DE102017130322B4 - Verfahren und Kit zur spezifischen Detektion von diagnostisch relevanten Proteinen in biologischen Proben - Google Patents
Verfahren und Kit zur spezifischen Detektion von diagnostisch relevanten Proteinen in biologischen Proben Download PDFInfo
- Publication number
- DE102017130322B4 DE102017130322B4 DE102017130322.7A DE102017130322A DE102017130322B4 DE 102017130322 B4 DE102017130322 B4 DE 102017130322B4 DE 102017130322 A DE102017130322 A DE 102017130322A DE 102017130322 B4 DE102017130322 B4 DE 102017130322B4
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- proteins
- sample
- dyes
- target protein
- fluorescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 120
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 title 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 60
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 45
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 21
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 21
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 20
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 13
- 208000002774 Paraproteinemias Diseases 0.000 claims description 11
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 11
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- 206010060880 Monoclonal gammopathy Diseases 0.000 claims description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 10
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- -1 epicoconone Chemical compound 0.000 claims description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- XUVKSPPGPPFPQN-UHFFFAOYSA-N 10-Methyl-9(10H)-acridone Chemical compound C1=CC=C2N(C)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1 XUVKSPPGPPFPQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 4
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 claims description 4
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 4
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N Quinine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 4
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- PPSZHCXTGRHULJ-UHFFFAOYSA-N dioxazine Chemical compound O1ON=CC=C1 PPSZHCXTGRHULJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N fluorene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3C2=C1 NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 4
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 claims description 4
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001006 nitroso dye Substances 0.000 claims description 4
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- AAAQKTZKLRYKHR-UHFFFAOYSA-N triphenylmethane Chemical compound C1=CC=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 AAAQKTZKLRYKHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- MCTQNEBFZMBRSQ-UHFFFAOYSA-N (3-amino-4-phenyldiazenylphenyl)azanium;chloride Chemical compound Cl.NC1=CC(N)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 MCTQNEBFZMBRSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QBZIEGUIYWGBMY-FUZXWUMZSA-N (5Z)-5-hydroxyimino-6-oxonaphthalene-2-sulfonic acid iron Chemical compound [Fe].O\N=C1/C(=O)C=Cc2cc(ccc12)S(O)(=O)=O.O\N=C1/C(=O)C=Cc2cc(ccc12)S(O)(=O)=O.O\N=C1/C(=O)C=Cc2cc(ccc12)S(O)(=O)=O QBZIEGUIYWGBMY-FUZXWUMZSA-N 0.000 claims description 2
- VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 2',7'-dichlorofluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Cl)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(Cl)C(O)=C1 VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PDURUKZNVHEHGO-UHFFFAOYSA-N 2-[6-[bis(carboxymethyl)amino]-5-(carboxymethoxy)-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylic acid Chemical compound O1C=2C=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCC(=O)O)=CC=2C=C1C1=NC=C(C(O)=O)O1 PDURUKZNVHEHGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AXDJCCTWPBKUKL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-aminophenyl)-(4-imino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]aniline;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1=CC(=N)C(C)=CC1=C(C=1C=CC(N)=CC=1)C1=CC=C(N)C=C1 AXDJCCTWPBKUKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZMERMCRYYFRELX-UHFFFAOYSA-N 5-{[2-(iodoacetamido)ethyl]amino}naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1NCCNC(=O)CI ZMERMCRYYFRELX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 claims description 2
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZHBOFZNNPZNWGB-UHFFFAOYSA-N 9,10-bis(phenylethynyl)anthracene Chemical compound C1=CC=CC=C1C#CC(C1=CC=CC=C11)=C(C=CC=C2)C2=C1C#CC1=CC=CC=C1 ZHBOFZNNPZNWGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FCNCGHJSNVOIKE-UHFFFAOYSA-N 9,10-diphenylanthracene Chemical compound C1=CC=CC=C1C(C1=CC=CC=C11)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=CC=CC=C1 FCNCGHJSNVOIKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000023761 AL amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 claims description 2
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 claims description 2
- 108091005950 Azurite Proteins 0.000 claims description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 108091005944 Cerulean Proteins 0.000 claims description 2
- 241000579895 Chlorostilbon Species 0.000 claims description 2
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 claims description 2
- 235000001258 Cinchona calisaya Nutrition 0.000 claims description 2
- 108091005960 Citrine Proteins 0.000 claims description 2
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091005947 EBFP2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 2
- 208000005531 Immunoglobulin Light-chain Amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 claims description 2
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 201000010848 Schnitzler Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N Stilbene Natural products C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 claims description 2
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 claims description 2
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 241000545067 Venus Species 0.000 claims description 2
- PFYWPQMAWCYNGW-UHFFFAOYSA-M [6-(dimethylamino)-9-(2-methoxycarbonylphenyl)xanthen-3-ylidene]-dimethylazanium;perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C21 PFYWPQMAWCYNGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- MGPYJVWEJNTXLC-UHFFFAOYSA-N [6-[6-[2-cyanoethoxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxyhexylcarbamoyl]-6'-(2,2-dimethylpropanoyloxy)-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound C12=CC=C(OC(=O)C(C)(C)C)C=C2OC2=CC(OC(=O)C(C)(C)C)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)NCCCCCCOP(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N)C=C21 MGPYJVWEJNTXLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N acridine yellow Chemical compound [H+].[Cl-].CC1=C(N)C=C2N=C(C=C(C(C)=C3)N)C3=CC2=C1 BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 2
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001000 anthraquinone dye Substances 0.000 claims description 2
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 claims description 2
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KSCQDDRPFHTIRL-UHFFFAOYSA-N auramine O Chemical compound [H+].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=N)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 KSCQDDRPFHTIRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 claims description 2
- 239000000987 azo dye Substances 0.000 claims description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940093265 berberine Drugs 0.000 claims description 2
- QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N berberine Natural products COc1ccc2C=C3N(Cc2c1OC)C=Cc4cc5OCOc5cc34 QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YVJPMMYYRNHJAU-UHFFFAOYSA-N chembl1206021 Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=C1 YVJPMMYYRNHJAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011035 citrine Substances 0.000 claims description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 claims description 2
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010976 emerald Substances 0.000 claims description 2
- 229910052876 emerald Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZBQZBWKNGDEDOA-UHFFFAOYSA-N eosin B Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC([N+]([O-])=O)=C(O)C(Br)=C1OC1=C2C=C([N+]([O-])=O)C(O)=C1Br ZBQZBWKNGDEDOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L eosin Y Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 claims description 2
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 claims description 2
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 2
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 claims description 2
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019239 indanthrene blue RS Nutrition 0.000 claims description 2
- UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N indanthrone blue Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=C4NC5=C6C(=O)C7=CC=CC=C7C(=O)C6=CC=C5NC4=C3C(=O)C2=C1 UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JGIDSJGZGFYYNX-YUAHOQAQSA-N indian yellow Chemical compound O1[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C(OC=2C(=C(O)C=CC=2)C2=O)C2=C1 JGIDSJGZGFYYNX-YUAHOQAQSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 claims description 2
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 108091005949 mKalama1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091005958 mTurquoise2 Proteins 0.000 claims description 2
- SQFDQLBYJKFDDO-UHFFFAOYSA-K merbromin Chemical compound [Na+].[Na+].C=12C=C(Br)C(=O)C=C2OC=2C([Hg]O)=C([O-])C(Br)=CC=2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O SQFDQLBYJKFDDO-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229960002782 merbromin Drugs 0.000 claims description 2
- XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M nile blue A Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4[O+]=C3C=C(N)C2=C1 XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000449 nitro group Chemical class [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 2
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000001007 phthalocyanine dye Substances 0.000 claims description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 208000009954 pyoderma gangrenosum Diseases 0.000 claims description 2
- KXXXUIKPSVVSAW-UHFFFAOYSA-K pyranine Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=C2C(O)=CC(S([O-])(=O)=O)=C(C=C3)C2=C2C3=C(S([O-])(=O)=O)C=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 KXXXUIKPSVVSAW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229960000948 quinine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002601 radiography Methods 0.000 claims description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 claims description 2
- YYMBJDOZVAITBP-UHFFFAOYSA-N rubrene Chemical compound C1=CC=CC=C1C(C1=C(C=2C=CC=CC=2)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=C11)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=CC=CC=C1 YYMBJDOZVAITBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000010979 ruby Substances 0.000 claims description 2
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 claims description 2
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 2
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000988 sulfur dye Substances 0.000 claims description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GWBUNZLLLLDXMD-UHFFFAOYSA-H tricopper;dicarbonate;dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Cu+2].[Cu+2].[Cu+2].[O-]C([O-])=O.[O-]C([O-])=O GWBUNZLLLLDXMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 229950002929 trinitrophenol Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ORZHVTYKPFFVMG-UHFFFAOYSA-N xylenol orange Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C(O)=C(C)C=2)=C1 ORZHVTYKPFFVMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 claims 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 62
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283283 Orcinus orca Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001295925 Gegenes Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002211 flavins Chemical class 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002148 quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 231100000925 very toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
- G01N33/561—Immunoelectrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Verfahren zum Nachweis von wenigstens einem Zielprotein in einer Probe, die Proteine enthält, umfassend die Schritte:i. Probenvorbereitung (z.B. Homogenisieren, Verdünnen usw. der Probe),ii. Markierung aller Proteine in der Probe mit einem Detektor-Molekül,iii. Auftragen der Probe auf ein Trennmittel,iv. Optional Auftrennung aller Proteine in der Probe,v. Fixierung des wenigstens einen markierten Zielproteins im Trenngel,vi. Entfernen aller Proteine der Probe, die nicht Zielproteine sind (z.B. durch Waschen),vii. Nachweis des wenigstens einen Zielproteins durch Detektieren des Detektor-Moleküls,viii. Optional Quantifizieren des wenigstens eines Zielproteins, undix. Optional Digitalisieren und Archivieren der Daten.
Description
- Hintergrund der Erfindung
- Für die Diagnostik vieler Erkrankungen ist der Nachweis spezifischer Proteine, sogenannter diagnostisch relevante Proteine (DRPs), wie z.B. spezifischer Immunglobuline (Ig), essentiell. So werden immunologisch bedingte Erkrankungen, wie Autoimmunerkrankungen oder Multiple Sklerose durch den Nachweis von Immunglobulinen diagnostiziert. Im Fall bestimmter Krebserkrankungen, wie dem Multiplen Myelom, treten mono- und oligoklonale Immunglobuline auf, die von den entarteten Zellen gebildet werden und diagnostisch relevant sind. Auch für die Routineuntersuchung von Allergien werden bestimmte Immunglobuline (IgG oder IgA) gegen die entsprechenden Allergene nachgewiesen. Des Weiteren kann der Nachweis anderer Proteine bzw. Proteinisoformen, neben den Immunglobulinen, der Diagnose bestimmter Erkrankungen dienen.
- In den meisten Fällen geschieht der diagnostische Nachweis durch die Ausnutzung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen sowie anderer spezifischer Molekül-Molekül-Wechselwirkungen (z.B. Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen), wobei das nachzuweisende DRP meist das Antigen (AG) bzw. einen proteinogenen Interaktionspartner darstellt. Der Nachweis erfolgt mit Hilfe zahlreicher Immunoassay-Verfahren, dabei auch in Kombination mit elektrophoretischen Trennungen.
- Stand der Technik:
- Der Nachweis diagnostisch relevanter Proteine (DRPs) basiert gegenwärtig meist auf Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen. Dabei wird das DRP in der Patientenprobe mittels spezifischen Antikörpern gegen dieses Protein nachgewiesen. Die Patientenprobe wird dabei direkt oder nach elektrophoretischer Auftrennung mit dem spezifischen Aintikörper inkubiert. Es bilden sich Antigen-Antikörper-Komplexe, die so das DRP in einer Matrix fixieren oder an einer Oberfläche (wie einer Immunoblot-Membran) zurückhalten. Die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe werden: (i) direkt als Präzipitat sichtbar, (ii) durch eine sichtbare Färbung nachgewiesen oder (iii) indirekt durch Inkubation mit weiteren Antikörpern, die mit einem Agens zum Nachweis konjugiert sind, sichtbar gemacht. Dieses Konjugat kann entweder direkt sichtbar sein oder, wie in den meisten Fällen, ein Enzym sein, welches eine sichtbare Farbreaktion katalysiert, die dann der Detektion dient (
1 ). Zur Anwendung kommt das derzeitige Verfahren u.a. bei Immunfixations-Elektrophoresen (kurz Immunfixation), Immunelektrophoresen sowie Immunblots und soll an Hand des folgenden Beispiels näher erläutert werden. - Immunfixation
- Für den diagnostischen Nachweis bestimmter Krebserkrankungen, wie dem multiplen Myelom, ist der Nachweis mono- und oligoklonaler Immunglobuline (Igs) sowie freier Ig-Leicht oder -Schwerketten im Serum oder Urin von entscheidender Bedeutung. Dabei unterscheidet man Ig-Typen A, G, M, D und E sowie die jeweiligen Schwerketten und die Leichtketten-Typen kappa und lambda.
- Mono- und oligoklonale Immunglobuline lassen sich von physiologischen, polyklonalen Immunglobulinen z.B. nach elektrophoretischer Auftrennung und anschließendem spezifischem Antikörper-Nachweis der Igs, die in diesem Fall die Antigene darstellen, unterscheiden. Die Auftrennung kann entweder mittels Gelelektrophorese (z.B. in einem Agarosegel) oder Capillarelektrophorese erfolgen. Nach der Reaktion der spezifischen Antikörper mit dem jeweiligen Antigen bilden sich Antigen-Antikörper-Komplexe, die das DRP in der Matrix fixieren und die anschließend mittels Färbungen sichtbar gemacht werden. Monoklonale Igs und freie Leichtketten treten dann in Form von scharfen, für das Auge sichtbaren Präzipitatbanden auf. Dabei erfolgt der Nachweis der einzelnen Ig-Typen (A, G, M, kappa und lambda) mit jeweils einer eigenen Analysespur. D.h. die Patientenprobe muss mindestens fünfmal aufgetragen und untersucht werden, da jeder Antikörper gegen jeden Ig-Typ einzeln und nicht in Kombination angewandt werden kann. Zusätzlich dazu ist eine Kontrollreaktion notwendig, um die korrekte elektrophoretische Auftrennung der Proben zu überwachen. Es wird dabei jedoch nur die Auftrennung der Proben, nicht aber die korrekte Bildung der Ig-Antikörper-Komplexe in jeder Analysespur überwacht (
2 ). - Die derzeitigen Nachweisverfahren diagnostisch relevanter Proteine haben folgende Nachteile bzw. Einschränkungen:
- i. Das diagnostisch relevante Protein wird nur indirekt mittels mindestens einem weiteren Antikörper nachgewiesen. Es sind somit neben der eigentlichen Antigen-Antikörper-Komplexbildung weitere Versuchsschritte, z.B. Reaktion mit weiteren Antikörpern oder eine Färbereaktion, notwendig, was einen entsprechenden Mehraufwand mit sich bringt. Der Nachweis des diagnostisch relevanten Proteins ist mit dieser Methode nur qualitativ, nicht aber quantitativ möglich.
- ii. Es müssen z.T. aufeinander folgend mehrere Antikörper eingesetzt werden, um den Nachweis zu ermöglichen, was entsprechende Kosten und Arbeitsaufwand hervorruft.
- iii. Es binden z.T. aufeinander folgend mehrere AK an ein Target bzw. an ein Antigen, was eine Quantifizierung einschränkt.
- iv. Die beschriebenen Reaktionen werden mittels sichtbarer Farbreaktion detektiert. Diese haben den Nachteil eingeschränkter Wiederhol- und Quantifizierbarkeit. Zudem können z.T. sehr giftige Reagenzien und Abfälle anfallen.
- Aus dem Stand der Technik (
US 2015241388 A ) sind Systeme und Kits und Zusammensetzungen, die zur Durchführung einer schnellen Färbung von Proteinen oder Peptiden geeignet sind, die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt werden. Hierbei bewegt sich ein Bindungs-Agens, beispielsweise ein Farbstoff, durch Anlegen einer Spannung in die Gelmatrix eines Gels hinein, in dem zuvor die Proteine aufgetrennt wurden. Das Bindungs-Agens bindet an die Proteine in der Gelmatrix. Der Nachteil dieser Systeme besteht in deren Unspezifität, da neben den Zielproteinen noch zahlreiche unerwünschte Proteine in der Gelmatrix vorhanden sind, die auch gefärbt werden. -
EP 2478364 B1 betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Zielantikörpers, insbesondere eines Ziel-Autoantikörpers, in einer Probe unter Verwendung eines mit einem kleinen Molekül Fluorophor-markierten Antigens, das spezifisch an den Zielantikörper bindet. Der Nachweis erfolgt typischerweise mittels Immunodiffusion oder Immunelektrophorese. Hierbei erfolgt keine direkte, sondern nur eine indirekte Fluoreszenzmarkierung des Ziel-Autoantikörpers über das Fluorophor-markierte Antigen. - Beschreibung der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung soll diagnostische Nachweise einfacher und sicherer machen. Sie ermöglicht den vereinfachten Nachweis von DRPs sowie deren verbesserte Quantifizierbarkeit. Die Erfindung beruht darauf, dass nicht mehr der dem Nachweis dienende Antikörper, sondern das DRP selbst detektiert und quantifiziert wird. Dies wird dadurch möglich, dass das DRP (zusammen mit anderen Proteinen in der Probe) mit einem Molekül direkt markiert wird, das der Detektion dient (=Detektormolekül).
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, die zuvor genannten Nachteile des Stands der Technik zu überwinden und ein neues, unkompliziertes Verfahren zum quantitativen Nachweis diagnostisch relevanter Proteine (DRPs) zu ermöglichen.
- Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, dass die DRPs zusammen mit der gesamten Patientenprobe (Serum, Urin oder Liquor) mit einem Detektor-Molekül direkt markiert, je nach Testverfahren elektrophoretisch aufgetrennt und die Antigene per spezifischem Antikörper je nach Testverfahren in der Elektrophorese-Matrix gezielt fixiert bzw. gezielt nachgewiesen werden. Durch die Markierung können die Igs direkt detektiert werden. Weiterhin können etablierte und verifizierte Testverfahren vereinfacht eingesetzt werden.
- Die hier beschriebene Methode umfasst folgende Schritte:
- In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von wenigstens einem Zielprotein in einer Probe, die Proteine enthält, bereit, wobei das Verfahren die Schritte:
- i. Probenvorbereitung (z.B. Homogenisieren, Verdünnen usw. der Probe),
- ii. Markierung aller Proteine in der Probe mit einem Detektor-Molekül,
- iii. Auftragen der Probe auf ein Trennmittel,
- iv. Optional Auftrennung aller Proteine in der Probe,
- v. Fixierung des wenigstens einen markierten Zielproteins im Trenngel,
- vi. Entfernen aller Proteine der Probe, die nicht Zielproteine sind (z.B. durch Waschen),
- vii. Nachweis des wenigstens einen Zielproteins durch Detektieren des Detektor-Moleküls,
- viii. Optional Quantifizieren des wenigstens eines Zielproteins, und
- ix. Optional Digitalisieren und Archivieren der Daten
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Detektor-Molekül kein Antikörper. Das erfindungsgemäße Verfahren dient gerade dazu, herkömmliche Nachweisverfahren dadurch zu vereinfachen, dass zur Detektion der DRPs nicht noch weitere Antikörper eingesetzt werden müssen. Dies führt zu Einsparungen beim experimentellen Aufwand und bei den Kosten für die Durchführung der Analysen.
- Besonders bevorzugt ist es, wenn das Detektor-Molekül ausgewählt ist aus Farbstoffen, Fluoreszenzfarbstoffen und Proteinen. Weiterhin bevorzugt ist es, wenn das Detektor-Molekül ausgewählt ist aus Isotopen, radioaktiven Sonden und anderen Liganden und Molekülen.
- Geeignete Farbstoffe sind beispielsweise Anthrachinonfarbstoffe bzw. Alizarinfarbstoffe, wie Anthrachinon, Indanthren und Alizarin; Azofarbstoffe, wie Kongorot, Alizaringelb R, und Chrysoidin; Dioxazinfarbstoffe, wie Dioxazin; Indigofarbstoffe und indigoide Farbstoffe, wie Indigo und Purpurfarbstoff; Nitro- und Nitrosofarbstoffe, wie Pikrinsäure (2,4,6-Trinitrophenol) oder das Amidogelb B, Pigmentgrün B, und Naphtholgrün B; Phthalocyaninfarbstoffe, wie Benzopurpurin; Schwefelfarbstoffe; und Triphenylmethanfarbstoffe, wie Triphenylmethan, Fuchsin, Kristallviolett, Phenolphthalein, Fluorescein, Eosin, und Bromphenolblau. Besonders bevorzugt sind solche Farbstoffe, die kovalent an die Proteine der Probe binden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Markierung der Proteine in der Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Ganz besonders geeignet für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Fluoreszenzfarbstoffe, deren Fluoreszenzanregungs- und Emissionsmaxima im UV- bis IR-Bereich liegen. Die Wellenlänge der Anregungsmaxima der Fluoreszenzfarbstoffe gemäß der Erfindung liegt vorzugsweise im Bereich von 450 nm bis 800 nm. Die Wellenlänge der Emissionsmaxima der Fluoreszenzfarbstoffe gemäß der Erfindung liegt vorzugsweise im Bereich von 500 nm bis 900 nm.
- Alle Fluoreszenzfarbstoffe, die an Proteine binden können, sind prinzipiell zur Anwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die Fluoreszenzfarbstoffe können z.B. ausgewählt sein aus den Gruppen der Phycobiline, Rhodamine und Safranine. Geeignete Fluoreszenzfarbstoffe können z.B. ausgewählt sein aus der Gruppe, die aus Acridingelb, Acridinorange, Aequorin, Aesculin, Allophycocyanin, 7-Aminoactinomycin, Auramin O, Berberin, 9,10-Bis(phenylethinyl)anthracen, Calcein, 6-Carboxyfluorescein, Chinin, Cumarin-Farbstoffe, Cyaninen, 4',6-Diamidin-2-phenylindol, 2,7-Dichlorfluorescein, 9,10-Diphenylanthracen, Eosin B, Eosin Y, Epicocconon, Ethidiumbromid, 6-FAMphosphoramidit, Flavinen, Fluoren, Fluorescein, Fluorescein Arsen Helix Bindern, Fura-2, Furaptra, Grün fluoreszierendes Protein (GFP), Hoechst 33342, IAEDANS, Indischgelb, Indocyaningrün, Luciferinen, Merbromin, N-Methylacridon, Nilblau, Nilrot, Phycocyanin, Phycoerythrin, Propidiumiodid, Pyranin, Rhodamin B, Rubren, Safranin T, Stilben, SYBR Green I, SYPRO Orange, SYPRO Red, SYPRO Ruby, Texas Red, TMRM+, Umbelliferon und Xylenolorange besteht.
- Die Fluoreszenzfarbstoffe sind vorzugsweise kovalent an die Proteine in der Probe gebunden. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Bindung und/oder Aktivierung der Fluoreszenzfarbstoffe über NHS-Ester, Maleimide, funktionelle Gruppen von Aminosäuren (z.B. Amino-Gruppe von Lysin-Resten oder Thiol-Gruppen von Cystein-Resten oder eine freie Carboxygruppe) erfolgt. Weiterhin bevorzugt sind Farbstoffe, die erst nach UV-Bestrahlung an die Proteine in der Probe binden und zur Fluoreszenz angeregt werden.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Detektormolekül ein Isotop oder radioaktiver Tracer ist. Geeignete Isotope gemäß der Erfindung sind ausgewählt aus 2H (D oder Deuterium), 3H (T oder Tritium), 13C, 14C, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 18F, 35S, 36Cl, 82Br, 75Br, 76Br, 77Br, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I und 99mTc.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Detektor-Molekül ein Protein, wie beispielsweise Biotin, das direkt an die Proteine der Probe bindet. Der Nachweis der Zielproteine erfolgt, ggf. nach Auftrennung, beispielweise mittels Streptavidin.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Detektor-Molekül ein fluoreszierendes Protein. Geeignete fluoreszierende Proteine sind beispielsweise Blau fluoreszierende Proteine, wie TagBFP, mTagBFP2 , Azurite, EBFP2, mKalama1 Sirius, Sapphire und T-Sapphire; Cyan fluoreszierende Proteine, wie ECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, monomeres Midoriishi-Cyan, TagCFP und mTFP1; Grün fluoreszierende Proteine, wie EGFP , Emerald, Superfolder GFP, Monomeric Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover und mNeonGreen; Gelb fluoreszierende Proteine, wie EYFP, Citrine, Venus, SYFP2 und TagYFP; Orange fluoreszierende Proteine, wie Monomeres Kusabira-Orange, mKOK, mKO2, mOrange und mOrange2; Rot fluoreszierende Proteine, wie mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby und mRuby2; photoaktive bzw. photoaktvierbare Proteine und/oder fluoreszierende Proteine.
- Die direkte Markierung der diagnostisch relevanten Proteine ist in mehrerlei Hinsicht vorteilhaft. Die DRPs können direkt, ohne weitere bzw. zusätzliche Markierungsschritte nachgewiesen werden. Eine Quantifizierung der DRPs ist möglich. Es müssen weniger Antikörper und Färbereagenzien eingesetzt werden. Mehrere aufwändige Analyseschritte entfallen. Dadurch kommt es zu einer Kosten- und Zeitersparnis. Auch der Einsatz verschiedener Kontrollen zum Überwachen der gesamten Analytik ist möglich.
- Als Detektor-Moleküle können u.a. Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, mit denen exemplarisch die Validierung des vorliegenden Verfahrens erfolgte. Die Verwendung von Fluoreszenz-Markierungen der Patientenproben bietet zusätzliche Vorteil, da Fluoreszenzmarkierungen eine hohe Sensitivität zeigen, einen hohen dynamischen Bereich besitzen und damit eine Quantifizierung ermöglichen, was mit den derzeitigen Verfahren des Standes der Technik nicht optimal möglich ist, da der derzeitige Nachweis indirekt durch die Färbung/Nachweis von Antikörper-Antigen-Komplexen erfolgt, nicht aber der direkte Nachweis des jeweiligen DRPs. Fluoreszenz-Markierungen sind reproduzierbar, wiederholbar und standardisierbar (z.B. durch Einsatz von externen Kontrollreagenzien), und können schnell und einfach durchgeführt werden. Aufwändigen Färbeprozeduren sind nicht erforderlich.
- Damit kann erfindungsgemäß der direkte Nachweis von DRPs in einer Probe, die Proteine enthält, durch
- i. Markierung mit einem Detektor-Molekül (z.B. Fluoreszenz-Farbstoff),
- ii. (je nach Testverfahren) elektrophoretische Auftrennung und anschließende gezielte Fixierung/Nachweis durch spezifische Antikörper,
- iii. Nachweis mittels Detektor-Molekül (z.B. Fluoreszenz-Imaging) und
- iv. Quantifizierung
- Die Erfindung beruht auf der direkten Markierung aller Proteine einer Probe und damit der darin befindlichen DRPs, der Fixierung der DRPs durch spezifische Antikörper und dem direkten Nachweis der DRPs durch die zuvor stattgefundene Markierung. Die direkte Markierung mit Detektor-Molekülen ermöglicht den hoch-sensitiven und reproduzierbaren direkten Nachweis der DRPs. Aufwändige Färbungen sind nicht mehr nötig. Des Weiteren erlaubt die Erfindung die Quantifizierung DRPs, was zum derzeitigen Stand der Technik nicht immer möglich ist, da der Nachweis herkömmlicherweise indirekt über Färbung der Antikörper-Antigen-Komplexe oder eine gekoppelte Farbreaktion erfolgt.
- Die Probenvorbereitung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst alle üblichen und dem Fachmann bekannten Maßnahmen, wie z.B. Homogenisieren, Verdünnen usw. der Probe.
- Das Trennmittel gemäß der Erfindung kann ein Trenngel oder eine Immunmembran sein.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Trennmittel ein Trenngel. Bevorzugt für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind deshalb Gelelektrophoresen. Grundsätzlich können alle herkömmlichen Gelelektrophoreseverfahren in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Herkömmliche Gelelektrophoreseverfahren sind zum Beispiel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) zur Trennung von Stoffgemischen (häufig Proteinen) nach Molekülgröße, IEF (isoelektrische Fokussierung) zur Trennung von Proteinen nach ihrem isoelektrischem Punkt, 2D-Gelelektrophorese als Kombination aus SDS-Page und IEF für komplexe Proteingemische, QPNC-PAGE (QPNC: quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis) zur Analytik von Metalloproteinen, Nativ-Gelelektrophorese zur Untersuchung der Proteinfaltung, SDD-AGE (semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis, halbdenaturierende detergenzvermittelte Agarose-Gelelektrophorese) zur Untersuchung von Proteinaggregaten, Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE) und Kapillarelektrophorese (CE).
- Besonders bevorzugt gemäß der Erfindung sind alle 1 D-Gelelektrophoreseverfahren, wie z.B. SDS-PAGE, IEF, QPNC-PAGE, Nativ-Gelelektrophorese zur Untersuchung der Proteinfaltung, SDD-AGE und PFGE.
- Je nach Zielprotein werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Elektrophoresegele basierend auf Cellulose-Acetat, Agarose oder PAA verwendet. Die Gelelektrophore kann je nach Zielprotein im pH-Bereich von 3-11 unter Verwendung allgemein bekannter Laufpuffer, Tris-, Barbital-, Glycin-, Citrat-Puffer o.ä. durchgeführt werden.
- Wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Trennmittel ein Trenngel verwendet wird, erfolgt die Fixierung des wenigstens einen markierten Zielproteins durch Inkubation des Trenngels, vorzugsweise nach erfolgter Gelelektrophorese, mit einem Antikörper, der spezifisch an das Zielprotein bindet, durch Bildung spezifischer Antikörper-Zielprotein-Komplexe. Durch die Bildung dieser Antikörper-Zielprotein-Komplexe kommt es zur Verankerung bzw. zum Festhalten dieser Komplexe in der Matrix des Elektrophoresegels.
- Der Antikörper kann sowohl ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, chimärer Antikörper oder Diabody sein, sofern er geeignet ist, spezifisch an das markierte Zielprotein zu binden.
- Im Anschluss an die ggf. Auftrennung der Proteine der Probe mittels Gelelektrophorese und Komplexbildung werden alle Proteine, die in der Probe enthalten sind, die nicht Zielproteine sind, entfernt. Zum Entfernen dieser unerwünschten Proteine eignen sich alle herkömmlichen und dem Fachmann bekannten Verfahren, wie z.B. Waschen o.ä.. Geeignet zum Waschen sind zum Beispiel ein Waschpuffer oder der Laufpuffer der Gelelektrophorese. Da die „unerwünschten“ Proteine keine Komplexe mit den nur spezifisch an die Zielproteine bindenden Antikörper im Fixierungsschritt bilden, werden die unerwünschten Proteine nicht in der Gelmatrix zurückgehalten, sondern ausgewaschen.
- Die Fixierung des wenigstens einen markierten Zielproteins kann auch auf einer Immunmembran erfolgen. Dazu wird ein Teil der Probe auf eine Immunmembran gegeben, an die zuvor ein spezifisch das wenigstens eine markierte Zielprotein bindender Antikörper gebunden wurde. Die in der Probe enthaltenen Zielproteine binden an diese Membran-gebundenen Antikörper. Unerwünschte Proteine binden nicht und können einfach durch Waschen entfernt werden.
- Nach der Fixierung der Zielproteine kann das Trennmittel unmittelbar dazu genutzt werden, um die markierten Zielproteine, wie beispielsweise deren Menge oder Konzentration, mittels eines geeigneten Detektionssystems direkt zu analysieren.
- Die Auswertung, vorzugsweise der Fluoreszenzsignale, kann mit jeder dazu geeigneten herkömmlichen Auswerteeinrichtung erfolgen. Geeignet sind beispielsweise Fluoreszenz-Reader oder jede Art von Gel-Imaging Systemen. Bevorzugt zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Auswerteeinrichtungen, die über eine Auswertesoftware verfügen und das Verhältnis der Signale und/oder die Bandenvolumina des markierten Zielproteins und ggf. eines Kontrollproteins in einer Probe automatisiert ermitteln können. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann also die herkömmliche bereits zur Laborausstattung gehörende Ausrüstung benutzt werden, sofern diese zur Fluoreszenzdetektion geeignet ist. Neuanschaffungen sind nicht nötig.
- Sofern das Detektormolekül ein Farbstoff ist, der nicht fluoresziert, erfolgt die Detektion und Quantifizierung der markierten Zielproteine visuell, mit einer Farb-Kamera oder einem für Farbdetektion geeigneten Imaging System. Sofern das Detektormolekül ein Isotop oder eine radioaktive Sonde ist, erfolgt die Detektion mittels Autoradiographie oder Radiographie beispielsweise durch Schwärzung eines fotografischen Filmes oder mit Hilfe eines Strahlungsdetektors oder anderen dem Fachmann bekannten Methoden.
- Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Probe kann humanen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein. Vorzugsweise ist die Probe humanen oder tierischen Ursprungs.
- Proben, die in einem Verfahren der Erfindung analysiert werden können, schließen Vollblut, Blutserum oder Plasma, Urin, Speichel, Hirnflüssigkeit (CSF) oder andere Körperflüssigkeiten (Stuhl, Tränenflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Sputum), Atem (z.B. als kondensierter Atem, oder ein Extrakt oder eine Aufreinigung oder eine Verdünnung davon) ein. Biologische Proben schließen auch Gewebehomogenate, Gewebesektionen und Biopsien von einem lebenden Probanden oder post-mortem entnommene ein. Die Proben können auf herkömmliche Weise vorbereitet und aufbewahrt werden, zum Beispiel, wo angebracht, verdünnt oder konzentriert werden.
- Das wenigstens eine Zielprotein, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren detektiert und quantifiziert werden soll, ist vorzugsweise ein diagnostisch relevantes Protein (DRP), wie beispielsweise ein Biomarker oder ein Immunglobulin (Ig).
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das DRP ein Ig. Das Ig ist beispielsweise ausgewählt aus IgA, IgG, IgM, IgE und IgD, deren Schwerketten sowie gebundene und freie kappa- und lambda-Leichtketten.
- Die Erfindung stellt weiterhin einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereit, wobei der Kit wenigstens ein Detektor-Molekül und eine Anleitung zur Verwendung des Kits umfasst.
- Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweisen und/oder Quantifizieren von diagnostisch relevanten Proteinen in einer Probe.
- Das erfindungsgemäße Verfahren und/oder der erfindungsgemäße Kit sind besonders geeigent für die Diagnose von Krankheiten, die mittels Detektion und Quantifizierung von Immunglobulinen diagnostiziert werden können. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Krankheiten, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert sind.
- In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung deshalb die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum direkten Nachweis von Immunglobulinen zur Diagnose einer Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist.
- Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist, bereit, umfassend den Nachweis und die Quantifizierung von wenigstens einem Immunoglobulin in einer Probe gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, Vergleich der Menge des wenigstens einen quantifizierten Immunglobulins mit dem Normalwert gesunder Probanden, Feststellen einer Abweichung der Menge des wenigstens einen quantifizierten Immunglobulins von dem Normalwert gesunder Probanden; wobei eine im Vergleich zum Normalwert erhöhte Menge des wenigstens einen quantifizierten Immunglobulins in der Probe ein positiver Indikator für das Vorliegen einer Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist, ist.
- Als monoklonale Gammopathie bezeichnet man das pathologisch erhöhte Vorkommen eines monoklonalen Antikörpers oder seiner Bestandteile (Leicht- oder Schwerketten) innerhalb der Immunglobulin-Fraktion der Serumproteine. Die Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist, ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Multiples Myelom, solitäres Plasmozytom, Non-Hodgkin-Lymphom (B-Zell-Lymphom), Morbus Waldenström, Schnitzler-Syndrom, AL-Amyloidose und Pyoderma gangraenosum.
- Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
- An Hand des folgenden allgemeinen Beispiels soll die vorliegende Erfindung näher beschrieben werden.
- Immunfixationselektrophorese:
- Am Beispiel der Immunfixation stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum direkten Nachweis von Immunglobulinen (Igs) zur Diagnostik monoklonaler Gammopathien inkl. Kontrollreaktionen bereit. Diagnostisch relevant sind die Igs IgA, IgG, IgM, IgD und IgE, deren Schwerketten sowie gebundene und freie kappa und lambda-Leichtketten, die in diesem Fall die Zielproteine darstellen, die herkömmlich jeweils separat nachgewiesen werden mussten. Die Erfindung beruht auf der direkten Markierung der in der Patientenprobe enthaltenen Proteine (darunter auch die DRPs) mit einem Detektor-Molekül. Die Probe wird anschließend elektrophoretisch aufgetrennt (pro Ig-Subtyp eine Spur) und die Igs werden mittels spezifischer Antikörper in der Gelmatrix oder nach Transfer auf einer Oberfläche fixiert (Ausbildung von Antikörper-Antigen-Komplexen). Bei Verwendung von Fluoreszenz-Farbstoffen als Detektor-Moleküle können die markierten und fixierten Zielproteine schnell und einfach durch Fluoreszenz-Imaging detektiert werden.
- Das Verfahren umfasst folgende Schritte:
- i. Markierung aller Proteine einer Probe mit einem Detektor-Molekül, z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff, inkl. der DRPs und ggf. von Kontrollproteinen (intern oder extern zugegeben)
- ii. Elektrophoretische Auftrennung der Probe zur Separation der markierten Proteine
- iii. Fixierung der DRPs durch Antikörper-Antigen-Komplex-Bildung mittels spezifischer Antikörper gegen Zielproteine (DRPs)
- iv. Entfernung von nicht-DRPs (durch z.B. Waschen)
- v. Nachweis der DRPs, z.B. durch Fluoreszenz-Imaging
- vi. optional Quantifizierung der DRPs (relativ oder absolut)
- Im Gegensatz zum bisherigen Verfahren werden direkt und primär die Zielproteine, z.B. die Igs, nachgewiesen und quantifiziert, und nicht sekundär durch die Antikörperbindung an die Zielproteine entstandenen Antikörper-Antigen-Komplexen. Da mehrere Antikörper pro Antigen binden können, ist bei der herkömmlichen Art der Detektion von Antikörper-Antigen-Komplexen völlig unklar, welchen Anteil das DRP an diesen Komplexen hat. Im Gegensatz dazu werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung nur die zusammen mit der Patientenprobe markierten diagnostischen Proteine selbst detektiert. Ausführungsbeispiel 2 unten zeigt das lineare Verhältnis von eingesetztem diagnostischen Protein (bzw. Patientenprobe) zum detektierten Signal. Somit ist in jedem Fall eine relative Quantifizierung möglich, und bei Einsatz eines Eichstandards auch eine absolute Quantifizierung. Es ist z.B. möglich das Verhältnis von Ig-Schwer- zu Ig-Leichtketten zu bestimmen, indem man das Bandenvolumen der nachgewiesenen Schwerketten zum Bandenvolumen der nachgewiesenen Leichtketten ins Verhältnis setzt. Setzt man für das jeweilige Ig einen Eichstandard (in bekannter Konzentration) ein, ist es ebenfalls möglich, anhand des Verhältnisses der Bandenvolumina Standard vs. Patientenprobe das diagnostisch relevante Protein mengenmäßig zu bestimmen. Zur Kontrolle der korrekten elektrophoretischen Auftrennung kann zunächst das Detektor-Molekül direkt nach der Elektrophorese detektiert werden.
- Als weitere Kontrolle können zusätzliche Proteine (die in der Probe enthalten sind oder extern zugegeben wurden, aber diagnostisch nicht relevant sind) dienen. Zum einen kann der Nachweis dieser Proteine direkt nach der Elektrophorese die korrekte Markierung der Probe mit dem Detekor-Molekül belegen. Zum anderen kann das Kontrollprotein durch spezifische Antikörper fixiert und mittels Nachweis des Detektor-Moleküls detektiert werden. Der Nachweis der Kontrollproteine stellt sicher, dass alle Proben korrekt markiert, aufgetrennt und fixiert worden.
- Das Verfahren kann ebenfalls für klassische Immunelektrophoresen angewandt werden. Bei diesen Analysen werden Patientenproben, die DRPs, enthalten elektrophoretisch aufgetrennt und mit spezifischen Antikörpern gegen die DRPs inkubiert. Die sich bildenden Antigen-Antikörper-Komplexe zeigen sich als sogenannte Präzipitate und fixieren so die DRPs in der Matrix. Auftreten und Form der Präzipitate sind entscheidend für die Diagnostik. Auch im Fall der Immunelektrphorese kann die Proteine in der Patientenprobe, und damit die DRPs im Vorfeld der Elektrophorese mit Detektor-Molekülen markiert werden, Der Nachweis der Detektor-Moleküle, nach Elektrophorese und AK-Reaktion erlaubt auch hier den direkten Rückschluss auf die DRPs.
- Ebenfalls zur Anwendung kommen, kann das vorliegenden Verfahren bei sogenannten Immunoblots (auch Line Blots genannt). Im Fall der Immunoblots werden gegen die DRPs gerichteten Antikörper oder andere mit den DRPs reagierenden Moleküle auf einer Oberfläche (Immunmembran) fixiert und mit der Patientenprobe inkubiert, wobei durch Ausbildung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen, die DRPs an der Oberfläche zurückgehalten werden. Der Nachweis der DRPs erfolgt im Anschluss indirekt über Reaktion mit weiteren Antikörpern, die dem Nachweis dienen (z.B. durch Vermittlung von Farbreaktionen). Auch hier kann das Verfahren deutlich vereinfacht werden, indem die Proteine in der Patientenprobe, einschließlich der DRPs, mit einem Detektor-Molekül markiert werden und so nach Zurückhalten an der Oberfläche die DRPs direkt nachgewiesen werden können.
- Sowohl für Immunelektrophorese- als auch Immunblot-Verfahren können die oben beschriebenen Kontrollen zum Einsatz kommen und die Methode vereinfachen und absichern.
- Die Erfindung wird nachfolgend anhand von vier Abbildungen und zwei Ausführungsbeispielen näher erläutert.
- Es zeigen:
-
1 Verfahren des Standes der Technik zum Nachweis von Proteinen (z.B. DRP); -
2 Verfahren des Standes der Technik zum Nachweis von Igs mittels Immunfixation; -
3 Immunfixation markierter Proteine einer Patientenprobe gemäß der Erfindung mittels IgM und HSA-Antikörper; und -
4 das lineare Verhältnis zwischen eingesetzter Verdünnungsstufe des Patientenserums und der gemessenen RFU der Fluoreszenzmarkierung (R = 0,987). - Ausführungsbeispiele:
- Beispiel 1: Immunfixation von monoklonalem IgM
- Für den Nachweis spezifischer Igs mittels Immunfixation wurde ein Patientenserum, das positiv auf monoklonales IgM diagnostiziert wurde, mit T-Rex (NH DyeAGNSOTICS) markiert (je 10 µl Serum (1:6 verdünnt) 2 nmol T-Rex; 30 min bei RT) und anschließend laut Herstellerangaben in einem IFE-Gel (Hellabio) elektrophoretisch aufgetrennt (3 Wiederholungen) und die Fluoreszenz direkt nach dem Lauf detektiert. IgM wurde mittels spezifischen Antikörper (Hellabio) in der Gelmatrix fixiert. Unspezifisch gebundener Antikörper sowie nicht fixierte Serumproteine wurden nach Herstellerangaben (Hellabio) durch abblotten entfernt. In einer Spur wurde der IgM- Antikörper - als Kontrolle - zusätzlich mit einem Antikörper gegen das humane Serumprotein Albumin (HSA; Thermo; 2,5 µg/µl) gemischt und zur Fixation eingesetzt. Der Nachweis der fixierten Proteine erfolgte mittels Fluoreszenz-Detektion mit dem ORCA Gel Analyzer (NH DyeAGNOSTICS).
-
3 zeigt zum einen die elektrophoretische Auftrennung der Probe (links) sowie die gelungene Fixierung von monoklonalem IgM (rechts) in den Spuren 1 und 2 und zusätzlich HSA in Spur 3. Mittels Fluoreszenz-Markierung der Patientenprobe konnte sowohl das diagnostisch relevante monoklonale IgM sowie das der Kontrolle dienende HSA nachgewiesen werden. Das nachgewiesene HSA kann hier die gelungene Markierung, die gelungene elektrophoretische Auftrennung sowie die Zugabe der AK und deren potenzielle Wirksamkeit belegen. - Beispiel 2: Immunfixation von monoklonalem IgA
- Für eine Quantifizierung immunfixierter Igs ist es zwingend erforderlich, dass ein lineares Verhältnis zwischen gemessenem Fluoreszenz-Signal und eingesetzter Probenmenge besteht. Ein Patientenserum, das positiv auf monoklonales IgA getestet wurde, wurde mit T-Rex (NH DyeAGNOSTICS) markiert (je 10 µl Serum (1:6 verdünnt) 2 nmol T-REX, 30 min bei RT) und anschließend laut Herstellerangaben in einer Verdünnungsreihe (jeweils in 1:2 Verdünnungsschritten) in einem IFE-Gel (Hellabio) elektrophoretisch aufgetrennt. IgA wurde mittels spezifischen AK (Hellabio) in der Gelmatrix fixiert. Unspezifisch gebundener AK sowie nicht fixierte Serumproteine wurden nach Herstellerangaben (Hellabio) durch abblotten entfernt. Der Nachweis der fixierten Proteine erfolgte mittels Fluoreszenz-detektion mit dem ORCA Gel Analyzer (NH DyeAGNOSTICS). Die RFU der fluoreszierenden Banden wurden mit der Software Lablmage 1D (Kapelan Bioimaging) bestimmt und in Abhängigkeit der eingesetzten Serumverdünnung dargestellt (lineare Regression mittels Microsoft Excel).
-
4 zeigt das lineare Verhältnis zwischen eingesetzter Verdünnungsstufe des Patientenserum und der gemessenen RFU der Fluoreszenzmarkierung (R = 0,987) und belegt damit die Möglichkeit der Quantifizierung des monoklonalen IgA.
Claims (20)
- Verfahren zum Nachweis von wenigstens einem Zielprotein in einer Probe, die Proteine enthält, umfassend die Schritte: i. Probenvorbereitung (z.B. Homogenisieren, Verdünnen usw. der Probe), ii. Markierung aller Proteine in der Probe mit einem Detektor-Molekül, iii. Auftragen der Probe auf ein Trennmittel, iv. Optional Auftrennung aller Proteine in der Probe, v. Fixierung des wenigstens einen markierten Zielproteins im Trenngel, vi. Entfernen aller Proteine der Probe, die nicht Zielproteine sind (z.B. durch Waschen), vii. Nachweis des wenigstens einen Zielproteins durch Detektieren des Detektor-Moleküls, viii. Optional Quantifizieren des wenigstens eines Zielproteins, und ix. Optional Digitalisieren und Archivieren der Daten.
- Verfahren nach
Anspruch 1 , wobei das Detektor-Molekül kein Antikörper ist. - Verfahren nach
Anspruch 1 oder2 , wobei das Detektor-Molekül ausgewählt ist aus Farbstoffen, Fluoreszenzfarbstoffen, Proteinen, Isotopen und radioaktiven Sonden. - Verfahren nach
Anspruch 3 , wobei der Farbstoff ausgewählt ist der Gruppe umfassend Anthrachinonfarbstoffe bzw. Alizarinfarbstoffe, wie Anthrachinon, Indanthren und Alizarin; Azofarbstoffe, wie Kongorot, Alizaringelb R, und Chrysoidin; Dioxazinfarbstoffe, wie Dioxazin; Indigofarbstoffe und indigoide Farbstoffe, wie Indigo und Purpurfarbstoff; Nitro- und Nitrosofarbstoffe, wie Pikrinsäure (2,4,6-Trinitrophenol) oder das Amidogelb B, Pigmentgrün B, und Naphtholgrün B; Phthalocyaninfarbstoffe, wie Benzopurpurin; Schwefelfarbstoffe; und Triphenylmethanfarbstoffe, wie Triphenylmethan, Fuchsin, Kristallviolett, Phenolphthalein, Fluorescein, Eosin, und Bromphenolblau; der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Acridingelb, Acridinorange, Aequorin, Aesculin, Allophycocyanin, 7-Aminoactinomycin, Auramin O, Berberin, 9,10-Bis(phenylethinyl)anthracen, Calcein, 6-Carboxyfluorescein, Chinin, Cumarin-Farbstoffe, Cyaninen, 4',6-Diamidin-2-phenylindol, 2,7-Dichlorfluorescein, 9,10-Diphenylanthracen, Eosin B, Eosin Y, Epicocconon, Ethidiumbromid, 6-FAMphosphoramidit, Flavinen, Fluoren, Fluorescein, Fluorescein Arsen Helix Bindern, Fura-2, Furaptra, Grün fluoreszierendes Protein (GFP), Hoechst 33342, IAEDANS, Indischgelb, Indocyaningrün, Luciferinen, Merbromin, N-Methylacridon, Nilblau, Nilrot, Phycocyanin, Phycoerythrin, Propidiumiodid, Pyranin, Rhodamin B, Rubren, Safranin T, Stilben, SYBR Green I, SYPRO Orange, SYPRO Red, SYPRO Ruby, Texas Red, TMRM+, Umbelliferon und Xylenolorange; das Protein ein fluoreszierendes Protein ist, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Blau fluoreszierende Proteine, wie TagBFP, mTagBFP2 , Azurite, EBFP2, mKalama1 Sirius, Sapphire und T-Sapphire; Cyan fluoreszierende Proteine, wie ECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, monomeres Midoriishi-Cyan, TagCFP und mTFP1; Grün fluoreszierende Proteine, wie EGFP , Emerald, Superfolder GFP, Monomeric Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover und mNeonGreen; Gelb fluoreszierende Proteine, wie EYFP, Citrine, Venus, SYFP2 und TagYFP; Orange fluoreszierende Proteine, wie Monomeres Kusabira-Orange, mKOK, mKO2, mOrange und mOrange2; Rot fluoreszierende Proteine, wie mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby und mRuby2; photoaktive bzw. photoaktvierbare Proteine und/oder fluoreszierende Proteine; und das Isotop ausgewählt ist aus 2H (D oder Deuterium), 3H (T oder Tritium), 13C, 14C, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 18F, 35S, 36Cl, 82Br, 75Br, 76Br, 77Br, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I und 99mTc. - Verfahren nach
Anspruch 3 , wobei der das Detektormolekül kovalent an die Proteine der Probe gebunden ist. - Verfahren nach
Anspruch 3 , wobei das Protein Biotin oder ein fluoreszierendes Protein ist. - Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Trennmittel ein Trenngel oder eine Immunmembran ist.
- Verfahren nach
Anspruch 7 , wobei das Auftrennen aller markierten Proteine der Probe durch Gelelektrophorese erfolgt. - Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Fixierung des wenigstens einen markierten Zielproteins durch Inkubation des Trenngels mit einem Antikörper, der spezifisch an das Zielprotein bindet, durch Bildung spezifischer Antikörper-Zielprotein-Komplexe erfolgt.
- Verfahren nach
Anspruch 7 , wobei die Fixierung des wenigstens einen markierten Zielproteins auf einer Immunmembran mit der Probe unter Ausbildung spezifischer Antikörper-Zielprotein-Komplexe erfolgt. - Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Probe humanen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs ist.
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Probe ausgewählt sein kann aus Vollblut, Blutserum oder Plasma, Urin, Speichel, Hirnflüssigkeit (CSF), anderen Körperflüssigkeiten (Stuhl, Tränenflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Sputum), Atem (z.B. als kondensierter Atem, oder einem Extrakt oder einer Aufreinigung oder einer Verdünnung davon), Gewebehomogenate, Gewebesektionen und Biopsien.
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das wenigstens eine Zielprotein ein diagnostisch relevantes Protein (DRP), wie beispielsweise ein Biomarker ist.
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das DRP ausgewählt ist aus IgA, IgG, IgM, IgE und IgD, deren Schwerketten sowie gebundene und freie kappa- und lambda-Leichtketten.
- Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 -3 und5 -14 , wobei der Nachweis des Detektor-Moleküls und/oder die Detektion des Zielproteins mittels Fluoreszenz-Imaging, visuell, mit einer Farb-Kamera oder einem für Farbdetektion geeigneten Imaging System; oder mittels Autoradiographie oder Radiographie erfolgt. - Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis15 , wobei der Kit wenigstens ein Detektor-Molekül und eine Anleitung zur Verwendung des Kits umfasst. - Verwendung des Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis15 oder des Kits nachAnspruch 16 zum Nachweisen und/oder Quantifizieren von diagnostisch relevanten Proteinen. - Verwendung nach
Anspruch 17 zum direkten Nachweis von Immunglobulinen zur Diagnose einer Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist. - Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist, umfassend den Nachweis und die Quantifizierung von wenigstens einem Immunoglobulin in einer Probe gemäß dem Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis15 , Vergleich der Menge des wenigstens einen quantifizierten Immunglobulins mit dem Normalwert gesunder Probanden, Feststellen einer Abweichung der Menge des wenigstens einen quantifizierten Immunglobulins von dem Normalwert gesunder Probanden; wobei eine im Vergleich zum Normalwert erhöhte Menge des wenigstens einen quantifizierten Immunglobulins in der Probe ein positiver Indikator für das Vorliegen einer Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist, ist. - Verfahren nach
Anspruch 19 , wobei die Krankheit, die mit einer monoklonalen Gammopathie assoziiert ist, ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Multiples Myelom, solitäres Plasmozytom, Non-Hodgkin-Lymphom (B-Zell-Lymphom), Morbus Waldenström, Schnitzler-Syndrom, AL-Amyloidose und Pyoderma gangraenosum.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102017130322.7A DE102017130322B4 (de) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Verfahren und Kit zur spezifischen Detektion von diagnostisch relevanten Proteinen in biologischen Proben |
| PCT/EP2018/085230 WO2019121527A1 (de) | 2017-12-18 | 2018-12-17 | Verfahren und kit zur spezifischen detektion von diagnostisch relevanten proteinen in biologischen proben |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102017130322.7A DE102017130322B4 (de) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Verfahren und Kit zur spezifischen Detektion von diagnostisch relevanten Proteinen in biologischen Proben |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE102017130322A1 DE102017130322A1 (de) | 2019-06-19 |
| DE102017130322B4 true DE102017130322B4 (de) | 2022-09-22 |
Family
ID=64959306
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE102017130322.7A Active DE102017130322B4 (de) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Verfahren und Kit zur spezifischen Detektion von diagnostisch relevanten Proteinen in biologischen Proben |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE102017130322B4 (de) |
| WO (1) | WO2019121527A1 (de) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150241388A1 (en) | 2009-06-29 | 2015-08-27 | Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corporation | System for rapid electrophoresis binding method and related kits and compositions |
| EP2478364B1 (de) | 2009-09-15 | 2017-08-02 | Gemini Research Limited | Nachweis von auto-antikörpern gegen nukleare antigen |
-
2017
- 2017-12-18 DE DE102017130322.7A patent/DE102017130322B4/de active Active
-
2018
- 2018-12-17 WO PCT/EP2018/085230 patent/WO2019121527A1/de active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150241388A1 (en) | 2009-06-29 | 2015-08-27 | Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corporation | System for rapid electrophoresis binding method and related kits and compositions |
| EP2478364B1 (de) | 2009-09-15 | 2017-08-02 | Gemini Research Limited | Nachweis von auto-antikörpern gegen nukleare antigen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE102017130322A1 (de) | 2019-06-19 |
| WO2019121527A1 (de) | 2019-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69912361T2 (de) | Fluoreszenzpolarisationsverfahren bei mehreren Wellenlängen | |
| EP2758783B1 (de) | Ein immunoblot verfahren | |
| DE69633344T2 (de) | Kalibrierverfahren und vorrichtung fur durchflusscytometer | |
| DE3322373C2 (de) | Testmittel und Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern | |
| DE2953524C2 (de) | ||
| DE102006003380B4 (de) | Untersuchungsteststreifen mit mehreren Markierungen und Lesen derselben | |
| EP2223111B1 (de) | Elispot-verfahren mit zwei filtersystemen | |
| DE2953610C1 (de) | Verfahren zum Bestimmen eines immunologisch aktiven Stoffs | |
| DE60013243T2 (de) | Immunochromatographisches teststück und chromatographische analysenmethode | |
| DE69919503T2 (de) | Verfahren zur bestimmung eines analyten und kit dafür | |
| EP2918597B1 (de) | Verfahren und kit zum überwachen der probenvorbereitung, von chemischen markierungsreaktionen und von antikörperreaktionen | |
| AT393035B (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung zumindest eines chemischen parameters eines probenmediums | |
| DE10211818B4 (de) | Verfahren zur quantitativen Bestimmung mehrerer Analyten | |
| DE2741862A1 (de) | Verfahren zur bestimmung eines thyroidhormons in einer aus einer biologischen fluessigkeit bestehenden probe | |
| DE102017130322B4 (de) | Verfahren und Kit zur spezifischen Detektion von diagnostisch relevanten Proteinen in biologischen Proben | |
| EP1295124B1 (de) | Kompetitives assay-verfahren | |
| DE102008006610A1 (de) | Verfahren zum sensitiven Nachweis von Polyaminosäuren und anderen Makromolekülen | |
| DE4024350C2 (de) | Immunologisches Multiplex-Testsystem | |
| DE60027176T2 (de) | Nachweis von prostatakrebs durch bestimmen des verhältnisses von psa zu igf-1 | |
| EP2986985A2 (de) | Automatisierbares verfahren zur identifizierung, quantifizierung und diskriminierung von spezifischen signalen gegenüber unspezifischen signalen in nachweisverfahren mittels detektor | |
| WO2006131379A2 (de) | Verfahren zum testen von substanzen oder substanzgemischen, dessen verwendung und entsprechende analysekits | |
| DE10054093A1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests | |
| DE4036288A1 (de) | Verfahren und vorrichtung fuer immunologische tests unter nutzung messbarer teilchen | |
| DE2537275A1 (de) | Immunchemisches verfahren zur bestimmung von antigenen und antikoerpern in biologischen fluessigkeiten | |
| EP2288916A1 (de) | Immunochromatographisches verfahren und testsystem zur bestimmung von wenigstens einem analyten in einer zu untersuchenden testlösung |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R012 | Request for examination validly filed | ||
| R016 | Response to examination communication | ||
| R018 | Grant decision by examination section/examining division | ||
| R020 | Patent grant now final |