame Limitierung bekannter Systeme besteht daher vor allem in der Anzahl möglicher unabhängiger Anregungs- und/oder Detektionskanäle. Um mit Signalen von mehreren Detektoren bis hin zu Matrixdetektoren arbeiten zu können, z. B. zur Realisierung mehrerer Farbkanäle oder für bildgebende Verfahren, sind Kanalzahlen von einigen wenigen bis zu hunderten von Interesse. Die bisher bekannten Lösungen erfordern immer eine Konstruktion einer speziellen Messanordnung für jedes einzelne Problem und sind dementsprechend nur schwierig erweiterbar.
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Aufgabe
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile des Standes der Technik für zeitaufgelöstes Einzelphotonenzählen zu überwinden. Aufgabe der Erfindung ist es insbesondere ein Verfahren anzugeben, das bezüglich der Anzahl möglicher Kanäle und der Dauer des Experiments beliebig skalierbar ist und unabhängig von der Anzahl der Kanäle stets einen einheitlichen, sortierten Datenstrom hervorbringt.
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Lösung
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Diese Aufgabe wird durch die Erfindung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Die Erfindung umfasst auch alle sinnvollen und insbesondere alle erwähnten Kombinationen von unabhängigen und/oder abhängigen Ansprüchen.
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Die Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung zur simultanen zeitaufgelösten Einzelphotonenregistrierung aus einer Mehrzahl von Detektionskanälen mit einer Mehrzahl von Zeitmesseinheiten, einer gemeinsamen Zeitbasis für alle Zeitmesseinheiten und einer zentralen Verarbeitungseinheit. Typischerweise enthält ein Detektionskanal sowohl optische Komponenten zum Sammeln der Photonen als auch einen Einzelphotonendetektor, wie eine single-photon avalanche Diode (SPAD) oder einen Photomultiplier (PMT).
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Die Zeitmesseinheiten enthalten dazu mindestens einen Eingangskanal um Signale aus einem der Detektionskanäle einspeisen zu können. Allerdings können auch andere Signale, wie beispielsweise Signale synchron zu den Pulsen eines Anregungslasers zugeführt werden.
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Zusätzlich enthalten die Zeitmesseinheiten einen Zeit-Digital-Wandler (time-to-digital converter, TDC) zur Zeitmessung. Ein TDC erfasst den Zeitpunkt eines Signals und gibt ihn in digitaler Form aus. Die für TDCs üblichen Realisierungen bzw. elektrischen Schaltungen sind in Kalisz (2004) beschrieben.
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Typischerweise enthält ein TDC einen Zähler, der durch den Takt einer Zeitbasis getriggert wird. Auf diese Weise wird eine erste grobe Zeitskala geschaffen. Für höhere Zeitauflösungen wird zwischen den Takten der Zeitbasis interpoliert.
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Der Zähler zählt üblicherweise von Null bis zu der größten durch seine Bitbreite vorgegebenen Zahl. Während einer solchen Zählung kann er eine Mehrzahl von Ereignissen erfassen und deren Zeitpunkt digital ausgeben.
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Die Zeit-Digital-Wandler aller Zeitmesseinheiten arbeiten mit der gemeinsamen Zeitbasis.
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Des Weiteren enthalten die Zeitmesseinheiten Mittel, die für jedes Signal des Einzelphotonendetektors mit Hilfe des Zeit-Digital-Wandlers einen Ereignisdatensatz erzeugen, der die Ankunftszeit des Signals angibt. Dadurch wird jedes Signal mit seiner Ankunftszeit gespeichert. Die Auflösung der Zeit-Digital-Wandler kann entsprechend den Anforderungen des Experiments angepasst werden. So sind Auflösungen von unter einer Pikosekunde ebenso möglich, wie mehrere Pikosekunden oder gar Nanosekunden.
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Die maximale Dauer der Zeit, die erfasst werden kann und damit auch die späteste Ankunftszeit des Signals, ist durch die zur Zeiterfassung verwendete Menge an Bits im Zeit-Digital-Wandler, beispielsweise zwischen 10 und 32 Bit, begrenzt. Diese Beschränkung wird dadurch überwunden, dass die Zeitmesseinheiten Mittel enthalten, die bei Überlauf des Zeit-Digital-Wandlers einen Überlaufdatensatz erzeugen. Dadurch kann beliebig lange mit voller Auflösung kontinuierlich gemessen werden. Dies ermöglicht Messungen auf längeren Zeitskalen, z. B. über Millisekunden oder Sekunden, im Prinzip unbegrenzt, also auch über Minuten und Stunden.
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Um nun bei einer Mehrzahl an Eingangskanälen und mehreren Zeitmesseinheiten die erzeugten Ereignisdatensätze oder Überlaufdatensätze identifizieren zu können, enthalten die Zeitmesseinheiten Mittel, die jeden Ereignisdatensatz und jeden Überlaufdatensatz um eine Identifikation der Zeitmesseinheit ergänzen, in dem diese erzeugt wurden, und/oder des Eingangskanals des Signals. Dadurch können später alle Datensätze eindeutig zugeordnet werden.
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Des Weiteren enthalten die Zeitmesseinheiten Mittel zum Senden der Ereignisdatensätze und Überlaufdatensätze zu der zentralen Verarbeitungseinheit. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Mitteln um eine serielle Verbindung, beispielsweise über die Backplane eines Frames, wenn die einzelnen modularen Zeitmesseinheiten als Einschübe für den Frame ausgeführt sind. Es können auch optische Datenverbindungen verwendet werden.
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Die angegebenen Mittel der Zeitmesseinheiten können beispielsweise durch einen oder mehrere FPGAs ausgeführt werden. Dadurch ist auch gleichzeitig eine flexible Anpassung der Verarbeitung der Signale möglich.
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Zusätzlich können die Zeitmesseinheiten Eingangskanäle enthalten, in die Signale eingespeist werden können, für welche die zeitliche Auflösung der gemeinsamen Zeitbasis der Zeitmesseinheiten ausreichend ist, wie beispielsweise der Zeilenumbruch bei bildgebenden Verfahren oder Positionsdaten einer Scaneinrichtung. Für diese ist eine sehr genaue Zeitmessung, wie sie im Zeit-Digital-Wandler durch Interpolation erzielt wird, nicht zwingend nötig. Daher werden für diese Signale Ereignisdatensätze erzeugt, welche nur die Zeitangabe bzw. den Zählerstand des Zählers des TDC enthalten, der durch die gemeinsame Zeitbasis getriggert wird. Dadurch können beliebige Informationen eines Experiments direkt und zeitsynchron in die Messdaten eingebettet werden. Dies erleichtert die Auswertung und erhöht die Datensicherheit, da alle Daten gemeinsam erfasst und/oder verarbeitet werden können.
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Alle Zeitmesseinheiten werden – wie oben bereits angegeben – mit einer gemeinsamen Zeitbasis betrieben. Deren Frequenz kann z. B. durch phase locked loops in einzelnen Zeitmesseinheiten in unterschiedliche Frequenzen umgewandelt werden. Die Laufzeiten der Zeitbasis-Signale durch die unterschiedlichen Verbindungen zwischen den Zeitmesseinheiten können durch eine Kalibrierung der Zeit-Digital-Wandler berücksichtigt werden.
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Durch die gemeinsame Zeitbasis sind die von den Zeitmesseinheiten erzeugten Überlaufdatensätze miteinander synchronisiert.
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Die zentrale Verarbeitungseinheit hat die Aufgabe alle erhaltenen Ereignisdatensätze chronologisch zu ordnen und/oder zu verarbeiten.
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Um die Daten aller Zeitmesseinheiten chronologisch ordnen und/oder verarbeiten zu können, enthält die zentrale Verarbeitungseinheit eine Mehrzahl von Daten-Puffern, wobei jeder Daten-Puffer jeweils die von einer Zeitmesseinheit gesendeten Datensätze empfängt und speichert. Bevorzugt sind diese Puffer FiFo-Puffer (first-in-first-out-Puffer). Ihre Größe wird so gewählt, dass mindestens die im Experiment anfallende Datenmenge zwischen zwei Überlaufdatensätzen gespeichert werden kann.
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Diese Puffer sind notwendig, da u. U. durch Verzögerungen bei der Übertragung oder der Verarbeitung in den Zeitmesseinheiten, beispielsweise bei hohen Ereignisraten, die Ereignisdatensätze eines bestimmten Zeitpunkts nicht gleichzeitig mit den Ereignisdatensätzen des gleichen Zeitpunkts einer anderen Zeitmesseinheit bei der zentralen Verarbeitungseinheit eintreffen. Die Datensätze jeder Zeitmesseinheiten werden zwar in der Reihenfolge ihrer Erzeugung übertragen, die Datensätze verschiedener Zeitmesseinheiten kommen aber u. U. nicht gleichzeitig an der zentralen Verarbeitungseinheit an.
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Um die Daten in den Puffern verarbeiten zu können, enthält die zentrale Verarbeitungseinheit Mittel, die alle Ereignisdatensätze aus allen Daten-Puffern mit Hilfe der Überlaufdatensätze chronologisch sortieren und/oder verarbeiten. Dazu werden alle Ereignisdatensätze sortiert und/oder verarbeitet, welche zwischen Paaren zeitgleicher Überlaufdatensätze der Zeitmesseinheiten erfasst wurden. Dabei werden die Ereignisdatensätze in neue Datensätze umgewandelt, welche beispielsweise eine gemeinsame Zeitzählung aufweisen, welche nicht mit der vorherigen übereinstimmen muss. Dabei können beispielsweise redundante Überlaufdatensätze entfernt und auf einen einzigen reduziert werden. Bevorzugt sind diese Mittel derart ausgeführt, dass der Algorithmus zur Sortierung oder Verarbeitung der Datensätze frei wählbar ist, also z. B. als FPGA oder DSP.
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Des Weiteren enthält die zentrale Verarbeitungseinheit einen Ausgangskanal, der die neuen Datensätze an mindestens eine weiterverarbeitende Recheneinheit sendet. Der Ausgangskanal ist bevorzugt eine serielle Datenverbindung, besonders bevorzugt eine Standardschnittstelle, wie USB, FireWire oder PCI-express. Bei der Übermittlung der neuen Datensätze kann das gleiche Prinzip der Zeitcodierung mit Überlaufdatensätzen verwendet werden wie bei der Übermittlung zwischen Zeitmesseinheiten und zentraler Verarbeitungseinheit.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt die zeitaufgelöste Registrierung von Photonenereignissen aus einer Mehrzahl von Detektionskanälen ohne die Nachteile des Stands der Technik. Sie ist durch ihren modularen Aufbau beliebig skalierbar. Die Ereignisse auf den einzelnen Kanälen werden über die gesamte Dauer des Experiments in voller Auflösung vermessen. Durch die Synchronisation aller Kanäle auf eine gemeinsame Zeitbasis können die Ereignisse aller Kanäle in ihrer genauen zeitlichen Lage zueinander erfasst werden, und können so chronologisch sortiert und/oder verarbeitet werden. Die Erfindung beseitigt die Einschränkungen bestehender Lösungen dahingehend, dass eine modulare Skalierbarkeit möglich wird, ohne dazu mehrere Einheiten einzeln an den Rechner zu koppeln, die prinzipbedingt getrennte Datenströme liefern, welche nachträglich durch Software geordnet werden müssen und damit Einschränkungen in der Echtzeitanalyse der Daten bewirken.
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Die auf oben angegebene Weise sortierten und/oder verarbeiteten Daten können in Echtzeit ausgewertet werden, da sichergestellt ist, dass für ein bestimmtes Zeitfenster alle Daten geordnet bzw. sortiert vorliegen. Erst durch diese Sortierung ist es für manche Anwendungen möglich, die Daten in Echtzeit zu analysieren.
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In eine der Zeitmesseinheiten kann ein Signal einer Anregungslichtquelle, z. B. eines Ultrakurzpulslasers, eingespeist werden, evtl. nachdem es durch einen Teller in seiner Frequenz reduziert wurde. Für jedes Signal bzw. für jeden Puls wird ein Ereignisdatensatz erzeugt. Mit Hilfe dieser Ereignisdatensätze können durch spätere Auswertung z. B. TCSPC-Analysen durchgeführt werden. Ein Vorteil der Vorrichtung besteht darin, dass für beliebig viele Detektionskanäle lediglich ein einziger Kanal für die Aufnahme von Signalen der Anregungsquelle (Synchronisationskanal) benötigt wird.
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Vorteilhafterweise enthalten die Mittel der Zeitmesseinheiten zum Senden der Ereignisdatensätze und Überlaufdatensätze zu der zentralen Verarbeitungseinheit mindestens einen FIFO-Puffer (first-in-first-out-Puffer), zum Abpuffern von Verzögerungen beim Senden, beispielsweise bei hohen Ereignisraten.
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In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird die gemeinsame Zeitbasis extern eingespeist, beispielsweise durch eine Atomuhr.
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Es ist auch möglich, dass die zentrale Verarbeitungseinheit Mittel zum Erstellen von Histogrammen oder Korrelationsfunktionen enthält. Dadurch kann für bestimmte Anwendungen die Auswertung auf der angeschlossenen Recheneinheit weiter vereinfacht werden, da nur die wirklich benötigten Daten übertragen werden. z. B. können Photonenereignisse mit den Pulsen eines Anregungslasers korreliert werden, um so TCSPC-Auswertungen durchführen zu können.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind mehrere zentrale Verarbeitungseinheiten als Kaskade geschaltet. Dadurch können die Datensätze sehr vieler Zeitmesseinheiten verarbeitet werden. Alternativ könnte der Ausgangskanal einer zentralen Verarbeitungseinheit wieder an einen Eingangskanal einer anderen zentralen Verarbeitungseinheit angeschlossen werden. Dadurch ist das System im Prinzip beliebig erweiterbar, solange eine gemeinsame Zeitbasis für alle Zeitmesseinheiten gewährleistet ist.
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Die Konstruktion der einzelnen Komponenten der Vorrichtung kann ebenfalls frei gewählt werden. Vorteilhafterweise sind die einzelnen Komponenten als Einschübe für einen Frame konstruiert, um eine einfache Erweiterung sicherzustellen.
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Die vollständige Erfassung aller gemessenen Signale ermöglicht eine vielfältige Analyse der Daten für viele verschiedene Anwendungen, beispielsweise Fluoreszenzlebensdauer-Bilder (fluorescence lifetime imaging, FLIM), Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (fluorescence correlation spectroscopy, FCS) neben allen bekannten Standardanwendungen von TCSPC.
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Außerdem wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur simultanen zeitaufgelösten Einzelphotonenregistrierung aus einer Mehrzahl von Detektionskanälen.
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Im Folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.
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Wenn ein Einzelphotonendetektor aus einem der Detektionskanäle ein Photon detektiert hat, so wird das dabei entstandene Signal über einen Eingangskanal einer Zeitmesseinheit erfasst. Es gibt eine Mehrzahl von Zeitmesseinheiten. Jede enthält einen Zeit-Digital-Wandler.
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Für jedes eingehende Signal wird mit Hilfe des Zeit-Digital-Wandlers ein Ereignisdatensatz erzeugt, welcher die genaue Ankunftszeit des Signals enthält. Die Zeit-Digital-Wandler aller Zeitmesseinheiten arbeiten mit einer gemeinsamen Zeitbasis. Dadurch sind die Zeiten der Ereignisdatensätze miteinander vergleichbar.
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Da der Zeit-Digital-Wandler in seinem Zählumfang begrenzt ist, beispielsweise 10 bis 32 Bit, wird bei jedem Überlauf eines Zeit-Digital-Wandlers ein Überlaufdatensatz erzeugt und der Zeit-Digital-Wandler neu gestartet.
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Alle Ereignisdatensätze und alle Überlaufdatensätze werden mit einer Identifikation der Zeitmesseinheit, in dem diese erzeugt wurden, und/oder um eine Identifikation des Eingangskanals des Signals ergänzt. Dadurch ist jeder erzeugte Datensatz einem bestimmten Eingangskanal zuzuordnen.
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Alle Datensätze werden danach zur zentralen Verarbeitungseinheit gesendet. Der Datenstrom zwischen einer Zeitmesseinheit und der zentralen Verarbeitungseinheit enthält daher, wenn Ereignisse gemessen wurden, einen oder mehrere Ereignisdatensätze und in regelmäßigen Abständen einen Überlaufdatensatz, wenn der zugehörige Zeit-Digital-Wandler übergelaufen ist.
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Die Kodierung der unterschiedlichen Datensätze ist dabei frei wählbar. So kann beispielsweise die Anzahl an Bits für die Zeitinformation, bzw. die Identifikation den Erfordernissen des Experiments angepasst werden.
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Die zentrale Verarbeitungseinheit hat die Aufgabe die erhaltenen Ereignisdatensätze der Zeitmesseinheiten chronologisch zu sortieren und/oder zu verarbeiten. Dazu ist es notwendig, dass für ein bestimmtes Zeitfenster alle zugehörigen Ereignisdatensätze aller Zeitmesseinheiten vorliegen.
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Daher werden die Ereignisdatensätze und Überlaufdatensätze der Zeitmesseinheiten von der zentralen Verarbeitungseinheit in je einem Daten-Puffer zwischengespeichert. Jeder Daten-Puffer empfängt und speichert jeweils die von einer Zeitmesseinheit gesendeten Datensätze.
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Anschließend werden alle Ereignisdatensätze aller Daten-Puffer mit Hilfe der Überlaufdatensätze chronologisch sortiert und/oder auf andere Weise verarbeitet, wodurch neue Datensätze entstehen. Dazu werden vorzugsweise alle Datensätze zwischen zwei zeitgleichen Überlaufdatensätzen aus den Puffern ausgelesen und verarbeitet bzw. sortiert.
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Dadurch ist sichergestellt, dass alle Ereignisdatensätze aller Zeitmesseinheiten zur Sortierung und/oder Verarbeitung vorliegen. Bei der Sortierung und/oder Verarbeitung werden redundante Überlaufdatensätze der verschiedenen Zeitmesseinheiten entfernt. Außerdem kann auch das Format der Ereignisdatensätze verändert und den Erfordernissen des Experiments angepasst werden. So kann beispielsweise unter Verwendung des gleichen Formats zur Zeitkodierung die Überlaufperiode verändert werden. Außerdem können die Ereignisdatensätze direkt vorverarbeitet werden, beispielsweise zur Berechnung von Histogrammen oder Korrelationen zwischen verschiedenen Kanälen.
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Die sortierten und/oder verarbeiteten neuen Datensätze werden danach über einen Ausgangskanal an eine weiterverarbeitende Recheneinheit gesendet. Dadurch ist es bei Änderung der Messanordnung, beispielsweise bei Anschluss neuer Zeitmesseinheiten, möglich, keine Änderung an der Recheneinheit vorzunehmen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Erfassung von Ereignissen aus einer Mehrzahl von Detektionskanälen und ist beliebig skalierbar.
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In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird in den Eingangskanal einer Zeitmesseinheit bei einem Anregungspuls durch eine Lichtquelle ein Signal eingespeist, wodurch zu diesem Signal ein Ereignisdatensatz erzeugt wird. Dieser kann in der zentralen Verarbeitungseinheit z. B. für die Berechnung des zeitlichen Abstands zwischen dem Anregungspuls und einem detektierten Photon und damit für TCSPC-Auswertungen verwendet werden.
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Zusätzlich kann für bestimmte Signale das Erzeugen eines Ereignisdatensatzes derart durchgeführt werden, dass ein Ereignisdatensatz erzeugt wird, der die Ankunftszeit auf der gemeinsamen Zeitbasis der Zeitmesseinheiten angibt, also lediglich den Zählerstand des Zählers des TDCs, der durch die gemeinsame Zeitbasis getriggert wird. Dies kann für Signale verwendet werden, für die diese Zeitauflösung ausreichend ist, wie beispielsweise für den Zeilenumbruch bei bildgebenden Verfahren oder für Positionsdaten einer Scaneinrichtung. Mit Hilfe dieses Mechanismus können die Ereignisdatensätze des Experiments mit beliebigen physikalischen Größen (z. B. Felder, Pufferkonzentrationen oder Temperaturen) synchronisiert werden. Dadurch können beliebige Informationen eines Experiments direkt und zeitsynchron in die Messdaten eingebettet werden. Dies erleichtert auch die Auswertung und erhöht die Datensicherheit, da alle Daten gemeinsam erfasst und/oder verarbeitet werden können.
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Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt.
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Das Ausführungsbeispiel ist in der anliegenden Figur schematisch dargestellt.
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1 zeigt ein Blockdiagramm der bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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1 zeigt ein Blockdiagram der Vorrichtung zur simultanen zeitaufgelösten Einzelphotonenregistrierung mit den einzelnen Bestandteilen und ihren Verbindungen untereinander. Gruppen von drei Punkten bezeichnen die freie Skalierbarkeit des Systems.
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1 zeigt die zentrale Taktquelle 7 als eine eigene Baugruppe. In praktischen Realisierungsformen kann diese Einheit auch innerhalb einer anderen Baugruppe angeordnet werden.
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In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind mehrere Zeitmesseinheiten 3, 4, mit jeweils einem oder mehreren Eingangskanälen 1, über serielle Datenverbindungen 8 mit der zentralen Verarbeitungseinheit 9 verbunden.
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Die Zeitmesseinheiten enthalten einen TDC zur Zeitmessung, der mit einer Auflösung zwischen 0.1 ps und 5 μs, bevorzugt zwischen 0.5 ps und 50 ps arbeitet.
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Die Erzeugung der Ereignisdatensätze und Überlaufdatensätze wird in einem FPGA ausgeführt. Die Zeitmesseinheiten 4 enthalten zusätzlich (nicht gezeigte) FiFo-Puffer um Verzögerungen beim Senden der Ereignisdatensätze und Überlaufdatensätze abzupuffern.
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Für die Ereignisdatensätze werden vorzugsweise 32 Bit verwendet. Die Bedeutung der einzelnen Bits ist beispielhaft in Tabelle 1 gezeigt.
| Bit | 1 | 2–26 | 27–32 |
| | 1 = Photon,
0 = Überlauf | Ankunftszeit | Zeitmesseinheit und/oder Eingangskanal |
Tabelle 1
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Bei einer Auflösung des TDC von z. B. 1 ps wird in diesem Beispiel alle 2^25· 1 ps = 33 μs ein Überlaufdatensatz erzeugt.
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In der beispielhaften Darstellung in Tabelle 1 sind 6 Bit für die Kanalcodierung vorgesehen. Wenn das System für sehr große Kanalzahlen, z. B. für Anwendungen mit Array-Detektoren genutzt wird, würde man die Anzahl der Bits für die Kanalcodierung geeignet größer wählen.
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Alle Zeitmesseinheiten 4 sind über die Verbindung 5 mit der internen Uhr 7 verbunden. Die gemeinsame Zeitbasis beträgt zwischen 10 und 100 MHz, bevorzugt 10 MHz. Als Alternative kann ein externes Zeitsignal über den Anschluss 6 eingespeist werden.
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Die Zeitmesseinheit 3 enthält zusätzlich noch einen oder mehreren Eingangskanäle 2, die zur Erfassung von Informationen dienen, die nur mit der dem groben Takt der gemeinsamen Zeitbasis erfasst werden, beispielsweise Positionsdaten eines konfokalen Mikroskops oder das aktuelle Pixel bei bildgebenden Verfahren.
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In die Zeitmesseinheit 3 werden über den Eingangskanal 1 Taktsignale synchron zu den Anregungspulsen einer Lichtquelle, bevorzugt eines Lasers, eingespeist. Als Lichtquellen können neben Blitzlampen alle handelsüblichen gepulsten Laser verwendet werden, bevorzugt Diodenlaser mit einer Frequenz zwischen 5 und 80 MHz. Dabei kann die Menge an Taktsignalen durch einen den Eingangskanälen vorgeschalteten Teiler reduziert werden. Die dadurch weggelassenen Signale können entweder in der zentralen Verarbeitungseinheit oder bei der späteren Datenverarbeitung auf rechnerischem Wege wieder erzeugt werden.
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Die erzeugten Ereignisdatensätze und Überlaufdatensätze werden von jeder Zeitmesseinheit 4 über je eine serielle Verbindung 8 an die zentrale Verarbeitungseinheit übertragen.
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Die zentrale Verarbeitungseinheit 9 beinhaltet neben der Prozessiereinheit 9b, welche das Sortieren und/oder Verarbeiten der Ereignisdatensätze durchführt, noch Ein- bzw. Ausgangs-Puffer 9a für die verschiedenen Eingangskanäle 8 bzw. den Ausgangskanal 10. Die Verarbeitungseinheit 9 ist vorzugsweise ein FPGA, kann aber auch mittels eines DSP (digitaler Signal-Prozessor) realisiert werden. Dadurch kann der Algorithmus der Sortierung bzw. der Verarbeitung der Ereignisdatensätze frei programmiert werden.
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Der Ausgangskanal der zentralen Verarbeitungseinheit ist bevorzugt eine serielle Datenverbindung, besonders bevorzugt eine Standardschnittstelle, wie USB, FireWire oder PCI-express.
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Die Vorrichtung ist vorzugsweise als Frame mit Einschüben für die Zeitmesseinheiten 4 ausgeführt, welche mit der zentralen Verarbeitungseinheit über die Backplane kommunizieren. In diesem bevorzugten Fall ist die serielle Verbindung 8 zwischen Zeitmesseinheit 4 und zentraler Verarbeitungseinheit 9 durch Leiterbahnen auf der Backplane des Frames realisiert.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Eingangskanäle der Zeitmesseinheiten
- 2
- Eingangskanäle für zusätzliche Signale
- 3
- Zeitmesseinheit
- 4
- Zeitmesseinheiten
- 5
- Verteilung des Zeitsignals an alle Zeitmesseinheiten
- 6
- Anschluss für externes Zeitsignal
- 7
- Internes Zeitsignal
- 8
- Datenverbindungen zwischen Zeitmesseinheiten und zentraler Verarbeitungseinheit
- 9
- zentrale Verarbeitungseinheit
- 9a
- Puffer der zentralen Verarbeitungseinheit
- 9b
- Prozessiereinheit der zentralen Verarbeitungseinheit
- 10
- Ausgangskanal
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Liste der zitierten Literatur:
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DE 43 39 787 A1
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DE 197 02 914 C2
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WO 1998/023941 A2
- Becker W., Bergmann A., Wabnitz H., Grosenick D., Liebert A. ”High-count-rate multichannel TCSPC for optical tomography”, Proceedings of SPIE, Vol. 4431, p. 249–254 (2001)
- Gregor I., Enderlein J. ”Time-resolved methods in biophysics, 3. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy”, Photochemical & Photobiological Sciences, Vol. 06, p. 0013–0018 (2007)
- Kalisz, Jόzef, ”Review of methods for time interval measurements with picoseconds resolution”, Metrologia, Vol. 41, p. 17–32 (2004)
- Koberling F., Wahl M., Patting M., Rahn H. -J., Kapusta P., Erdmann R. ”Two channel fluorescence lifetime microscope with two colour laser excitation, single-molecule sensitivity and submicrometer resolution”, Proceedings of SPIE, Vol. 5143, p. 181–192 (2003)
- Wahl M., Erdmann R., Lauritsen K., Rahn H. -J. ”Hardware solution for continuous time-resolved burst detection of single molecules in flow”, Proceedings of SPIE, Vol. 3259, p. 173–178 (1998)
- Wahl M., Rahn H. -J., Gregor I., Erdmann R., Enderlein J. ”Deadtime optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels”, Review of Scientific Instruments, Vol. 78, 033106 (2007)
