DE102006045391A1

DE102006045391A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Nukleinsäure-Isolierung

Info

Publication number: DE102006045391A1
Application number: DE102006045391A
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Hitachinaka Yamashita; Toshinari Hitachinaka Sakurai
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2005-11-04
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2026-09-27
Also published as: JP2007124952A; CN101153282A; US8048681B2; JP4699868B2; US20070106071A1; DE102006045391B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technik zur wirksamen Isolierung von langen Nucleinsäuren und kurzen Nucleinsäuren aus einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und kurzen Nucleinsäuren durch sichere und zweckmäßige Maßnahmen. Speziell werden lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren aus einer Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren isoliert, indem man die die Nucleinsäuren enthaltende Probe mit einem chaotropen Mittel vermischt, das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch eine erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid, das Durchgangsporen mit vorgegebenen Porengrößen aufweist, laufen lässt, das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch eine zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid, das Durchgangsporen mit Porengrößen, die kleiner als die Porengrößen der ersten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid sind, laufen lässt und separat Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, und solche, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, gewinnt.

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technik zur wirksamen Isolierung von langen Nucleinsäuren und kurzen Nucleinsäuren aus einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und kurzen Nucleinsäuren durch sichere und zweckmäßige Maßnahmen. Ferner kann die vorliegende Erfindung als eine Technik zur Isolierung von genomischer DNA und gesamter RNA (z. B. Messenger-RNA, ribosomaler RNA und Transfer-RNA) oder von genomischer DNA und Plasmid-DNA verwendet werden.

Technischer Hintergrund

Nucleinsäuren stehen im Zusammenhang mit genetischen Informationen in Organismen und liegen in verschiedenen Formen vor, z. B. als genomische DNA, Plasmid-DNA, Messenger-RNA, ribosomale RNA und Transfer-RNA, die sich funktionell voneinander unterscheiden.

Auf der Grundlage der Analyse dieser Nucleinsäuren lassen sich sehr wichtige molekularbiologische Informationen erhalten. Bei der Analyse verschiedener Typen von Nucleinsäuren ist es im allgemeinen bevorzugt, eine Vorbehandlung durchzuführen, die die Isolierung von Nucleinsäuren von Interesse aus einer biologischen Probe, die verschiedene Typen von Nucleinsäuren enthält, umfasst. Beispielsweise wird bei der Messenger-RNA-Analyse zum Zweck der Genexpressionsanalyse die gesamte RNA von genomischer DNA, die als Inhibitor während der Messenger-RNA-Analyse wirken kann, abgetrennt.

Im allgemeinen ist eine Phenol/Chloroform-Extraktion als ein Verfahren zur Abtrennung von gesamter RNA von genomischer RNA in einer biologischen Probe bekannt (Analytical Biochemistry, Bd. 162 (1989), S. 156-159). Dieses Verfahren umfasst folgendes: (1) Auflösen einer biologischen Probe in einer Lösung von Guanidinthiocyanat und Zusetzen einer sauren Pufferlösung, einer Phenollösung und einer Chloroformlösung in der angegebenen Reihenfolge, und anschließendes Mischen; (2) Trennen des Gemisches in eine wässrige Phase mit einem Gehalt an RNA, eine Zwischenphase und eine organische Lösungsmittelphase mit einem Gehalt an insolubilisierter DNA und denaturierten Proteinen durch Zentrifugation; (3) Zusetzen von Ethanol oder Isopropanol zur wässrigen Phase, die RNA enthält; und (4) selektives Ausfällen von unsolubilisierter RNA durch Zentrifugation. Im Vergleich zu herkömmlichen Ultrazentrifugationsverfahren ist dieses Verfahren in bezug auf die RNA-Isolierung wirksamer, jedoch müssen bei diesem Verfahren hochgradig gefährliches Phenol und Chloroform verwendet werden, was ein Problem darstellt.

Als Beispiele für ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäure, bei dem nicht die Verwendung von Phenol, Chloroform oder dergl. erforderlich ist und bei dem keine Maßnahmen, wie eine Ethanolfällung oder eine Isopropanolfällung erforderlich sind, sind Verfahren unter Ausnützen der Nucleinsäure-Bindungseigenschaften an einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid in Gegenwart eines chaotropen Mittels bekannt (B. Vogelstein und D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (2) (1979), S. 615-619; R. Boom et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 28 (3) (1990), S. 495-503). Ferner werden Verfahren zur DNA- und RNA-Isolierung, bei denen das letztgenannte Verfahren angewandt wird, beschrieben (JP-Patentveröffentlichungen (Kokai) Nr. 2004-340839 A, Nr. 2002-187897 A, Nr. 2000-505295 A, Nr. 2002-534080 A und Nr. 2004-201607 A). Jedoch führen derartige Verfahren zu einer unzureichenden DNA- und RNA-Trennung, so dass die isolierte RNA eine vorgegebene Menge an DNA enthält.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, in wirksamer Weise lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren aus einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und kurzen Nucleinsäuren durch sichere und zweckmäßige Maßnahmen zu isolieren.

Als Ergebnis eingehender Untersuchungen mit dem Ziel zur Lösung der vorstehenden Aufgabe haben die Erfinder festgestellt, dass dann, wenn ein Lösungsgemisch aus einem chaotropen Mittel und einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und kurzen Nucleinsäuren mindestens zweimal über eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid (Silica) gegeben wird, das Flüssigkeits-Durchgangsporen mit Porengrößen aufweist, die zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit langen Nucleinsäuren und einem geringen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führen, die langen Nucleinsäuren selektiv und in wirksamer Weise sich so an die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden lassen, dass sie von den kurzen Nucleinsäuren getrennt werden.

Speziell betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung, das folgende Stufen umfasst:
man vermischt ein chaotropes Mittel mit einer Probe, die lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren enthält;
man lässt das Lösungsmittelgemisch mindestens zweimal durch eine erste feste Phase, die Siliciumdioxid mit Durchgangsporen von vorgegebenen Porengrößen enthält, laufen;
man lässt das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch eine zweite feste Phase, die Siliciumdioxid mit Durchgangsporen mit Porengrößen, die kleiner als die der ersten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid sind, laufen; und
man gewinnt getrennt Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, und solche, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind.

Beim vorerwähnten Verfahren lässt man vorzugsweise das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch die erste und die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid in beiden Richtungen in bezug auf die festen Phasen mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen (z. B. in Aufwärts- und Abwärtsrichtung).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich bei Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid finden, um lange Nucleinsäuren, die aus mindestens 20 000 und vorzugsweise mindestens 50 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sind, und bei Nucleinsäuren, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, um kurze Nucleinsäuren, die aus höchstens 10 000 und vorzugsweise höchstens 5 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sind.

In einem derartigen Fall weisen die Durchgangsporen der ersten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Porengrößen von 20 bis 25 μm auf. Gleichzeitig wiesen die Durchgangsporen der zweiten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid vorzugsweise Porengrößen von 0,1 bis 10 μm auf.

Bei einer Ausführungsform handelt es sich bei Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um genomische DNA und bei Nucleinsäuren, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um RNA. Alternativ handelt es sich bei Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um genomische DNA und bei Nucleinsäuren, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um Plasmid-DNA. Somit können gesamte RNA, Plasmid-DNA oder genomische DNA in selektiver und wirksamer Weise auf einer biologischen Probe isoliert werden.

Ferner wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung bereitgestellt, die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung verwendet wird. Die Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung ist mit einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid und einer Durchgangsöffnung, durch die das Lösungsgemisch aus einer Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren und einem chaotropen Mittel angesaugt und abgegeben wird, ausgestattet. Das Lösungsgemisch wird durch Drucksteuerung von der Durchgangsöffnung angesaugt oder daraus abgegeben. Somit wird das Lösungsgemisch zwischen Räumen, die durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid getrennt sind, transportiert, so dass man das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen lässt.

Ferner wird erfindungsgemäß ein Kit zur Nucleinsäure-Isolierung bereitgestellt, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung und mindestens ein Element umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem chaotropen Mittel, einem organischen Lösungsmittel, einem Waschreagenz und einem Elutionsreagenz besteht.

Zu Beispielen für ein chaotropes Mittel, das verwendet werden kann, gehören Guanidinthiocyanat, Natriumthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Natriumiodid und Kaliumiodid. Zu Beispielen für ein organisches Lösungsmittel, das verwendet werden kann, gehören Ethanol und Diethylenglycoldimethylether.

Erfindungsgemäß können lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren in wirksamer Weise aus einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und kurzen Nucleinsäuren durch sichere und zweckmäßige Maßnahmen isoliert werden. Somit können beispielsweise genomische DNA und gesamte RNA (Messenger-RNA, ribosomale RNA oder Transfer-RNA) oder genomische DNA und Plasmid-DNA in wirksamer Weise getrennt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt in schematischer Weise eine Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung.
2 zeigt die Beziehungen zwischen der Anzahl der Passagen und der Nucleinsäure-Gewinnungsraten für Kombinationen aus Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung und Nucleinsäureproben.
3 zeigt die Ergebnisse einer Elektrophorese von Nucleinsäuren, die unter Verwendung einer Vorrichtung für die Isolierung von langen Nucleinsäuren und einer Vorrichtung für die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren isoliert worden sind.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung, wobei Nucleinsäuren in wirksamer Weise je nach ihrer Länge (lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren) isoliert werden. Erfindungsgemäß wird eine Probe mit einem Gehalt an zu isolierenden Nucleinsäuren mit einem chaotropen Mittel vermischt. Anschließend lässt man das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch eine erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid (Silica) laufen, das Durchgangsöffnungen mit Porengrößen aufweist, die einen hohen Kontaktwirkungsgrad mit langen Nucleinsäuren und einen geringen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren ergeben, so dass lange Nucleinsäuren selektiv und in wirksamer Weise an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden. Anschließend lässt man das Lösungsgemisch, das die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid durchlaufen hat, mindestens zweimal durch eine zweite feste Phase laufen, das Siliciumdioxid enthält, das Durchgangsporen mit Porengrößen aufweist, die zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führen, so dass kurze Nucleinsäuren an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden. Somit werden Nucleinsäuren, die an die erste und an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, separat unter Verwendung von Elutionsreagenzien gewonnen, so dass lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren in wirksamer Weise isoliert werden können.
Proben (insbesondere biologische Proben) mit einem Gehalt an Nucleinsäuren, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, enthalten zwei oder mehr Typen von Nucleinsäuren mit unterschiedlichen Längen (lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren). Zu Beispielen hierfür gehören Blut, biologisches Gewebe, gezüchtete Zellen und Bakterien. Ferner bedeutet der Ausdruck "Nucleinsäure" ein kettenförmiges Polymeres, das aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt ist, die über Phosphodiester-Bindungen aneinander gebunden sind, sowie einen Komplex, der derartige Polymere umfasst, die aneinander über Wasserstoffbrückenbindungen oder dergl. gebunden sind. Ferner können derartige Nucleinsäuren einzelsträngig oder doppelsträngig sein.
Erfindungsgemäß sind lange Nucleinsäuren, die man an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden lässt, vorzugsweise aus mindestens 20 000 und insbesondere aus mindestens 50 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt. Beispielsweise können genomische DNA, genomische RNA, Plasmid-DNA und Nucleinsäuren, die Fragmente davon darstellen, eingesetzt werden. Zu speziellen Beispielen für lange Nucleinsäuren, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, gehören genomische DNA mit Längen von vorzugsweise mindestens 10 kb und insbesondere mindestens 25 kb und genomische RNA mit Längen von vorzugsweise mindestens 20 kb und insbesondere mit mindestens 50 kb.
Ferner sind kurze Nucleinsäuren, die man an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden lässt, vorzugsweise aus höchstens 10 000 und insbesondere aus höchstens 5000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt. Beispielsweise können erfindungsgemäß Messenger-RNA, ribosomale RNA, Transfer-RNA, cDNA, Plasmid-DNA und durch PCR erhaltene amplifizierte DNA eingesetzt werden. Zu speziellen Beispielen für kurze Nucleinsäuren, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, gehören doppelsträngige cDNAs mit Längen von vorzugsweise höchstens 5 kb und insbesondere mit höchstens 2,5 kb und Messenger-RNAs mit Längen von vorzugsweise höchstens 10 kb und insbesondere von höchstens 5 kb.
Zu Beispielen für chaotrope Mittel, die einer Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren zugesetzt werden können, gehören Guanidinthiocyanat, Natriumthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Natriumiodid und Kaliumiodid. Die Konzentration des zugesetzten chaotropen Mittels beträgt vorzugsweise 1,0 bis 4,0 mol/Liter im Lösungsgemisch, das mit einem organischen Lösungsmittel versetzt worden ist (vergl. R. Boom et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 28 (3) (1990), S. 495-503.
Bei Verwendung einer biologischen Probe können neben einem chaotropen Mittel ferner ein oberflächenaktives Mittel, ein Protein-Denaturierungsmittel, eine Protease oder dergl. zugesetzt werden. Ferner ist es bevorzugt, dass das Lösungsgemisch einer physikalischen Behandlung unter Verwendung eines Rührers, eines Homogenisators oder dergl. unterworfen wird, was die Auflösung einer biologischen Probe und die Freisetzung von Nucleinsäuren fördert.
Vorzugsweise wird das Lösungsgemisch, das eine Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren und ein chaotropes Mittel enthält, mit einem organischen Lösungsmittel versetzt, um die Bindung von Nucleinsäuren an eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid zu fördern.
Zu Beispielen für ein organisches Lösungsmittel, das verwendet werden kann, gehören eine Kombination aus einer oder mehreren Verbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus aliphatischen Alkoholen, aliphatischen Ethern, aliphatischen Estern und aliphatischen Ketonen besteht.
Zu Beispielen für aliphatische Alkohole, die verwendet werden können, gehören Methanol, Ethanol, 2-Propanol, 2-Butanol und Polyethylenglycol. Zu Beispielen für aliphatische Ether, die verwendet werden können, gehören Diethylenglycoldimethylether, Diethylenglycoldiethylether, Ethylenglycoldimethylether, Ethylenglycoldiethylether, Propylenglycoldimethylether, Propylenglycoldiethylether und Tetrahydrofuran. Zu Beispielen für aliphatische Ester, die verwendet werden können, gehören Ethyllactat und Propylenglycolmonomethyletheracetat. Zu Beispielen für aliphatische Ketone, die verwendet werden können, gehören Aceton, Hydroxyaceton und Methylketon. Insbesondere werden Ethanol, Diethylenglycoldimethylether und dergl. bevorzugt.
Die erfindungsgemäß verwendete feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid umfasst eine Silica-Verbindung mit einem Gehalt an Siliciumdioxid. Zu Beispielen für eine derartige Silica-Verbindung gehören Glasteilchen (feine Teilchen), Silica-Teilchen (feine Teilchen), Glasfasern, Silicafasern, Diatomeenerde und Zerkleinerungsprodukte davon. Die silicahaltige feste Phase weist eine Mehrzahl von Durchgangsporen auf, durch die eine Lösung laufen kann. Sofern die feste, silicahaltige Phase auf die vorstehend beschriebene Weise gebildet worden ist, kann sie in Form einer Scheibe, von Fasern oder eines Aggregats von Teilchen vorliegen, wobei aber keine spezielle Beschränkung hierauf besteht.
Vorzugsweise weist die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid-Durchgangsporen mit Porengrößen von 20 bis 25 μm auf, was zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit langen Nucleinsäuren und einem geringen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führt. Der Grund hierfür ist, dass dann, wenn die Porengrößen unter diesem Bereich liegen, der Kontaktwirkungsgrad der festen Phasen mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mit kurzen Nucleinsäuren so zunimmt, dass kurze Säuren daran binden, während andererseits dann, wenn die Porengrößen über diesem Bereich liegen, der Kontaktwirkungsgrad der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mit langen Nucleinsäuren abnimmt, so dass die Menge an langen Nucleinsäuren, die daran binden, abnimmt.
Das Lösungsgemisch muss die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mindestens zweimal passieren. Der Grund hierfür ist, dass eine einzige Passage des Lösungsgemisches zu einem geringen Bindungswirkungsgrad der langen Nucleinsäuren an der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid führt, so dass keine ausreichende Menge an langen Nucleinsäuren gewonnen werden kann. Ferner steigt bei zunehmender Zahl der Flüssigkeitspassagen durch die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid die Menge an langen Nucleinsäuren, die daran binden; jedoch nimmt die Menge an kurzen Nucleinsäuren, die daran binden, nicht erheblich zu. Wenn man somit das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen lässt, wird es möglich, in selektiver Weise die Menge an langen Nucleinsäuren, die daran binden, zu erhöhen, so dass die Ausbeute an langen Nucleinsäuren verbessert wird.
Dagegen weist die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid vorzugsweise Durchgangsporen mit Porengrößen von 0,1 bis 10 μm auf, was zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führt. Um den Bindungswirkungsgrad der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mit kurzen Nucleinsäuren zu verbessern, ist es bevorzugt, die Anzahl der Passagen des Lösungsgemisches durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid zu erhöhen und die Größen der Durchgangsporen innerhalb eines Bereiches, der sich für die Größen der Nucleinsäuren eignet, zu verringern.
Die vorerwähnte erste und zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid werden an einem einzigen oder an verschiedenen Hohlelementen, wie Spitzen, Spritzen und Säulen, immobilisiert. Ein derartiges Element ist mit einer Durchgangsöffnung ausgestattet, durch die das Lösungsgemisch angesaugt und abgegeben wird, sowie mit einer Verbindungsöffnung, an die ein Drucksteuerelement oder dergl. zur Drucksteuerung des Hohlraums angeschlossen ist, und mit einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid, die sich im Hohlraum befindet. Das Element ist so konstruiert, dass der Hohlraum unter Verwendung eines Drucksteuerinstruments, das an die Verbindungsöffnung angeschlossen ist, einem Druckabbau oder einer Druckerhöhung unterzogen wird; das Lösungsgemisch durch die Durchgangsöffnung angesaugt oder abgegeben wird; und das Lösungsgemisch zwischen Räumen, die durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid voneinander getrennt sind, transportiert wird, so dass es mindestens zweimal die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert.
Beispielsweise laufen im Fall einer Spitze, an der eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid immobilisiert ist, folgende Vorgänge ab: Der Innenraum der Spitze wird unter Verwendung einer Spritze oder einer Pipette, die an die Verbindungsöffnung angeschlossen ist, einem Druckabbau unterworfen; das Lösungsgemisch wird angesaugt, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert; der Innenraum der Spitze wird unter Druck gesetzt; und das Lösungsgemisch wird abgegeben, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert. Diese Stufen werden wiederholt, so dass das Lösungsgemisch mindestens zweimal die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert. Ferner ist es vor Anschluss eines Drucksteuerinstruments möglich, eine Flüssigkeit über die Verbindungsöffnung zuzuführen. Somit ist es nach Zuführen einer Flüssigkeit möglich, ein Drucksteuerelement an die Spitze anzuschließen, um die Flüssigkeit über die Durchgangsöffnung abzugeben.
Ferner laufen im Fall einer Spritze, an der die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid immobilisiert worden ist, folgende Vorgänge ab: der Innenraum der Spritze wird unter Verwendung eines Kolbens, der vorher an einer Verbindungsöffnung vorgesehen worden ist, einem Druckabbau unterzogen; das Lösungsgemisch wird angesaugt, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert; der Innenraum der Spritze wird unter Druck gesetzt; und das Lösungsgemisch wird abgegeben, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert. Diese Stufen werden wiederholt, so dass das Lösungsgemisch mindestens zweimal die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert.
Ähnliche Stufen können im Fall einer Zentrifugiersäule, in der die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid immobilisiert worden ist, durchgeführt werden. Beispielsweise können unter Verwendung einer derartigen Zentrifugiersäule gemäß bekannten Zentrifugiersäulensystemen folgende Vorgänge ablaufen: man führt das Lösungsgemisch in die Zentrifugiersäule ein und lässt das Lösungsgemisch aufgrund von Zentrifugalkraft durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen. Ferner wird das Lösungsgemisch, das die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert hat, erneut in die Zentrifugiersäule eingeführt, so dass das Lösungsgemisch mindestens zweimal die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert.
Verunreinigungen in jeder festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid, an die Nucleinsäuren gebunden sind, werden entfernt, indem man ein Waschreagenz durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen lässt. Ein derartiges Waschreagenz muss die Aufrechterhaltung der Bindung zwischen Nucleinsäuren und der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gewährleisten und Verunreinigungen, die an der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, entfernen. Beispielsweise können eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an 80 % (Vol./Vol.) Ethanol und eine Pufferlösung mit einem Gehalt an 80 % (Vol./Vol.) Ethanol mit einer geringen Salzkonzentration verwendet werden.
Anschließend lässt man nach dem Waschen ein Elutionsreagenz durch jede feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen, so dass Nucleinsäuren, die an der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, eluiert werden. Ein derartiges Elutionsreagenz muss zur Elution von Nucleinsäuren in der Lage sein, die von der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid eluiert werden sollen. Beispielsweise können nucleasefreies Wasser und eine nucleasefreie Pufferlösung mit einer geringen Salzkonzentration verwendet werden.
Erfindungsgemäß werden die vorerwähnten Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung und Kits zur Nucleinsäure-Isolierung, die diese Vorrichtungen enthalten, bereitgestellt. Derartige Kits können Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung und mindestens ein Element aus der Gruppe, das aus einem chaotropen Mittel, einem organischen Lösungsmittel, einem Waschreagenz und einem Elutionsreagenz gemäß den vorstehenden Ausführungen besteht, enthalten. Ferner können die vorerwähnten Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung (Verwendung von Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung), die Handhabung der Reagenzien und dergl. auf der Packung oder in der Packungsbeilage des Kits je nach Bedarf beschrieben werden.
Beispiele
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, obgleich der technische Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht hierauf beschränkt ist.
[A] Proben, Reagenzien und Vorrichtungen

1. Proben
1.1. Lange Nucleinsäure Genomische DNA (ein isoliertes Produkt aus humanem Blut unter Verwendung eines QIAamp DNA Blood Mini Kits)
1.2 Kurze Nucleinsäure pBR322DNA (Länge: 4361 bp) (MBI Fermentas)
1.3 Biologische Probe humanes Blut (unter Zugabe des Antikoagulationsmittels EDTA-2Na)
2. Reagenzien
2.1. Reagenz zur Lysis von roten Blutkörperchen 155 mM NH₄Cl 10 mM KHCO₃ 0,1 mM EDTA-2Na
2.2 Chaotropes Reagenz A 6 M Guanidinhydrochlorid 50 mM MES
2.3 Chaotropes Reagenz B 4 M Guanidinthiocyanat 25 mM Natriumcitrat (pH 7,5) 1 % β-Mercaptoethanol
2.4 Organisches Lösungsmittel A Ethanol
2.5 Organisches Lösungsmittel B 40 %-ige (Vol./Vol.) wässrige Lösung von Diethylenglycoldimethylether
2.6 Waschreagenz 80 %-ige (Vol./Vol.) wässrige Ethanollösung
2.7 Elutionsreagenz A TE (pH-Wert 8,0) (Wako Pure Chemical)
2.8 Elutionsreagenz B H₂O (nucleasefrei) (Wako Pure Chemical)
3. Vorrichtungen für die Isolierung von langen Nucleinsäuren
3.1 Feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Ein Glasfaserfilter (Standard 14) (Porengröße: etwa 23 μm) (Whatman)
3.2 Element zum Halten einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Sinterplatte aus Polypropylen-Teilchen (Porengröße- etwa 100 μm) (Dicke: 1, 5 mm)
3.3 Vorrichtung für die RNA-Isolierung

1 zeigt ein Beispiel für den Aufbau einer Vorrichtung für die Isolierung von langen Nucleinsäuren. Die Vorrichtung 10 zur Nucleinsäure-Isolierung hat das Aussehen einer Pipettenspitze. Die Vorrichtung ist mit einer Durchgangsöffnung 12, durch die ein Lösungsgemisch angesaugt und abgegeben wird, und einer Verbindungsöffnung 11, an die ein Drucksteuerelement, das den Innenraum der Spitze einem Druckabbau oder Druckaufbau unterzieht, angeschlossen ist, versehen. Ferner nimmt die Vorrichtung eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid 13 in ihrem Innenraum auf. Auf jeder Seite der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid ist ein scheibenförmiges Element 14 zum Halten einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid angeschlossen. Diese Elemente, die eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid halten, weisen eine Anzahl von Poren auf, durch die Flüssigkeit und Gas passieren. Wenn sich in dieser Vorrichtung ein Spitzenbereich der Durchgangsöffnung in Kontakt mit Flüssigkeit befindet, wird ein Hohlraum unter Verwendung einer Drucksteuervorrichtung, die an die Verbindungsöffnung angeschlossen ist, einem Druckabbau oder Druckaufbau unterzogen, so dass Flüssigkeit durch die Durchgangsöffnung angesaugt oder abgegeben werden kann, so dass diese die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert. Ferner ist es möglich, vor dem Anschließen einer derartigen Drucksteuervorrichtung Flüssigkeit durch die Verbindungsöffnung zuzuführen. In einem solchen Fall wird eine Drucksteuervorrichtung nach der Zufuhr der Flüssigkeit angeschlossen, so dass die Flüssigkeit durch die Durchgangsöffnung abgegeben werden kann. In den Beispielen wurde eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid, die zu einer scheibenförmigen Gestalt mit einem Durchmesser von 4,2 mm zugeschnitten worden war, verwendet und sandwichartig zwischen zwei Elementen zum Halten einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mit einem Durchmesser von 4,1 mm angeordnet, so dass ein Presssitz in einem Hohlraum mit einem Innendurchmesser von 4 mm erreicht wurde.

4. Vorrichtung für die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren
4.1 Feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Glasfaserfilter (GF/D) (Porengröße: etwa 2,7 μm) (Whatman)
4.2 Element zum Halten einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Sinterplatte aus Polypropylen-Teilchen (Porengröße: etwa 100 μm) (Dicke: 1, 5 mm)
4.3 Vorrichtung zur RNA-Isolierung

Eine Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren weist eine eine ähnliche Struktur wie eine Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren auf.
[B] Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung
1. Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung aus einer Nucleinsäure-Lösung

(1) Eine TE-Lösung (10 μl) mit einem Gehalt an 1 μg einer Nucleinsäureprobe wird hergestellt.
(2) Ein chaotropes Reagenz A (0,3 ml) wird zugegeben. Anschließend wird vermischt.
(3) Ein organisches Lösungsmittel A (0,3 ml) wird zugegeben. Anschließend wird vermischt.
(4) Eine Spritze wird an einer Verbindungsöffnung einer Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angebracht. Das Lösungsgemisch wird wiederholt für eine vorgegebene Anzahl von Vorgängen durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angesaugt und abgegeben. Es ist darauf hinzuweisen, dass im Fall einer einzigen Flüssigkeitspassage das Lösungsgemisch durch die Verbindungsöffnung zugeführt wird, bevor die Spritze angebracht wird, so dass die Lösung durch die Durchgangsöffnung abgegeben werden kann.
(5) Ein Waschreagenz (1 ml) wird einmal durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angesaugt und abgegeben.
(6) Die Stufe (5) wird 3-mal wiederholt, so dass das Waschreagenz vollständig abgegeben wird.
(7) Ein Elutionsreagenz A (0,05 ml) wird wiederholte Male durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung 10-mal angesaugt und abgegeben.
(8) Das Elutionsreagenz wird als eine Nucleinsäure-Isolierungslösung gewonnen.

2. Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung aus Blut

(1) Ein Lysis-Reagenz für rote Blutkörperchen (3 ml) wird zu 0,6 ml Vollblut gegeben. Anschließend wird vermischt.
(2) Das Gemisch wird 5 Minuten auf Eis inkubiert.
(3) Eine 10-minütige Zentrifugation mit 400 × g wird durchgeführt.
(4) Der Überstand des erhaltenen Produkts wird entfernt.
(5) Ein Lysis-Reagenz für rote Blutkörperchen (1,2 ml) wird zu den erhaltenen Pellets gegeben. Anschließend wird vermischt.
(6) Eine 10-minütige Zentrifugation mit 400 × g wird durchgeführt.
(7) Der Überstand des erhaltenen Produkts wird entfernt, so dass ein Pellet von weißen Blutkörperchen erhalten wird.
(8) Ein chaotropes Reagenz B (0,3 ml) wird zu den Pellets mit weißen Blutkörperchen gegeben. Anschließend wird vermischt.
(9) Das Lösungsgemisch wird unter Verwendung eines Homogenisators (QIA-Zerkleinerungshomogenisator) (QIAGEN) homogenisiert.
(10) Ein organisches Lösungsmittel B (0,3 ml) wird zugegeben. Anschließend wird vermischt.
(11) Eine Spritze wird an einer Verbindungsöffnung einer Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren angebracht. Das Lösungsgemisch wird wiederholt durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung 3-mal angesaugt und abgegeben.
(12) Ein Waschreagenz (1 ml) wird einmal durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angesaugt und abgegeben.
(13) Die Stufe (12) wird 3-mal wiederholt, so dass das Waschreagenz vollständig abgegeben wird.
(14) Ein Elutionsreagenz A (0,2 ml) wird wiederholt durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angesaugt und abgegeben.
(15) Das Elutionsreagenz wird in Form einer Isolierungslösung mit langen Nucleinsäuren gewonnen.
(16) Eine Spritze wird an der Verbindungsöffnung der Vorrichtung für die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren angebracht. Das Lösungsgemisch, das in Stufe (11) aus der Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung abgegeben worden ist, wird in 10-maliger Wiederholung angesaugt und abgegeben.
(17) Ein Waschreagenz (1 ml) wird einmal durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angesaugt und abgegeben.
(18) Die Stufe (17) wird 3-mal wiederholt, wobei das Waschreagenz vollständig abgegeben wird.
(19) Ein Elutionsreagenz B (0,05 ml) wird in 10-maliger Wiederholung durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angesaugt und abgegeben.
(20) Das Elutionsreagenz wird in Form einer Isolierungslösung mit kurzen Nucleinsäuren gewonnen.

[C] Verfahren zur Bewertung von isolierten Nucleinsäuren
1. Quantitative Bestimmung der Nucleinsäurekonzentration
Eine Nucleinsäurelösung wurde auf eine geeignete Menge verdünnt. Die Absorption bei 260 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers (GeneSpec I, Hitachi Naka Instrument) bestimmt. Die Absorption bei 260 nm einer DNA-Lösung (50 μg/ml) wurde auf 1 festgelegt, so dass die DNA-Konzentration der Nucleinsäurelösung berechnet werden konnte.
2. Nucleinsäure-Elektrophorese
Unter Verwendung eines 1,25 %-igen Agarosegels (Reliant RNA Gel System, FMC) wurde eine Elektrophorese (10 V/cm, 40 Minuten) mit einer Nucleinsäurelösung, die einer Formamid-Denaturierung unterworfen worden war, durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel mit Ethidiumbromid und unter UV-Bestrahlung photographiert.
[D] Verifikationsexperiment 1
Genomische DNA wurde als Probe von langen Nucleinsäuren und pBR322-DNA als Probe von kurzen Nucleinsäuren verwendet. Gemäß dem vorerwähnten Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung aus einer Nucleinsäurelösung wurde eine Nucleinsäure-Isolierung unter Verwendung einer Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren und einer Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren durchgeführt. In einer Bindungsstufe wurden die einzelnen Proben durch eine Öffnung einer Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung eingeführt und durch eine Durchgangsöffnung in Einwegrichtung abgegeben. Ferner wurde jede Probe 1-, 5- oder 10-mal durch die Durchgangsöffnung angesaugt und abgegeben.
In der folgenden Tabelle sind die Nucleinsäure-Ausbeuten der einzelnen Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung, die Nucleinsäureproben und die Anzahl der Flüssigkeitspassagen aufgeführt. Ferner zeigt 2 die Beziehung zwischen den Typen der Flüssigkeitspassage und der Nucleinsäureausbeuten in jedem der Geräte zur Nucleinsäure-Isolierung sowie die Nucleinsäureproben. Außerdem sind die Nucleinsäureausbeuten als prozentuale Anteile an Nucleinsäuren, die bezogen auf die zugeführten Mengen an Nucleinsäuren isoliert worden sind, angegeben.
Tabelle 1
Im Fall einer Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren stieg die Ausbeute an langen Nucleinsäuren mit der Anzahl der Flüssigkeitspassagen. Jedoch war die Ausbeute an kurzen Nucleinsäuren unabhängig von der Anzahl der Flüssigkeitspassagen äußerst gering. Dagegen nahm im Fall der Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren die Ausbeute an langen Nucleinsäuren und die Ausbeute an kurzen Nucleinsäuren mit der Anzahl der Flüssigkeitspassagen zu.
Die Ergebnisse zeigen, dass man lange Nucleinsäuren in selektiver Weise an die Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren binden kann, während kurze Nucleinsäuren damit keine Bindung eingehen. Ferner ist ersichtlich, dass bei Verwendung der Vorrichtung für die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren kurze Nucleinsäuren, die keine Bindung mit der Vorrichtung für die Isolierung von langen Nucleinsäuren eingehen, gebunden werden, so dass lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren in wirksamer Weise isoliert werden können.
[E] Verifikationsexperiment 2
Gemäß dem Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung aus Blut wurde eine Nucleinsäure-Isolierung unter Verwendung von humanem Blut als biologischer Probe, einer Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren und einer Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren durchgeführt.
3 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese von Nucleinsäuren, die mit der Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren isoliert worden sind, und von Nucleinsäuren, die mit der Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren isoliert worden sind. Die mit der Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren isolierten Nucleinsäuren enthalten hauptsächlich genomische DNA und im wesentlichen keine RNA. Dagegen enthalten Nucleinsäuren, die mit der Vorrichtung für die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren isoliert worden sind, vorwiegend ribosomale RNA (etwa 5000 b; 28S rRNA), ribosomale RNA (etwa 1900 b; 18S rRNA) und Messenger-RNA, während sie im wesentlichen keine genomische DNA enthalten.
Die Ergebnisse zeigen, dass genomische DNA und gesamte RNA in wirksamer Weise aus einer biologischen Probe mit einem Gehalt an genomischer DNA und gesamter RNA unter Verwendung einer Vorrichtung für die Isolierung von langen Nucleinsäuren und einer Vorrichtung für die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren isoliert werden können.
Sämtliche Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die hier zitiert werden, werden in ihrer Gesamtheit typischerweise zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.

Claims

Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung, umfassend die folgenden Stufen: man vermischt ein chaotropes Mittel mit einer Probe, die lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren enthält; man lässt das Lösungsmittelgemisch mindestens zweimal durch eine erste feste Phase, die Siliciumdioxid mit Durchgangsporen von vorgegebenen Porengrößen enthält, laufen; man lässt das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch eine zweite feste Phase, die Siliciumdioxid mit Durchgangsporen mit Porengrößen, die kleiner als die der ersten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid sind, laufen; und man gewinnt getrennt Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind, und solche, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden sind.
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung nach Anspruch 1, wobei man das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch die erste und zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid in Richtung zu den festen Phasen mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen lässt.
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Durchgangsporen der ersten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Porengrößen von 20-25 μm aufweisen und die Durchgangsporen der zweiten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Porengrößen von 0,1 bis 10 μm aufweisen.
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, aus mindestens 20 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sind, und Nucleinsäuren, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, aus höchstens 10 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sind.
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung nach Anspruch 4, wobei die Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, aus mindestens 50 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sind.
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung nach Anspruch 4 oder 5, wobei Nucleinsäuren, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, aus höchstens 5000 Dexoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sind.
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um genomische DNA handelt und es sich bei Nucleinsäuren, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um RNA handelt.
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei Nucleinsäuren, die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um genomische DNA handelt und es sich bei Nucleinsäuren, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um Plasmid-DNA handelt.
Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung, die mit einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid und einer Durchgangsöffnung, durch die ein Lösungsgemisch aus einer Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren und einem chaotropen Mittel angesaugt und abgegeben wird, ausgestattet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsgemisch aus der Durchgangsöffnung durch Drucksteuerung angesaugt oder abgegeben wird und das Lösungsgemisch zwischen den Räumen, die durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid getrennt sind, so transportiert wird, dass man das Lösungsgemisch mindestens zweimal durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen lässt.
Kit zur Nucleinsäure-Isolierung, umfassend die Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung nach Anspruch 9 und mindestens ein Element, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem chaotropen Mittel, einem organischen Lösungsmittel, einem Waschreagenz und einem Elutionsreagenz besteht.
Kit zur Nucleinsäure-Isolierung nach Anspruch 10, wobei es sich beim chaotropen Mittel um mindestens einen Bestandteil aus der Gruppe handelt, die aus Guanidinthiocyanat, Natriumthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Natriumiodid, Kaliumiodid besteht und wobei es sich beim organischen Lösungsmittel um Ethanol und/oder Diethylenglycoldimethylether handelt.