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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Technik zur wirksamen Isolierung
von langen Nucleinsäuren und
kurzen Nucleinsäuren
aus einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und
kurzen Nucleinsäuren
durch sichere und zweckmäßige Maßnahmen.
Ferner kann die vorliegende Erfindung als eine Technik zur Isolierung
von genomischer DNA und gesamter RNA (z. B. Messenger-RNA, ribosomaler
RNA und Transfer-RNA) oder von genomischer DNA und Plasmid-DNA verwendet
werden.
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Technischer Hintergrund
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Nucleinsäuren stehen
im Zusammenhang mit genetischen Informationen in Organismen und
liegen in verschiedenen Formen vor, z. B. als genomische DNA, Plasmid-DNA,
Messenger-RNA, ribosomale
RNA und Transfer-RNA, die sich funktionell voneinander unterscheiden.
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Auf
der Grundlage der Analyse dieser Nucleinsäuren lassen sich sehr wichtige
molekularbiologische Informationen erhalten. Bei der Analyse verschiedener
Typen von Nucleinsäuren
ist es im allgemeinen bevorzugt, eine Vorbehandlung durchzuführen, die
die Isolierung von Nucleinsäuren
von Interesse aus einer biologischen Probe, die verschiedene Typen
von Nucleinsäuren
enthält,
umfasst. Beispielsweise wird bei der Messenger-RNA-Analyse zum Zweck
der Genexpressionsanalyse die gesamte RNA von genomischer DNA, die als
Inhibitor während
der Messenger-RNA-Analyse wirken kann, abgetrennt.
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Im
allgemeinen ist eine Phenol/Chloroform-Extraktion als ein Verfahren
zur Abtrennung von gesamter RNA von genomischer RNA in einer biologischen
Probe bekannt (Analytical Biochemistry, Bd. 162 (1989), S. 156–159). Dieses
Verfahren umfasst folgendes: (1) Auflösen einer biologischen Probe
in einer Lösung
von Guanidinthiocyanat und Zusetzen einer sauren Pufferlösung, einer
Phenollösung
und einer Chloroformlösung in der
angegebenen Reihenfolge, und anschließendes Mischen; (2) Trennen
des Gemisches in eine wässrige Phase
mit einem Gehalt an RNA, eine Zwischenphase und eine organische
Lösungsmittelphase
mit einem Gehalt an insolubilisierter DNA und denaturierten Proteinen
durch Zentrifugation; (3) Zusetzen von Ethanol oder Isopropanol
zur wässrigen
Phase, die RNA enthält;
und (4) selektives Ausfällen
von unsolubilisierter RNA durch Zentrifugation. Im Vergleich zu
herkömmlichen
Ultrazentrifugationsverfahren ist dieses Verfahren in bezug auf
die RNA-Isolierung wirksamer, jedoch müssen bei diesem Verfahren hochgradig
gefährliches
Phenol und Chloroform verwendet werden, was ein Problem darstellt.
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Als
Beispiele für
ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäure, bei dem nicht die Verwendung
von Phenol, Chloroform oder dergl. erforderlich ist und bei dem
keine Maßnahmen,
wie eine Ethanolfällung
oder eine Isopropanolfällung
erforderlich sind, sind Verfahren unter Ausnützen der Nucleinsäure-Bindungseigenschaften
an einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid in Gegenwart
eines chaotropen Mittels bekannt (B. Vogelstein und D. Gillespie,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (2) (1979), S. 615–619; R.
Boom et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 28 (3) (1990), S. 495–503). Ferner
werden Verfahren zur DNA- und RNA-Isolierung, bei denen das letztgenannte
Verfahren angewandt wird, beschrieben (JP-Patentveröffentlichungen
(Kokai) Nr. 2004-340839 A, Nr. 2002-187897 A, Nr. 2000-505295 A,
Nr. 2002-534080 A und Nr. 2004-201607 A). Jedoch führen derartige
Verfahren zu einer unzureichenden DNA- und RNA-Trennung, so dass die isolierte RNA
eine vorgegebene Menge an DNA enthält.
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Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, in wirksamer Weise lange
Nucleinsäuren
und kurze Nucleinsäuren
aus einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und
kurzen Nucleinsäuren
durch sichere und zweckmäßige Maßnahmen
zu isolieren.
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Als
Ergebnis eingehender Untersuchungen mit dem Ziel zur Lösung der
vorstehenden Aufgabe haben die Erfinder festgestellt, dass dann,
wenn ein Lösungsgemisch
aus einem chaotropen Mittel und einer Probe mit einem Gehalt an
langen Nucleinsäuren
und kurzen Nucleinsäuren
mindestens zweimal über
eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid (Silica) gegeben
wird, das Flüssigkeits-Durchgangsporen
mit Porengrößen aufweist,
die zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit langen Nucleinsäuren und
einem geringen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führen, die
langen Nucleinsäuren
selektiv und in wirksamer Weise sich so an die feste Phase mit einem
Gehalt an Siliciumdioxid binden lassen, dass sie von den kurzen
Nucleinsäuren
getrennt werden.
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Speziell
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung,
das folgende Stufen umfasst:
man vermischt ein chaotropes Mittel
mit einer Probe, die lange Nucleinsäuren und kurze Nucleinsäuren enthält;
man
lässt das
Lösungs
gemisch mindestens zweimal durch eine erste feste Phase, die Siliciumdioxid
mit Durchgangsporen von vorgegebenen Porengrößen enthält, laufen;
man lässt das
Lösungsgemisch
mindestens zweimal durch eine zweite feste Phase, die Siliciumdioxid
mit Durchgangsporen mit Porengrößen, die
kleiner als die der ersten festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
sind, laufen; und
man gewinnt getrennt Nucleinsäuren, die
an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden
sind, und solche, die an die zweite feste Phase mit einem Gehalt
an Siliciumdioxid gebunden sind.
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Beim
vorerwähnten
Verfahren lässt
man vorzugsweise das Lösungsgemisch
mindestens zweimal durch die erste und die zweite feste Phase mit
einem Gehalt an Siliciumdioxid in beiden Richtungen in bezug auf
die festen Phasen mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen (z.
B. in Aufwärts-
und Abwärtsrichtung).
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Beim
erfindungsgemäßen Verfahren
handelt es sich bei Nucleinsäuren,
die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
finden, um lange Nucleinsäuren,
die aus mindestens 20 000 und vorzugsweise mindestens 50 000 Desoxyribonucleotiden
oder Ribonucleotiden zusammengesetzt sind, und bei Nucleinsäuren, die
an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden
sind, um kurze Nucleinsäuren,
die aus höchstens
10 000 und vorzugsweise höchstens
5 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt
sind.
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In
einem derartigen Fall weisen die Durchgangsporen der ersten festen
Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid Porengrößen von 20 bis 25 μm auf. Gleichzeitig
wiesen die Durchgangsporen der zweiten festen Phase mit einem Gehalt
an Siliciumdioxid vorzugsweise Porengrößen von 0,1 bis 10 μm auf.
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Bei
einer Ausführungsform
handelt es sich bei Nucleinsäuren,
die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
binden, um genomische DNA und bei Nucleinsäuren, die an die zweite feste
Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um RNA. Alternativ
handelt es sich bei Nucleinsäuren,
die an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
binden, um genomische DNA und bei Nucleinsäuren, die an die zweite feste
Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden, um Plasmid-DNA.
Somit können
gesamte RNA, Plasmid-DNA oder genomische DNA in selektiver und wirksamer
Weise auf einer biologischen Probe isoliert werden.
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Ferner
wird eine Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung bereitgestellt,
die im erfindungsgemäßen Verfahren
zur Nucleinsäure-Isolierung
verwendet wird. Die Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung ist mit einer
festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid und einer Durchgangsöffnung,
durch die das Lösungsgemisch
aus einer Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren und einem chaotropen Mittel
angesaugt und abgegeben wird, ausgestattet. Das Lösungsgemisch
wird durch Drucksteuerung von der Durchgangsöffnung angesaugt oder daraus
abgegeben. Somit wird das Lösungsgemisch
zwischen Räumen,
die durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid getrennt
sind, transportiert, so dass man das Lösungsgemisch mindestens zweimal
durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen
lässt.
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Ferner
wird ein Kit zur Nucleinsäure-Isolierung bereitgestellt,
das eine Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung und mindestens
ein Element umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem chaotropen
Mittel, einem organischen Lösungsmittel,
einem Waschreagenz und einem Elutionsreagenz besteht.
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Zu
Beispielen für
ein chaotropes Mittel, das verwendet werden kann, gehören Guanidinthiocyanat,
Natriumthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Natriumiodid und Kaliumiodid.
Zu Beispielen für
ein organisches Lösungsmittel,
das verwendet werden kann, gehören
Ethanol und Diethylenglycoldimethylether.
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Erfindungsgemäß können lange
Nucleinsäuren
und kurze Nucleinsäuren
in wirksamer Weise aus einer Probe mit einem Gehalt an langen Nucleinsäuren und
kurzen Nucleinsäuren
durch sichere und zweckmäßige Maßnahmen
isoliert werden. Somit können
beispielsweise genomische DNA und gesamte RNA (Messenger-RNA, ribosomale
RNA oder Transfer-RNA) oder genomische DNA und Plasmid-DNA in wirksamer
Weise getrennt werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
in schematischer Weise eine Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung.
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2 zeigt
die Beziehungen zwischen der Anzahl der Passagen und der Nucleinsäure-Gewinnungsraten
für Kombinationen
aus Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung
und Nucleinsäureproben.
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3 zeigt
die Ergebnisse einer Elektrophorese von Nucleinsäuren, die unter Verwendung
einer Vorrichtung für
die Isolierung von langen Nucleinsäuren und einer Vorrichtung
für die
Isolierung von kurzen Nucleinsäuren
isoliert worden sind.
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Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung,
wobei Nucleinsäuren
in wirksamer Weise je nach ihrer Länge (lange Nucleinsäuren und
kurze Nucleinsäuren)
isoliert werden. Erfindungsgemäß wird eine
Probe mit einem Gehalt an zu isolierenden Nucleinsäuren mit
einem chaotropen Mittel vermischt. Anschließend lässt man das Lösungsgemisch
mindestens zweimal durch eine erste feste Phase mit einem Gehalt
an Siliciumdioxid (Silica) laufen, das Durchgangsöffnungen
mit Porengrößen aufweist,
die einen hohen Kontaktwirkungsgrad mit langen Nucleinsäuren und
einen geringen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren ergeben,
so dass lange Nucleinsäuren
selektiv und in wirksamer Weise an die erste feste Phase mit einem
Gehalt an Siliciumdioxid binden. Anschließend lässt man das Lösungsgemisch,
das die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid durchlaufen
hat, mindestens zweimal durch eine zweite feste Phase laufen, das
Siliciumdioxid enthält,
das Durchgangsporen mit Porengrößen aufweist,
die zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führen, so
dass kurze Nucleinsäuren
an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid binden.
Somit werden Nucleinsäuren,
die an die erste und an die zweite feste Phase mit einem Gehalt
an Siliciumdioxid gebunden sind, separat unter Verwendung von Elutionsreagenzien
gewonnen, so dass lange Nucleinsäuren
und kurze Nucleinsäuren
in wirksamer Weise isoliert werden können.
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Proben
(insbesondere biologische Proben) mit einem Gehalt an Nucleinsäuren, die
für die
vorliegende Erfindung eingesetzt werden, enthalten zwei oder mehr
Typen von Nucleinsäuren
mit unterschiedlichen Längen
(lange Nucleinsäuren
und kurze Nucleinsäuren).
Zu Beispielen hierfür
gehören
Blut, biologisches Gewebe, gezüchtete
Zellen und Bakterien. Ferner bedeutet der Ausdruck "Nucleinsäure" ein kettenförmiges Polymeres,
das aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt
ist, die über
Phosphodiester-Bindungen
aneinander gebunden sind, sowie einen Komplex, der derartige Polymere
umfasst, die aneinander über
Wasserstoffbrückenbindungen
oder dergl. gebunden sind. Ferner können derartige Nucleinsäuren einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein.
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Erfindungsgemäß sind lange
Nucleinsäuren,
die man an die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
binden lässt,
vorzugsweise aus mindestens 20 000 und insbesondere aus mindestens
50 000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt.
Beispielsweise können
genomische DNA, genomische RNA, Plasmid-DNA und Nucleinsäuren, die
Fragmente davon darstellen, eingesetzt werden. Zu speziellen Beispielen
für lange
Nucleinsäuren,
die erfindungsgemäß eingesetzt
werden können,
gehören
genomische DNA mit Längen
von vorzugsweise mindestens 10 kb und insbesondere mindestens 25
kb und genomische RNA mit Längen
von vorzugsweise mindestens 20 kb und insbesondere mit mindestens
50 kb.
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Ferner
sind kurze Nucleinsäuren,
die man an die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
binden lässt,
vorzugsweise aus höchstens
10 000 und insbesondere aus höchstens
5000 Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt.
Beispielsweise können
erfindungsgemäß Messenger-RNA, ribosomale
RNA, Transfer-RNA, cDNA, Plasmid-DNA
und durch PCR erhaltene amplifizierte DNA eingesetzt werden. Zu
speziellen Beispielen für
kurze Nucleinsäuren,
die erfindungsgemäß eingesetzt
werden können, gehören doppelsträngige cDNAs
mit Längen
von vorzugsweise höchstens
5 kb und insbesondere mit höchstens
2,5 kb und Messenger-RNAs mit Längen
von vorzugsweise höchstens
10 kb und insbesondere von höchstens
5 kb.
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Zu
Beispielen für
chaotrope Mittel, die einer Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren zugesetzt
werden können,
gehören
Guanidinthiocyanat, Natriumthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Natriumiodid
und Kaliumiodid. Die Konzentration des zugesetzten chaotropen Mittels
beträgt
vorzugsweise 1,0 bis 4,0 mol/Liter im Lösungsgemisch, das mit einem
organischen Lösungsmittel
versetzt worden ist (vergl. R. Boom et al., J. Clin. Microbiol.,
Bd. 28 (3) (1990), S. 495–503.
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Bei
Verwendung einer biologischen Probe können neben einem chaotropen
Mittel ferner ein oberflächenaktives
Mittel, ein Protein-Denaturierungsmittel, eine Protease oder dergl. zugesetzt
werden. Ferner ist es bevorzugt, dass das Lösungsgemisch einer physikalischen
Behandlung unter Verwendung eines Rührers, eines Homogenisators
oder dergl. unterworfen wird, was die Auflösung einer biologischen Probe
und die Freisetzung von Nucleinsäuren
fördert.
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Vorzugsweise
wird das Lösungsgemisch,
das eine Probe mit einem Gehalt an Nucleinsäuren und ein chaotropes Mittel
enthält,
mit einem organischen Lösungsmittel
versetzt, um die Bindung von Nucleinsäuren an eine feste Phase mit
einem Gehalt an Siliciumdioxid zu fördern.
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Zu
Beispielen für
ein organisches Lösungsmittel,
das verwendet werden kann, gehören
eine Kombination aus einer oder mehreren Verbindungen, die aus der
Gruppe ausgewählt
sind, die aus aliphatischen Alkoholen, aliphatischen Ethern, aliphatischen
Estern und aliphatischen Ketonen besteht.
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Zu
Beispielen für
aliphatische Alkohole, die verwendet werden können, gehören Methanol, Ethanol, 2-Propanol,
2-Butanol und Polyethylenglycol.
Zu Beispielen für
aliphatische Ether, die verwendet werden können, gehören Diethylenglycoldimethylether,
Diethylenglycoldiethylether, Ethylenglycoldimethylether, Ethylenglycoldiethylether,
Propylenglycoldimethylether, Propylenglycoldiethylether und Tetrahydrofuran.
Zu Beispielen für
aliphatische Ester, die verwendet werden können, gehören Ethyllactat und Propylenglycolmonomethyletheracetat.
Zu Beispielen für
aliphatische Ketone, die verwendet werden können, gehören Aceton, Hydroxyaceton und
Methylketon. Insbesondere werden Ethanol, Diethylenglycoldimethylether
und dergl. bevorzugt.
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Die
erfindungsgemäß verwendete
feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid umfasst eine Silica-Verbindung
mit einem Gehalt an Siliciumdioxid. Zu Beispielen für eine derartige
Silica-Verbindung gehören Glasteilchen
(feine Teilchen), Silica-Teilchen (feine Teilchen), Glasfasern,
Silicafasern, Diatomeenerde und Zerkleinerungsprodukte davon. Die
silicahaltige feste Phase weist eine Mehrzahl von Durchgangsporen
auf, durch die eine Lösung
laufen kann. Sofern die feste, silicahaltige Phase auf die vorstehend
beschriebene Weise gebildet worden ist, kann sie in Form einer Scheibe,
von Fasern oder eines Aggregats von Teilchen vorliegen, wobei aber
keine spezielle Beschränkung
hierauf besteht.
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Vorzugsweise
weist die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid-Durchgangsporen
mit Porengrößen von
20 bis 25 μm
auf, was zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit langen Nucleinsäuren und einem
geringen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führt. Der Grund hierfür ist, dass
dann, wenn die Porengrößen unter
diesem Bereich liegen, der Kontaktwirkungsgrad der festen Phasen
mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mit kurzen Nucleinsäuren so
zunimmt, dass kurze Säuren
daran binden, während
andererseits dann, wenn die Porengrößen über diesem Bereich liegen,
der Kontaktwirkungsgrad der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
mit langen Nucleinsäuren
abnimmt, so dass die Menge an langen Nucleinsäuren, die daran binden, abnimmt.
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Das
Lösungsgemisch
muss die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mindestens
zweimal passieren. Der Grund hierfür ist, dass eine einzige Passage
des Lösungsgemisches
zu einem geringen Bindungswirkungsgrad der langen Nucleinsäuren an
der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid führt, so
dass keine ausreichende Menge an langen Nucleinsäuren gewonnen werden kann.
Ferner steigt bei zunehmender Zahl der Flüssigkeitspassagen durch die
erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid die Menge an
langen Nucleinsäuren,
die daran binden; jedoch nimmt die Menge an kurzen Nucleinsäuren, die daran
binden, nicht erheblich zu. Wenn man somit das Lösungsgemisch mindestens zweimal
durch die erste feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen
lässt,
wird es möglich,
in selektiver Weise die Menge an langen Nucleinsäuren, die daran binden, zu
erhöhen,
so dass die Ausbeute an langen Nucleinsäuren verbessert wird.
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Dagegen
weist die zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
vorzugsweise Durchgangsporen mit Porengrößen von 0,1 bis 10 μm auf, was
zu einem hohen Kontaktwirkungsgrad mit kurzen Nucleinsäuren führt. Um
den Bindungswirkungsgrad der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
mit kurzen Nucleinsäuren
zu verbessern, ist es bevorzugt, die Anzahl der Passagen des Lösungsgemisches
durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid zu erhöhen und
die Größen der
Durchgangsporen innerhalb eines Bereiches, der sich für die Größen der
Nucleinsäuren
eignet, zu verringern.
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Die
vorerwähnte
erste und zweite feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
werden an einem einzigen oder an verschiedenen Hohlelementen, wie
Spitzen, Spritzen und Säulen,
immobilisiert. Ein derartiges Element ist mit einer Durchgangsöffnung ausgestattet,
durch die das Lösungsgemisch
angesaugt und abgegeben wird, sowie mit einer Verbindungsöffnung,
an die ein Drucksteuerelement oder dergl. zur Drucksteuerung des
Hohlraums angeschlossen ist, und mit einer festen Phase mit einem
Gehalt an Siliciumdioxid, die sich im Hohlraum befindet. Das Element
ist so konstruiert, dass der Hohlraum unter Verwendung eines Drucksteuerinstruments,
das an die Verbindungsöffnung
angeschlossen ist, einem Druckabbau oder einer Druckerhöhung unterzogen
wird; das Lösungsgemisch
durch die Durchgangsöffnung
angesaugt oder abgegeben wird; und das Lösungsgemisch zwischen Räumen, die
durch die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid voneinander
getrennt sind, transportiert wird, so dass es mindestens zweimal
die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert.
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Beispielsweise
laufen im Fall einer Spitze, an der eine feste Phase mit einem Gehalt
an Siliciumdioxid immobilisiert ist, folgende Vorgänge ab:
Der Innenraum der Spitze wird unter Verwendung einer Spritze oder einer
Pipette, die an die Verbindungsöffnung
angeschlossen ist, einem Druckabbau unterworfen; das Lösungsgemisch
wird angesaugt, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
passiert; der Innenraum der Spitze wird unter Druck gesetzt; und
das Lösungsgemisch
wird abgegeben, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
passiert. Diese Stufen werden wiederholt, so dass das Lösungsgemisch mindestens
zweimal die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert.
Ferner ist es vor Anschluss eines Drucksteuerinstruments möglich, eine
Flüssigkeit über die
Verbindungsöffnung zuzuführen. Somit
ist es nach Zuführen
einer Flüssigkeit
möglich,
ein Drucksteuerelement an die Spitze anzuschließen, um die Flüssigkeit über die
Durchgangsöffnung
abzugeben.
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Ferner
laufen im Fall einer Spritze, an der die feste Phase mit einem Gehalt
an Siliciumdioxid immobilisiert worden ist, folgende Vorgänge ab:
der Innenraum der Spritze wird unter Verwendung eines Kolbens, der
vorher an einer Verbindungsöffnung
vorgesehen worden ist, einem Druckabbau unterzogen; das Lösungsgemisch
wird angesaugt, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
passiert; der Innenraum der Spritze wird unter Druck gesetzt; und
das Lösungsgemisch
wird abgegeben, so dass es die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
passiert. Diese Stufen werden wiederholt, so dass das Lösungsgemisch
mindestens zweimal die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
passiert.
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Ähnliche
Stufen können
im Fall einer Zentrifugiersäule,
in der die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid immobilisiert
worden ist, durchgeführt
werden. Beispielsweise können
unter Verwendung einer derartigen Zentrifugiersäule gemäß bekannten Zentrifugiersäulensystemen
folgende Vorgänge
ablaufen: man führt
das Lösungsgemisch
in die Zentrifugiersäule
ein und lässt
das Lösungsgemisch
aufgrund von Zentrifugalkraft durch die feste Phase mit einem Gehalt
an Siliciumdioxid laufen. Ferner wird das Lösungsgemisch, das die feste
Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert hat, erneut in
die Zentrifugiersäule
eingeführt, so
dass das Lösungsgemisch
mindestens zweimal die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
passiert.
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Verunreinigungen
in jeder festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid, an die
Nucleinsäuren
gebunden sind, werden entfernt, indem man ein Waschreagenz durch
die feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen lässt. Ein
derartiges Waschreagenz muss die Aufrechterhaltung der Bindung zwischen
Nucleinsäuren
und der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gewährleisten
und Verunreinigungen, die an der festen Phase mit einem Gehalt an
Siliciumdioxid gebunden sind, entfernen. Beispielsweise können eine wässrige Lösung mit
einem Gehalt an 80 % (Vol./Vol.) Ethanol und eine Pufferlösung mit
einem Gehalt an 80 % (Vol./Vol.) Ethanol mit einer geringen Salzkonzentration
verwendet werden.
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Anschließend lässt man
nach dem Waschen ein Elutionsreagenz durch jede feste Phase mit
einem Gehalt an Siliciumdioxid laufen, so dass Nucleinsäuren, die
an der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid gebunden
sind, eluiert werden. Ein derartiges Elutionsreagenz muss zur Elution
von Nucleinsäuren
in der Lage sein, die von der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
eluiert werden sollen. Beispielsweise können nucleasefreies Wasser
und eine nucleasefreie Pufferlösung
mit einer geringen Salzkonzentration verwendet werden.
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Erfindungsgemäß werden
die vorerwähnten
Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung
und Kits zur Nucleinsäure-Isolierung, die diese
Vorrichtungen enthalten, bereitgestellt. Derartige Kits können Vorrichtungen zur
Nucleinsäure-Isolierung
und mindestens ein Element aus der Gruppe, das aus einem chaotropen
Mittel, einem organischen Lösungsmittel,
einem Waschreagenz und einem Elutionsreagenz gemäß den vorstehenden Ausführungen
besteht, enthalten. Ferner können
die vorerwähnten
Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung (Verwendung
von Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung), die
Handhabung der Reagenzien und dergl. auf der Packung oder in der
Packungsbeilage des Kits je nach Bedarf beschrieben werden.
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Beispiele
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Die
Konzentrationsangaben mM und M beziehen sich auf mMol/l und Mol/l.
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Bezugnahme auf
die folgenden Beispiele beschrieben, obgleich der technische Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung nicht hierauf beschränkt ist.
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[A] Proben, Reagenzien und Vorrichtungen
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1. Proben
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1.1. Lange Nucleinsäüre
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Genomische
DNA (ein isoliertes Produkt aus humanem Blut unter Verwendung eines
QIAamp DNA Blood Mini Kits)
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1.2 Kurze Nucleinsäure
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- pBR322DNA (Länge:
4361 bp) (MBI Fermentas)
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1.3 Biologische Probe
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- humanes Blut (unter Zugabe des Antikoagulationsmittels EDTA-2Na)
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2. Reagenzien
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2.1. Reagenz zur Lysis von roten Blutkörperchen
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- 155 mM NH4Cl
- 10 mM KHCO3
- 0,1 mM EDTA-2Na
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2.2 Chaotropes Reagenz A
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- 6 M Guanidinhydrochlorid
- 50 mM MES
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2.3 Chaotropes Reagenz B
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- 4 M Guanidinthiocyanat
- 25 mM Natriumcitrat (pH 7,5)
- 1 % β-Mercaptoethanol
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2.4 Organisches Lösungsmittel A
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2.5 Organisches Lösungsmittel B
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- 40 %-ige (Vol./Vol.) wässrige
Lösung
von Diethylenglycoldimethylether
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2.6 Waschreagenz
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- 80 %-ige (Vol./Vol.) wässrige
Ethanollösung
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2.7 Elutionsreagenz A
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- TE (pH-Wert 8,0) (Wako Pure Chemical)
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2.8 Elutionsreagenz B
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- H2O (nucleasefrei) (Wako Pure Chemical)
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3. Vorrichtungen für die Isolierung von langen
Nucleinsäuren
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3.1 Feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
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- Ein Glasfaserfilter (Standard 14) (Porengröße: etwa
23 μm) (Whatman)
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3.2 Element zum Halten einer festen Phase
mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
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- Sinterplatte aus Polypropylen-Teilchen (Porengröße: etwa
100 μm)
(Dicke: 1,5 mm)
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3.3 Vorrichtung für die RNA-Isolierung
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1 zeigt
ein Beispiel für
den Aufbau einer Vorrichtung für
die Isolierung von langen Nucleinsäuren. Die Vorrichtung 10 zur
Nucleinsäure-Isolierung
hat das Aussehen einer Pipettenspitze. Die Vorrichtung ist mit einer
Durchgangsöffnung 12,
durch die ein Lösungsgemisch
angesaugt und abgegeben wird, und einer Verbindungsöffnung 11,
an die ein Drucksteuerelement, das den Innenraum der Spitze einem
Druckabbau oder Druckaufbau unterzieht, angeschlossen ist, versehen.
Ferner nimmt die Vorrichtung eine feste Phase mit einem Gehalt an
Siliciumdioxid 13 in ihrem Innenraum auf. Auf jeder Seite
der festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid ist ein scheibenförmiges Element 14 zum
Halten einer festen Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid angeschlossen.
Diese Elemente, die eine feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
halten, weisen eine Anzahl von Poren auf, durch die Flüssigkeit
und Gas passieren. Wenn sich in dieser Vorrichtung ein Spitzenbereich
der Durchgangsöffnung
in Kontakt mit Flüssigkeit
befindet, wird ein Hohlraum unter Verwendung einer Drucksteuervorrichtung,
die an die Verbindungsöffnung
angeschlossen ist, einem Druckabbau oder Druckaufbau unterzogen,
so dass Flüssigkeit
durch die Durchgangsöffnung
angesaugt oder abgegeben werden kann, so dass diese die feste Phase
mit einem Gehalt an Siliciumdioxid passiert. Ferner ist es möglich, vor
dem Anschließen
einer derartigen Drucksteuervorrichtung Flüssigkeit durch die Verbindungsöffnung zuzuführen. In
einem solchen Fall wird eine Drucksteuervorrichtung nach der Zufuhr
der Flüssigkeit
angeschlossen, so dass die Flüssigkeit
durch die Durchgangsöffnung
abgegeben werden kann. In den Beispielen wurde eine feste Phase
mit einem Gehalt an Siliciumdioxid, die zu einer scheibenförmigen Gestalt
mit einem Durchmesser von 4,2 mm zugeschnitten worden war, verwendet
und sandwichartig zwischen zwei Elementen zum Halten einer festen
Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid mit einem Durchmesser von
4,1 mm angeordnet, so dass ein Presssitz in einem Hohlraum mit einem
Innendurchmesser von 4 mm erreicht wurde.
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4. Vorrichtung für die Isolierung von kurzen
Nucleinsäuren
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4.1 Feste Phase mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
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- Glasfaserfilter (GF/D) (Porengröße: etwa 2,7 μm) (Whatman)
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4.2 Element zum Halten einer festen Phase
mit einem Gehalt an Siliciumdioxid
-
- Sinterplatte aus Polypropylen-Teilchen (Porengröße: etwa
100 μm)
(Dicke: 1,5 mm)
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4.3 Vorrichtung zur RNA-Isolierung
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- Eine Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren weist
eine eine ähnliche
Struktur wie eine Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren auf.
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[B] Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung
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1. Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung
aus einer Nucleinsäure-Lösung
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- (1) Eine TE-Lösung (10 μl) mit einem Gehalt an 1 μg einer Nucleinsäureprobe
wird hergestellt.
- (2) Ein chaotropes Reagenz A (0,3 ml) wird zugegeben. Anschließend wird
vermischt.
- (3) Ein organisches Lösungsmittel
A (0,3 ml) wird zugegeben. Anschließend wird vermischt.
- (4) Eine Spritze wird an einer Verbindungsöffnung einer Vorrichtung zur
Nucleinsäure-Isolierung
angebracht. Das Lösungsgemisch
wird wiederholt für
eine vorgegebene Anzahl von Vorgängen
durch die Durchgangsöffnung
der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
angesaugt und abgegeben. Es ist darauf hinzuweisen, dass im Fall
einer einzigen Flüssigkeitspassage
das Lösungsgemisch
durch die Verbindungsöffnung
zugeführt
wird, bevor die Spritze angebracht wird, so dass die Lösung durch
die Durchgangsöffnung abgegeben
werden kann.
- (5) Ein Waschreagenz (1 ml) wird einmal durch die Durchgangsöffnung der
Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
angesaugt und abgegeben.
- (6) Die Stufe (5) wird 3-mal wiederholt, so dass das Waschreagenz
vollständig
abgegeben wird.
- (7) Ein Elutionsreagenz A (0,05 ml) wird wiederholte Male durch
die Durchgangsöffnung
der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
10-mal angesaugt und abgegeben.
- (8) Das Elutionsreagenz wird als eine Nucleinsäure-Isolierungslösung gewonnen.
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2. Verfahren zur Nucleinsäure-Isolierung
aus Blut
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- (1) Ein Lysis-Reagenz für rote Blutkörperchen
(3 ml) wird zu 0,6 ml Vollblut gegeben. Anschließend wird vermischt.
- (2) Das Gemisch wird 5 Minuten auf Eis inkubiert.
- (3) Eine 10-minütige
Zentrifugation mit 400 x g wird durchgeführt.
- (4) Der Überstand
des erhaltenen Produkts wird entfernt.
- (5) Ein Lysis-Reagenz für
rote Blutkörperchen
(1,2 ml) wird zu den erhaltenen Pellets gegeben. Anschließend wird
vermischt.
- (6) Eine 10-minütige
Zentrifugation mit 400 x g wird durchgeführt.
- (7) Der Überstand
des erhaltenen Produkts wird entfernt, so dass ein Pellet von weißen Blutkörperchen
erhalten wird.
- (8) Ein chaotropes Reagenz B (0,3 ml) wird zu den Pellets mit
weißen
Blutkörperchen
gegeben. Anschließend
wird vermischt.
- (9) Das Lösungsgemisch
wird unter Verwendung eines Homogenisators (QIA-Zerkleinerungshomogenisator)
(QIAGEN) homogenisiert.
- (10) Ein organisches Lösungsmittel
B (0,3 ml) wird zugegeben. Anschließend wird vermischt.
- (11) Eine Spritze wird an einer Verbindungsöffnung einer Vorrichtung zur
Isolierung von langen Nucleinsäuren
angebracht. Das Lösungsgemisch
wird wiederholt durch die Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
3-mal angesaugt und abgegeben.
- (12) Ein Waschreagenz (1 ml) wird einmal durch die Durchgangsöffnung der
Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
angesaugt und abgegeben.
- (13) Die Stufe (12) wird 3-mal wiederholt, so dass das Waschreagenz
vollständig
abgegeben wird.
- (14) Ein Elutionsreagenz A (0,2 ml) wird wiederholt durch die
Durchgangsöffnung
der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung angesaugt
und abgegeben.
- (15) Das Elutionsreagenz wird in Form einer Isolierungslösung mit
langen Nucleinsäuren
gewonnen.
- (16) Eine Spritze wird an der Verbindungsöffnung der Vorrichtung für die Isolierung
von kurzen Nucleinsäuren
angebracht. Das Lösungsgemisch,
das in Stufe (11) aus der Durchgangsöffnung der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
abgegeben worden ist, wird in 10-maliger Wiederholung angesaugt
und abgegeben.
- (17) Ein Waschreagenz (1 ml) wird einmal durch die Durchgangsöffnung der
Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
angesaugt und abgegeben.
- (18) Die Stufe (17) wird 3-mal wiederholt, wobei das Waschreagenz
vollständig
abgegeben wird.
- (19) Ein Elutionsreagenz B (0,05 ml) wird in 10-maliger Wiederholung
durch die Durchgangsöffnung
der Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung
angesaugt und abgegeben.
- (20) Das Elutionsreagenz wird in Form einer Isolierungslösung mit
kurzen Nucleinsäuren
gewonnen.
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[C] Verfahren zur Bewertung von isolierten
Nucleinsäuren
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1. Quantitative Bestimmung der Nucleinsäurekonzentration
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Eine
Nucleinsäurelösung wurde
auf eine geeignete Menge verdünnt.
Die Absorption bei 260 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers
(GeneSpec I, Hitachi Naka Instrument) bestimmt. Die Absorption bei
260 nm einer DNA-Lösung (50 μg/ml) wurde
auf 1 festgelegt, so dass die DNA-Konzentration der Nucleinsäurelösung berechnet
werden konnte.
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2. Nucleinsäure-Elektrophorese
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Unter
Verwendung eines 1,25 %-igen Agarosegels (Reliant RNA Gel System,
FMC) wurde eine Elektrophorese (10 V/cm, 40 Minuten) mit einer Nucleinsäurelösung, die
einer Formamid-Denaturierung
unterworfen worden war, durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel mit Ethidiumbromid
und unter UV-Bestrahlung photographiert.
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[D] Verifikationsexperiment 1
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Genomische
DNA wurde als Probe von langen Nucleinsäuren und pBR322-DNA als Probe
von kurzen Nucleinsäuren
verwendet. Gemäß dem vorerwähnten Verfahren
zur Nucleinsäure-Isolierung
aus einer Nucleinsäurelösung wurde
eine Nucleinsäure-Isolierung unter
Verwendung einer Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren und
einer Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren durchgeführt. In
einer Bindungsstufe wurden die einzelnen Proben durch eine Öffnung einer
Vorrichtung zur Nucleinsäure-Isolierung eingeführt und
durch eine Durchgangsöffnung
in Einwegrichtung abgegeben. Ferner wurde jede Probe 1-, 5- oder
10-mal durch die Durchgangsöffnung
angesaugt und abgegeben.
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In
der folgenden Tabelle sind die Nucleinsäure-Ausbeuten der einzelnen
Vorrichtungen zur Nucleinsäure-Isolierung,
die Nucleinsäureproben
und die Anzahl der Flüssigkeitspassagen
aufgeführt.
Ferner zeigt
2 die Beziehung zwischen den
Typen der Flüssigkeitspassage
und der Nucleinsäureausbeuten
in jedem der Geräte
zur Nucleinsäure-Isolierung
sowie die Nucleinsäureproben.
Außerdem
sind die Nucleinsäureausbeuten
als prozentuale Anteile an Nucleinsäuren, die bezogen auf die zugeführten Mengen
an Nucleinsäuren isoliert
worden sind, angegeben. Tabelle 1
Vorrichtung
zur Nucleinsäure-Isolierung | Nucleinsäureprobe | Typen
der Flüssigkeitspassage | Nucleinsäureausbeute [%] |
Vorrichtung
für die
Isolierung von lange Nucleinsäure | lange
Nucleinsäure | Einweg | 42 |
Ansaugen
und Abgeben, 1-mal | 60 |
Ansaugen
und Abgeben, 5-mal | 78 |
Ansaugen
und Abgeben, 10-mal | 81 |
kurze Nucleinsäure | Einweg | 1 |
Ansaugen
und Abgeben, 1-mal | 1 |
Ansaugen
und Abgeben, 5-mal | 1 |
Ansaugen
und Abgeben, 10-mal | 1 |
Vorrichtung
für die
Isolierung von kurzen Nucleinsäuren | lange
Nucleinsäure | Einweg | 63 |
Ansaugen
und Abgeben, 1-mal | 78 |
Ansaugen
und Abgeben, 5-mal | 84 |
Ansaugen
und Abgeben, 10-mal | 87 |
kurze Nucleinsäure | Einweg | 46 |
Ansaugen
und Abgeben, 1-mal | 62 |
Ansaugen
und Abgeben, 5-mal | 75 |
Ansaugen
und Abgeben, 10-mal | 77 |
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Im
Fall einer Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren stieg
die Ausbeute an langen Nucleinsäuren
mit der Anzahl der Flüssigkeitspassagen.
Jedoch war die Ausbeute an kurzen Nucleinsäuren unabhängig von der Anzahl der Flüssigkeitspassagen äußerst gering.
Dagegen nahm im Fall der Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren die Ausbeute
an langen Nucleinsäuren
und die Ausbeute an kurzen Nucleinsäuren mit der Anzahl der Flüssigkeitspassagen
zu.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass man lange Nucleinsäuren in selektiver Weise an
die Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren binden
kann, während
kurze Nucleinsäuren
damit keine Bindung eingehen. Ferner ist ersichtlich, dass bei Verwendung
der Vorrichtung für
die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren kurze Nucleinsäuren, die
keine Bindung mit der Vorrichtung für die Isolierung von langen
Nucleinsäuren
eingehen, gebunden werden, so dass lange Nucleinsäuren und
kurze Nucleinsäuren
in wirksamer Weise isoliert werden können.
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[E] Verifikationsexperiment 2
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Gemäß dem Verfahren
zur Nucleinsäure-Isolierung
aus Blut wurde eine Nucleinsäure-Isolierung
unter Verwendung von humanem Blut als biologischer Probe, einer
Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren und einer Vorrichtung
zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren durchgeführt.
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3 zeigt
die Ergebnisse der Elektrophorese von Nucleinsäuren, die mit der Vorrichtung
zur Isolierung von langen Nucleinsäuren isoliert worden sind,
und von Nucleinsäuren,
die mit der Vorrichtung zur Isolierung von kurzen Nucleinsäuren isoliert
worden sind. Die mit der Vorrichtung zur Isolierung von langen Nucleinsäuren isolierten
Nucleinsäuren
enthalten hauptsächlich
genomische DNA und im wesentlichen keine RNA. Dagegen enthalten
Nucleinsäuren,
die mit der Vorrichtung für
die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren isoliert worden sind,
vorwiegend ribosomale RNA (etwa 5000 b; 28S rRNA), ribosomale RNA
(etwa 1900 b; 18S rRNA) und Messenger-RNA, während sie im wesentlichen keine
genomische DNA enthalten.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass genomische DNA und gesamte RNA in wirksamer
Weise aus einer biologischen Probe mit einem Gehalt an genomischer
DNA und gesamter RNA unter Verwendung einer Vorrichtung für die Isolierung
von langen Nucleinsäuren
und einer Vorrichtung für
die Isolierung von kurzen Nucleinsäuren isoliert werden können.
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Sämtliche
Veröffentlichungen,
Patente und Patentanmeldungen, die hier zitiert werden, werden in
ihrer Gesamtheit typischerweise zum Gegenstand der Beschreibung
gemacht.