WO2004031745A2

WO2004031745A2 - Qualitätskontrolle von mikroarray sensorfeldern

Info

Publication number: WO2004031745A2
Application number: PCT/EP2003/010795
Authority: WO
Inventors: Holger Ottleben; Harald Rau; Robert Schnepf; Dirk Vetter
Original assignee: Graffinity Pharmaceuticals Ag
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-29
Publication date: 2004-04-15
Also published as: DE10245651A1; AU2003280344A8; AU2003280344A1; WO2004031745A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft verfahren zur Qualitätskontrolle von Sensorfeldern auf Mikroarrays.

Description

Qualitätskontrolle von Mikroarray Sensorfeldern

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Qualitätskontrolle von Sensorfeldem auf Mikroarrays.

Mikroärrays haben in der letzten Zeit immer mehr an Bedeutung gewonnen. Sie ermöglichen die Präsentation einer enormen Vielzahl von chemischen oder biologischen Materialien für die vielfältigsten Anwendungsgebiete.

Hierbei sind Polynukleotid- (z.B. DNA- oder RNA-) oder Oligonukieotidarrays die am weitesten verbreiteten. Diese basieren häufig auf einem Glasträger, der, chemisch modifiziert, den synthetischen Aufbau oder die Anbindung der gewünschten Probe ermöglicht. Zuweilen werden diese Träger auch Chip oder Biochip genannt. Diese können dann u.a. für Hybridisierungszwecke eingesetzt werden. Eine vergleichbare Entwicklung haben Mikroarrays mit immobilisierten Proteinen vollzogen. Jedoch zeigt sich hier eine gewisse Unverträglichkeit zumindest einiger Proteine mit dem festen Träger, so dass beispielsweise Denaturierungserscheinungen zu beobachten sind. -Seltener- werden in- er-Uteratur chemische- Mikroarrays-beschriebenrd:hr Mikroarrays auf denen organische Moleküle meist mit geringem Molekulargewicht (sogenannte "kleine organische Moleküle"; im Englischen auch "small molecules" oder "small organic molecules") immobilisiert sind. Dies liegt an den stark unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Verbindungen dieser heterogenen Stoffklasse, die bei der Synthese der Proben und der Herstellung der Mikroarrays berücksichtigt werden müssen.

Die Vorteile solcher Mikroarrays liegen in deren leichten Handhabbarkeit sowie ihrem Potenzial zur Miniaturisierung und der möglichen Automatisierung bei der Herstellung und dem Einsatz in Instrumenten, wie Meßgeräten. Dies liegt zum einen in der Mikrosystemtechnik, die beispielsweise Strukturierungen bis in den Nanometerbereich ermöglicht. Zum anderen erlauben die fortschreitenden Entwicklungen in der Handhabung von Flüssigkeiten mit Hilfe von Mikropipetten oder Stiften (Pins) das Absetzen immer kleinerer Mengen von Flüssigkeitstropfen auf den Mikroarrays, wobei versucht wird, die Varianz der Volumina von Tropfen zu Tropfen zu verringern. Ein bedeutender Anwendungsbereich insbesondere für chemische Mikroarrays ist die Wirkstoffforschung, wobei die oben genannten Vorteile deutlich zu Tage treten. Hierbei werden eine Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen, sogenannten Proben, nahezu gleichzeitig mit einem Zielmolekül, beispielsweise einem Protein das in Zusammenhang mit einer Krankheit oder einem therapeutischen Anwendungsgebiet steht, in Kontakt gebracht und die Wechselwirkung zwischen immobilisierter Verbindung und Zielmolekül z.B. als Bindungsassay detektiert (Screening). Die hieraus gewonnenen Informationen dienen dann zur Weiterentwicklung interessanter Strukturen bis hin zum Wirkstoff. Dabei erweist sich das Arrayscreening als schneller und kostengünstiger gegenüber dem klassischen häufig mit Mikrotiterplatten (im Löslichen) arbeitenden Hochdurchsatzscreening (HTS).

Für alle Anwendungsbereiche ist die Qualitätskontrolle der Mikroarrays von großer Bedeutung. Zahlreiche Kontrollen, die die Qualität und den Erfolg bestimmter Vorgänge betreffen, sind allgemein bekannt und werden auch in der Chip- bzw. Mikroarraytechnologie eingesetzt. Hierzu gehören beispielsweise das Anfertigen mehrerer Kopien, beispielsweise von Duplikaten, sowohl von Proben auf einem Array als auch des Arrays selbst. Darüber hinaus werden sogenannte Positiv- und Negativkontrollen eingesetzt.

So beschreibt WO 01/6236 A1 einen Oberflächenpiasmonen Resonanz (SPR) Chip, auf dem einzelne Kontrollspots als positive oder negative Kontrolle dienen sollen. Mit Hilfe solcher QC-Kontrollen soll sichergestellt werden, dass die Chipproduktion (insbesondere das Spotting) als Ganzes und der Assay, für den der Chip beispielsweise eingesetzt werden kann, als solcher funktioniert haben. Dem liegt die Annahme zugrunde, dass eine gewisse Anzahl an Kontrollproben, die gleichmässig über den Chip plaziert werden, bei Eintreten des erwarteten Ergebnisses (Signalerkennung der Positivkontrolle bzw. fehlendes oder ein dem Untergrundrauschen vergleichbares Signal bei einer Negativkontrolle) prognostiziert werden können und nach statistischer Bewertung eine Aussage hinsichtlich des Gelingens des Versuchs für alle Sensorfelder erlauben. Eine Differenzierung bezogen auf jedes einzelne Sensorfeld ist jedoch nicht möglich.

Es ist jedoch von großer Bedeutung für jedes Sensorfeld bzw. jeden Spot eine Einschätzung zu gewinnen, wie erfolgreich die Immobilisierung einer Probe oder eines Probenfragments zum weiteren synthetischen Aufbau der Probe verlaufen ist, um die Vergleichbarkeit der Proben untereinander zu gewährleisten. Üblicherweise hat die Menge an immobilisierter Probe Einfluß auf das Ergebnis der jeweiligen Anwendung.

So liegt bei dem oben erwähnten Anwendungsbeispiel des Arrayscreenings eine Möglichkeit der Auswertung der gewonnen Information darin, ein sogenanntes Ranking durchzuführen. Dabei werden die Proben in der Reihenfolge ihrer Messergebnisse, und damit ihrer Affinität bezüglich des Zielmoleküls aufgelistet und die ersten ("besten", mit den stärksten Signalen) z.B. zehn werden dann anhand ihrer chemischen Struktur herangezogen, um den Wirkstoffentwicklungsprozess fortzuführen. Eine solche Selektion ist häufig deshalb notwendig, da bei einem Screening generell mehr sogenannte Treffer (deutlich vom Grundrauschen erhöhte Signale) auftreten, als Strukturen weiter bearbeitet werden sollen.

Liegen nun unterschiedliche Oberflächenkonzentrationen der immobilisierten Proben vor (unterschiedlicher Immobilisierungserfolg), so kann eine Probe höherer Affinität gegenüber dem Zielmolekül, die in geringerer Dichte (Konzentration) als eine andere, schwächer bindende Probe angeboten wird, zu einem verminderten Signal führen und umgekehrt. Das aus diesen Signalwerten ermittelte Ranking wäre somit fehlerhaft. Einen Extremfall stellt die Situation dar, bei dem eine Probe auf einem Sensorfeld gar nicht immobilisiert wurde, so dass ein darauffolgendes Screening immer ein "Nichtbinden" ergibt.

Das Auftreten unterschiedlicher Erfolge des Immobilisierens von Proben kann -je nach verwendetem System und Verfahren- zahlreiche Gründe haben. Beispielsweise können die Konzentrationen der Proben in den aufgebrachten Probenflüssigkeiten unterschiedlich sein, was bei einer thermodynamisch oder kinetisch kontrollierten chemischen Reaktion mit der reaktiven Gruppe einer Bindematrix zu unterschiedlichen Produkt(oberfIächen-)konzentrationen führt. Dies kann Ursachen in der Synthese der Proben haben.

Diese Problematik tritt insbesondere bei chemischen Mikroarrays auf, die eine Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen, die meist aus Verfahren der kombinatorischen Synthese stammen, tragen.

Weiterhin können beim Absetzen der Probe Fälle auftreten, in denen ein Teil der Flüssigkeit nicht auf die vorgesehenen Probenfelder gelangt. So ist es auch denkbar, dass die abgesetzte Probenflüssigkeit nicht ausreicht, um das gesamte vorgesehene Probenfeld zu benetzen (z.B. aufgrund hoher Flüchtigkeit des Lösemittels).

In der Literatur sind nur sehr wenige Verfahren beschrieben, die eine Kontrolle des Immobilisierungserfolges von Proben auf Sensorfeldern prinzipiell für jedes Sensorfeld von Mikroarrays erlauben.

In Biotechniques 2000, 29, 78-81 wird ein Verfahren zur Qualitätskontrolle (QC) für DNA Arrays beschrieben, das es ermöglicht, die Homogenität der Oberfläche eines jeden DNA Spots im gesamten Array zu kontrollieren. Bei diesem Verfahren werden auf mit Polylysin beschichteten Standard Glas Objektträgern für die Mikroskopie Tupfen (Spots) durch Absetzen von Einzelstrang-DNA (ssDNA) enthaltender Flüssigkeit mit Hilfe von piezoelektrischen Pipetten erzeugt. Der Erfolg dieses Vorgangs wird durch sogenanntes Staining des gesamten Glasträgers mit einer SYBR^® Green II Lösung, einem hochempfindlichen Fluorophor-Farbstoff mit literaturbekannter Affinität zu ssDNA, überprüft. Die anschließende Detektion erfolgt mittels Fluoreszenzscanner. Die Datenauswertung erfolgt durch bildverarbeitende Software, die u.a. die Spot-Positionen sowie den Hintergrund ermittelt. Ein Vorteil dieser QC-Methode ist dadurch begründet, dass das Staining Reagenz wieder von der Oberfläche entfernt werden kann ("Destaining") und somit der Glaschip wiederverwendbar ist, beispielsweise für Hybridisierungsversuche mit der eigentlich zu untersuchenden Probe.

Dieses Verfahren, das den direkten Nachweis der immobilisierten Probe ermöglicht, ist jedoch auf DNA beschränkt, da für andere Stoffklassen ein universelles "Kontroll- Staining Reagenz" nicht zur Verfügung steht.

In dem vorstehenden Stand der Technik erfolgt die Immobilisierung der Proben nicht direkt auf dem Träger, sondern es wird zunächst eine organische, in diesem Falle polymere Schicht als Bindematrix gewählt, an der die Proben immobilisiert werden. Als weitere im Stand der Technik sehr vorteilhaft beschriebene organische Schichten zur Verwendung als Bindematrix sind selbstassemblierende Monolagen zu nennen, die zur Maskierung von Trägeroberflächen herangezogen werden (s. z.B. Langmuir 1987, 3, 932-950). Diese sind daher besonders geeignet, da die sich selbst assemblierenden Moleküle einen dicht gepackten Film ergeben, der beispielsweise die unerwünschte Wechselwirkung eines Zieimoleküls mit dem meist anorganischen Träger vermeidet.

Die Oberflächeneigenschaften und -qualität einer ω-funktionalisierten selbstassemblierten Monolage sowie ihre Verwendbarkeit zur kovalenten Immobilisierung von Proteinen und ihrem Einsatz in der Rastermikroskopie- insbesondere der Rasterkraftmikroskopie (AFM, atomic force microscopy)- wurden eingehend in Biophys. J. 1996, 70, 2052-2066 untersucht. Hierbei wurde Dithio- bis(succinimidylundecansäure) auf extrem ebener Goldoberfläche immobilisiert und die Kinetik der Monolagenbildung anhand von AFM, Ellipsometrie, Kontaktwinkelmessung und Isotopenmarkierung studiert. Die Aktivesterfunktion dient zur anschließenden kovalenten Immobilisierung von Lysin oder einer Reihe von Biomolekülen. Dabei wird die Möglichkeit der Bestimmung von umgesetzten N-Hydroxysuccinimid (NHS) und damit indirekt des immobilisierten Reaktionspartners beschrieben, die auf der 1 ,4-¹⁴C- Markierung des NHS im Disulfid beruht, wobei nach der Reaktion die Menge des freigesetzten radioaktiven NHS untersucht werden kann.

Diese Methode, die indirekt den Immobilisierungserfolg der Probe durch die ermittelte Menge an Abgangsgruppe bestimmt, ist ungeeignet für die Verwendung bei Mikroarrays, da gewährleistet werden müßte, dass für jedes Sensorfeld separat die Menge an NHS bestimmt würde, was technisch extrem schwer zu realisieren ist. Weiterhin ist die Methode auf die zu verwendende Immobilisierungschemie beschränkt, da eine freiwerdende Abgangsgruppe notwendig ist. Eine Additionsreaktion zur Immobilisierung wäre dieser Methode somit nicht zugänglich. Nachteilig ist ebenfalls, dass mit radioaktiv markierten Reagenzien gearbeitet werden müßte, was ebenfalls eine Erschwernis darstellt.

Es besteht daher in der Fachwelt ein großes Bedürfnis für alternative Qualitätskontrollverfahren, die den Immobilisierungserfolg von Proben auf Sensorfeldern eines Mikroarrays erkennbar machen können und dabei möglichst breit einsetzbar sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung eines neuen Qualitätskontrollverfahrens für den Immobilisierungserfolg einer Probe an die Bindematrix von Sensorfeldern eines Mikroarrays, die unabhängig von der chemischen Natur der Probe ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass es möglich ist, nach Immobilisierung von Proben auf der Bindematrix von Sensorfeldern eines Mikroarrays deren Immobilisierungserfolg indirekt anhand der verbliebenen freien Stellen der Bindematrix zu überprüfen, indem diese freien Stellen mit einem Kontrollliganden belegt werden, der dann mit Hilfe einer geeigneten Detektionsmethode auf der Oberfläche des Arrays nachgewiesen wird.

Die Aufgabe wird damit gelöst durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Qualitätskontrolle von Sensorfeldern auf Mikroarrays, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen eines Mikroarrays auf dessen einer Oberfläche eine Vielzahl von Sensorfeldern vorhanden sind, die jeweils eine Bindematrix enthalten, an der mindestens ein Ligand kovalent immobilisiert ist;

(b) In Kontakt bringen mindestens eines mit Ligand belegten Sensorfeldes mit einem Kontrollliganden;

(c) gegebenenfalls Entfernen nicht gebundener Kontrollliganden;

(d) Nachweis des an die Bindematrix des Sensorfeldes gebundenen Kontrollliganden mit Hilfe einer geeigneten Detektionsmethode.

Vorteilhafte Merkmale des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Das vorstehend definierte Verfahren beruht also darauf, dass dem Mikroarray, welches bereits mindestens einen bzw. eine zu untersuchende Liganden bzw. Probe trägt (Schritt (a)) mindestens ein weiterer Kontrollligand angeboten wird (Schritt (b)), dessen chemische oder physikalische Eigenschaften zumindest soweit bekannt sind, dass seine Immobilisierung auf dem Sensorfeld mit einem vorgegebenen Verfahren direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. Der Kontrollligand sollte so ausgestaltet sein, dass er diejenigen Funktionalitäten der Bindematrix zur bevorzugt kovalenten Anbindung nützen kann, die auch für die Immobilisierung der zu untersuchenden Liganden verantwortlich sind. Wird ein solcher Kontrollligand unter Bedingungen mit dem Mikroarray in Kontakt gebracht, unter denen sich seine Bindung mit der Bindematrix ausbilden kann, gibt der Nachweis der gebundenen Kontrollliganden Aufschluss darüber, zu welchem Ausmaß die Kopplung des zu untersuchenden Liganden an die Bindematrix zur Belegung der dort vorhandenen Bindungsstellen geführt hat.

Der Nachweis des Kontrollliganden kann auf seinen chemischen oder physikalischen Eigenschaften beruhen. So kann beispielsweise sein Vorhandensein auf dem Sensorfeld durch seine Masse in einem massensensitiven Detektionsverfahren nachgewiesen werden. Weiterhin kann der Kontrollligand markiert sein und durch seine Markierung (z.B. radioaktive oder Fluoreszenzmarkierung, Infrarotmarker) nachgewiesen werden.

Bevorzugt erfolgt ein sensorfeldaufgelöster Nachweis des Kontrollliganden über dessen Interaktion mit einem für den Kontrollliganden an sich bekannten Interaktionspartner, der z.B. durch seine Masse oder seine Markierung nachgewiesen werden kann. So sind beispielsweise Festphasenimmunoassays für die Detektion einsetzbar. Hierzu können Kontrollligand und Interaktionspartner gleichzeitig auf die Sensorfelder gebracht werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden in diesem Fall Kontrollligand und bereits gebundener Interaktionspartner vereinfachend wie ein (einheitlicher) Kontrollligand angesehen. Bevorzugt erfolgt jedoch zunächst das in Kontakt bringen mindestens eines mit Liganden belegten Sensorfeldes mit einem Kontrollliganden und anschließend die Inkubation der Sensorfelder mit dem I nteraktionspartner.

Der Nachweis kann qualitativ, semi-quantitativ oder quantitativ erfolgen. Bei einem qualitativen Nachweis ergibt sich als Qualitätsnachweis eine "Ja-Nein-Aussage". Vorzugsweise wird jedoch ein Messwert ermittelt, der als Maß für die Sensorfeldkonzentration des Kontrollliganden dient und somit eine semi-quantitative oder quantitative Aussage erlaubt. Der Vergleich der einzelnen Sensorfelder kann dann anhand der ermittelten Werte erfolgen. Die Werte selbst oder der Vergleich der Sensorfeldwerte untereinander können dann zu Qualitätskontrollaussagen herangezogen werden.

So können beispielsweise die einzelnen Sensorfeldwerte mit einem vorher festgelegten Schwellenwert verglichen werden. Dieser kann anhand einer Kalibrierkurve ermittelt werden, die einen experimentell zu bestimmenden funktionalen Zusammenhang zwischen Schwellenwert und Oberflächenkonzentration an Kontrollligand wiedergibt. Beispielsweise kann als Anforderung definiert werden, dass mindestens 99% eines Sensorfeldes mit dem bzw. den zu untersuchenden Liganden belegt ist. Der Schwellenwert ergibt sich dann als Zahlenwert für das Maß an Interaktion zwischen Kontrollligand und Interaktionspartner aus der Kalibrierkurve für 1 % Sensorfeldbelegung.

Für den Fachmann ergeben sich offensichtlich eine Reihe weiterer Möglichkeiten, anhand deren die gewonnenen Einzeldaten zu Qualitätskontrollzwecken verarbeitet werden können.

Um zu gewährleisten, dass der Nachweis des Kontrollliganden nicht durch den zu untersuchenden Liganden verfälscht wird, ist es von Vorteil, den Kontrollliganden so auszuwählen, dass der für ihn geeignete Nachweis nicht auf die zu untersuchenden Liganden anspricht. Alternativ, aber auch zusätzlich zu dieser Auswahl ist es möglich, vor der eigentlichen Messung im Rahmen der Qualitätskontrolle das Hintergrundsignal am Sensorfeld ohne Belegung mit Kontrollligand zu bestimmen und diesen Wert bei der späteren Kontrollmessung mit Kontrollligand zu berücksichtigen. Im bevorzugten Fall eines indirekten Nachweises des Kontrollliganden mit Hilfe eines mobilen (Kontroll- ) Interaktionspartners bedeutet dies beispielsweise, dass der Interaktionspartner, dessen Affinität zum Kontrollliganden bekannt ist, zunächst mit dem Sensorfeld ohne Kontrollliganden in Kontakt gebracht wird bevor der Kontrollligand immobilisiert und die eigentliche Kontrollmessung durchgeführt wird. Hier kann es jedoch erforderlich sein, dass gebundene Interaktionspartner vor Immobilisierung des Kontrolliganden entfernt werden müssen. Eine alternative Vorgehensweise ist durch die Untersuchung zweier gleicher Mikroarrays gegeben, wobei der erste Array direkt mit dem (Kontroll-) Interaktionspartner umgesetzt wird und der zweite vor dieser Umsetzung zunächst mit Kontrolligand belegt wird.

Zwischen der Immobilisierung des Kontrollliganden und dem Aufbringen dessen Interaktionspartners kann die gesamte sensorfeldseitige Mikroarrayoberfläche geblockt werden. Das Blocking kann zur Durchführung der Detektion erforderlich sein. Das Blockingreagenz kann chemischer Natur sein, beispielsweise Mercaptoethanol bei thiolsensitiver Bindematrix. Weiterhin kann das Blockieren durch Reagenzien wie BSA, Tween, Triton oder SDS erfolgen. Solche Blockierungsreagenzien sind dem Fachmann geläufig.

Der Begriff "Qualitätskontrolle" soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Information beinhalten, die es erlaubt qualitative, semi-quantitative oder quantitative Aussagen über das Vorhandensein nicht umgesetzter Immobilisierungsstellen einer Bindematrix auf einem Sensorfeld nach Immobilisierung einer Probe zu treffen.

Der Begriff "Sensorfeld" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht limitierend auf die Verwendung der Sensorfelder auf einem Mikroarray zu Meßzwecken zu verstehen. Vielmehr kann ein Mikroarray mit solchen "Sensorfeldern" vielfältig angewendet werden, z.B. zu Festphasensynthesezwecken von biologischen oder chemischen Molekülen. Auch für solche Anwendungsgebiete ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Qualitätskontrolle einsetzbar. Der Begriff "Sensorfeld" soll vielmehr verdeutlichen, dass diese geometrische Einheit im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens einer Nachweismethode unterworfen wird.

Der Begriff "Ligand" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede zu immobilisierende Probe oder jedes Probenfragment biologischer, chemischer oder anderer Natur. Im Zusammenhang mit der molekularen Wechselwirkung von Interaktionspartnern bestimmt der Begriff "Ligand" den Partner, der immobilisiert vorliegen soll. Der/die andere/n Partner wird/werden als "mobile/r Interaktionspartner" bezeichnet. So bestimmt der Begriff "Kontrollligand" ebenfalls den Partner, der immobilisiert vorliegen soll.

Der Begriff "Mikroarray" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede gegenständliche Ausgestaltung, die mindestens eine Oberfläche aufweist, auf der Sensorfelder vorhanden sind. Es bestehen keine Beschränkungen in Bezug auf die Dimensionen eines Mikroarrays oder der Anzahl oder Dimensionen der Sensorfelder oder der Dichte der Sensorfelder auf einem Mikroarray. Das Suffix "Mikro" dient lediglich der Verdeutlichung, dass eine Miniaturisierung -soweit möglich- bevorzugt ist.

Sensorfelder und Mikroarray können verschiedenartig erzeugt werden. So kann der Mikroarray ein- oder mehrstückig sein und beispielsweise mehrere Schichten umfassen. Dabei befindet sich eine Vielzahl von Sensorfeldern auf einer Oberfläche des Mikroarrays. Die Sensorfelder sind voneinander getrennt durch Sensorfeldzwischenbereiche, die sich chemisch, physikalisch oder andersartig von den Sensorfeldern unterscheiden. Dabei beinhaltet jedes Sensorfeld eine Bindematrix, an der mindestens ein Ligand kovalent immobilisiert ist.

Die Materialien, die ein Mikroarray beinhaltet, können vielfältiger Natur sein und hängen u.a. vom Verwendungszweck des Arrays, der Natur der Ligandeη und die für das erfindungsgemäße Verfahren notwendige Detektions- bzw. Nachweismethode ab. Geeignete Materialien z.B. sind permeable Stoffe, wie Cellulose oder undurchlässige Stoffe, wie Kunststoffe, Gläser, Metalle, Metalloxide oder Legierungen.

Der Mikroarray kann auf der sensorfeldseitigen Oberfläche strukturiert oder unstrukturiert sein

Beispielsweise kann ein Träger als Teil des Mikroarrays eine planare Oberfläche besitzen, auf der sich eine einheitliche Bindematrix zur kovalenten Anknüpfung des Liganden befindet. Die Sensorfelder entstehen dann erst beim Aufbringen der Liganden, beispielsweise durch Spotting. Die Position sowie die Form der Sensorfelder werden dann durch die Spotting Vorrichtung bestimmt. Für die Meßfelderkennung existieren im Stand der Technik zahlreiche, meist softwarebasierte Methoden, die dem betreffenden Fachmann geläufig sind. Die Sensorfeldzwischenbereiche unterscheiden sich chemisch von den Sensorfeldern durch das Fehlen von Liganden. Diese Bereiche zeigen nach wie vor eine Bindematrix. Beim Nachweis des Kontrollliganden, der dann auch in den Zwischenfeldbereichen immobilisiert wird, lassen sich die Sensorfelder durch einen geringeren Meßwert als ihre Umgebung erkennen. Es ist auch möglich, dass der Kontrollligand ebenfalls auf. die selben Stellen wie vorher die Liganden gespottet werden und anschließend die Zwischenbereiche geblockt werden, bevor der Kontrollligand nachgewiesen wird. Zur Herstellung eines Peptidarrays auf Cellulosemembran durch Spotting siehe z.B. WO 01/18545 A2.

Bevorzugt sind jedoch strukturierte Mikroarrays. Die Strukturierung kann beispielsweise chemisch durch photostrukturierende Behandlung einer auf einem planaren Träger aufgebrachten Bindematrix erfolgen. Die Sensorfelder werden somit durch die Beschaffenheit bzw. die Modifizierung der Bindematrix definiert. Hierbei unterscheiden sich, wie im Fall eines unstrukturierten Mikroarrays, die Sensorfelder von den Sensorfeldzwischenbereichen nur chemisch. Jedoch ist diese Unterscheidung bereits vor Immobilisierung der Liganden erkennbar und die Sensorfeldposition somit vor deren Aufbringen festgelegt. Ein Beispiel eines solchen Arrays ist in WO 00/67028 A1 gegeben.

Weiterhin kann die Strukturierung durch Erhebungen oder Vertiefungen erzielt werden. Als Beispiel eines einstückigen Mikroarrays kann eine Mikrotiterplatte dienen. Hierbei können die Kavitätenböden (Vertiefungen) und -Wandungen die Sensorfelder darstellen und der Plattenkörper die Sensorfeldzwischenbereiche. In einem solchen Fall kann die Bindematrix sich nur über die Sensorfelder oder über die gesamte Oberfläche erstrecken. Die US-A-6,063,338 offenbart beispielsweise eine Mikrotiterplatte, die ein Cycloolefin für spektroskopische Zwecke enthält und für die Festphasensynthese geeignet sein soll. Hierbei wird unter anderem vorgeschlagen, dass die Kavitäteninnenwände und -böden funktionalisiert werden, um Komponenten für die Festphasensynthese zu immobilisieren.

Ebenso kann ein Mikroarray aus mehreren Schichten aufgebaut sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, dass der Mikroarray auf seiner den Sensorflächen zugewandten Oberfläche eine strukturierende Schicht auf einem planaren Träger umfaßt. Die strukturierende Schicht kann beispielsweise mit Hilfe einer Maske auf den Träger gebracht werden. Die Stellen, an denen keine Schicht aufgebracht wurde, stellen dann die Sensorfelder dar. Ebenso kann der Träger oder eine weitere Zwischenschicht zusätzlich Vertiefungen an diesen Stellen aufweisen, wodurch die gebildeten Kavitäten tiefer ausgestaltet sind. Weiterhin bevorzugt kann der Mikroarray eine Metallschicht, insbesondere eine Goldschicht, auf der strukturierenden Schicht und/oder auf dem Träger enthalten. Vorteilhaft wäre die Goldschicht sowohl auf den Sensorfeldern, die durch die freigelassenen Trägeroberfläche gebildet werden als auch auf den Träger bedeckenden strukturierenden Schicht. Dabei kann sich die Bindematrix ebenfalls nur im Bereich der Sensorfelder oder über den gesamten Array auf der Metallschicht nach außen hin befinden. Solche mehrschichtigen Mikroarrays sind in WO 01/92883 A2 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt diesbezüglich vollständig Bezug genommen wird.

Besonders bevorzugt besteht der Träger eines solchen mehrschichtigen Mikroarrays aus einem lichtdurchlässigen Material (wie z.B. Glas) und die strukturierende Schicht besitzt zusätzlich geeignete optische Eigenschaften, die einen Mikroarray als Oberflächen Plasmonenresonänz (SPR) Sensor bilden, wie er in der WO 01/92883 A1 beschrieben ist. Auf den diesbezüglichen Offenbarungsgehalt der WO 01/92883 A1 wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.

Für die Abmessungen des Mikroarrays bestehen keine Beschränkungen. Ein häufig verwendetes Maß entspricht dem eines handelsüblichen Objektträgers für die Mikroskopie mit den Maßen 76 x 26 mm. Aber auch andere Abmessungen wie 125 x 83 mm sind denkbar. Die Sensorfelddichte beträgt vorteilhafterweise mehr als 50, bevorzugt mehr als 100 Sensorfelder pro cm². Bevorzugt enthält der Mikroarray mindestens 96, stärker bevorzugt mindestens 4608 und am meisten bevorzugt mindestens 9216 Sensorfelder. Die Sensorfelder liegen hierbei bevorzugt in einer an handelsübliche Mikrotiterplattenformate angepaßten Anzahl (gleiche Anzahl oder ein ganzzahliges Vielfaches davon) vor. Die Sensorfelder können rund, elliptisch, rechteckig oder quadratisch sein oder eine andere Form besitzen. Bevorzugte Sensorfelder sind rund und haben einen Durchmesser von höchstens 700 μm, bevorzugt 400μm.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Qualitätskontrolle verwendeten Sensorfelder beinhalten eine Bindematrix. Diese Bindematrix dient dazu, einen Liganden (chemisch) kovalent zu binden. Die Bindematrix kann beispielsweise als Ergebnis der Modifizierung vorhandener Teile des Mikroarrays oder durch Hinzufügen zusätzlicher Teile entstehen. So kann ein fester Träger auf einer seiner Oberflächen Chemikalien ausgesetzt werden, die reaktive chemische Gruppen freisetzen, die dann die Anbindung des Liganden ermöglichen. Beispielsweise setzt die alkalische Behandlung von Glasoberflächen Si-OH Gruppen frei, die eine kovalente Bindung ermöglichen können. Die so behandelte Oberfläche wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Bindematrix verstanden.

Bevorzugt wird jedoch der Ligand nicht direkt an einen festen Träger immobilisiert, sondern es wird eine zusätzliche organische Schicht aufgebracht, die beispielsweise über die oben genannte chemische Modifikation an den Träger gebunden wird. Die als Bindematrix fungierende organische Schicht muß jedoch nicht kovalent an einen festen Träger gebunden sein. Vielmehr ist auch eine ionische, adsorptive, oder komplexchemische Anbindung möglich. Auch bioorganische Systeme, die hydrophobe Wechselwirkungen mit Wasserstoffbrücken und ionischen Wechselwirkungen kombinieren, können die Anbindung des Liganden gewährleisten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Bindematrix eine selbstassemblierende Monolage (SAM) als organische Schicht. Die Selbstorganisation eines SAM zu einem dichten Film erfolgt normalerweise durch hydrophobe Wechselwirkung langkettiger Kohlenwasserstoffe an deren einem Ende eine funktioneile Gruppe vorhanden ist, die die Anbindung an den Träger ermöglicht und an deren anderen Ende eine funktionelle Gruppe die Immobilisierung des Liganden ermöglicht. Verbindungen, die diese funktioneilen Bausteine umfassen (Kopf-, Fußgruppe, hydrophober Teil), werden auch Anker oder Ankermoleküle genannt. Weiterhin kann der Anker einen Spaceranteil besitzen, der bevorzugt Ethylenglykoleinheiten enthält.

Vorteihafterweise werden zusammen mit den erwähnten Ankermolekülen sogenannte Verdünnermoleküle auf die Trägeroberfläche aufgebracht, um die selbstassemblierende Monolage geeignet zu strukturieren und die Konzentration der Bindungsstellen auf der Oberfläche zu steuern. Eine zu dichte Oberflächenkonzentration kann durch sterische Hinderung nachteilig sein. Verdünnermoleküle sind strukturell den Ankermolekülen angepaßt, jedoch besitzen Sie keine Kopfgruppe für die Anbindung des Liganden. Ebenso muß gewährleistet werden, dass der Kontrolligand nicht an die Verdünnermoleküle bindet.

Beispielsweise können SAMs durch Chemisorption von Alkylthiolen auf einer Metalloberfläche (z.B. Gold) erzeugt werden. Die langkettigen Moleküle packen sich als SAM auf die Festphase, wobei die Goldatome von den Schwefelfunktionen komplexiert werden. Ein weiteres Beispiel ist die Silanisierung von Glas oder Silizium mit reaktiven Epoxid- oder Aminogruppen-haltigen Silanen und die anschließende Acylierung der Aminogruppen, beispielsweise mit Nukleosidderivaten (Maskos und Southern, Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1679-84).

Zur Synthese und zu bevorzugten chemischen Strukturen von Anker und Verdünnermolekülen sei auf WO 00/73796 A2 und WO 01/92883 A2 verwiesen, auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. Bevorzugt wird ein Ankermoleküi der allgemeinen Formel X-R-Y eingesetzt.

Dabei ist X ein Atom oder eine Atomgruppierung, die die Anbindung an einen festen Träger gewährleistet. Die Wahl der Gruppe X hängt von der chemischen Natur des festen Trägers ab. Geeignete funktionelle Gruppen oder reaktive Verbindungen sind dem Fachmann bekannt und können leicht bei Kenntnis des Trägers ermittelt werden. Besonders bevorzugt ist X ein Element der V. oder VI. Hauptgruppe, wobei auch Kombinationen von identischen oder verschiedenen Elementen verwendet werden können. Vorteilhaft sind hier Kombinationen wie -S-Se- oder -Se-Se-. Ebenfalls vorteilhaft ist, je nach Oberflächenbeschaffenheit die Verwendung von bei neutralem pH ionisiert vorliegenden Gruppen, wie z.B. Sulfonat. Bevorzugt eingesetzt wird als X Schwefel, z.B. in Form der Disulfidfunktion (-S-S-), der Thiolfunktion (-SH) oder der Sulfidfunktion (-S-). Die verwendeten Elemente zeichnen sich dadurch aus, dass sie entweder eine hohe Affinität zu Metallen, insbesondere Edelmetallen (Gold, Silber etc.), aufweisen und somit eine Immobilisierung der Ankermoleküle z.B. auf einer Gold- , Silber oder Platinoberfläche ermöglichen, oder aber, wenn es sich um eine ionische Gruppe handelt, an eine Metalloxidoberfläche wie z.B. AI₂O₃ binden können. Weist X zwei freie Valenzen auf, so können beide mit gleichen oder unterschiedlichen Resten - R-Y verbunden sein.

Der Rest R stellt eine verzweigte oder unverzweigte, gegebenenfalls durch Heteroatome wie beispielsweise S, N oder O, Amid- oder Esterbindungen unterbrochene Kohlenwasserstoffkette von mehr als 10 Atomen Länge dar.

Y ermöglicht die kovalente Anbindung der Liganden direkt oder indirekt mit oder ohne vorheriger Modifizierung der Liganden. Geeignete funktionelle Gruppen oder reaktive Verbindungen sind dem Fachmann bekannt und können leicht bei Kenntnis der Liganden ermittelt werden. Besonders bevorzugt für Y sind Acetale, Ketale, Acylale, Acylhalogenide, Alkohole, Aldehyde, Alkene, Halogenide, Alkine, Allene, Amide, Amidine, Aminale, Amine, Anhydride, Azide, Azine, Aziridine, Azoverbindungen, Borane, Carbamate, Carbodiimide, Carbonsäuren, Carbonsäureester, Cyanamide, Cyanate, Diazoverbindungen, Diazoniumsalze, Epoxide, Ether, Hydrazide, Hydrazine, Hydrazone, Hydroxamsäuren, Hydroxamsäureester, Hydroxylamine, Imide, Imine, Anorganische Ester, Isocyanate, Isocyanide, Isothiocyanate, Ketene, Ketone, Nitrile, Nitroverbindungen, Nitrosoverbindungen, Oxime, Phenole, Phosphine, Phosphonate, Ammoniumsalze, Phosphoniumsalze, Sulfonamide, Sulfone, Sulfonsäuren, Sulfonester, Sulfoniumsalze, Sulfonylazide, Sulfonylhalogenide, Sulfoxide, Thioamide, Thiocarbamate, Thiocyanate, Triazene, Harnstoffe oder Isoharnstoffe.

Am meisten bevorzugt sind reaktive Kopfgruppen, die prinzipiell eine nahezu quantitative (> 99%) Umsetzung der Gruppe Y mit dem Liganden ermöglicht. Als Beispiel sei die Addition von Thiolen an eine Maleimidylgruppe genannt. Weitere Beispiele sind in WO 01/92883 A2 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Weiterhin kann die organische Schicht polymere Moleküle wie Biomoleküle oder synthetische Makromoleküle umfassen. Beispielhaft seien Hydrogele, wie sie in WO 90/5303 A1 offenbart sind, genannt. Diese bilden ein dreidimensionales Gerüst, das eine Immobilisierung der Liganden gegebenenfalls auch in drei Dimensionen erlaubt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Qualitätskontrolle auch hierbei einsetzbar. Die Verwendung der Begriffe Schicht, Oberfläche oder Oberflächenkonzentration u.a. sind nicht dahin gehend einschränkend zu interpretieren, dass eine Zweidimensionalität der Präsentation der zur Anbindung der Liganden vorhandenen Stellen der Bindematrix eines Mikroarrays Voraussetzung wären.

In einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich die Bindematrix über die gesamte sensorfeldseitige Mikroarrayoberfläche. In diesem Fall muß jedoch gewährleistet sein, dass beim Nachweis des Kontrollliganden die einzelnen Sensorfeider unterscheidbar sind.

Bevorzugt können als Liganden bei der Immobilisierung Proteine, Peptide, Oligonucleotide, Kohlenhydrate (Glycoside), Isoprenoide, Enzyme, Lipidstrukturen und organische Moleküle eingesetzt werden. Insbesondere sind kleine organische Moleküle (small molecules oder smali molecular weight molecules oder small organic molecule) bevorzugt (Chemische Mikroarrays). In der Literatur stellt zumeist das Molekulargewicht die Definitionsgrundlage für solche kleinen Moleküle dar. In WO 89/03041 und WO 89/03042 werden Moleküle mit Molekülmassen von bis 7000 g/mol als kleine Moleküle beschrieben. Üblicherweise werden jedoch Molekülmassen zwischen 50 und 3000 g/mol, häufiger aber zwischen 75 und 2000 g/mol und meistens im Bereich zwischen 100-1000 g/mol angegeben. Als Beispiele sei auf die Schriften WO 86/02736, WO 97/31269, US-A-5928868, US-A-5242902, US-A-5468651 , US-A- 5547853, US-A-5616562, US-A-5641690, US-A-4956303 und US-A-5928643 verwiesen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelten Liganden mit einem Molekulargewicht unter 3000, bevorzugt unter 1000 am meisten bevorzugt unter 750 g/mol als kleine organische Moleküle.

Bevorzugt werden Liganden als Duplikate auf einem Mikroarray immobilisiert. Vorteilhaft werden dabei insgesamt bis zu 96, bevorzugt bis zu 1536, am meisten bevorzugt bis zu 4608 verschiedene Liganden auf den Sensorfeldern immobilisiert, wobei pro Sensorfeld bevorzugt ein Ligand immobilisiert ist. Die Anzahl der Sensorfelder muß jedoch nicht in Zusammenhang mit der Anzahl an unterschiedlich immobilisierten Liganden stehen. So müssen beispielsweise nicht alle Sensorfelder belegt sein, oder es können mehrere Liganden auf einem Sensorfeld immobilisiert sein. Die Formulierung Ligand pro Sensorfeld ist hierin dahingehend zu verstehen, dass eine Ligandensorte auf einem Sensorfeld immobilisiert ist, nicht etwa ein einzelnes ügandenmolekül.

Ebenso ist es vorteilhaft, ganze Array-Duplikate anzufertigen. Duplikat meint im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht zwangsläufig das Anfertigen von genau zwei sondern vielmehr das Anfertigen von mindestens einer Kopie.

Zur Immobilisierung der Liganden und Kontrollliganden an der Bindematrix können vorhandene chemische funktionelle Gruppen im Liganden eingesetzt werden (z.B. N- terminale Aminogruppen von Peptiden). Es können auch vorhandene funktionelle Gruppen chemisch modifiziert werden (z.B. Spaltung von Disulfidbrücken zu Thiolen in Proteinen). Bevorzugt ist bei der Herstellung chemischer Mikroarrays die Verwendung von zusätzlichen Linkermolekülen (Zusatzmoleküle oder Tag), die zum einen die Anbindung an den Liganden und zum anderen die Immobilisierung an die Bindematrix ermöglichen und dabei eine zusätzliche Spacerfunktion erfüllen. Bevorzugt wird für alle Liganden das gleiche Linkermolekül verwendet, wodurch die Liganden chemisch "ähnlicher werden" und ein größerer Immobilisierungserfolg nach Optimierung erreicht werden kann. Einsetzbare Linkermoleküle ("Ligand Tag") sind in PCT/EP 02/01184 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich bezug genommen wird.

Als Kontrollliganden für die erfindungsgemäße Qualitätskontrolle können prinzipiell Liganden dienen, die eine Eigenschaft besitzen, die es ermöglicht diese bei deren Nachweis von allen anderen vorher immobilisierten Liganden zu unterscheiden. Bevorzugt sind Liganden, die mit einem an sich bekannten mobilen Interaktionspartner in Wechselwirkung treten können. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn das Paar aus Kontrollligand und mobilem Interaktionspartner eine hohe Sensitivität und Selektivität besitzt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter einer hohen Sensitivität zu verstehen, dass bei der zugrundeliegenden Detektion ein hohes Signal erzeugt werden kann und die Signaländerung in Proportionalität zur Kontroliligandenkonzentration steht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter Selektivität zu verstehen, dass der Interaktionspamtner lediglich mit dem Kontrollliganden eine hohes Signal erzeugt, und mit anderen Liganden nicht oder nur sehr schwach interagiert (wegen der notwendigen Unterscheidbarkeit zwischen einem Liganden und dem Kontrollliganden auf ein und demselben Sensorfeld). In diesem Zusammenhang ist eine hohe Dissoziationskonstante vorteilhaft, da ansonsten die notwendige Konzentration des mobilen Kontroll-Interaktionspartners (z.B. Kontrollprotein) zu hohem Hintergrundsignal führen kann. Natürlich muss sich der Kontrollligand von den auf dem untersuchten Sensorfeld vorliegenden Liganden unterscheiden.

Eine weiteres wichtiges Kriterium ist die Kinetik der Interaktion. Die Kontrollreaktion sollte möglichst schnell verlaufen.

Das in Kontakt bringen des Kontrollliganden mit der Bindematrix erfolgt unter Bedingungen, unter denen eine bevorzugt kovalente Anbindung des Kontrolliganden an die Bindematrix möglich ist, soweit letztere noch freie Bindungsstellen aufweist. Im allgemeinen wird dabei eine Flüssigkeit, die den Kontrollliganden enthält, auf die Bindematrix aufgebracht. Eventuell vorhandene nicht gebundene Kontrollliganden können gegebenenfalls durch Behandeln des Mikroarrays mit Waschlösung entfernt werden.

Der Kontrollligand kann als bzw. in Flüssigkeit durch Tüpfeln oder durch Inkubation der gesamten sensorfeldseitigen Mikroarrayfläche oder durch Inkubation des gesamten Mikroarrays auf die Sensorfelder gebracht werden. Die zu verwendende Menge bzw. Konzentration an Kontrollligand sollte so gewählt werden, dass sich selbst bei nicht vorhandenen Liganden ein Überschuß an Kontrollligand gegenüber den freien (allen freien) Steilen der Bindematrix ergibt. Dies gilt besonders, wenn die Sensorfeldzwischenbereiche ebenfalls mit der Bindematrix belegt sind. Als Richtwert sollte ein 100facher stöchiometrischer Überschuss zu den theoretisch freien Bindestellen gewährleistet sein.

Bei der Verwendung von mobilen Interaktionspartnern zum Nachweis von Kontrollliganden sind prinzipiell alle hochaffinen Interaktionspartner (wobei ein Partner Kontrollligand fungiert) denkbar, bei der der mobile Interaktionspartner ein ausreichend geringes Hintergrundrauschen verursacht. Bei einer massensensitiven Detektionsmethode - wie der SPR - ist es ebenfalls vorteilhaft, wenn der mobile Interaktionsparter ein hohes Molekulargewicht aufweist. Bevorzugte Paare aus Kontrollligand und Interaktionspartner sind Ligand/Protein Systeme wie Phosphotyrosin/antiPhophotyrosin, Biotin/Streptavidin, Biotin/Avidin, RNA/RNA, RNA/DNA und DNA/DNA.

Bevorzugt wird der mobile Interaktionspartner ganzflächig auf die sensorfeldseitigen Fläche des Mikroarrays in geeigneter Lösung (z.B. Pufferlösung) aufgebracht. Die Konzentration des mobilen Interaktionspartners sollte so gewählt werden, dass eine ausreichende Interaktion mit dem Kontrollliganden möglich ist. In den zur Erläuterung der Erfindung angefügten Beispielen war für Biotin/Avidin eine Konzentration des mobilen Interaktionspartners von 200nM (Avidin Tetramer) ausreichend.

Ein Beispiel, in dem die hohe und spezifische Affinität und Sensitivität des Systems Biotin/Streptavidin bzw. Biotin/Avidin benutzt wird, um die Verwendbarkeit von chemischen Mikroarrays in biologischen Assays zu demonstrieren, stellt Bioconjugate Chem. 2001, 12, 346-353 dar. Hierbei wurden konventionelle Glas-Objektträger verwendet, deren Oberfläche chemisch aktiviert und mit mehreren chemischen Raktionsschritten eine kovalent gebundene Bindeoberfläche aufgebaut wurde. Als reaktive Kopfgruppen zur kovalenten Anbindung des Liganden wurden die Amino- sowie die Carbonylgruppe, z.B. als Glyoxylat verwendet. Die Anbindung von Biotin neben anderen peptidischen Liganden wurde mit Hilfe der konventionellen Mikroarray Spotting Technik durchgeführt. Ein "chemisches Blocking" wurde nicht als notwendig erachtet; BSA-Blocking war für die Durchführung der Experimente ausreichend. Eine Kontrolle des Grades an Umsetzung der Kopfgruppe mit dem Liganden erfolgte nicht.

Die beispielhaft genannten Paare stellen bekannte hoch affine Systeme dar. Hierbei zeigte sich überraschenderweise, dass bei der Immobilisierung der Kontrollliganden an die Bindematrix eines mit Liganden vorbelegten Sensorfeldes eine Diskriminierung, was die Quantität an gebundenem Kontrolliganden betrifft, erzielt werden konnte. Erstaunlich ist an dieser Stelle, dass die verbliebenen freien Kopfgruppen zuvor keine anderweitigen Reaktionen eingegangen sind und dass unterschiedliche Immobilisierungserfolge relativ zueinander sowie absolut sehr empfindlich nachgewiesen werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Kontrollligand ebenfalls ein Linkermolekül (Tag). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können für einen Mikroarray verschiedene Kontrollliganden verwendet werden, bevorzugt wird jedoch die Verwendung eines einzigen Typs des Kontrolliganden.

Die Bindung zwischen Kontrollligand und mobilem Interaktionspartner kann durch in der Literatur bekannte Verfahren wieder aufgehoben werden. Dadurch kann der Mikroarray regeneriert werden und beispielsweise für die Interaktionsanalyse mit einem interessierenden Protein verwendet werden. Je nach Verwendungszweck des Mikroarrays kann dieser auch mit gebundenem Interaktionspartner eingesetzt werden. Bevorzugt werden jedoch von einem Mikroarray eine oder mehrere Kopien erzeugt, von denen eine der erfindungsgemäßen Qualitätskotrolle unterzogen wird.

Für den Nachweis des Kontrollliganden können alle geeigneten Detektionsverfahren eingesetzt werden. Auch einfachste visuelle Verfahren sind einsetzbar, insbesondere wenn lediglich qualitative Aussagen bezüglich der Qualität (z.B. brauchbar, nicht brauchbar) erforderlich sind. Für den Fall, dass ein Interaktionspartner als Mittel zum Nachweis des Kontrollliganden herangezogen wird, stellt die Detektion der Bindung zwischen Kontrollligand und mobilem Interaktionspartner ein geeignetes Wechselwirkungsphänomen dar. Die Detektion kann dabei sequentiell von Sensorfeld zu Sensorfeld bzw. Sensorfeldreihe zu Sensorfeldreihe erfolgen oder aber bevorzugt parallel, indem alle Felder gleichzeitig detektiert werden. Vorteilhaft beruht das Detektionsverfahren auf einem radioaktiven, optischen oder elektrischen Verfahren. So sind beispielsweise radioaktiv- fluoreszenz- oder lumineszenzbasierte Detektion (z.B. RIA, ELISA, etc.) möglich. Bevorzugt erfolgt die Detektion jedoch markierungsfrei, da hierdurch die Durchführung erleichtert wird. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines reflexionsoptischen Verfahrens wie der SPR-Spektroskopie.

Die bei der Detektion erhaltenen Meßwerte können dann wie bereits beschrieben zu Aussagen der Qualität des Immobilisierungserfolges herangezogen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt verwendet für Mikroarrays, die im Screening oder der Festphasensynthese eingesetzt werden.

Beispiele

I Herstellung eines chemischen Mikroarrays

Beispiel 1 Synthese eines Verdünners ("Verdünnermolekül")

a) Immobilisierung von N-(N⁵-Fmoc-5-aminopentyl)-11-mercaptoundecanamid an Chlortrityl-Harz

600 mg (1 ,15 mmol) N-(N⁵-Fmoc-aminopentyl)-11-mercaptoundecanamid, erhältlich aus S-geschütztem 11-Mercaptoundecanamid und Fmoc-1 ,5- diaminopentanhydrochlorid, wurden in 15 ml DMF gelöst und mit 2 g Methoxytrityl- chlorid-Harz (1 ,6 mmol) (Novabiochem) versetzt. Die Suspension wurde 1 h vorsichtig geschüttelt. Anschließend wurden 500 μ\ Pyridin zugegeben und die Suspension weitere 3 h geschüttelt. Das Harz wurde anschließend 1 x mal mit N,N- Dimethylformamid (DMF), 1 x mit 5% Wasser in DMF, 4 x mit DMF, 3 x mit Dichlormethan und 2 x mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Beladung des Harzes mit N-(N⁵-Fmoc-5-aminopentyl)-11-mercaptoundecanamid wurde über Fmoc-Analytik (G.B. Fields, R.L. Noble, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 35, 161- 214) zu 0,35 mmol/g bestimmt (Ausbeute 60 % d.Th.).

b) Allgemeine Vorschrift für die Kupplung von Fmoc-8-Amino-3,6-dioxa-octansäure (Fmoc-Ado)

Für die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde 1 g des beladenen Harzes (0,35 mmol) 20 min in 15 ml 1/3 (v/v) Piperidin/DMF vorsichtig gerührt und anschließend 6 mal mit DMF gewaschen. Die Kupplung von Fmoc-8-amino-3,6-dioxa-octansäure erfolgte durch 4 h Inkubation des Harzes mit einer Lösung von 270 mg (0,70 mmol) Fmoc-8-amino-3,6-dioxa-octansäure, 270 mg (0,71 mmol) O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)- N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU) und 250 μ\ (1 ,44 mmol) Ethyl-diisopropylamin (DIEA) in 7 ml DMF. Anschließend wurde das Harz 5 mal mit DMF, 3 mal mit Dichlormethan und 2 mal mit Hexan gewaschen und getrocknet.

c) Weitere Kupplung von Fmoc-Ado und Acetylierung

An 500 mg Harz aus b) (0,175 mmol) wurde wie unter b) beschrieben Fmoc-8-amino- 3,6-dioxa-octansäure nochmals gekuppelt und anschließend die Fmoc-Schutzgruppe wie unter b) beschrieben abgespalten. Anschließend wurden die freien Aminogruppen durch 30 min Inkubation des Harzes mit 10 ml 1/1/2 (v/v/v) Essigsäureanhydrid/Pyridin/DMF acetyliert. Dann wurde das Harz 5 mal mit DMF und 3 mal mit Dichlormethan gewaschen. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgte mit 2/18/1 (v/v/v) Trifluoressigsäure / Dichlormethan / Triethylsilan. Das Produkt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt und mittels LC/MS analysiert. LC-MS (ber.): [M+H]⁺ 635,5 (635,4), [M+Na]⁺ 657,5 (657,4)

Beispiel 2 Synthese eines Ankers ("Ankermolekül")

An 100 mg Harz des in Beispiel 1b) dargestellten Harzes wurde wie unter 1b) beschrieben zweimal Fmoc-8-amino-3,6-dioxa-octansäure gekuppelt und anschließend die Fmoc-Schutzgruppe abgespalten. Anschließend wurde 3-Maleinimidopropansäure durch 1 h Inkubation des Harzes mit 4 eq. 3-Maleinimidopropansäure und 4 eq. Diisopropylcarbodiimid in DMF (c = 0,15 M) gekuppelt.

Dann wurde das Harz 5 mal mit DMF und 3 mal mit Dichlormethan gewaschen. Die

Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgte mit 2/18/1 (v/v/v) Trifluoressigsäure /

Dichlormethan /Triethylsilan. Das Produkt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt und mittels LC/MS analysiert.

LC-MS (ber.): [M+H]⁺ 889,2 (889,5) [M+Na]⁺ 911 ,1 (911,5)

Beispiel 3 Herstellung eines Mikroarrays (Goldchip) mit Bindematrix a) Mikroarray

Als Mikroarray diente eine Sensorplatte (40 nm Gold, 2 nm Titan als Haftvermittlung, 50 μm strukturierende Schicht auf einer planaren Glasplatte mit den Außenmaßen im Mikrotiterformat (ca.12,5x8,3 cm) wie sie als Teil einer SPR Sensoranordnung in WO 01/63256 A1 beschrieben ist. Die Strukturierung der Sensorplatte wurde mit Ormocer^® durchgeführt, dem Graphit beigemischt wurde, so dass sich 4608 annähernd kreisrunde Sensorfelder mit einem Sensorfelddurchmesser von ca. 700 μm ergaben.

b) Beschichtung mit der Bindematrix

Die Bindematrix setzt sich aus dem Anker aus Beispiel 2 und dem Verdünner aus Beispiel 1 zusammen.

Zunächst werden Stammlösungen der Einzelkomponenten durch Auflösen der Feststoffe in Ethylenglycol / 0,1 % TFA mit der gewünschten Molarität hergestellt, die im Ellman-Test (G.L Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959), 70-77) oder über den Extinktionskoeffizienten bei 295 nm überprüft wird, hergestellt. Anschließend werden die Stammlösungen von Anker und Verdünner im gewünschten Verhältnis (z.B. 1/24, v/v) gemischt und die Goldoberfläche ganzflächig mit dieser 1 OOμM bis 1 mM Lösung 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit Methanol / 0,1 % TFA sowie mehrfach mit Wasser / Essigsäure (2ppm) gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.

Beispiel 4 Immobilisierung der Liganden

Als Liganden dienen sogenannte kleine organische Moleküle, die eine Molmasse unter 750 g/mol aufweisen und alle eine Carboxylgruppe besitzen. Vor der Immobilisierung werden die Liganden mit einem "Tag" umgesetzt, um eine Thiolgruppe einzuführen, die dann in einer Additionsreaktion mit der Maleimideinheit der Kopfgruppe des Ankers abreagieren kann. Die Anbindung des Tags an die Carboxylfunktion des Liganden erfolgt über eine Amidbindung. Das daraus resultierende Ligand-Tag-Konjugat besitzt die Formel HS-(CH₂)₂-NH-C(O)-CH₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O- (CH₂)₂-NH-CO-Ligand. a) Synthese des Ligand-Tag-Konjugates

Das Ligand-Tag-Konjugat kann synthetisiert werden durch Ankopplung der Thiolfunktion des Tags mit Tentagel-trityl- Harz. Anschließend wird dieses mit einer Lösung des gegebenenfalls geschützten Liganden, O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)- N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluoro-phosphat (HATU) und Ethyl-diisopropylamin (DIEA) in DMF 2h reagieren lassen und schließlich mit DMF gewaschen. Etwa vorhandene Schutzgruppen werden abgespalten und anschließend erfolgt die Abspaltung des Produktes vom Harz mit 48/48/4 (v/v/v) Trifluoressigsäure / Dichlormethan / Triethylsilan, welches im Anschluß durch RP-HPLC gereinigt und mittels LC/MS analysiert wird.

b) Belegung der Sensorfelder mit dem Ligand-Tag-Konjugat

Zur Belegung der Sensorfelder des Mikroarrays mit dem Ligand-Tag-Konjugat wird dieses in einem Gemisch aus Ethylenglycol/Wasser/Acetonitril in gewünschter Konzentration gelöst und mittels Phosphatpuffer auf pH 7 eingestellt. Aus dieser Lösung werden Flüssigkeitstropfen mit Hilfe eines Tüpfelroboters unter Verwendung von Stahlpins auf die Sensorfelder transferiert. Anschließend wird der gesamte Array mit Methanol gewaschen und getrocknet.

II Immobilisierung von Biotin als Kontrollliganden und Detektion der

Interaktion mit Avidin

Beispiel 5 Immobilisierung von Biotin

Die Synthese eines Biotin-Tag-Konjugates erfolgte gemäß Beispiel 4a). Zur Kupplung des Biotin-Tag-Konjugates an die verbleibenden freien Maleimidgruppen wurde der gesamte Mikroarray, nachdem bereits vorher Sensorfelder mit Liganden gemäß Beispiel 4b) belegt wurden, ganzflächig mit einer 100 μM Lösung des Biotin-Tag- Konjugates in 0,2 M Pi, 5 mM EDTA und 10% (v/v) Ethylenglycol pH 7,0 für 30 min inkubiert. Anschliessend wird die Oberfläche 3 x mit 49,95/49,95/0,1 (v/v/v) Methanol / Wasser / TFA, Methanol / 0,1 % TFA sowie mehrfach mit Wasser / Essigsäure (2ppm) gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Beispiel 6 Detektion der Interaktion mit Avidin

Die Interaktion zwischen immobilisiertem Biotin und Avidin wurde mit Hilfe einer SPR Sensoranordnung, wie sie in WO 01/63256 A1 beschrieben ist (vgl. Beispiel 3a), durchgeführt. Durch Imaging des Mikroarrays können die Intensitäten aller Sensorfelder gleichzeitig erfaßt und ausgewertet werden. Die dabei ermittelten SPR- Verschiebungen (SPR shift) ergeben sich durch Subtraktion der ermittelten Minima aus den wellenlängenabhängigen Intensitätskurven vor und nach Inkontaktbringen der mit Biotin belegten Sensorfelder mit Avidin. Bei vorgegebenem Kontroll-Interaktionspaar stellt der Wert der Verschiebung ein Maß für die Oberflächenkonzentration an Biotin dar.

Das in Kontakt bringen erfolgt in dem der Mikroarray ganzflächig für 3h mit einer 800nM Avidin-Lösung (Konzentration bezogen auf Monomer MW 16kD) in 50mM Hepes pH 7.0 inkubiert wird.

III Nachweis unvollständiger Ligandenbelegung durch Kontrolle Biotin/Avidin

Beispiel 7 Immobilisierung zweier Liganden auf Sensorfeldern

Die Liganden A und B wurden als Ligand-Tag-Konjugat (siehe Abb. 1) gemäß Beispiel 4 hergestellt und immobilisiert. Anschließend wurde der Kontrollligand immobilisiert und das Maß an Wechselwirkung mit Avidin gemäß der Beispiele 5 und 6 detektiert.

Hierbei wurde die Konzentration der Liganden in der Tüpfellösung variiert, um die Minimalkonzentration zu ermitteln, die eine vollständige Belegung der Sensorfelder mit den Liganden gewährleistet. Unterhalb dieser Konzentration reicht die Konzentration an Ligand-Tag-Konjugat nicht aus, so dass die noch verbliebenen reaktiven Gruppen der Bindematrix mit Biotin belegt und dessen Vorhandensein nachgewiesen werden kann.

Abb. 2 zeigt, dass mit sinkender Ligandenkonzentration die SPR-Verschiebung zunimmt und dass ab einer Konzentration von etwa 25 μM für diese Sensorfelder von einer vollständigen Belegung mit Liganden ausgegangen werden kann. Die verbleibende SPR-Verschiebung bei höheren Konzentrationen beruhen auf dem üblichen Hintergrundrauschen, was Blindmessungen (ohne Biotin) mit Avidin ergeben haben.

IV Qualitätskontrolle einer Bibliothek kleiner organischer Moleküle

Beispiel 8

Ca. 10.000 Liganden aus einer Bibliothek kleiner organischer Moleküle wurden entsprechend der Beispiele 1 bis 6 dem erfindungsgemäßen Kontrollverfahren unterworfen. Abb. 3 zeigt das Histogramm sowie die Häufigkeitsdichteverteilung der SPR-Verschiebungen der Bibliothek.

Die Auswertung der Qualitätskontrolldaten kann derart erfolgen, dass ein Wert für die SPR-Verschiebung festgelegt wird, der noch als akzeptabel in Bezug auf den Immobilisierungserfolg gewertet werden kann. So zeigen z.B. mehr als 96% der Sensorfelder eine Verschiebung von max. 4 nm. Da aufgrund der sensorfeldaufgelösten Detektion die Liganden bekannt sind, die diesen Wert überschreiten, können für diese Liganden getrennte Untersuchungen je nach Anwendungszweck des Mikroarrays vorgenommen werden.

Alternativ kann festgestellt werden, wie groß die SPR-Verschiebung von 90% der Bibliothek ergibt. Im vorliegenden Fall zeigen diese eine Verschiebung von max. 2.36 nm. Anhand dieses Wertes kann entschieden werden, ob dieser Wert ausreichend gering ist und man somit toleriert, dass (nur) 10% der Liganden dieses Kriterium nicht erfüllen.

Für den Fachmann ergeben sich offensichtlich eine Reihe weiterer Möglichkeiten, anhand deren die gewonnenen Einzeldaten zu Qualitätskontrollzwecken verarbeitet werden können. V Ermittlung einer Kalibrierungskurve

Beispiel 9 Herstellung von Sensorfeldern mit unterschiedlicher Biotin- Oberflächenkonzentration.

Zunächst wurden die Sensorfelder des Mikroarrays mit unterschiedlichen Bindematrizen belegt, in dem das Anker/Verdünner-Verhältnis variiert wurde. Anschließend wurde Biotin wie ein gewöhnlicher Ligand mit Tag versehen und immobilisiert. So betrug die Oberflächenkonzentration an Biotin auf einer 1:25- Oberfläche 4%« auf einer 1 :100-Oberfläche 1%, usw. Anschließend wurde die Wechselwirkung mit Avidin wie im Kdntrollverfahren detektiert.

Beispiel 10 Kalibrierkurve

Abb. 4 zeigt den funktionalen Zusammenhang zwischen Oberflächenkonzentration von Biotin und SPR-Verschiebung.

Im Bereich bis zu 1 % Biotin ist eine stark ansteigender SPR-Verschiebung bis 9 nm zu detektieren, welcher sich im Bereich 2-4% nur noch geringfügig von 11 nm bis auf 12 nm erhöht. Im Konzentrationsbereich von 0 bis 1 % kann somit die Menge an bei vorbelegten Liganden nicht abreagierenden reaktiven Kopfgruppen der Ankermoleküle auf einem Sensorfeld mit grosser Genauigkeit bestimmt werden.

Anhand der Kalibrierkurve kann die SPR-Verschiebung in den prozentualen Anteil an gebundenem Liganden ermittelt werden. So entspricht der 4 nm Wert aus Beispiel 8 einer Biotinkonzentration von ungefähr 0.4% bezogen auf die Gesamtanzahl der Moleküle, wie der Vergleich mit der Kalibrierungskurve zeigt.

Claims

Ansprüche:

1. Verfahren zur Qualitätskontrolle von Sensorfeldern auf Mikroarrays die Schritte umfassend

(c) gegebenenfalls Entfernen nicht gebundener Kontrollliganden;

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (d) folgenden Schritt umfaßt:

(d¹) Sensorfeldaufgelöster Nachweis der Interaktion zwischen Kontrollligand und einem für den Kontrollliganden an sich bekannten Interaktionspartner.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (d) ein weiterer Schritt folgt:

(e) Ermittlung eines Meßwertes als Maß für die Sensorfeldkonzentration des Kontrollliganden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (e) ein weiterer Schritt folgt:

(f) Vergleich der einzelnen Sensorfelder anhand ihrer in (e) ermittelten Werte.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindematrix eine organische Schicht beinhaltet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Schicht eine selbstassemblierende Monolage (SAM) ausbilden kann.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der SAM Ankermoleküle umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der SAM weiterhin Verdünnermoleküle umfaßt.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindematrix sich über die gesamte sensorfeldseitige Mikroarrayoberfläche erstreckt.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroarray auf seiner den Sensorflächen zugewandten Oberfläche strukturiert ist.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroarray eine strukturierende Schicht auf einem planaren Träger umfaßt.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroarray eine Metallschicht auf der strukturierenden Schicht und/oder dem Träger enthält, auf der sich nach außen hin die Bindematrix befindet.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallschicht Gold enthält.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroarray mindestens 96, bevorzugt mindestens 4608, am meisten bevorzugt mindestens 9216 Sensorfelder enthält.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass bis zu 96, bevorzugt bis zu 1536, am meisten bevorzugt bis zu 4608 verschiedene Liganden auf den Sensorfeldern immobilisiert sind.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei Liganden um kleine organische Moleküle handelt.

17. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden alle ein gleiches Linkermolekül (Tag) besitzen.

18. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Paar aus Kontrollligand und Interaktionspartner eine hohe Sensitivität und Selektivität hat.

19. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Paar aus Kontrollligand und Interaktionspartner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phophotyrosin/antiPhophotyrosin, Biotin/Streptavidin und Biotin/Avidin.

20. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontrolligand ebenfalls ein Linkermolekül (Tag) gemäß Anspruch 16 trägt.

21. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis (Detektion) auf mehreren oder allen Sensorfeldern parallel verläuft.

22. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsverfahren auf einem radioaktiven, optischen oder elektrischen Verfahren beruht.

23. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das die Detektion markierungsfrei erfolgt.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass ein reflexionsoptisches Verfahren verwendet wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zur Detektion die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) verwendet wird.

6. Verwendung eines Verfahrens zu Qualitätskontrolle von Sensorfeldern auf Mikroarrays nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 25, wobei der Mikroarray zu Screening- oder Festphasenynthesezwecken eingesetzt wird.