DE102008024526A1

DE102008024526A1 - Verfahren und Anordnung zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen

Info

Publication number: DE102008024526A1
Application number: DE102008024526A
Authority: DE
Inventors: Charaf Cherkouk; Lars Rebohle; Wolfgang Skorupa
Original assignee: Forschungszentrum Dresden Rossendorf eV
Current assignee: Forschungszentrum Dresden Rossendorf eV
Priority date: 2008-05-21
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2009-12-03

Abstract

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen vor Ort zu realisieren. Der Nachweis basiert auf einer Fluoreszenzanalyse, wobei eine integrierte Lichtquelle mit einer bioaktiven Schicht auf deren Oberfläche verwendet wird. Die bioaktive Schicht wird durch ein spezielles Hybridisierungs- und Silanisierungsverfahren erzeugt. Die Messung erfolgt durch die optische Detektion farbstoffmarkierter Hormonmoleküle, die nach einem bestimmten Messprotokoll die Rezeptoren belegen, die noch nicht durch Hormone aus der Messprobe gesättigt worden sind.

Description

Die Bedeutung der Spurenanalytik nimmt sowohl in der Trinkwasserversorgung als auch in der Lebensmittelindustrie und bei der Diagnostik von Erkrankungen zu, wobei insbesondere die Trinkwasseranalyse im Mittelpunkt steht.
Zur Online-Überwachung der Wasserqualität wurde das RIANA-(RIver ANAlyzer) [Rodriguez S, Reder S, Lopez de Alda M, Gauglitz G and Barceló D.: Biosens Bioelectron. (19) 633–640, 2004.] und das AWACS-System (Automated Water Analyzer Computer supported System) [Tschmelak J. et al.: Intern. J. Environ. Anal. Chem. (85) 837–852, 2005] entwickelt, die beide auf der Methode der totalen internen Reflexions-Fluoreszenz (TIRF) basieren. Dabei wird das Licht einer externen Laserdiode in einen Wellenleiter eingekoppelt, auf dessen Oberfläche ein farbstoffmarkierter Analyt immobilisiert ist. Das evaneszente Feld der den Wellenleiter durchlaufenden Lichtwelle kann den Farbstoff anregen, dessen Fluoreszenz durch ein Array von Fotodioden detektiert wird. Die Intensität dieser Fluoreszenz ist ein Maß für die Konzentration des Analyten. Diese Systeme weisen bereits einen hohen Automatisierungsgrad auf und können stationär zur Überwachung der Wasserqualität eingesetzt werden.
Östrogene sind hormonaktive Substanzen, die sich in vier Klassen einteilen lassen: die endogenen Östrogene, die Phytoestrogene, die synthetischen Östrogene (z. B. Ethinylestradiol, das in der „Pille” enthalten ist) und die Xenoestrogene. [Proll G.: Biosensorsystem für vollständig automatisierte ultrasensitive Multianalyt-Immunoassays, Dissertation, Universität Tübingen, 2005.]. Etablierte Nachweismethoden im Labormaßstab wie die Gas- und Flüssigkeitschromatographie, die mit einem nicht unerheblichen apparativen und finanziellen Aufwand verbunden sind, werden zurzeit benutzt. Bei diesen Methoden muss man mit einer Reaktionszeit zwischen Probenentnahme und Ergebnis von ein bis drei Tagen rechnen.
Ziel der Erfindung ist es, schnelle, sensitive, kostengünstige und einfach zu bedienende analytische Nachweismethoden von Östrogen in wässrigen Lösungen zu entwickeln, die in ein portables Gerät integriert werden können. Dieses Biosensorsystem soll einen deutlich höheren Grad an Portabilität aufweisen als bestehende Systeme und schnelle Vor-Ort-Tests ermöglichen.
Die hier beschriebene Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen sowie eine geeignete Anordnung zu dessen Durchführung. Die Neuheit des Lösungsansatzes besteht vor allem darin, dass keine externe Lichtquelle verwendet wird, sondern diese auf einem Chip integriert ist. Dies ermöglicht eine deutliche Reduzierung der Geräteabmessungen, verbunden mit einer entsprechenden Ersparnis an Ressourcen, Energie und Herstellungskosten.
Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel für die Anordnung und für das Verfahren näher erläutert.
Die zugehörigen Abbildungen zeigen:
1: Hybridisierte Sensor-Oberfläche
2: Silanisierte Sensor-Oberfläche
3: XPS-Spektrum für silanisierte SiO₂-Oberflächen, die der Passivierungsschicht des Sensors entspricht. Die Abbildung zeigt den N1s-Peak an einer sauberen und an einer mit APS bedeckten Oberfläche nach verschiedenen Silanisierungszeiten
4: Aufbau des Sensors nach der Silanisierung und der Anbindung der Rezeptoren an die silanisierte Chip-Oberfläche
5: Aufbringen der kontaminierten Wasserprobe auf der Sensor-Oberfläche
6: Aufbringen der Referenzlösung auf der Sensor-Oberfläche
7: Messprinzip des Sensors
8: Auswertungsbeispiel des Messsignals
Der für das Verfahren zu verwendende Sensor besteht aus einem Si-basierten Lichtemitter [ DE 101 30 568 A1 ], der erst gereinigt, dann hybridisiert und silanisiert wird.
Für die Reinigungsprozedur werden folgende Schritte ausgeführt:

• Der Chip wird in eine 1,1,1-trichloroethane-Lösung für 5 Minuten getaucht und danach mit N₂-Gas getrocknet. Als Basis für die wässrige 1,1,1-trichloreethane Lösung kommt vorzugsweise CH₃CCl zum Einsatz.
• Der Chip wird in einer Aceton-Lösung für 5 Minuten getaucht und anschließend wieder mit N₂-Gas getrocknet.
• Der Chip wird für 5 Minuten in eine Methanol-Lösung eingetaucht und danach wieder mit N₂-Gas getrocknet.

Auf dem Sensor befindet sich eine 200 nm dicke SiO₂ Oberfläche. Die in-situ-Hybridisierung dieser Schicht wird in einem gasdichten Reaktionsraum (Hybridisierungskammer) durchgeführt. In der Hybridisierungskammer wird die Katalyselösung MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfone-Hydrate-Säure mit der Summenformel C₆H₁₃NO₄S·xH₂O) pipettiert. Die anschließende in-situ-Hybridisierung erfolgt vorteilhafter Weise bei Temperaturen um 50°C (1).
Die Silanisierung der Lichtemitter-Oberfläche ist von der Hybridisierungsqualität stark abhängig. Die Hybridisierung mit der Katalyselösung MES begünstigt die anschließende Silanisierung der Oberfläche. Die Silanisierung wird vorteilhafterweise mit einer APS-Lösung (N,N'-Bis(3-aminopropyl)-2-butene-1,4-diamine) durchgeführt. Die Chips werden für 1 bis 10 Minuten in die APS-Lösung getaucht.
Nach der Silanisierungsphase wird der Chip wieder mit Trichlorethan, Ethanol und destilliertes Wasser gereinigt, wobei nach jeder Reinigungsphase der Chip mit Stickstoffgas getrocknet wird (2).
An die reaktiven NH₂-Gruppen folgt dann die kovalente Adsorption der Rezeptoren. Dafür kommen verschiedene Rezeptoren in Frage, die käuflich erwerbbar sind. Die Rezeptoren weisen eine starke Wechselwirkung mit dem entsprechenden Östrogen auf, die nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip erfolgt (4).
Die Silanisierung kann im Falle von Östrogen auch mit anderen MPS ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane), NPS(n-propyltrimethoxysilane)-Lösungen mit jeweils -SH bzw. -CH₃ als funktionelle Gruppe je nach Rezeptortyp (z. B. aus der nicht-konventionellen Hefe Arxula adeninivorans gewonnenen menschliche Östrogen Rezeptor α (hERα) [Kunze et al. 2006]) durchgeführt werden.
Längere Silanisierungsprozesse sind im Fall von Östrogen nicht notwendig. 3 zeigt die XPS-Intensitäten bei unterschiedlichen Einwirkzeiten der APS-Lösung. Die Silanisierungsprozesse mit der APS-Lösung zeigen nach einer, nach fünf und nach zehn Minuten, dass sich auf der silanisierten Oberfläche ausreichend freien NH₂-Gruppen gebildet haben. Diese funktionelle Gruppe ist reaktiv auf den Östrogen-Rezeptor.
Beim Messverfahren kommt eine Referenzprobe zum Einsatz, die aus farbstoffmarkierten Hormonmolekülen besteht. Die optische Anregungswellenlänge des verwendeten Farbstoffs muss hinreichend gut mit der Emissionswellenlänge des integrierten Lichtemitters übereinstimmen.
Das Messverfahren besteht aus drei Schritten:

• Das Aufbringen der kontaminierten Probe auf die Chip-Oberfläche durch Pipettieren, Eintauchen oder Vorbeiströmen in einer Mikrofluidik (5). Eventuell vorhandene Östrogenmoleküle werden an den Rezeptoren immobilisiert.
• Das Spülen der Probe mit destilliertem Wasser, um leicht gebundene Östrogenmoleküle bzw. Fremdmoleküle zu beseitigen.
• Das Aufbringen einer Referenzprobe auf die Chip-Oberfläche durch Pipettieren, Eintauchen oder Vorbeiströmen in einer Mikrofluidik (6).
• Durch Anlegen einer Spannung regt der integrierte Lichtemitter den Farbstoff der Referenzprobe zur Photolumineszenz an. Das Lichtsignal des Farbstoffes wird mit Hilfe eines Filters vom Signal des integrierten Lichtemitters getrennt und mit einem Detektor gemessen (7).

Für die Verwendung dieses Verfahrens sind nur sehr geringe Farbstoffmengen in der Referenzprobe notwendig, damit werden die Kosten pro Nachweis reduziert.
Je nach Kontaminierungsgrad der Probe ergeben sich unterschiedliche Signalstärken, die in 8 dargestellt sind.

• Eine östrogenfreie Wasserprobe ergibt ein Fluoreszenz-Signal von 100%, da alle Rezeptoren mit farbstoffmarkierten Hormonen der Referenzprobe belegt werden können (8a).
• Eine mit Östrogen kontaminierte Wasserprobe ergibt ein Fluoreszenz-Signal zwischen 0 und 100% (z. B. 75%), da nur ein Teil der Rezeptoren mit farbstoffmarkierten Östrogen belegt ist (8b).
• Eine mit Östrogen stark kontaminierte Wasserprobe liefert kein Fluoreszenz-Signal, da alle imobilisierten Rezeptoren vollständig mit Östrogen aus der Wasserprobe belegt sind (8c).

Die Verminderung des Fluoreszenzsignals ist dabei proportional zu der in der Wasserprobe enthaltenen Hormon-Konzentration.
Durch die Anpassung der Silangruppe an existierende Rezeptoren anderer Hormone, ist dieses Verfahren auch für den Nachweis dieser Hormone geeignet.

APS: N,N'-Bis(3-aminopropyl)-2-butene-1,4-diamine
MPS: (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane
NPS: n-propyltrimethoxysilane
ITO: Indium Oxide Film
MES: 2-(N-Morpholino)ethanesulfone-Hydrate-Säure
1: Keine Silanisierung
2: 1 min-APS
3: 5 min-APS
4: 10 min APS
5: 120 min APS
6: 240 min APS
7: Chip-Oberfläche
8: Rezeptor
9: Silangruppe
10: Si-Subtrat mit Lichtemitter
11: Wässrige Lösung
12: Östrogen
13: Östrogenfreie Substanzen
14: Referenzlösung
15: Detektor
16: Filter

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- DE 10130568 A1 [0016]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Rodriguez S, Reder S, Lopez de Alda M, Gauglitz G and Barceló D.: Biosens Bioelectron. (19) 633–640, 2004 [0002]
- Tschmelak J. et al.: Intern. J. Environ. Anal. Chem. (85) 837–852, 2005 [0002]
- Proll G.: Biosensorsystem für vollständig automatisierte ultrasensitive Multianalyt-Immunoassays, Dissertation, Universität Tübingen, 2005 [0003]
- Kunze et al. 2006 [0022]

Claims

Anordnung zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen besteht aus einem Si-basierten Lichtemitter, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Lichtemitter eine bioaktive Schicht aufgebracht wird.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die bioaktive Schicht durch Reinigung, Hybridisierung und Sinalisierung aufgebracht wird.
Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die dreistufige Reinigung mit einer wässrige 1,1,1-trichloreethane Lösung, einer Aceton-Lösung und einer Methanol-Lösung erfolgt, wobei nach jeder Stufe eine Trocknung mit Stickstoffgas erfolgt.
Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung mit einer MES-Katalyselösung erfolgt.
Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Sinalisierung mit einer APS- oder einer MPS-Lösung oder NPS-Lösung erfolgt und b. danach eine dreistufige Reinigung mit Trichlorethan, Ethanol und destilliertes Wasser erfolgt, wobei nach jeder Reinigungsstufe die Anordnung mit Stickstoffgas getrocknet wird.
Verfahren zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Referenzprobe mit farbstoffmarkierten Östrogenmolekülen verwendet wird, bei der die optische Anregungswellenlänge des verwendeten Farbstoff hinreichend gut mit der Emissionswellenlänge des integrierten Lichtemitters übereinstimmt.
Verfahren zum Nachweis von Östrogen in wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass a. auf die Anordnung nach den Ansprüchen 1 und 2 eine Probenlösung aufgebracht wird, b. danach die Anordnung vorzugsweise mit destilliertem Wasser gereinigt wird, c. danach auf die Anordnung die Referenzprobe nach Anspruch 6 aufgebracht wird und d. danach eine elektrischen Spannung an die Anordnung angelegt wird und an einem Detektor das Messergebnis abgelesen werden kann.