WO2009016110A1 - Verfahren zum abtrennen von nicht-proteinhaltigen biomolekülen, insbesondere nukleinsäuren aus proteinhaltigen proben - Google Patents

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WO2009016110A1
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protein
samples
biomolecules
nucleic acids
solid phase
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PCT/EP2008/059774
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Vera HOLLÄNDER
Stefanie SCHRÖER
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Qiagen Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acids from protein-containing samples, in particular from biological samples such as blood, stool, saliva, sputum or plasma.
  • the prior art discloses a large number of methods for separating non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acids, from biological samples.
  • the proteins contained in the respective samples are usually degraded in the isolation of DNA by lysis with a proteinase or else a mixture of proteinases.
  • the DNA is usually protected from enzymatic degradation during protein degradation by binding the cofactors required for DNase activity by chelators in the lysis buffer.
  • the isolation of RNA presents a particular challenge because RNases are ubiquitous, abundant, active in a wide temperature range, and do not require cofactors. Specific inactivation of all RNases during lysis is therefore not possible. Nevertheless, in order to rapidly inactivate endogenous and exogenous RNases, lysis of the sample with very strongly denaturing lysing reagents, such as e.g. As phenol and / or chaotropic substances.
  • the purification can z. B. for the achievement of high purity, on the binding of non-proteinous biomolecules, in particular nucleic acids, to a solid phase, for. B. silica membranes, done. Such methods for z. B. Nucleic acid purification are known in the art.
  • sample materials that may be of interest for isolation of non-protein biomolecules, particularly nucleic acid isolation, are significantly different in structure and composition.
  • sample materials with an unfavorable nucleic acid / protein ratio very much protein or very few non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acids
  • samples which contain substances which may interfere in later applications place special demands on the method for purifying nucleic acids
  • Such "difficult" sample materials are z.
  • Another particular difficulty arises when it is intended to isolate both DNA and a separate fraction of RNA from a sample.
  • protocols known to those skilled in the art for "lighter" sample materials are known.
  • RNA is first bound to a solid phase.
  • the flow which contains, inter alia, the RNA, is adjusted by adding further reagents so that subsequently the RNA can be bound to a solid phase.
  • Difficult sample materials such as saliva, sputum, blood or stool, which imperatively require treatment with proteinases, so far can not be used in such a method.
  • the proteinase step necessary for complete lysis can not be carried out under the chaotrope concentration necessary for the protection of the RNA.
  • dilution to proteinase-compatible chaotrope concentrations leads to an increased risk of RNA degradation, since RNases are also active under these conditions.
  • a dilute lysate does not permit selective binding of the DNA to a solid phase and thus no separation of the various nucleic acid species. Without a proteinase treatment, however, the yield and quality of the isolated nucleic acid fractions are usually insufficient.
  • the object is achieved by a method according to claim 1 of the present invention. Accordingly, a method is proposed for the isolation of non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acids from protein-containing biological samples, comprising the steps:
  • Protein degradation, the non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acid ⁇ ) are bound to the solid phase.
  • biological samples includes, in particular, body fluids such as blood, semen, cerebrospinal fluid, saliva, sputum or urine, fluids which are obtained when reprocessing blood, such as serum or plasma, Leucocyte fractions or "buffy coat", leech saliva, feces, smears, punctates, dandruff, hair, cutaneous fragments, forensic samples, food or environmental samples containing free or bound biomolecules, in particular free or bound non-proteinaceous biomolecules , in particular nucleic acids, whole organisms, preferably whole non-living organisms, tissues of multicellulars, preferably of insects and mammals, in particular of humans, for example in the form of tissue sections (eg FFPE samples), tissue fragments, or organs, isolated cells, for example in Form of adherent or suspended cell cultures, organelle len, for example, chloroplasts or mitochondria, vesicles, cell nuclei or chromosomes, plants, plant parts, plant
  • protein-containing is understood to mean, in particular, that the sample contains peptides and peptide fragments, but also entire proteins or protein complexes, which may also be substituted, in particular glycosylated, phosphorylated or acetylated ,
  • non-proteinaceous biomolecules is understood to mean, but is not limited to, all biomolecules (other than proteins), such as, for example, lipids, carbohydrates, metabolites, metabolites and, in particular, all types of nucleic acids.
  • biomolecules are understood as meaning, but not limited to, all naturally occurring or artificially introduced molecules in biological samples.
  • nucleic acid in the context of the present invention particularly, but not limited to natural, preferably isolated linear, branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, DNA and the like, synthetic or modified nucleic acids, for example oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used for the PCR, nucleic acids labeled with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes or so-called PNAs ("peptide nucleic acids").
  • immobilization in the sense of the present invention is understood to mean, in particular but not limited to, a reversible immobilization to a suitable solid phase.
  • Samples like blood, plasma, sputum, stool or saliva.
  • step a) Preference is given in step a) to the non-proteinaceous biomolecules contained in the biological sample, in particular nucleic acids which are essentially completely immobilized on the solid phase.
  • the method according to the invention can also be used is when only a part of the non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acids, is immobilized.
  • step b) the non-protein-containing biomolecules bound to the solid phase, in particular nucleic acid (s), are completely immobilized on the solid phase; however, the present invention is not limited thereto. It has been found that in many applications of the present invention, the method according to the invention can also be used if, during step b), part of the non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acid (s), dissolves or does not dissolve from the solid phase immobilized present.
  • the solid phase is a phase with a high nucleic acid affinity, preferably selected from the group of silica membranes, silica beads, magnetic particles, hydrophilic membranes, hydrophobic membranes, ion exchange matrices, or mixtures thereof.
  • a high nucleic acid affinity preferably selected from the group of silica membranes, silica beads, magnetic particles, hydrophilic membranes, hydrophobic membranes, ion exchange matrices, or mixtures thereof.
  • hybrid-mediated binding of nucleic acids to solid phases such.
  • the ratio of protein to non-protein-containing biomolecules, in particular nucleic acids, in g / g before carrying out the method is> 10: 1, according to a further embodiment> 100: 1, according to a further embodiment> 1000: 1, and according to another embodiment> 10000: l.
  • step a) is carried out with the addition of a chaotropic buffer.
  • a chaotropic buffer This has the advantage that any degradation by RNases or DNases can be largely prevented in advance and the binding of nucleic acids is mediated especially on Silikaoberflä- chen.
  • other suitable for the respective sample material and the selected solid phase lysis reagents are possible, such as. B. the known in the art alkaline lysis of bacteria with subsequent binding z. B. on Anionenhenhenerober horr.
  • the buffer to be used in step a) is preferably determined on the basis of the respective sample material, the biomolecule to be immobilized, and the selected solid phase.
  • the method additionally comprises at least one step a1), which is carried out before step b):
  • the method additionally comprises at least one step c), which is carried out after step b):
  • step b) This has turned out to be favorable for many applications since in this way the proteinases present in step b) can be largely inactivated. Carrying out the enzyme into the eluate, which could prevent or disturb further enzyme- or protein-based applications (eg PCR) there, can also be prevented or largely avoided in many applications.
  • enzyme- or protein-based applications eg PCR
  • Step b) can be carried out with various protein-degrading enzymes (proteases) or a mixture of several proteases.
  • proteases proteinase K and the QIAGEN protease are preferred.
  • step b) can take place during the incubation at a desired temperature.
  • the temperature is preferably adapted to the respective temperature optimum of the selected enzyme or of the enzyme mixture.
  • the incubation is preferably carried out at a temperature of> 0 ° C to ⁇ 100 ° C, preferably between> 4 ° C and ⁇ 80 ° C, more preferably between> 18 ° C and ⁇ 70 ° C, particularly preferably between> 30 ° C. and ⁇ 65 ° C.
  • proteinase K and / or QIAGEN protease are used as protein-degrading enzyme
  • a temperature range of> 40- ⁇ 60 ° C, in particular> 54 ° C to ⁇ 58 0 C is preferred.
  • the protease is preferably applied dissolved in liquid to the solid phase.
  • liquid it is preferred to use solutions which produce optimal conditions for enzymatic degradation (eg, pH, salt compositions and concentrations) of cofactors or other conditions.
  • step b) is carried out in water and / or in unbuffered solutions.
  • the solution of the protease in water surprisingly enough in many applications to allow the protein degradation.
  • the solvent water and the relatively small volume thus allow in many applications in the method according to the invention the access of the proteases to the immobilized protein-containing sample and the expression of the enzymatic activity.
  • step b) is carried out with at least one protease having an activity of> 1 mAU / mg.
  • mAU is meant the activity in which the enzyme liberates folin-positive amino acids and peptides corresponding to 1 ⁇ mol of tyrosine per minute.
  • step b) is carried out with a (protease) activity of at least> 10 mAU / mg, more preferably> 20 mAU / mg and particularly preferably with a (protease) activity of at least> 30 mAU / mg
  • step b) is carried out for a period of> ⁇ ⁇ ⁇ seconds to ⁇ T seconds, wherein
  • X denotes the numerical value of the (protease) activity of the enzyme used (as described above).
  • X means the average (protease) activity of these enzymes. This has proved useful in many fields of application of the present invention, since on the one hand a protein digestion which is as complete as possible can be ensured, but on the other hand the biomolecules to be isolated are not or only slightly degraded or damaged.
  • step b) is for a period of> ⁇ ⁇ ⁇ seconds to ⁇ T ⁇
  • Step b) is preferred for a period of> ⁇ seconds to ⁇ -y
  • the minimum total volume during the performance of step b) is such that the solid phase, including all the biomolecules immobilized thereon, is completely wetted.
  • the maximum total volume during the performance of step b) is preferably such that the biomolecules to be isolated are not eluted from the solid phase and washed off, z. B. when dripping through a membrane.
  • FIG. 2 shows three absorption spectra of DNA after isolation in three comparative experiments according to Example 1
  • a human saliva sample is collected. Before the collection, the subject had neither eaten nor drunk for Ih to avoid contamination of the saliva sample with food leftovers. During the collection process, the sample is stored on ice. The sample is then subdivided into 200 ⁇ l aliquots and each aliquot is mixed with ImI of the saliva stabilization solution RNAprotect Saliva from QIAGEN and stored for 2 days at 2-8 ° C in the refrigerator. For the subsequent isolation of DNA and RNA from the stabilized saliva samples, the components of the QIAamp Mini Kit and the RNeasy Micro Kit of the manufacturer QIAGEN are used.
  • the samples are centrifuged off according to the manufacturer for 10 min at lOOOOrpm, the supernatant removed by Abpippet Schl and the pellet dissolved by snapping the vessel slightly.
  • the pellet is then dissolved in 350 ⁇ l of the GTC-containing lysis buffer RLT by vortexing.
  • the lysate is applied to the silica membrane, in the QIAamp mini-column, and passed through the membrane by centrifugation for 1 min. At 1000 rpm.
  • RNA was analyzed by means of quantitative real-time RT-PCR using the QuantiTect OneStep RT-PCR kit and primer and sample for the detection of the actin ß transcript. Each sample is analyzed in duplicate. The mean of the duplicate determinations of the three samples is shown in Table 1.
  • the QIAamp column is used to isolate the DNA.
  • the membrane is washed by passing 350 ⁇ l of the guanidine hydrochloride-containing wash buffer AW1.
  • Each 25 ⁇ l of the proteinase K solution contained in the QIAamp Mini Kit is made up to a total volume of 80 ⁇ l with water and applied to the membrane.
  • the washing step is repeated with AWI and then washed with the alcohol-containing wash buffer AW2.
  • the membrane is dried by centrifuging at 14000 rpm for 2 minutes.
  • the DNA is eluted by application of 100 ⁇ l of water and subsequent centrifugation, the elution being repeated with another 100 ⁇ l.
  • the DNA isolation without protease shows very high absorptions in the range less than 250 nm, which are due to impurities.
  • the isolated with the aid of the method according to the invention DNA (Fig.l, samples la-c) is of significantly better quality, since the range of less than 240nm only has a much lower absorption and thus a lower impurity.
  • a curve with a maximum at 260 nm can be recognized, which is due to the absorption by the isolated DNA. (maximum absorption of DNA is 260nm).
  • a saliva sample is collected as described in Example 1, aliquoted, stabilized, refrigerated for 3 days at 2-8 ° C and used for RNA and DNA isolation.
  • the DNA was eluted in 2x 40 ⁇ l of water.
  • the samples 4a-c were used for DNA isolation with proteinase K digestion on the membrane according to the invention, the samples 5a-c were subjected to the same procedure without proteinase K insert.
  • the DNA is obtained from saliva samples by a method involving proteinase K digestion in solution.
  • saliva is collected, stabilized, stored and centrifuged (samples 6a-c). After removal of the supernatant is used for washing of samples of ImI PBS are added to the pellets and mixed by vortexing. The samples are pelleted again by centrifugation at 100rpm for 2 minutes and the supernatant discarded. The pellet is then dissolved in 180 ⁇ l of PBS, mixed with 25 ⁇ l of the proteinase K solution from the QIAamp Mini Kit (QIAGEN) and 200 ⁇ l of the buffer AL and mixed by vortexing. The samples are incubated for 10 min at 56 ° C. Each sample is then mixed with 200 ⁇ l of 100% ethanol and applied to the silica membrane in the QIAamp Mini column. Further DNA isolation is carried out as described for samples 2a-c in Example 1.
  • RNA was analyzed in all cases by quantitative real-time RT-PCR using the QuantiTect OneStep RT-PCR kit and primer and sample to detect the interleukin-8 transcript, all samples showing comparable results, so that comparable NA Content of the samples is to be assumed (data not shown).
  • the DNA yield was determined by measuring the absorbance at 260nm.
  • the mean values of the yields of samples 4, 5 and 6 (a to c) are shown in Table 2.
  • the DNA isolated in this way was used in duplicate for the detection of the gene coding for the 18SrRNA.
  • the samples 1 to 3 were used in each case 2 .mu.l
  • the eluates of samples 4 to 6 were diluted 1:10 with water and used in each case 2 .mu.l.
  • the amplification was carried out in a total volume of 25 .mu.l with a suitable master mix for real-time PCR, such as the QuantiTect SYBRGreen PCR kit from QIAGEN, according to the manufacturer.
  • the amplification takes place in a suitable real-time amplification device, such. B. the 7700 ABI. From the ct values determined, the mean values are determined using the duplicate determinations of each of three replicates a to c and the standard deviation. The result is shown in Table 3.
  • Table 3 Table 3
  • RNAproduct Saliva from QIAGEN and refrigerate for one day at 2-8 ° C.
  • the components of the RNeasy Micro Kit from the manufacturer QIAGEN are used.
  • the samples are centrifuged off according to the manufacturer for 10 min at lOOOOrpm, the supernatant removed by Abpippet Schl and the pellet dissolved by snapping the vessel slightly.
  • the pellet is then dissolved in 350 ⁇ l of the GTC-containing lysis buffer RLT by vortexing.
  • the lysate is mixed with 350 ⁇ l of 70% ethanol, applied to the silica membrane in the RNeasy Micro column, and passed through the membrane by centrifugation for 1 min at 100 ° C.
  • RNA isolation from each saliva sample, an aliquot (A) for RNA isolation according to the manufacturer's instructions is used.
  • the respective other aliquot (B) is used for RNA isolation by means of the method according to the invention.
  • the membrane is washed by the passage of 350 .mu.l of the guanidine hydrochloride wash buffer RWl.
  • Each 20 ⁇ l proteinase K solution is made up to a total volume of 80 ⁇ l with water and applied to the membrane.
  • a washing step is performed with a mixture of equal portions of Lysis Buffer RLT and 70% ethanol. The wash is then repeated with RWI and then washed with the alcohol-containing wash buffer RPE.
  • RNA is eluted by application of 14 ⁇ l of water and subsequent centrifugation.
  • the RNA thus isolated was analyzed in all cases by means of quantitative real-time PCR using the QuantiTect OneStep RT-PCR kit and primer and sample for the detection of the IL8 transcript in triplicate. In each case 2.5 ⁇ l of the eluates were used in a total volume of 25 ⁇ l. The obtained averages and standard deviations of the triplicate determinations of the samples are shown in Table 4.
  • FFPE samples formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples from rat liver are used. From these samples, cuts of about 20 ⁇ M thickness are made using a microtome and 1 slice per sample is used.
  • RNeasy FFPE Kit components of the RNeasy FFPE Kit, the Allprep DNA / RNA Kit and the QIAamp Mini Kit from the manufacturer QIAGEN are used.
  • the tissues are deparaffinized according to the manufacturer (RNeasy FFPE kit manual) by washing with 1 ml of xylene and, after centrifuging the sample and removing the supernatant, with ImI 100% ethanol. After re-centrifuging the sample and removing the supernatant, the samples are dried for 10 min at 37 ° C. Connecting the samples are added K from the RNeasy FFPE Kit and incubated for 3h min at 56 ° C and 15 min at 80 0 C with 150 ⁇ l of buffer PKD and lO ⁇ l proteinase.
  • the resulting mixture is applied to the silica membrane in the Allprep DNA column (from the Allprep DNA / RNA Mini Kit) and passed through the membrane by centrifugation for 1 min at 14000 rpm.
  • a proteinase K treatment is carried out on the silica membrane by applying 20 ⁇ l proteinase K and 60 ⁇ l water to the membrane and incubating the sample for 10 min at 56 ° C., while the comparison sample ( Sample 2) is not treated with proteinase K.
  • the membranes of both samples are then carried out by carrying out 500 .mu.l of the guanidine hydrochloride-containing wash buffer AWl and then 500 .mu.l of the alcoholic washing buffer AW2.
  • the membrane is dried by centrifuging at 14000 rpm for 2 minutes.
  • the DNA is eluted by applying 30 ⁇ l of water after incubation for one minute by centrifugation.
  • the DNA thus obtained is first checked by means of agarose gel electrophoresis. For this purpose, 5 ⁇ l each of the resulting eluate are diluted with 15 ⁇ l of water and separated on a 0.5% agarose-TAE gel for about 4h at 60V.
  • the ethidium bromide stained gel in both cases shows fragmented DNA, recognizable by a light "smear" spread over a certain size range, the control sample (2) containing substantially smaller fragments than sample 1 after proteinase treatment on the membrane
  • the application of the method according to the invention thus leads to the isolation of larger DNA fragments.
  • the DNA which can be isolated from FFPE samples is always fragmented, since the DNA is already degraded during fixation, embedding and storage.
  • the DNA is covalently cross-linked by formalin fixation with other nucleic acids and especially with proteins, which makes both the isolation of the DNA and the analysis of the DNA by means of amplification techniques extremely difficult.
  • the eluates were used for further analysis by means of quantitative real-time PCR.
  • the isolated DNA was used in duplicate for the detection of a 465 bp amplicon of the prion protein-encoding gene.
  • the eluates were each diluted 1:20 with water and 5 .mu.l of these dilutions used in the real-time PCR.
  • the amplification was carried out in a total volume of 25 .mu.l with a suitable master mix for real-time PCR, such as the QuantiTect SYBRGreen PCR kit from QIAGEN, according to the manufacturer.
  • the amplification was carried out in a suitable real-time amplification device, such as. B. the 7700 ABI. From the determined ct values, the mean values were determined by means of the duplicate determinations of the duplicates and the standard deviation. The result is shown in Table 5.
  • Comparative sample, as well as the treated sample according to the invention, have experienced at the beginning of the DNA isolation process, a three-hour treatment with proteinase K in solution. Nevertheless, the comparatively very short treatment time of 15 minutes causes an improvement in the DNA fragment size and in particular an improvement in the amplifiability of the DNA.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren, wobei an einer festen Phase ein Proteinabbau durchgeführt wird.

Description

VERFAHREN ZUM ABTRENNEN VON NICHT-PROTEINHALTIGEN BIOMOLEKÜLEN, INSBESONDERE NUKLEINSÄUREN AUS PROTEINHALTIGEN PROBEN
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Nicht- proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren aus proteinhaltigen Proben, insbesondere aus biologischen Proben wie Blut, Stuhl, Speichel, Sputum oder Plasma.
Technischer Hintergrund
Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Verfahren zur Abtrennung von Nicht- proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren aus biologischen Proben bekannt.
Diese Verfahren dienen dabei u. a. der Aufreiniung der Nukleinsäuren unter Abtrennung von anderen Probenbestandteilen wie insbesondere Proteinen und ande- ren möglicherweise in späteren Applikationen inhibierenden Substanzen. Gleichzeitig müssen diese Verfahren gewährleisten, dass die zu isolierende Nukleinsäure nicht während der Aufreinigung enzymatisch oder chemisch degradiert wird.
Die in den jeweiligen Proben enthaltenden Proteine werden bei der Isolierung von DNA üblicherweise durch Lyse mit einer Proteinase oder auch einem Gemisch von Proteinasen abgebaut. Die DNA wird während des Proteinabbaus vor enzy- matischer Degradation üblicherweise geschützt, indem die für Aktivität von DN- asen notwendigen Cofaktoren durch Chelatoren im Lysepuffer gebunden werden. Die Isolierung von RNA stellt eine besondere Herausforderung dar, da RNasen allgegenwärtig sind, in großen Mengen vorhanden sind, in einem großen Temperaturbereich aktiv sind und keine Cofaktoren benötigen. Eine spezifische Inakti- vierung aller RNasen während der Lyse ist daher nicht möglich. Um endogene und exogene RNasen dennoch rasch zu inaktivieren, wird üblicherweise eine Lyse der Probe mit sehr stark denaturierenden Lysereagenzien wie z. B. Phenol und/oder chaotropen Substanzen durchgeführt.
Nach der Lyse der Probe erfolgt die Aufreinigung der Nicht-proteinhaltigen Bio- moleküle, insbesondere Nukleinsäuren. Die Aufreinigung kann z. B. für die Erzielung hoher Reinheit, über die Bindung der Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, an eine feste Phase, z. B. Silikamembranen, erfolgen. Derartige Methoden zur z. B. Nukleinsäureaufreinigung sind dem Fachmann bekannt.
Die verschiedenen biologischen Probenmaterialien, die für eine Isolierung von nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere einer Nukleinsäureisolierung, von Interesse sein könnten, unterscheiden sich wesentlich hinsichtlich ihrer Struktur und Zusammensetzung. Insbesondere Probenmaterialien mit einem ungünsti- gen Nukleinsäure-Proteinverhältnis (sehr viel Protein oder sehr wenig Nicht- proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren) und Proben, welche Substanzen enthalten, die in späteren Applikationen stören können (Inhibitoren), stellen besondere Ansprüche an das Verfahren zur Nukleinsäureaufreinigung. Derartig "schwierige" Probenmaterialien sind z. B. Blut, Plasma, Sputum, Spei- chel oder Stuhl. Eine weitere, besondere Schwierigkeit ergibt sich, wenn aus einer Probe sowohl DNA, als auch in einer getrennten Fraktion RNA, isoliert werden soll. Für diesen Zweck sind dem Fachmann für "leichtere" Probenmaterialien geeignete Protokolle bekannt. Diese beginnen mit einer stark denaturierenden Lyse mit chaotropen Re- agenzien, um die RNA vor dem Abbau zu schützen. Im Anschluss an die Lyse wird zunächst die DNA an eine feste Phase gebunden. Der Durchfluss, welcher unter anderem die RNA enthält, wird durch Zugabe weiterer Reagenzien so eingestellt, dass im Folgenden die RNA an eine feste Phase gebunden werden kann.
Schwierige Probenmaterialien, wie z. B. Speichel, Sputum, Blut oder Stuhl, welche zwingend eine Behandlung mit Proteinasen benötigen, können bisher nicht in ein solches Verfahren eingesetzt werden. Der zur vollständigen Lyse notwendige Proteinase-Schritt kann nicht unter der zum Schutz der RNA notwendigen Chao- trop-Konzentration durchgeführt werden. Eine Verdünnung auf Proteinase- verträgliche Chaotrop- Konzentrationen führt zum einen zu einem erhöhten Risiko des RNA- Abbaus, da unter diesen Bedingungen auch RNasen aktiv sind. Zum anderen ist aus einem verdünnten Lysat keine selektive Bindung der DNA an eine feste Phase und somit keine Trennung der verschiedenen Nukleinsäure-Spezies möglich. Ohne eine Proteinase-Behandlung sind jedoch die Ausbeute und Qualität der isolierten Nukleinsäure- Fraktionen meist nicht ausreichend.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen, sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden und insbesondere für eine weite Spanne von Anwendungen ein Verfahren zu schaffen, bei dem eine Isolierung von Nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren aus proteinhaltigen Proben möglich ist. Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird ein Verfahren zur Isolierung von Nicht- proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren aus proteinhaltigen biologischen Proben vorgeschlagen, umfassend die Schritte:
a) Immobilisierung zumindest eines Teils der in der biologischen Probe enthaltenden Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure(n) an eine feste Phase
b) enzymatischer Proteinabbau, wobei zumindest während eines Teils des
Proteinabbaus die Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure^) an die feste Phase gebunden sind.
Unter dem Term „biologischen Proben" werden - aber nicht darauf beschränkt - im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere Körperflüssigkeiten wie Blut, Sperma, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Sputum oder Urin, Flüssigkeiten, welche beim Aufarbeiten von Blut erhalten werden, wie etwa Serum oder Plasma, Leukozyten-Fraktionen oder „buffy coat", Blutegelspeichel (Saliva), Fäkalien, Abstriche, Punktate, Schuppen, Haare, Hautfragmente, forensische Proben, Le- bensmittel- oder Umweltproben, die freie oder gebundene Biomoleküle, insbesondere freie oder gebundene Nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren enthalten, ganze Organismen, vorzugsweise ganze nicht lebende Organismen, Gewebe von Mehrzellern, vorzugsweise von Insekten und Säugetieren, insbesondere vom Menschen, beispielsweise in Form von Gewebeschnitten (z.B. FFPE-Proben), Gewebefragmenten, oder Organen, isolierte Zellen, beispielsweise in Form adhärenter oder suspendierter Zellkulturen, Organellen, beispielsweise Chloroplasten oder Mitochondrien, Vesikel, Zellkerne oder Chromosomen, Pflanzen, Pflanzenteile, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen, Bakterien, Viren, Viroide, Prionen, Hefen und Pilze oder Teile von Pilzen verstanden. Die biologischen Proben können sowohl frisch, als auch gefroren oder mit verschiedenen Methoden stabilisiert vorliegen; ggf. wird dann vor Schritt a) eine geeignete Lyse vorgenommen.
Unter dem Term „proteinhaltig" wird - aber nicht darauf beschränkt - im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere verstanden, dass die Probe Peptide und Peptidfragmente, aber auch ganze Proteine oder Proteinkomplexe enthält, welche ggf. auch substituiert, insbesondere glykosyliert, phosphoryliert oder acetyliert vorliegen können.
Unter dem Term „Nicht-proteinhaltige Biomoleküle" werden - aber nicht darauf beschränkt - im Sinne der vorliegenden Erfindung sämtliche Biomoleküle (außer Proteine), wie z. B Lipide, Kohlenhydrate, Metabolite, Stoffwechselprodukte und insbesondere alle Arten von Nukleinsäuren verstanden.
Unter dem Term „Biomoleküle" werden - aber nicht darauf beschränkt - im Sinne der vorliegenden Erfindung sämtlich in biologischen Proben natürlicherweise vorkommende oder künstlich eingebrachte Moleküle verstanden.
Unter dem Term „Nukleinsäure" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - natürliche, vorzugsweise isolierte lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren wie RNA, insbesondere mRNA, siR- NA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder Ribozyme, DNA und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, beispielsweise Oligonukleotide, insbesondere für die PCR verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digo- xigenin, Biotin oder Fluoreszensfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder sogenannte PNAs („peptide nucleic acids") verstanden. Unter dem Term „Immobilisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - eine reversible Immobilisierung an eine geeignete feste Phase verstanden.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass auch bei Proben, bei denen der Proteinanteil sehr viel höher als der Anteil der zu isolierenden Nicht- proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure(n) ist, ein Proteinabbau stattfinden kann, während die Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure(n) zumindest teilweise an eine feste Phase gebunden sind.
Eine derartige Vorrichtung bietet für eine weite Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindungen mindestens einen der folgenden Vorteile:
- Dadurch, dass während des Proteinabbaus die Nicht-proteinhaltigen Bio- moleküle zumindest teilweise an eine feste Phase gebunden sind, ist ein
Abbau der Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle weitgehend ausgeschlossen bzw. kann zumindest bei den meisten Anwendungen zum großen Teil unterdrückt werden.
- Die Vorrichtung erlaubt die Untersuchung bisher nur schwer zugänglicher
Proben wie Blut, Plasma, Sputum, Stuhl oder Speichel.
- Es findet keine oder nur eine sehr geringe Verdünnung während des Proteinabbaus statt, wie dies bei Protokollen in Lösung der Fall wäre.
- Durch die Verlagerung des Proteinabbaus vom Lyseschritt vor der Bindung der Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, auf einen Zeitpunkt nach der Bindung der Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, an die feste Phase können oftmals auch Protokolle zur parallelen Isolierung verschiedener Spezies, insbesondere Nukleinsäure-Spezies, aus einer Probe durchgeführt werden.
Bevorzugt werden in Schritt a) die in der biologischen Probe enthaltenden Nicht- proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, welche im wesentlichen vollständig an der festen Phase immobilisiert sind., Jedoch hat sich herausgestellt, dass bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung das erfindungsgemäße Verfahren auch dann einsetzbar ist, wenn nur ein Teil der Nicht- proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, immobilisiert ist.
Entsprechend ist es bevorzugt, dass während Schritt b) die an der festen Phase gebundenen Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure(n), vollständig an der festen Phase immobilisiert sind; jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Es hat sich herausgestellt, dass bei vielen An- Wendungen der vorliegenden Erfindung das erfindungsgemäße Verfahren auch dann einsetzbar ist, wenn während Schritt b) sich ein Teil der Nicht- proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure(n), von der festen Phase löst bzw. nicht immobilisiert vorliegt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die feste Phase eine Phase mit einer hohen Nukleinsäure-Affinität, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Silikamembranen, silica-beads, magnetische Partikel, hydrophile Membranen, hydrophobe Membranen, Ionenaustauschmatrices, oder Mischungen daraus. Eingeschlossen sind Hybridvermittelte Bindungen von Nukleinsäuren an fes- te Phasen wie z. B. die Bindung spezifischer Nukleinsäuresequenzen über immobilisierte Oligonukleotide.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass das erfindungsgemäße Verfahren - wenn damit Nukleinsäuren isoliert werden sollen - nicht nur bei relativ Nuk- leinsäure-reichen Proben, sondern auch bei Proben durchführbar ist, bei denen das Verhältnis von Protein zu Nukleinsäure ungünstig ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis von Protein zu Nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren, in g/g vor Durchführung des Verfahrens >10:l, gemäß einer weiteren Ausführungsform >100:l, gemäß einer weiteren Ausführungsform >1000:l, sowie gemäß einer weiteren Ausführungsform >10000:l.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird Schritt a) unter Zusatz eines chaotropen Puffers durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass etwaiger Abbau durch RNasen oder DNasen schon im Vorfeld weitgehend verhindert werden kann sowie die Bindung von Nukleinsäuren insbesondere an Silikaoberflä- chen vermittelt wird. Es sind aber auch andere für das jeweilige Probenmaterial und die gewählte feste Phase geeignete Lysereagenzien möglich, wie z. B. die dem Fachmann bekannte alkalische Lyse von Bakterien mit nachfolgender Bindung z. B. an Anionenaustauscheroberflächen. Der in Schritt a) zu verwendende Puffer wird vorzugsweise anhand des jeweiligen Probenmaterials, dem zu immobilisierenden Biomolekül, sowie der gewählten festen Phase bestimmt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zusätzlich mindestens einen Schritt al), der vor Schritt b) durchgeführt wird:
al) Waschen der festen Phase mit einer mindestens eine chaotrope Substanz enthaltenden Lösung.
Dies hat sich für viele Anwendungen als günstig herausgestellt, da so gröbere Verunreinigungen, die aufgrund der unvollständigen Lyse ohne Proteinabbau im Lysat verbleiben und auf die feste Phase gelangen, zum Teil entfernt werden kön- nen. Diese durch das Waschen erzielte Entfernung ist unvollständig. Es verbleiben Proteine an der festen Phase durch Bindung der Proteine an die feste Phase selbst oder durch Bindung an Nicht-proteinhaltige Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren. Das Waschen verringert aber die Menge an abzubauenden Proteinen und erleichtert den Zugang der Proteinase an die verbleibenden Proteine.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zusätzlich mindestens einen Schritt c), der nach Schritt b) durchgeführt wird:
c) Waschen der festen Phase mit einer mindestens eine chaotrope Substanz enthaltenden Lösung.
Dies hat sich für viele Anwendungen als günstig herausgestellt, da so die in Schritt b) vorhandenen Proteinasen weitgehend inaktiviert werden können. Ein Verschleppen des Enzyms in das Eluat, welches dort weitere Enzym- bzw. Prote- in-basierende Applikationen (z. B. PCR) verhindern oder stören könnte, kann so bei vielen Anwendungen ebenfalls verhindert oder weitgehend vermieden werden.
Für den Fachmann ist es augenfällig, dass sich an das erfindungsgemäße Verfah- ren weitere Schritte anschließen können. Falls DNA isoliert werden soll, würde sich z. B. ein Waschen mit einem Ethanol-haltigen Puffer, ggf. Trocknen der Membran und Elution der DNA anschließen. Im Falle der Isolierung der RNA würden sich entsprechend modifizierte Schritte anschließen.
Der Schritt b) kann mit verschiedenen proteinabbauenden Enzymen (Proteasen) oder einer Mischung aus mehreren Proteasen durchgeführt werden. Insbesondere werden Proteinase K und die QIAGEN-Protease bevorzugt. Der Schritt b) kann ggf. während der Inkubation bei einer gewünschten Temperatur erfolgen. Bevorzugt wird die Temperatur dem jeweiligen Temperaturoptimum des gewählten Enzyms bzw. der Enzym- Mischung angepasst.
Die Inkubation erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von >0°C bis <100°C, bevorzugt zwischen >4°C und <80°C, besonders bevorzugt zwischen >18°C und <70°C, insbesondere bevorzugt zwischen >30°C und <65°C.
Für den Fall, dass Proteinase K und/oder QIAGEN-Protease als proteinabbauen- des Enzym benutzt werden, ist ein Temperaturbereicht von >40-<60°C, insbesondere >54°C bis <58 0C bevorzugt.
Während oder in Schritt b) wird die Protease bevorzugt in Flüssigkeit gelöst auf die feste Phase appliziert.
Als Flüssigkeit werden bevorzugt Lösungen verwendet, die optimale Bedingungen für den enzymatischen Abbau (z. B. bzgl. des pH- Wertes, der Salzzusammensetzungen und -konzentrationen) von Co-Faktoren oder anderer Bedingungen, herstellen.
Überraschenderweise hat sich jedoch herausgestellt, dass, im Gegensatz zu herkömmlichen dem Fachmann bekannten Verfahren des enzymatischen Proteinabbaus in Lösung, der erfindungsgemäße Protein-Abbau bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung an festen Phasen ohne spezielle, mittels Lösungen eingestellten Bedingungen verlaufen kann. Somit ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass Schritt b) in Wasser und/oder in un- gepufferten Lösungen durchgeführt wird. Die Lösung der Protease in Wasser reicht überraschenderweise bei vielen Anwendungen aus um den Proteinabbau zu ermöglichen. Das Lösungsmittel Wasser sowie das relativ kleine Volumen ermöglichen somit bei vielen Anwendungen im erfindungsgemäßen Verfahren den Zugang der Proteasen an die immobilisierte proteinhaltige Probe sowie die Ausprägung der enzymatischen Aktivität.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Schritt b) mit mindestens einer Protease, die eine Aktivität von >1 mAU/mg aufweist, durchgeführt.
Dabei ist unter „mAU" die Aktivität gemeint, bei der das Enzym Folin-positive Aminosäuren und Peptide entsprechend lμmol Tyrosin pro Minute freisetzt.
Dies hat sich für viele Anwendungsbereiche der vorliegenden Erfindung bewährt, da so eine gute Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens oftmals auf einfache Weise erreicht werden kann.
Bevorzugt wird Schritt b) mit einer (Protease-) Aktivität von mindestens >10 mAU/mg, noch bevorzugt >20 mAU/mg sowie insbesondere bevorzugt mit einer (Protease-)Aktivität von mindestens >30 mAU/mg durchgeführt
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Schritt b) für einen Zeitraum von > ~ττ~ Sekunden bis < ^T Sekunden durchgeführt, wobei
„X" der Zahlenwert der (Protease-)Aktivität des verwendeten Enzyms (wie oben beschrieben) bezeichnet.
Für den Fall, dass mehrere Enzyme verwendet werden, bedeutet X die durchschnittliche (Protease-)Aktivität dieser Enzyme. Dies hat sich bei vielen Anwendungsbereichen der vorliegenden Erfindung bewährt, da so zum einen ein möglichst vollständiger Proteinverdau sichergestellt werden kann, zum anderen aber die zu isolierenden Biomoleküle nicht oder nur unwesentlich abgebaut oder beschädigt werden.
Bevorzugt wird Schritt b) für einen Zeitraum von > ~^~ Sekunden bis < T}
Sekunden, weiter bevorzugt > ~rτ~ Sekunden bis < — ^T — Sekunden, noch be-
! 800 o , _, , . 54000 o , J J , c , vorzugt > ^ Sekunden bis < — 77 — Sekunden durchgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Schritt b) für ei-
1500 o , _, , . 13000000 o , _, _, , c , nen Zeitraum von > y Sekunden bis < y Sekunden durchgeführt, wobei „Y" den Zahlenwert der (Protease-)Aktivität in mAU der Lösung darstellt, in der Schritt b) durchgeführt wird und wobei mit „mAU" die Aktivität gemeint ist, bei der Folin-positive Aminosäuren und Peptide entsprechend lμmol Tyrosin pro Minute freigesetzt werden.
Dies hat sich bei vielen Anwendungsbereichen der vorliegenden Erfindung bewährt, da so ebenfalls zum einen ein möglichst vollständiger Proteinverdau sichergestellt werden kann, zum anderen aber die zu isolierenden Biomoleküle nicht oder nur unwesentlich abgebaut oder beschädigt werden.
Bevorzugt wird Schritt b) für einen Zeitraum von > γ Sekunden bis < — y —
9000 270000
Sekunden, noch bevorzugt > y Sekunden bis < — y — Sekunden durchgeführt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das minimale Gesamtvolumen während der Durchführung von Schritt b) so bemessen, dass die feste Phase einschließlich sämtlicher daran immobilisierten Biomoleküle vollständig benetzt ist.
Es hat sich herausgestellt, dass bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung eine solche Benetzung zu einem Flüssigkeitsfilm führt, welcher Molekularbewegung und Diffusion ermöglicht, um den Zugang der Proteasen zu den Proteinen sowie die enzymatische Aktivität zu gewährleisten.
Das maximale Gesamtvolumen während der Durchführung von Schritt b) ist bevorzugt so bemessen, dass die zu isolierenden Biomoleküle nicht von der festen Phase eluiert bzw. abgelöst und abgeschwemmt werden, z. B. bei Durchtropfen durch eine Membran.
Auf diese Weise kann bei einer breiten Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindung zum einen sichergestellt werden, dass der Proteinverdau mit einer hohen Effektivität verläuft, zum anderen wird so verhindert, dass die zu isolierenden Biomoleküle (insbesondere Nukleinsäuren) während des Verdaus von der festen Phase eluiert oder abgelöst werden.
Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden Komponenten unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption kei- nen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen Figuren und Beispiele, in denen - exemplarisch - mehrere Aus- führungsbeispiele sowie Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung dargestellt sind.
Fig. 1 zeigt drei Absorptionsspektren von DNA nach der Isolierung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei drei Testversuchen gemäß Beispiel 1
Fig. 2 zeigt drei Absorptionsspektren von DNA nach der Isolierung bei drei Ver- gleichsversuchen gemäß Beispiel 1
Die Erfindung wird nachfolgend ebenfalls anhand von Beispielen erläutert. Es versteht sich, dass diese rein illustrativ zu betrachten sind und keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung darstellen sollen, welche ausschließlich durch die Ansprüche festgelegt wird.
Beispiel 1 : Verbesserung der DNA-Qualität bei Isolierung aus Speichel
Für diesen Versuch wird eine humane Speichelprobe gesammelt. Vor der Sammlung hat der Proband für Ih weder gegessen noch getrunken um Verunreinigungen der Speichelprobe mit Nahrungsresten zu vermeiden. Während des Sammelvorgangs wird die Probe auf Eis gelagert. Im Anschluss wird die Probe jeweils in 200μl Aliquots aufgeteilt und jedes Aliquot mit ImI der Speichelstabilisierungslö- sung RNAprotect Saliva der Firma QIAGEN vermischt und für 2 Tage bei 2-8°C im Kühlschrank gelagert. Für die folgende Isolierung von DNA und RNA aus den stabilisierten Speichelproben werden der Komponenten des QIAamp Mini Kits und des RNeasy Micro Kits des Herstellers QIAGEN verwendet. Im Anschluss an die Lagerung werden die Proben laut Angaben des Herstellers für 10 min bei lOOOOrpm abzentrifugiert, der Überstand durch Abpippetieren abgenommen und das Pellet durch Anschnippen des Gefäßes etwas gelöst. Das Pellet wird dann in 350μl des GTC-haltigen Lysepuffers RLT durch Vortexen gelöst. Das Lysat wird auf die Silikamembran, in der QIAamp Mini-Säule aufgetragen und durch Zentrifugation für 1 min bei lOOOOrpm durch die Membran geführt.
Während die QIAamp Mini-Säule zur DNA-Isolierung verwendet wird, wird der Durchfluss mit 350μl 70% Ethanol vermischt und zur RNA-Isolierung auf eine zweite Silikamembran in der RNeasy Micro-Säule aufgetragen, und die RNA laut Angaben des Herstellers isoliert. Die RNA wurde in allen Fällen mittels quantitativer Real-time RT-PCR mit Hilfe des QuantiTect OneStep RT-PCR Kits und Primer und Probe zum Nachweis des Aktin ß-Transkriptes analysiert. Jede Probe wird in Doppelbestimmung analysiert. Der Mittelwert der Doppelbestimmungen der jeweils drei Proben ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Das Ergebnis zeigt, dass alle Proben einen vergleichbaren et- Wert aufweisen, woraus zu schließen ist, dass alle Aliquots der ursprünglichen Speichelprobe bzgl. ihrer Nukleinsäuren vergleichbar sind.
Anschließend wird die QIAamp-Säule zur Isolierung der DNA verwendet.
Für die Proben la-c wird hierzu die Membran durch die Durchführung von 350μl des Guanidin-Hydrochlorid-haltigen Waschpuffers AWl gewaschen. Jeweils 25μl der im QIAamp Mini Kit enthaltenden Proteinase K-Lösung werden auf ein Ge- samtvolumen von 80μl mit Wasser aufgefüllt und auf die Membran aufgetragen. Nach einer 10 minütigen Inkubation bei 56°C wird der Waschschritt mit AWl wiederholt und im Anschluss mit dem alkoholhaltigen Waschpuffer AW2 gewaschen. Die Membran wird durch eine 2 minütige Zentrifugation bei 14000rpm getrocknet. Die DNA wird durch Auftrag von lOOμl Wasser und anschließender Zentrifugation eluiert, wobei die Elution mit weiteren lOOμl wiederholt wird.
Bei den Proben 2a-c entfällt die Proteinase-Anwendung. Die Säule wird mit 500μl AWl und direkt im Anschluss mit AW2 gewaschen und dann wie bei den Proben la-c getrocknet und die DNA eluiert. Die Qualität der DNA wird durch Erstellung eines Absorptionsspektrums ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt. Dabei zeigt Fig. 1 die Absorptionsspektren der Proben Ia-Ic; Fig. 2 die Absorptionsspektren der Vergleichsproben 2a- 2c ohne Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die DNA-Isolierung ohne Protease (Fig. 2, Proben 2a-c) zeigt sehr hohe Absorptionen im Bereich kleiner als 250nm, welche auf Verunreinigungen zurückzuführen sind. Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens isolierte DNA (Fig.l, Proben la-c) ist von deutlich besserer Qualität, da der Bereich von kleiner als 240nm nur eine deutlich geringere Absorption und somit eine geringere Verunreinigung aufweist. Außerdem ist eine Kurve mit einem Maximum bei 260nm zu erkennen, welche auf die Absorption durch die isolierte DNA zurückzuführen ist. (maximale Absorption von DNA liegt bei 260nm).
Beispiel 2: Verbesserung der DNA-Ausbeute
Eine Speichelprobe wird wie in Beispiel 1 beschrieben gesammelt, aliquotiert, stabilisiert, für 3 Tage bei 2-8°C im Kühlschrank gelagert und zur RNA- und DNA-Isolierung verwendet. Die DNA wurde in 2x 40μl Wasser eluiert. Die Pro- ben 4a-c wurden dabei für die DNA-Isolierung mit Proteinase K- Verdau auf der Membran gemäß der Erfindung verwendet, die Proben 5a-c wurden dem gleichen Verfahren ohne Proteinase- K-Einsatz unterzogen.
Zum Vergleich wird die DNA aus Speichelproben mit Hilfe einer Methode, wel- che einen Proteinase K- Verdau in Lösung beinhaltet durchgeführt. Dafür wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, Speichel gesammelt, stabilisiert, gelagert und ab- zentrifugiert (Proben 6a-c). Nach Abnahme des Überstandes wird zum Waschen der Proben ImI PBS auf die Pellets gegeben und durch Vortexen gemischt. Die Proben werden durch 2 minütige Zentrifugation bei lOOOrpm erneut pelletiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wird dann in 180μl PBS gelöst, mit 25 μl der Proteinase K-Lösung aus dem QIAamp Mini Kit (QIAGEN) sowie 200μl des Puffers AL versetzt und durch Vortexen vermischt. Die Proben werden für 10 min bei 56°C inkubiert. Anschließend wird jede Probe mit jeweils 200μl 100% Ethanol vermischt und auf die in der QIAamp Mini-Säule befindliche Silikamembran aufgetragen. Die weitere DNA-Isolierung erfolgt wie für die Proben 2a-c im Beispiel 1 beschrieben.
Die RNA wurde in allen Fällen mittels quantitativer Real-time RT-PCR mit Hilfe des QuantiTect OneStep RT-PCR Kits und Primer und Probe zum Nachweis des Interleuking-8-Transkriptes analysiert, wobei alle Proben vergleichbare Ergebnisse zeigten, so dass von vergleichbaren NA-Gehalt der Proben auszugehen ist (Da- ten nicht gezeigt).
Die DNA- Ausbeute wurde durch Messung der Absorption bei 260nm bestimmt. Die Mittelwerte der Ausbeuten der Proben 4, 5 und 6 (a bis c) sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Figure imgf000019_0001
Die Ergebnisse zeigen, dass bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich höhere DNA-Ausbeuten zu erzielen sind.
Beispiel 3 : Downstream- Analyse der isolierten DNA
Die DNA-Proben aus Beispiel 1 wurden zur weiteren Analyse mittels quantitativer Real-Time-PCR eingesetzt. Zusätzlich zu den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Proben wurde von der Speichelprobe aus Beispiel 1 eine DNA- Isolierung als Kontrolle durchgeführt (= Probe 3a-c), wie in Beispiel 2 für die Proben 6a-c beschrieben.
Die so isolierte DNA wurde jeweils in Doppelbestimmung für den Nachweis des für die 18SrRNA kodierenden Gens verwendet. Von den Proben 1 bis 3 wurden jeweils 2 μl eingesetzt, die Eluate der Proben 4 bis 6 wurden 1:10 mit Wasser verdünnt und davon jeweils 2μl eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 25 μl mit einem geeigneten Mastermix zur Real-Time-PCR, wie z.B. dem QuantiTect SYBRGreen PCR- Kit der Firma QIAGEN, laut Angaben des Herstellers. Die Amplifikation erfolgt in einem geeigneten Real-Time- Amplifikations gerät, wie z. B. dem 7700 der Firma ABI. Aus den ermittelten ct- Werten werden die Mittelwerte über die Doppelbestimmungen er jeweils drei Replikate a bis c und die Standartabweichung ermittelt. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Figure imgf000021_0001
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass ohne Proteinase-Einsatz deutlich schlechtere Ergebnisse in der PCR zu beobachten sind, der erfindungsgemäße Einsatz der Proteinase K aber vergleichbar gute Ergebnisse erbringt, wie ein Proteinase K- Ansatz in Lösung.
Beispiel 4: Verbesserung der RNA- Isolierung aus Speichel
Für diesen Versuch werden zwei humane Speichelproben gesammelt, wie in Beispiel 1 beschreiben. Im Anschluss werden die Proben in jeweils 800μl Aliquots aufgeteilt und jedes Aliquot mit 4ml der Speichelstabilisierungslösung RNApro- tect Saliva der Firma QIAGEN vermischt und für einen Tag bei 2-8°C im Kühlschrank gelagert. Für die folgende Isolierung von RNA aus den stabilisierten Speichelproben werden die Komponenten des RNeasy Micro Kits des Herstellers QIAGEN verwendet.
Im Anschluss an die Lagerung werden die Proben laut Angaben des Herstellers für 10 min bei lOOOOrpm abzentrifugiert, der Überstand durch Abpippetieren abgenommen und das Pellet durch Anschnippen des Gefäßes etwas gelöst. Das PeI- let wird dann in 350μl des GTC-haltigen Lysepuffers RLT durch Vortexen gelöst. Das Lysat wird mit 350μl 70% Ethanol vermischt, auf die Silikamembran in der RNeasy Micro-Säule aufgetragen und durch Zentrifugation für 1 min bei lOOOOrpm durch die Membran geführt.
Von jeder Speichelprobe wird ein Aliquot (A) zur RNA-Isolierung laut Angaben des Herstellers verwendet. Das jeweils andere Aliquot (B) wird zur RNA- Isolierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt. Hierzu wird die die Membran durch die Durchführung von 350μl des Guanidin-Hydrochlorid- haltigen Waschpuffers RWl gewaschen. Jeweils 20μl Proteinase K-Lösung wer- den auf ein Gesamtvolumen von 80μl mit Wasser aufgefüllt und auf die Membran aufgetragen. Nach einer 10 minütigen Inkubation bei 56°C wird ein Waschschritt mit einem Gemisch aus gleichen Anteilen des Lysepuffers RLT und 70% Ethanol durchgeführt. Im Anschluss wird die Waschung mit RWl wiederholt und dann mit dem alkoholhaltigen Waschpuffer RPE gewaschen. Nach einer weiteren Wa- schung der Membran mit 80%igen Ethanol wird die Membran durch eine 5 minü- tige Zentrifugation bei 14000rpm getrocknet. Die RNA wird durch Auftrag von 14μl Wasser und anschließender Zentrifugation eluiert. Die so isolierte RNA wurde in allen Fällen mittels quantitativer Real-Time-PCR mit Hilfe des QuantiTect OneStep RT-PCR Kits und Primer und Probe zum Nachweis des IL8-Transkriptes in Dreifachbestimmung analysiert. Hier wurden jeweils 2,5μl der Eluate in einem Gesamtvolumen von 25μl eingesetzt. Die erzielten Mittelwerte und Standardabweichungen der Dreifachbestimmungen der Proben sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Figure imgf000023_0001
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass auch bei der Isolierung von RNA aus proteinreichen Proben ohne Proteinase-Einsatz deutlich schlechtere Ergebnisse in der PCR zu beobachten sind, der erfindungsgemäße Einsatz der Proteinase K aber deutlich bessere Ergebnisse erbringt. Beispiel 5: Verbesserung der Downstream- Analysen von DNA aus FFPE- Proben
Für diesen Versuch werden in Formalin- fixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeproben (FFPE-Proben) aus Ratten-Leber verwendet. Von diesen Proben werden mit Hilfe eines Microtoms Schnitte von ca.20μM Dicke hergestellt und 1 Schnitt je Probe eingesetzt. Für die folgende Isolierung von DNA aus den FFPE- Schnitten werden Komponenten des RNeasy FFPE Kit, des Allprep DNA/RNA Kit und des QIAamp Mini Kits des Herstellers QIAGEN verwendet.
Die Gewebe werden nach Angaben des Herstellers (Handbuch RNeasy FFPE Kit) entparaffiniert - durch Waschen mit 1 ml Xylol - und, nach Abzentrifugieren der Probe und Abnehmen des Überstandes, mit ImI 100% Ethanol versetzt. Nach erneutem Abzentrifugieren der Probe und Abnehmen des Überstandes werden die Proben für 10 min bei 37°C getrocknet. Anschließen werden die Proben mit 150μl des Puffers PKD sowie lOμl Proteinase K aus dem RNeasy FFPE-Kit versetzt und für 3h min bei 56°C und 15 min bei 800C inkubiert. Nach Zugabe von 320μl des chaotrophaltigen Lysepuffers RBC wird das so erhaltene Gemisch auf die Silika- membran in der Allprep DNA-Säule (aus dem Allprep DNA/RNA Mini Kit) aufgetragen und durch Zentrifugation für 1 min bei 14000rpm durch die Membran geführt.
Im Anschluss wird bei einer Probe (Probe 1) eine Proteinase K-Behandlung auf der Silikamembran durchgeführt, indem 20μl Proteinase K und 60μl Wasser auf die Membran aufgetragen und die Probe für 10 min bei 56°C inkubiert wird, wäh- rend die Vergleichsprobe (Probe 2) nicht mit Proteinase K behandelt wird. Die Membranen beider Proben werden dann mittels Durchführung von 500μl des Guanidin-Hydrochlorid-haltigen Waschpuffers AWl und anschließend von 500μl des dem alkoholhaltigen Waschpuffers AW2 gewaschen. Die Membran wird durch eine 2 minütige Zentrifugation bei 14000rpm getrocknet. Die DNA wird durch Auftrag von 30μl Wasser nach einminütiger Inkubation durch Zentrifugation eluiert.
Die so erhaltene DNA wird zunächst mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Hierzu werden je 5μl des erhaltenen Eluates mit 15μl Wasser verdünnt und auf einem 0,5% Agarose-TAE-Gel für ca 4h bei 60V aufgetrennt. Das mit Ethidi- umbromid angefärbte Gel zeigt in beiden Fällen fragmentierte DNA, erkennbar an einem hellen „Schmier" verteilt über einen bestimmten Größenbereicht, wobei die Vergleichsprobe (2) im Wesentlichen kleinere Fragmente enthält, als die Probe 1 nach Proteinase-Behandlung auf der Membran. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens führt somit zur Isolierung größerer DNA-Fragmente.
Die aus FFPE- Proben isolierbare DNA ist immer fragmentiert, da die DNA bereits während der Fixierung, Einbettung und Lagerung degradiert wird. Zusätzlich wird die DNA durch die Formalinfixierung mit anderen Nukleinsäuren und vor allem mit Proteinen kovalent quervernetzt, was sowohl die Isolierung der DNA, als auch die Analyse der DNA mittels Amplifikationstechniken extrem erschwert. Um nun die Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht nur auf die Isolierung der DNA, sondern auch auf die Analyse mittels Amplifikation zu untersuchen, wurden die Eluate zur weiteren Analyse mittels quantitativer Real-Time- PCR eingesetzt.
Die isolierte DNA wurde jeweils in Doppelbestimmung für den Nachweis eines 465bp großen Amplicons des für das Prionprotein kodierenden Gens verwendet. Die Eluate wurden jeweils 1 :20 mit Wasser verdünnt und 5 μl dieser Verdünnungen in die Realtime-PCR eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 25μl mit einem geeigneten Mastermix zur Real-Time-PCR, wie z.B. dem QuantiTect SYBRGreen PCR- Kit der Firma QIAGEN, laut Angaben des Herstellers. Die Amplifikation erfolgte in einem geeigneten Real-Time- Amplifikations gerät, wie z. B. dem 7700 der Firma ABI. Aus den ermittelten ct- Werten wurden die Mittelwerte über die Doppelbestimmungen der Duplikate und die Standartabweichung ermittelt. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5
Figure imgf000026_0001
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass der erfindungsgemäße Einsatz der Proteinase K deutlich bessere Ergebnisse erbringt, als ein vergleichbarer Ansatz ohne das erfindungsgemäße Verfahren. Dies ist besonders überraschend, da sowohl die
Vergleichsprobe, als auch die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Probe, zu Beginn des DNA-Isolierungsprozesses eine dreistündige Behandlung mit Proteinase K in Lösung erfahren haben. Dennoch verursacht die im Vergleich dazu sehr kurze Behandlungszeit von 15 min eine Verbesserung der DNA- Fragmentgröße und insbesondere eine Verbesserung der Amplifizierbarkeit der DNA.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Isolierung von Nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbe- sondere Nukleinsäuren aus proteinhaltigen biologischen Proben, umfassend die Schritte:
a) Immobilisierung zumindest eines Teils der in der biologischen Probe enthaltenden Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure(n) an eine feste Phase
b) enzymatischer Proteinabbau, wobei zumindest während eines Teils des Proteinabbaus die Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäure^) an die feste Phase gebunden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in der biologischen Probe das Verhältnis von Protein zu Nicht-proteinhaltigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren in g/g vor Durchführung des Verfahrens >10: l beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nicht-proteinhaltigen Biomoleküle Nukleinsäuren umfassen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die feste Phase eine
Phase mit einer hohen Nukleinsäure-Affinität ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Silikamembranen, silica-beads, magnetische Partikel, hydrophile Membranen, hydrophobe Membranen, Ionenaustauschmatrices, oder Mischungen daraus.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, zusätzlich umfassend einen Schritt al), der zwischen Schritt a) und b) durchgeführt wird:
al) Waschen der festen Phase mit einer mindestens eine chaotrope Substanz erhaltenden Lösung.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zusätzlich umfassend einen Schritt c), der nach Schritt b) durchgeführt wird:
c) Waschen der festen Phase mit einer mindestens eine chaotrope Substanz enthaltenden Lösung.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Schritt b) mit mindestens einer Protease, die eine Aktivität von >1 mAU/mg aufweist, durchge- führt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Schritt b) für einen
300 o , J , . 2600000 o , _, _, , c , Zeitraum von > ~^~ Sekunden bis < 77 Sekunden durchgeführt wird, wobei „X" der Zahlenwert der Protease- Aktivität des verwendeten Enzyms bezeichnet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Schritt b) für einen
1500 13000000 Zeitraum von > y Sekunden bis < y Sekunden durchgeführt wird, wobei „Y" den Zahlenwert der Protease-Aktivität in mAU der Lösung bedeutet, in der Schritt b) durchgeführt wird
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Schritt b) in Wasser und/oder in ungepufferten Lösungen durchgeführt wird.
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