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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein APIase-Proteinkonstrukt.
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Die
Herstellung von ihre native Struktur aufweisenden Polypeptiden ist
unter anderem hinsichtlich wissenschaftlicher, diagnostischer oder
therapeutische Zwecke im human- oder tiermedizinischen Bereich von
großem
wirtschaftlichen Interesse, da in der Regel nur Polypeptide in ihrer
nativen Struktur löslich
sind und ihre entsprechende Funktion ausüben können.
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Weisen
hingegen Polypeptide eine von ihrer nativen Struktur abweichende
Struktur auf, die auch als abweichende Raumstruktur (aRu) bezeichnet wird,
so neigen diese häufig
zur Ausbildung unlöslicher
Polypeptidaggregate, wobei Polypeptide mit einer aRu oder in aggregierter
Form im Vergleich zu löslichen
nativen Polypeptiden im Allgemeinen entweder nicht ihre angestammte
Funktion ausüben können oder
unerwünschte
Eigenschaften aufweisen. Dabei werden unter dem Begriff der aRu
solche Strukturen verstanden, die von der nativen Struktur eines
Polypeptids abweichen, so zum Beispiel denaturierte Polypeptide,
teildenaturierte Polypeptide oder nichtnative Polypeptide.
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Native
Polypeptide lassen sich beispielsweise mittels denaturierender Substanzen
wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid in solche mit einer aRu überführen. Durch
eine Absenkung der Konzentration dieser Substanzen oder durch ihre
Entfernung kann dieser Vorgang unter Umständen unter geeigneten Bedingungen
umgekehrt werden. Die Wissenschaftsliteratur summiert diese Verfahren
häufig
unter dem Begriff der Proteinfaltung oder der Proteinrückfaltung.
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Gegenwärtig beruht
die Herstellung von Polypeptiden im Wesentlichen auf drei Verfahren,
nämlich
auf der Genexpression (in vivo-Expression), auf der in vitro-Translation
(auch in vitro-Expression genannt) und auf der chemischen Synthese.
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Die
Genexpression von Polypeptiden beruht wie die in vitro-Translation auf der
rekombinanten DNA-Gentechnik. Diese Technik erlaubt es, DNA-Sequenzen
bereitzustellen, die Polypeptide mit einer beliebigen Aminosäuresequenz
kodieren.
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Bei
der in vitro-Translation an sich wird eine DNA-Sequenz außerhalb
einer biologischen Zelle ribosomal zu einem entsprechenden Polypeptid
translatiert (siehe hierzu z.B. Ying, B. et al.: BBRC 320(2004)1359–64). Bei
der Genexpression hingegen wird die DNA-Sequenz in einem geeigneten
Expressionsvektor in eine biologische Zelle eingeführt, in
welcher dann das entsprechende Protein produziert wird.
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Die
Methoden der Genexpression und der in vitro-Translation sind im
Stand der Technik bekannt und beispielsweise im Lexikon der Biochemie,
Spektrum-Verlag oder in T. Spahl u. T. Deichmann, Lexikon der Gentechnik,
Eichhorn-Verlag beschrieben.
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Auch
die chemische Synthese von Polypeptiden, bei der häufig Polypeptidsegmente
synthetisiert und nachträglich
zu Polypeptiden verknüpft
werden (Ligation), z.B. mittels der Inteintechnik (Dawson et al.,
Science, 266(1994), 776–9),
sind im Stand der Technik bekannt und umfangreich publiziert (vgl. hierzu
Merrifield Angew. Chem. 97(1985)799–810).
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Unabhängig davon,
welche der drei vorgenannten Methoden oder welche Kombination dieser Methoden
zur Herstellung eines Polypeptids eingesetzt wird, enthalten diese
Methoden bzw. Kombinationen dieser Methoden allesamt eine Vielzahl
von Teilschritten, von denen einer oder mehrere für die Herstellung
von löslichen
Polypeptiden mit einer nativen Struktur kritisch sein können, einschließlich der Schritte,
welche die Aufreinigung des gewünschten Polypeptids
betreffen, um das gewünschte
Polypeptid von unerwünschten
Begleitstoffen zu trennen.
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Die
genannten kritischen Schritte zeichnen sich in der Regel dadurch
aus, dass es innerhalb dieser zur Ausbildung von intramolekularen
oder intermolekulare Wechselwirkungen zwischen Polypeptidsegmenten
eines Polypeptids bzw. verschiedener Polypeptidmoleküle kommt.
Diese intra- oder intermolekularen Wechselwirkungen können einen
nachteiligen Einfluss auf die Ausbildung der nativen Struktur eines
entsprechenden Polypeptids haben und entsprechend die Bildung von
Polypeptiden mit einer unerwünschten
aRu begünstigen.
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Die
Herstellung von Polypeptiden gestaltet sich häufig auch deshalb als problematisch,
da, wenn ein gewünschtes
Polypeptid einmal eine aRu eingenommen hat, dieses oft zunächst in
seine native Struktur überführt werden
muss, um den Herstellungsprozess weiter fortzusetzen. Um die Ausbildung einer
aRu eines gewünschten
Polypeptids während der
Herstellung oder Lagerung zu vermeiden oder rückgängig zu machen, sind für sämtliche
Teilschritte des Produktionsprozesses von Polypeptiden eine Vielzahl
von Techniken und Methoden entwickelt worden, die sich von der Herstellung
des Polypeptids an sich, einschließlich der Herstellungsbedingungen, über die
Aufreinigung des Polypeptids bis hin zu dessen Lagerung erstrecken.
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Zahlreiche
so genannter Proteinfaltungs- und Proteinentfaltungsstudien wurden
vorgenommen, um zu ergründen,
wie eine vorgegebene beliebige Raumstruktur eines Polypeptids in
vitro beeinflusst werden kann. In diesen Studien wurden unter anderem
verschiedenste Substanzen darauf hin untersucht, inwieweit sie in
der Lage sind, ein Polypeptid mit einer unerwünschten Raumstruktur aRu in
ein Polypeptid mit einer nativen Struktur zu überführen.
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Bei
den vorgenannten Studien wurden eine Vielzahl von Substanzen und
Substanzgemischen aufgefunden, die geeignet sind, das Verhältnis des Anteils
von einem Polypeptid mit einer nativen Struktur zu dem entsprechenden
Polypeptid mit einer aRu in Richtung des Polypeptids mit der nativen
Struktur zu beeinflussen (siehe hierzu beispielsweise die
US 2004049012 ). So können z.B.
verschiedene Salze (vgl. hierzu die NZ 512098) wie TRIS (vgl. hierzu
die
US 5,618,927 ,
DE 40 37 196 ) oder Zitrat
in Kombination mit den unterschiedlichsten chemischen Verbindungen
(vgl. hierzu die
US 5,352,453 ),
Polyionen (vgl. hierzu die
JP
2004315541 , WO 9640784), Aminosäuren (vgl. hierzu Arakawa T.
et al., Biochemical & Biophysical
Research Communications, 304(2003), 148–152) oder auch Proteine, wie
z.B. ein oder auch mehrere kleine Hitzeschockproteine (vgl. hierzu
die
JP 7025897 ,
DE 42 39 969 ,
US 2004157289 ), Chaperone wie GroEL,
GroES, Dank oder DnaJ (vgl. hierzu die
EP
556 726 ), Bindeproteine (vgl. hierzu die
US 2004033564 , WO 3059945) oder
kleine Bindemoleküle
(vgl. hierzu die WO 0 032 175) die Raumstruktur von Polypeptiden
in Richtung der nativen Struktur des Polypeptids beeinflussen.
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Generell
konnte gezeigt werden, dass Substanzen oder Substanzgemische, welche
das Verhältnis
des Anteils von einem Polypeptid mit einer nativen Struktur zu dem
entsprechenden Polypeptid mit einer aRu in Richtung des Polypeptids
mit der nativen Struktur begünstigen,
den Faltungsweg des Polypeptids beeinflussen, wobei den vorgenannten
aufgefundenen Substanzen diese beeinflussenden Eigenschaften nicht
generell für
jedes beliebige Polypeptid zukommen, sondern die Art der Substanz
oder des Substanzgemisches sowie dessen Konzentration vielmehr individuell
auf das jeweilige Polypeptid abgestimmt und optimiert werden muss.
Dazu wurden mehrere Optimierungsstrategien entwickelt, die in der
Literatur ausführlich
beschrieben sind (vgl. hierzu Clark E. D. B. et al., Current Opinion
in Biotechnology, 9(1998), 157–163;
Maeda Y. et al., 9(1996), 461–465;
Wetlaufer D. B. et al., Protein Sci, 4(1995), 1535–43).
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Darüber hinaus
konnte gezeigt werden, dass sich das Verhältnis des Anteils von einem
Polypeptid mit einer nativen Struktur zu dem entsprechenden Polypeptid
mit einer aRu in Richtung des Polypeptids mit der nativen Struktur
verschieben lässt,
indem physikalische Parameter wie z.B. Temperatur und/oder Druck
unter Umständen
auch in Gegenwart verschiedenster Substanzen oder Substanzgemische
variiert werden. Dabei konnten auch verschiedenste „Faltungsintermediate" isolieren werden,
die strukturell zwischen einem vollständig denaturierten Polypeptid
und seiner nativen Form anzusiedeln sind.
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Offensichtlich
bewirken die oben genannten Substanzen und Substanzgemische sowie
eine Variation der physikalischen Parameter wie Druck und Temperatur
die Bevorzugung eines von mehreren möglichen Faltungswegen, was
zu einem höheren Anteil
an Polypeptid mit nativer Struktur führen kann (vgl. hierzu die
US 6,613,398 ).
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Gegenstand
des Interesses waren auch solche Methoden, mit welchen die Raumstruktur
eines Polypeptids in vivo beeinflusst werden kann, wobei in diesem
Zusammenhang von besonderer Bedeutung war, wie sich die Raumstruktur
eines Polypeptids beeinflussende Mitteln in das zelluläre Milieu
der Zelle, in der das gewünschte
Polypeptid hergestellt werden soll, einbringen lassen.
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In
diesem Zusammenhang hat sich in einigen Fällen die Coexpression von solchen
Proteinen als durchaus vorteilhaft erwiesen, welche die Bildung der
nativen Struktur eines Polypeptids unterstützen. So führte z.B. die Coexpression
von Chaperonen parallel zum gewünschten
Polypeptid in einigen Fällen zu
einer erhöhten
Löslichkeit
desselben, was als ein Indikator dafür angesehen wird, dass das
entsprechende Polypeptid in seiner nativen Struktur vorliegt (vgl.
hierzu Venkatesh B. et al., Biosci, Biotechnol. Biochem, 68(2004),
2096–2103).
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Die
Wirkung der Chaperone beruht vermutlich auf ihrer Wechselwirkung
mit hydrophoben Bereiche des gewünschten
Polypeptids, so dass intra- und intermolekulare Wechselwirkungen
zwischen diesen Bereichen vermieden und dadurch eine Aggregation der
Polypeptide oder deren fehlerhafte Faltung umgangen werden (vgl.
hierzu Houry W. A. et al., Nature, 402(1999), 147–154; Hartel
F. U., Nature, 381(1996), 571–580).
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Neben
den Chaperonen, die keine auf eine Peptidkette gerichtete Enzymaktivität besitzen,
sind auch Proteine, die eine Isomerisierungsaktivität bezüglich der
cis/trans-Isomerisierung
des Polypeptidrückgrates
aufweisen, hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Faltung von Polypeptiden
untersucht worden. So konnte anhand von in vitro-Untersuchungen in einigen Fällen gezeigt
werden, dass sich durch Zusatz von PPIasen, welche die Geschwindigkeit
der cis/trans-Isomerisierung von Prolyl-Peptidbindungen katalytisch
erhöhen
können,
der Anteil an löslichem gewünschtem
Proteinen steigern lässt
(vgl. hierzu Golbik R. et al., Biochemistry, 44(2005), 16026–16034;
Kim S. G. et al., Protein Expression & Purification, 41(2005), 426–432).
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Durch
den Zusatz einer PPIase zu einem gewünschten Polypeptid kann vermutlich
durch deren katalytische Aktivität
die Beweglichkeit des Peptidrückgrates
eines entfalteten Polypeptids erhöht werden, wodurch vermutlich
vermehrt solche Faltungswege eingeschlagen werden können, welche
zur Ausbildung eines Polypeptids mit nativer Struktur führen.
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Durch
Hemmung der Faltungshelferenzymaktivität von entsprechenden Enzymen
mittels geeigneter Substanzen konnte darüber hinaus gezeigt werden,
dass einige dieser Faltungshelferenzyme auch Chaperon-Eigenschaften
besitzen, wie z.B. der Trigger Factor (vgl. hierzu Zarnt, T. et
al., J. Mol. Biol, 271(1997), 827–37), das SurA (vgl. hierzu
Behrens et al., EMBO J, 20(2001), 285–294), das DsBA (vgl. hierzu
Frech C. et al., EMBO J, 15(1996), 392–98), das FkpA und das SlyD
(vgl. hierzu
US 6,962,982 ).
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Obwohl
zahlreiche dieser Faltungshelferenzyme in den zur Polypeptid-Produktion
eingesetzten Zellen von Natur aus vorkommen, konnte in mehreren
Untersuchungen gezeigt werden, dass eine Erhöhung der Konzentration dieser
Faltungshelferenzymen, auch von wirtsfremden oder biochemisch veränderten
Faltungshelferenzyme, in den für
die Produktion des gewünschten
Polypeptids wichtigen Zellkompartimenten, beispielsweise durch Coexpression,
die Bildung des gewünschten
Polypeptids in seiner nativen Struktur vorteilhaft beeinflussen
können
(vgl. hierzu die WO 99/22010,
US
20030096352 ,
JP 11092495 ).
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Dabei
werden unter dem Begriff der Coexpression im Allgemeinen alle die
Prozesse verstanden, bei welchen in zeitlicher Nähe zur Expression des gewünschten
Polypeptids die Expression des die Faltung des gewünschten
Polypeptids beeinflussenden Polypeptids so erfolgt, dass in mindestens
einem Zellkompartiment der Faltungshelfer mit dem gewünschten
Polypeptid in Kontakt treten kann.
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Im
Unterschied zu den PPIasen, deren Substratspezifität auf die
cis/trans-Isomerisierung von Prolyl-Peptid-Bindungen gerichtet ist,
ist die Substratspezifität
der neu entdeckten Familie der Sekundär-Amid Peptidbindungs cis/trans-Isomerasen
(APIasen) auf die cis/trans-Isomerisierung von sekundären Amidpeptidbindungen
gerichtet (vgl. hierzu Schiene-Fischer C. et al., Biological Chemistry, 383(2002),
1865–1873;
Schiene-Fischer
C. et al., Nature Structural Biology, 9(2002), 419–424; WO 03/018618).
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Zwar
konnte auch in in vitro-Untersuchungen gezeigt werden, dass Vertreter
der APIasen effektive Katalysatoren sind, welche den Anteil an löslichem gewünschtem
Proteinen erhöhen
können
(vgl. hierzu Schiene-Fischer C. et al., Biological Chemistry, 383(2002),
1865–1873).
Aber entgegen den Erwartungen führte
die Coexpression von einer APIase mit verschiedenen gewünschten
Polypeptiden nur zu einer marginalen Erhöhung des Anteils an löslichem gewünschtem
Polypeptid.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Möglichkeit bereitzustellen,
mit welcher sich auf einfache und damit kostengünstige Weise verschiedenste
Polypeptide in löslicher
Form herstellen lassen.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein
Proteinkonstrukt gelöst,
umfassend ein Fusionsprotein mit einem ersten Aminosäuresequenzabschnitt
und einem zweiten Aminosäuresequenzabschnitt,
wobei der erste Aminosäuresequenzabschnitt
eine Sekundär-Amid
Peptidbindungs spezifische cis/trans-Isomerase (APIase) kodiert
und der zweite Aminosäuresequenzabschnitt
ein beliebiges erstes Polypeptid kodiert, oder umfassend ein Polypeptidassoziat,
enthaltend ein mit einem ersten Tag versehenes erstes Polypeptidmolekül und ein
mit einem zweiten Tag versehenes zweites Polypeptidmolekül, wobei
das erste Polypeptidmolekül
eine APIase ist und das zweite Polypeptidmolekül ein beliebiges zweites Polypeptid
ist und wobei der erste Tag an dem zweiten Tag spezifisch bindet,
vorzugsweise mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als
1 μM.
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Erfindungsgemäß wird unter
einer APIase ein Polypeptid verstanden, das eine APIase-Aktivität aufweist,
d.h. eine katalytische Aktivität,
welche die cis/trans-Isomerisierung von sekundären Amid-Peptidbindungen beschleunigt.
Um eine solche katalytische Aktivität nachzuweisen, sind dem Fachmann mehrere
Untersuchungsmethoden aus dem Stand der Technik bekannt, welche
durch die nachstehenden Referenzen in die vorliegende Erfindung
miteinbezogen werden (Schiene-Fischer C. et al., Biological Chemistry,
383(2002), 1865–1873;
Schiene-Fischer
C. et al., Nature Structural Biology, 9(2002), 419–424; WO
03/018618).
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Neben
den in der Natur vorkommenden, eine APIase-Aktivität aufweisenden
Polypeptiden, deren Aminosäuresequenz
genkodiert vorliegt, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung
unter dem Begriff „APIase" auch solche APIasen
verstanden, bei welchen mittels dem Fachmann bekannter Methoden die
Aminosäuresequenz
einer natürlichen
APIase durch Verlängern
oder Verkürzen
der Sequenz, den Einbau einer oder mehrer neuer zusätzlicher
Aminosäuren
oder Aminosäuresequenzen,
oder dem Ausschneiden einer oder mehrere Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen
so verändert
worden ist, dass die veränderte
Aminosäuresequenz
zur natürlichen Aminosäuresequenz
eine Sequenzidentität
von größer/gleich
15% aufweist, vorzugsweise eine von größer als 50%, bevorzugt eine
von größer als
70%, weiter bevorzugt eine von größer als 90%, mehr bevorzugt
eine von größer als
95%, mehr bevorzugt eine von größer als
98% und am meisten bevorzugt eine von größer als 99%. Die Identitätswerte
in % können beispielsweise
mit WU-BLAST-2 ermittelt werden (Tatusova TA 1999).
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Darüber hinaus
werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „APIase" auch solche APIasen
verstanden, bei welchen mittels dem Fachmann bekannter und im Allgemeinen
als Derivatisierung bezeichneter Methoden ein oder mehrere Aminosäurereste
der Aminosäuresequenz
einer natürlichen
APIase, beispielsweise eine Seitenkette eines Aminosäurerestes
oder der N- oder C-Terminus, derivatisiert sind, beispielsweise
chemisch modifiziert. Solche Veränderungen
an der APIase können beispielsweise
dazu dienen, wie im Allgemeinen für Proteine bekannt, die Löslichkeit
der APIase zu ändern,
die Stabilität
gegenüber
Proteasen zu erhöhen, unerwünschten
oder gewünschten
Interaktion zu anderen Polypeptiden oder Zellstrukturen entgegenzuwirken
bzw. zu bewirken oder um Vorteile für einen Polypeptid-Herstellungsprozeß zu bewirken,
wie z.B. eine gewünschte
Affinität
zu Trennmaterialien.
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Ferner
werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „APIase" auch solche APIasen
verstanden, die durch strukturelle Komplementierung gebildet werden.
Dabei beinhaltet der Begriff der „strukturellen Komplementierung" die Ausbildung einer
deutlichen APIase-Aktivität
erst durch Assoziation von mehreren inaktiven APIase-Komponenten,
d.h. die APIase des Fusionsprotein oder des Polypeptidassoziats
ist in diesem Fall eine Komponente einer APIase. Unter inaktiven
APIase-Komponenten sollen dabei solche Komponenten verstanden werden,
welche weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 1%, APIase-Aktivität im Vergleich
zur APIase-Aktivität
einer komplementierten APIase aufweisen, oder vorzugsweise eine
APIase-Aktivität
von kleiner 0,01%. Bei den inaktiven APIase-Komponenten kann es sich beispielsweise
um APIase-Teilsequenzen
handeln oder um ein oder mehrere Aktivatormoleküle, deren Interaktion mit einer
anderen inaktiven APIase-Komponente eine solche strukturelle Veränderung
hervorruft, dass eine deutliche APIase-Aktivität entsteht.
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Die
inaktiven APIase-Komponenten können beispielsweise
aber auch ein Fängermolekül enthalten,
wobei nach spezifischer Bindung einer entsprechenden Substanz an
das Fängermolekül eine an
die APIase gebundene, die Aktivität der APIase unterdrückende Substanz
freigesetzt oder entfernt und so die strukturelle Komplementierung
der APIase herbeigeführt
wird. Das Konzept der strukturellen Komplementierung ist ausführlich in
der
US 2005019829 beschrieben.
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Umfasst
das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt
ein Polypeptidassoziat, so beinhaltet dieses die APIase sowie das
zweite Polypeptid, die über eine
nicht-kovalente Bindung miteinander über zwei sogenannte Tags verbunden
sind. Unter Tags werden spezifische Bindungspartner in Form von
Oligo- oder Polypeptiden
verstanden, die beispielsweise mittels dem Fachmann bekannter gentechnischer Methoden
(vgl. hierzu
JP 20055315688 ,
US 2005221308 ,
US 2005214900 oder Lichty
J. J. et al., 41(2005), 98–105.)
auf DNA-Ebene so mit der APIase oder dem zweiten Polypeptid verknüpft werden können, dass
durch die ribosomale Proteinsynthese die APIase und/oder das zweite
Polypeptid zusammen mit der Tag-Sequenz synthetisiert werden.
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Beispiele
für bevorzugte
Tags sind das Biotin-Tag (Tucker J. and Grisshammer R., Biochem.
J, 317(1996), 891–899;
BioMethods: "A laboratory
guide to biotin-lableing in biomolecule analysis", Vol. 7, Birkhäuser Verlag, ISBN 3-7643-5206-X), das Streptavidin-Tag
(Cass B. et al., Protein Expr. Purif, 40(2005), 77–85), das
PinPoint-Tag (
US 5,252,466 ,
US 5,276,062 ), das CBD-Tag
(Tomme, P. et al., Protein Engineering, 7(1994), 117–123), das
MBP-Tag (R. Gräf,
Anal. Biochem, 289(2001), 297–300)
oder auch Tags wie FLAG, GST, ProteinA oder Thioredoxin (WO 00/73464).
Die an die vorgenannten Tags spezifisch bindenden Bindepolypeptide
werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung entsprechend auch als
Tags bezeichnet.
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Darüber hinaus
sind zahlreiche Methoden bekannt, die es dem Fachmann erlauben,
immer neue Tags aufzufinden (siehe hierzu Yu C. et al., Angew. Chemie,
44 (2005), 1408–1412;
Verge et al., Tetrahedron Letters, 43(2002), 2363–6); Cooper
M. A., Analytical & Bioanalytical
Chemistry, 377(2003), 834–842.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter den Begriffen Oligopeptide
und Polypeptide Peptide verstanden, die 2 bis 9 bzw. mehr als 9 Aminosäurereste
enthalten.
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Das
erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid
des Polypeptidassoziats werden im Folgenden auch als gewünschtes
Polypeptid oder als Zielpolypeptid bezeichnet.
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Die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung genannten thermodynamischen
Affinitätskonstanten lassen
sich mittels vielfältiger,
dem Fachmann bekannter Methoden, wie z.B. mittels Kalorimetrie (vgl. z.B.:
Bruylants, G. et al.: Current Medicinal Chemistry 12(2005)2011–2020) oder
mittels Surface Plasmone Resonanz Techniken (vgl. z.B. Plattnaik
P.: Applied Biochemistry & Biotechnology
126(2005)79–92)
bestimmen. Die Konstante selbst lässt sich ausdrücken als
Bruch zweier kinetischer Konstanten, der Anlagerungsgeschwindigkeit
(kon) und der Dissoziationsgeschwindigkeit
(koff) der das Polypeptidassoziat ausbildenden
Bestandteile.
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Das
erfindungsgemäße Proteinkonstrukt
hat den Vorteil, dass sich mittels ihm verschiedenste Polypeptide
in löslicher
Form, das heißt
Polypeptide mit ihrer nativen Struktur, herstellen lassen, insbesondere
auch solche, die in anderen Herstellungsverfahren nur in unlöslicher
oder nur in geringen Mengen in löslicher
Form anfallen.
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Ist
das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt ein
Fusionsprotein umfassendes Konstrukt, so enthält das Fusionsprotein vorzugsweise
nur eine APIase und nur ein Zielpolypeptid, wobei das Zielpolypeptid
beispielsweise sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus der APIase
fusioniert sein kann. Das Fusionsprotein kann aber auch mehrere
APIasen und/oder mehrere Zielpolypeptide enthalten, die in beliebiger
Reihenfolge miteinander verknüpft
sein können.
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Ist
das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt ein
Polypeptidassoziat umfassendes Konstrukt, so enthält das Assoziat
vorzugsweise nur eine getagte APIase und nur ein getagtes Zielpolypeptid,
wobei die APIase und das Zielpolypeptid unabhängig voneinander beispielsweise
entweder am N-Terminus oder am C-Terminus getagt sein können. Das
Polypeptidassoziat kann aber auch mehrere APIasen und/oder mehrere
Zielpolypeptide enthalten, die in beliebiger Reihenfolge miteinander
verknüpft
sein können.
Beispielsweise kann die APIase sowohl am N-Terminus als auch am
C-Terminus mit einem Tag versehen sein, wobei die beiden Tags voneinander verschieden
sind. Durch Inkontaktbringen einer derart ausgebildeten APIase mit
zwei voneinander verschiedenen Zielpolypeptiden, von denen das eine
mit einem Tag versehen ist, das an dem N-terminalen Tag der APIase
spezifisch bindet, und das andere mit einem Tag versehen ist, welches
das C-terminale
Tag der APIase spezifisch bindet, bildet sich ein Polypeptidassoziat
aus, welches ein Molekül
APIase und zwei voneinander verschiedene Moleküle Zielpolypeptid enthält.
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Mittels
des erfindungsgemäßen Polypeptidkonstrukts
lassen sich Zielpolypeptide mit nahezu beliebiger Größe in löslicher
Form herstellen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der Anteil
an löslichem
Zielpolypeptid umso höher
ist, je kleiner das Zielpolypeptid ist. Vorzugsweise besteht das
erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid
des Polypeptidassoziats aus 10 bis 1000 Aminosäureresten, weiter vorzugsweise
aus 20 bis 500 Aminosäureresten,
bevorzugt aus 30 bis 300 Aminosäureresten
und besonders bevorzugt aus 50 bis 200 Aminosäureresten.
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Insbesondere
Polypeptide, die in nativer Form eine definierte Tertiärstruktur
aufweisen, neigen unter anderem aufgrund hoher Expressionsgeschwindigkeiten
zur Ausbildung von aRu, die in der Regel mit der Aggregation der
Zielproteine und der Ausbildung fester Inclusionbodies einhergeht.
Daher eignet sich das erfindungsgemäße Konstrukt insbesondere zur
Herstellung löslicher
Zielpolypeptide, die in nativer Form eine definierte Tertiärstruktur
aufweisen. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts
weist daher das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite
Polypeptid des Polypeptidassoziats in seiner nativen Form eine definierte
Tertiärstruktur
auf.
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Die
vorliegende Erfindung ist nicht auf Polypeptidkonstrukte enthaltend
spezielle Zielpolypeptide beschränkt.
Aus wirtschaftlichen und damit auch aus Kostengründen kann das erfindungsgemäße Polypeptidkonstrukt
insbesonders vorteilhaft zur Herstellung von Zielpolypeptiden eingesetzt
werden, die beispielsweise bei ihrer Expression zur Bildung von
Inclusionbodies führen
oder sich nur in geringen Mengen in Bakterien oder eukaryote-Wirtszellenh
in löslicher
Form herstellen lassen. Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Konstrukts
ist daher das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite
Polypeptid des Polypeptidassoziats ein Polypeptid, das bei separater
Expression in E. coli, in Hefezellen, in Insektenzellen oder in
Pflanzenzellen zur Ausbildung von Inclusionbodies führt oder
das sich bei separater Expression in Bakterien oder in eukaryontischen
Wirtszellen nur in geringen Mengen in löslicher Form herstellen lässt, vorzugsweise
in Mengen von im Mittel weniger als 1 Pikogramm (pg) pro Bakterium
oder Wirtszelle.
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Das
Zielpolypeptid kann auch jegliches Polypeptid sein, dessen Herstellung
für allgemein
wirtschaftliche, wissenschaftliche, für diagnostische oder für therapeutische
Zwecke in der Human- oder
Tiermedizin von Bedeutung ist. Dies können z.B. sein Zytokine, Hormone,
aktivierende oder inhibierende Faktoren oder Enzyme.
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Günstig ist
es, wenn das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite
Polypeptid des Polypeptidassoziats ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Zytokinen, Hormonen, Enzymen, Membranproteinen, Strukturproteinen,
Transportproteinen und aktivierenden oder inhibierenden Faktoren.
Insbesondere diese Polypeptide lassen sich mittels eines entsprechenden
Proteinkonstrukts in verhältnismäßig großer Ausbeute
in löslicher
Form herstellen.
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Es
kann vorgesehen sein, dass die APIase mit einer oder mehreren posttranslationalen
Modifikationen versehen ist.
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Bevorzugt
ist es, wenn die APIase eine mittels eines Aktivatormoleküls aktivierbare
APIase ist. Bei dem Einsatz einer derartig ausgebildeten APIase kann
die APIase-Aktivität über die
Konzentration an Aktivatormolekül
gesteuert und damit für
ein jeweiliges Zielpolypeptid angepasst werden.
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Ferner
kann es bevorzugt sein, dass die APIase eine mittels Inaktivierung
eines Inhibitors aktivierbare APIase ist. Auch bei dem Einsatz einer
derart ausgebildeten APIase kann die APIase-Aktivität über die
Konzentration an Aktivatormolekül
gesteuert und damit an ein jeweiliges Zielpolypeptid angepasst werden.
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Die
APIase hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli weist eine verhältnismäßig hohe
APIase-Aktivität auf.
Es konnte gezeigt werden, dass sich mittels dieser APIase auch besonders
hydrophobe Polypeptide in löslicher
Form herstellen lassen. Gemäß einer
weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts
ist daher die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli oder ein
Ortholog davon desselben oder eines anderen Organismus.
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Günstig ist
es, wenn die APIase an ein Trägermaterial
gebunden ist. Zum einen kann die Gegenwart eines Trägermaterials
die Stabilität
der Raumstruktur der APIase erhöhen,
insbesondere wenn denaturierende Agenzien zugegen sind. Zum anderen
kann sich dass erfindungsgemäße Proteinkonstrukt
durch die Bindung an einen Träger,
die beispielsweise kovalenter Natur sein kann, verhältnismäßig einfach,
beispielsweise durch zentrifugieren, von einer Lösung abgetrennt werden. Geeignete
Trägermaterialien
sind beispielsweise Polymerpartikel aus Polypropylen oder -ethylen.
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Es
kann bevorzugt sein, dass das Fusionsprotein einen dritten Aminosäuresequenzabschnitt umfasst,
der zwischen dem ersten und dem zweiten Aminosäuresequenzabschnitt angeordnet
ist und der einen Peptidlinker kodiert. Dadurch wird gewährleistet,
dass das katalytisch aktive Zentrum der APIase auch bei sterisch
anspruchsvollen Zielpolypeptiden sämtliche, die Faltung beeinflussende
Peptidbindungen des Zielpolypeptids verhältnismäßig ungehindert erreichen kann.
Von Vorteil ist dabei auch, wenn der Peptidlinker aus solchen Aminosäureresten
gebildet ist, die dem Linker eine verhältnismäßig hohe Flexibilität verleihen,
so dass diese in ihrer räumlichen
Anordnung zu keiner sterischen Behinderung der Annäherung des
aktiven katalytischen Zentrums der APIase an das Zielpolypeptid
führen.
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In
Abhängigkeit
von der Natur der APIase und/oder des Zielpolypeptids kann es bevorzugt
sein, wenn der Peptidlinker aus bis zu 1000 Aminosäureresten
besteht, vorzugsweise aus bis zu 100 Aminosäureresten und besonders bevorzugt
aus 5 bis 30 Aminosäureresten.
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Besitzt
die verwendete APIase und das Zielpolypeptid im Bereich einer potentiellen
Bindung aneinander aber solche Aminosäurereste, die es erlauben,
dass das Zielpolypeptid und das aktive Zentrum der APIase problemlos
zusammenwirken können,
so dass es zur vermehrten Bildung an löslichem Zielpolypeptid kommen
kann, so ist kein Peptidlinker von nöten.
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Wird
ein Peptidlinker eingesetzt, kann es von Vorteil sein, einen solchen
Linker zu verwenden, der sich mittels im Stand der Technik beschriebener
geeigneter Methoden gezielt spalten lässt, um das gewünschte Polypeptid
ohne APIase in ungebundener Form zu erhalten. Sowohl geeignete Linker
als auch entsprechende Methoden zur Spaltung der Linker sind im
Stand der Technik bekannt, wobei die in der nachstehenden Referenz
zitierten in die vorliegende Erfindung miteinbezogen werden (WO
99/13091).
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Der
Linker kann zum Beispiel die Sequenz Ile-Glu-Gly-Arg enthalten,
die sich durch den Faktor Xa, eine Protease, spalten lässt. Es
gibt beispielsweise auch Peptidlinker, die sich mittels anderer
Proteasen spalten lassen, wie z.B. Thrombin, Enterokinase, Trypsin
oder Collagenase. Der Linker kann auch so ausgeführt sein, dass er erst nach
einer Behandlung mit geeigneten Chemikalien, wie z.B. Hydroxylamin, Bromcyan
oder bei niedrigen pH-Werten gespalten wird.
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Je
nach Art der APIase und/oder des Zielpolypeptids kann es bevorzugt
sein, wenn der Peptidlinker auf chemischem Weg oder mittels einer
Protease spaltbar ist.
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Dabei
kann gemäß einer
weiteren Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Konstrukts
der Peptidlinker derart ausgebildet sein, dass er spezifisch mittels
Faktor Xa, Thrombin, Enterokinase, Trypsin oder Collagenase spaltbar
ist.
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Alternativ
oder zusätzlich
dazu kann es von Vorteil sein, wenn der Peptidlinker mittels Behandlung
von Hydroxylamin, Bromcyan oder durch ein saures Milieu spaltbar
ist.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Polynukleotid, dass das Fusionsprotein
umfassende erfindungsgemäße Proteinkonstrukt
kodiert oder eine mit einem Tag versehene APIase, wobei das Tag
vorzugsweise an ein komplementäres
Oligo- oder Polypeptid mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante
von kleiner als 1 μM
spezifisch binden kann.
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Die
Erfindung betrifft ferner einen Vektor, umfassend das erfindungsgemäße Polynukleotid.
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Die
Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, enthaltend das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt, das
erfindungsgemäße Polynukleotid
und/oder den erfindungsgemäßen Vektor.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Wirtszelle
ist diese eine eukaryontische oder eine prokaryontische Zelle.
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Besonders
bevorzugt ist es, wenn die Wirtszelle ein E. coli ist, eine Hefezelle,
eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine humane Zelle.
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Beispielsweise
entsprechend den ausgewählten
Vektoren kann das das Fusionsprotein umfassende Proteinkonstrukt
in eukaryotischen oder in prokaryotischen Zellen hergestellt werden.
Die für
die Genexpression ausgewählten
Zellen können
selbst gezielt gentechnisch veränderte
Zellen oder Organismen (Prokaryonten, Eukaryonten) sein (vgl. hierzu WO
2006014899,
CN 1271777 ),
deren Kultivierung wiederum unter für die Genexpression löslicher
Proteine optimierten Kulturbedingungen erfolgten kann. Neben der
Optimierung physikalischer Parameter (wie z.B. der Temperatur) oder
der Optimierung physiologischer Parameter der zur Produktion verwendeten
Zellen (z.B. Startpunkt der Expression oder Expressionsdauer in
Abhängigkeit
von physiologischen Zellzuständen,
wie z.B. Alter oder Wachstumsphase) sind dem Fachmann zahlreiche
weitere Methoden bekannt, um durch die gezielte Fusion eines herzustellenden
Polypeptids mit einem weiteren Polypeptid ein Fusionsprotein zu
erzeugen, welche ebenfalls in gewünschter Weise die Löslichkeit
des gewünschten
Polypeptids beeinflusst.
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So
sind dem Fachmann zahlreiche Methoden und Polypeptidsequenzen bekannt,
z.B. H. Bannai et al., Bioinformatics, 18(2002), 298–305; M.
Cokol et al., EMBO Rep, 1(2000)411–415, die es erlauben, die
Konzentration eines Polypeptids gezielt in einem Zellkompartiment
zu erhöhen
(vgl. hierzu die WO 2005085431) oder auch das Polypeptid ganz aus
der Zelle auszuschleusen (vgl. hierzu Novy, R. et al., inNovations,
7(1997), 4–7),
wobei die vorgenannten Polypeptidsequenzen hiermit ausdrücklich in
die Erfindung miteinbezogen werden.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen
Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte:
- a)
die in vivo- oder in vitro-Expression des Fusionsprotein umfassenden
erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts
unter Bedingungen, welche die Expression des Proteinkonstrukts erlauben;
- b) die Spaltung des Proteinkonstrukts unter Freisetzung des
ersten Polypeptids; und gegebenenfalls
- c) die Gewinnung des ersten Polypeptids durch Aufreinigung.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen
Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte:
- a)
die Bereitstellung einer mit einem Tag versehenen APIase;
- b) das Inkontaktbringen eines mit einem Tag versehenen Zielpolypeptids
mit der APIase unter für das
Zielpolypeptid denaturierenden Bedingungen, wobei der Tag des Zielpolypeptids
unter den denaturierenden Bedingungen spezifisch an dem Tag der
APIase bindet;
- c) die Absenkung der Konzentration der die denaturierenden Bedingungen
bewirkenden Substanzen auf eine Konzentration, die für das Zielpolypeptid
nicht denaturierend wirkt;
- d) die Lösung
der Bindung zwischen dem Tag der APIase und dem Tag des Zielpolypeptids,
vorzugsweise durch den Zusatz von geeigneten Substanzen; und gegebenenfalls
- e) die Gewinnung des Zielpolypeptids durch Aufreinigung.
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Neben
dem Verfahren zur Herstellung löslicher
Zielpolypeptide über
die Expression von Fusionspolypeptide kann es von Vorteil sein,
wenn das gewünschte
lösliche
Zielpolypeptid mittels einer getagten APIase hergestellt wird. Bei
diesem Verfahren wird in der Regel zunächst die Bildung von Aggregaten
des getagten Zielpolypeptids, dem Fachmann als „Inclusionbodies" (vgl. hierzu Markossian
KA. et al., Biochemistry, 69(2004), 971–984; Klikova M., Chemicke
Listy, 89(1995), 377–381)
bekannt, als gewünschter
Zwischenschritt ausgenutzt.
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Um
gezielt „Inclusionbodies" herzustellen, sind
dem Fachmann zahlreiche Methoden bekannt, die umfangreich in der
Literatur dokumentiert sind (vgl. hierzu
US 2005283000 ,
US 2003104581 ,
EP 1 603 938 ). Die Herstellung löslicher
Polypeptide über den
Zwischenschritt der Herstellung von Inclusionbodies hat den Vorteil,
dass diese festen Aggregate das Zielpolypeptid in der Regel schon
in angereicherter Form enthalten und sich relativ einfach und kostengünstig von
den übrigen
Bestandteilen der zur Produktion eingesetzten Zellkultur abtrennen
lassen.
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Während es
in wenigen speziellen Fällen
mit guter Ausbeute gelingt, Inclusionbodies in Lösungen mit stark chaotropen
Substanzen wie Urea, Guanidinhydrochlorid oder Thiocyanaten zu Solubilisieren (vgl.
hierzu Tsumoto K. et al., Protein Expression & Purification, 28(2003), 1–8), und
dann das Zielpolypeptid durch Absenkung der Konzentration an chaotroper
Substanz in seiner native Struktur und damit in ein lösliches
Polypeptid zu überführen, ist
dieser Schritt für
zahlreiche Polypeptide oft sehr problematisch und Gegenstand vielfältigster
Studien.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist das Tag wie vorstehend bezüglich
des erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts
definierte.
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Für das Zielpolypeptid
denaturierende bzw. nicht denaturierende Bedingungen können beispielsweise
durch die Aufnahme von Circular-Dichroismus-Spektren des Zielpolypeptids in
Abhängigkeit von
der Konzentration der entsprechenden denaturierenden Reagenzien
bestimmt werden, wie dies umfangreich in der Literatur beschrieben
ist.
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Die
Vorteile der nachfolgenden bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens
ergeben sich aus den entsprechenden obigen Ausführungen zu dem erfindungsgemäßen Proteinkonstrukt.
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Bevorzugt
ist es, wenn das Zielpolypeptid aus 10 bis 1000 Aminosäureresten
besteht, vorzugsweise aus 20 bis 500 Aminosäureresten, bevorzugt aus 30
bis 300 Aminosäureresten
und besonders bevorzugt aus 50 bis 200 Aminosäureresten.
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Ferner
kann es bevorzugt sein, dass das Zielpolypeptid in seiner nativen
Form eine definierte Tertiärstruktur
aufweist.
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Darüber hinaus
kann es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
aus oben genannten Gründen von
Vorteil sein, dass das Zielpolypeptid ein Polypeptid ist, das bei
separater Expression in E. coli, in Hefezellen, in Insektenzellen
oder in Pflanzenzellen zur Ausbildung von Inclusionbodies führt oder
das sich bei separater Expression in Bakterien oder in eukaryontischen
Wirtszellen nur in geringen Mengen in löslicher Form herstellen lässt, vorzugsweise
in Mengen von im Mittel weniger als 1 pg pro Bakterium oder Wirtszelle.
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Gemäß einer
weiter bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das Zielpolypeptid ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Zytokinen, Hormonen, Enzymen, Membranproteinen,
Strukturproteinen, Transportproteinen und aktivierenden oder inhibierenden
Faktoren.
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Ferner
kann es bevorzugt sein, wenn die APIase mit einer oder mehreren
posttranslationalen Modifikationen versehen ist.
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Bevorzugt
ist ferner, wenn die APIase eine mittels eines Aktivatormoleküls aktivierbare
APIase ist.
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Gemäß einer
weiter bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die APIase eine mittels Inaktivierung eines Inhibitors aktivierbare
APIase ist.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli oder ein Ortholog
davon desselben oder eines anderen Organismus.
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Weiter
bevorzugt ist es, wenn die APIase an ein Trägermaterial gebunden ist.
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Abwandlungen
der APIase wurden bereits oben erwähnt und beziehen sich auch
auf die Stabilität
der Struktur der APIase und damit auch auf deren APIase-Aktivität. Ziel
von Veränderungen
der APIase kann es zum Beispiel sein, dass die APIase-Aktivität unter
Bedingungen erhalten bleibt, die für das getagte Zielpolypeptid
denaturierend wirken. Die Durchführung
und die Art solcher Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt, umfangreich
in der Literatur dokumentiert und geeignet, die APIase-Aktivität einer APIase
auch unter Bedingungen zu erhalten, die für das Zielpolypeptid denaturierend
wirken.
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Abwandlungen
der APIase, um die APIase-Aktivität unter Bedingungen zu erhalten,
die für ein
getagtes Zielpolypeptid denaturierend wirken, schließen auch
die Immobilisierung der getagten APIase an einen Träger ein,
wobei die Bindung der APIase an den Träger sowohl kovalenter als auch nicht- kovalenter Natur
sein kann. Das Trägermaterial kann
beispielsweise ein Polymermaterial sein (vgl. hierzu die
US2003176638 über die
Stabilisierung von Troponin), Mikrosphären (vgl. hierzu die WO 03062199)
oder eine entsprechende Affinitätsmatrize,
an welcher die APIase beispielsweise mittels eines His-Tag bindet.
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Die
Erhöhung
der Stabilität
der Struktur von APIase und damit der Beibehaltung von deren APIase-Aktivität auch unter
denaturierenden Bedingungen gelingt auch durch die räumlich gezielte
Einführung
von Cysteinen in eine APIase, wobei die Stabilisierung letztendlich
durch die Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken erfolgt, wie dies beispielsweise
in der WO 02103024 beschrieben ist.
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Entsprechend
einer weiter bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens bindet
das Tag des Zielpolypeptids spezifisch an dem Tag der APIase mit
einer thermodynamischen Affinitätskonstante
von kleiner als 1 μM.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein lösliches
Polypeptid, gewonnen aus dem erfindungsgemäßen Proteinkonstrukt, wobei
das lösliche
Polypeptid entweder das erste Polypeptid des Fusionsproteins ist oder
das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats mit oder ohne Tag.
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Die
Erfindung betrifft ferner eine APIase, die mit einem Tag versehen
ist, vorzugsweise mit einem Oligo- oder Polypeptidtag, das spezifisch
an ein Oligo- oder Polypeptid oder an ein Oligo- oder Polypeptidtag
binden kann.
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Bevorzugt
ist es, wenn das Tag an ein an ein Polypeptid gebundenes Tag unter
Bedingungen spezifisch binden kann, welche für das Polypeptid denaturierend
sind.
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Ferner
kann es von Vorteil sein, wenn das Tag der APIase an dem Tag des
Polypeptids mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als
1 μM spezifisch
binden kann.
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Gemäß einer
weiter bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen APIase
ist die APIase an ein Trägermaterial
gebunden.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen APIase
ist die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli oder ein Ortholog
davon desselben oder eines anderen Organismus.
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Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen APIase
bei der Herstellung eines löslichen
Polypeptids.
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Die
nachfolgende Zeichnung dient im Zusammenhang mit den Beispielen
der Erläuterung
der Erfindung. Es zeigt:
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1:
Ausbeute an aktiver Luziferase bei einer APIase-Coexpression gemäß Vergleichsbeispiel und bei
der Expression eines Luziferase-APIase-Fusionsproteins gemäß Beispiels
1.
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Vergleichsbeispiel: Coexpression von APIase
und Zielpolypeptid
-
Um
die Ausbeute an mittels der Erfindung und mittels einer einfachen
Coexpression gewonnenem nativem Zielpolypeptid bestimmen und entsprechend
vergleichen zu können,
wurde Luziferase als Zielpolypeptid ausgewählt. Luziferase produziert
bei der Umsetzung des Substrates Luziferin Lichtquanten, deren Anzahl
zur Menge an aktivem und damit korrekt gefaltetem Enzym (Luziferase)
proportional ist.
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a) Luziferase-Assay
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Als
Kontroll- oder Prüflösung wurde
eine Luziferaselösung
bereitgestellt, welche die nachstehenden Parameter aufwies: 100
mM TRIS-HCl, 200 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, pH 7.8. 80 μl dieser Lösung wurden
zu Messung verwendet.
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Unmittelbar
vor dem Start der Messung wurde nach dem Vermischen mit 400 μl einer Lösung mit den
Parametern 2,5 mM ATP, 5 mM MgSO4, 100 mM TRIS-HCl,
200 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, pH 7.8 aus einer Stammlösung Luziferin
zur Luziferaselösung
hinzugegeben, so dass das Luziferin eine Endkonzentration von 100 μM im Messansatz
von 500 μl
erreichte. Die Luminszenz läßt sich
bei 550 nm bei einer spektralen Bandbreite von 30 nm an einem Spektralphotometer
(Shimadzu RF2000) spektralphotometrisch bei ausgeschalteter Photometer-Lampe oder an einem
Lumineszenz-Meßgerät (Berthold) verfolgen.
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b) Coexpression von Luziferase und APIase
-
Dnak
als APIase wurde zusammen mit Luciferase in E. coli exprimiert.
Dabei wurde die Ausbeute an löslicher
Luziferase durch Änderung
des Temperaturregimes der E. coli-Kultur (bis zu 40°C) optimiert. Zu
verschiedenen Zeiten nach IPTG-Zugabe zu den E. coli-Zellen wurden
die Zellen geerntet und entsprechend einer von A. A. Michels et
al. (Eur. J. Biochem. 234(1995), 382–389) erarbeiteten Vorschrift lysiert.
Nach Abzentrifugation der unlöslichen Zellbestandteile
von dem entsprechenden Lysat wurde die Luziferase-Aktivität der verbleibenden
Lösung
wie oben angegeben bestimmt. Die Luziferase-Aktivität des Versuchs
der Coexpression von Luziferase und DnaK ist in der 1 gezeigt
(linke Säule).
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Beispiel 1: Herstellung eines DnaK-Luciferase-Fusionsproteins
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Zunächst wurde
ein DNA-Fragment, kodierend für
die Aminosäuresequenz
DnaK-(GGGS)2GG und eingeschlossen durch NdeI- and BamHI-Restriktionsseiten,
sowie ein DNA-Fragment, kodierend für die Aminosäuresequenz
(GGGS)2GGG-Luciferase und eingeschlossen durch BamHI- and XhoI-Restriktionsseiten,
mittels gentechnischer Methoden hergestellt. Als Primer wurden dazu
folgende Sequenzen benutzt: (a): SEQ ID. No 1; (b): SEQ ID. No 2;
(c) SEQ ID. No 3; (d) SEQ ID. No 4.
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Anschließend wurden
die DNA-Fragmente unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme
gespalten und mittels Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt.
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Die
entsprechende DnaK-Luciferase-Kassette wurde durch Ligation der
entsprechenden DNA-Fragmente in einen pET28a-Vektor hergestellt, wobei die NdeI/BamHI-Restriktionsschnittstelle
des Vektors von dem DnaK-(GGGS)2GG-Konstrukt und die BamHI/XhoI-Schnittstelle
von dem (GGGS)2GGG-Luciferase-Konstrukt
flankiert wurde. Die Richtigkeit der Sequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung überprüft. Die
zusätzlichen
Glycin- bzw. Serinreste dienen dabei als Linker.
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Die
Expression des Fusionsproteins wurde durch IPTG im E. coli-Stamm
BL21 induziert. Die Aufarbeitung des Fusionsproteins und die Bestimmung der
Luziferase-Aktivität
erfolgte wie im Vergleichsbeispiel beschrieben.
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Die
Luziferase-Aktivität
der durch das Fusionsprotein gewonnenen Luziferase ist in der 1 gezeigt
(rechte Säule).
Die Ausbeute an aktiver Luziferase ist hier deutlicher höher als
bei der Coexpression (vgl. 1, linke
Säule).
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Beispiel 2: Polypeptidassoziat mit einer
getagten Dnak und einer getagten Luziferase
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Mittels
gentechnischer Methoden wurde ein Vektor mit einer DNA-Sequenz hergestellt,
die eine C-terminal Strep(II) (SEQ ID. No 5)-getagte Luziferase
kodiert, sowie ein Vektor mit einer DNA-Sequenz, die ein N-terminal
Streptactin (eine Streptavidin-Mutante)-getagtes Dnak kodiert. Die
Plasmid-Konstrukte
wurden entsprechend dem Standardprotokoll (J. Sambrook & D. W. Russel: „A laboratory
manual", 3. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory 2001) hergestellt. Die Affinitätskonstante
zwischen Streptactin und dem Strep(II)-Tag ist größer als
1013 M–1.
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Mit
den beiden vorgenannten Vektoren transfizierte E. coli Zellen wurden
bei 37°C
in LB (Luria-Bertani)-Medium, versetzt mit AMP (200 μg/ml), Tetracyclin
(10 μg/ml)
und Streptomycin (50 μg/ml), angezogen.
Für die
Expression wurden die Bakterienstämme E. coli BL21(DE3), E. coli
BL21(DE3) pLysS und E. coli Rosetta(DE3) mit den entsprechenden
pASK Vektoren eingesetzt. Zur Verbesserung der Expressionsrate können die
Konstrukte aber auch in einen pET28a-Vektor mit einem T7-Promomotor kloniert
werden.
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Nach
Induktion der Polypeptidsynthese wurde die Coexpression beider Proteinkonstrukte
durch Variation von Temperatur und Inkubationszeit optimiert. Die
Aufarbeitung des Polypeptidassoziats bzw. der Luziferase und die
Bestimmung der Luziferase-Aktivität erfolgten wie im Vergleichsbeispiel
beschrieben.
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In
dem Beispiel 2 war die Luziferase-Aktivität verhältnismäßig höher als die in der 1,
linke Säule
gezeigte.
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Beispiel 3: Herstellung einer N-terminal
Streptactin-getagten
und C-terminal His-getagten DnaK und Einsatz derselben bei einer
Polypeptidrückfaltung
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Ein
mit einem C-terminalen His-Tag (6 aufeinander folgende Histidin)
und N-terminalen Streptactin-Tag versehene DnaK wurde entsprechend
der von E. Rungeling et al. angegebenen Prozedur (FEMS Microbiol
Lett. 170(1999)119–123)
hergestellt. Statt des dort angegebenen E. coli-Stammes kann auch
der DnaK defiziente Stamm BB1553 (B. Bukau & G. C. Walker: EMBO J. 9(1990)4027–4036) dazu
verwendet werden.
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Sowohl
der His-Tag als auch der Streptactin-Tag kann zur Aufreinigung der
APIase aus dem entsprechenden Zelllysat genutzt werden. So wurde das
in Rede stehende Konstrukt gemäß einer
Standardprozedur (Sigma) an ein Nickel-NTA-Säulenmaterial
gebunden und aufgereinigt. Anstatt das Polypeptid jedoch von dem
Säulenmaterial
mittels einer Imidazol-Lösung
abzutrennen und so zu gewinnen, wurde es auf dem Material belassen
und zusammen mit diesem in einer Rückfaltung eines Zielpolypeptids eingesetzt.
Als Zielpolypeptid kam dabei C-terminal Strep(II)-getagte Luciferase
zum Einsatz, die bei ihrer Expression in E. coli in Form von Inclusionbodies angefallen
war.
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Dazu
wurden 100 mg der vorgenannten Inclusionbodies in 1 ml einer 6 M
Harnstofflösung,
enthaltend 5 mg DTT, solubilisiert und die erhaltene Lösung zur
Abtrennung von Feststoffen filtriert.
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In
einem mit einem Rührer
versehenen Becherglas wurden 100 μl
des an dem Nickel-NTA-Säulenmaterial
gebundenen DnaK-Konstrukts
in 100 ml TRIS-HCL-Puffer (100 mM, pH 7,6) bei Raumtemperatur suspendiert.
Unter starkem Rühren
wurde dann bei Raumtemperatur zu dieser Suspension in Aliquoten
von jeweils 20 μl
1 ml der polypeptidhaltigen Harnstofflösung gegeben.
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Danach
wurde das Gemisch bei 5°C über Nacht
aufbewahrt. Anschließend
wurde das Säulenmaterial
in eine Mikrosäule überführt und
mit 50 ml Waschpuffer (100 mM Tris, pH 8,0) gewaschen. Das Zielpolypeptid
ließ sich
anschließend
mit einem Elutionspuffer (100 mM Tris, 5 mM Desthiobiotin, pH 8,0) von
dem DnaK-Konstrukt ablösen.
Die Ausbeute an rückgefalteter
Luciferase war sehr hoch im Vergleich zu einem entsprechenden Rückfaltungsversuch
in Abwesenheit einer APIase.
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Aufgrund
der sehr hohen Ausbeute an rückgefaltetem
Zielpolypeptid ist ein fester Träger,
beispielsweise eine Sepharose, auf dem eine mit einem Tag versehene
APIase fest, z.B. kovalent, gebunden ist, von besonderem kommerziellen
Interesse.
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.