DE102006028076A1

DE102006028076A1 - APlase-Proteinkonstrukt

Info

Publication number: DE102006028076A1
Application number: DE200610028076
Authority: DE
Inventors: Günter Prof. Dr. Fischer; Cordelia Dr. Schiene-Fischer; Gerhard Dr. Küllertz
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2006-06-19
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2007-12-20
Also published as: WO2007147527A2; WO2007147527A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Proteinkonstrukt zur Herstellung löslicher Polypeptide. Um eine Möglichkeit bereitzustellen, mit welcher sich auf einfache und damit kostengünstige Weise verschiedenste Polypeptide in löslicher Form herstellen lassen, wird ein Proteinkonstrukt vorgeschlagen, umfassend ein Fusionsprotein mit einem ersten Aminosäuresequenzabschnitt und einem zweiten Aminosäuresequenzabschnitt, wobei der erste Aminosäuresequenzabschnitt eine Sekundär-Amid-Peptidbindungs-spefizische cis/trans-Isomerase (APIase) kodiert und der zweite Aminosäuresequenzabschnitt ein beliebiges erstes Polypeptid kodiert, oder umfassend ein Polypeptidassoziat, enthaltend ein mit einem ersten Tag versehenes erstes Polypeptidmolekül und ein mit einem zweiten Tag versehenes zweites Polypeptidmolekül, wobei das erste Polypeptidmolekül eine APIase ist und das zweite Polypeptidmolekül ein beliebiges zweites Polypeptid ist und wobei der erste Tag an dem zweiten Tag spezifisch bindet, vorzugsweise mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 µM.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein APIase-Proteinkonstrukt.
Die Herstellung von ihre native Struktur aufweisenden Polypeptiden ist unter anderem hinsichtlich wissenschaftlicher, diagnostischer oder therapeutische Zwecke im human- oder tiermedizinischen Bereich von großem wirtschaftlichen Interesse, da in der Regel nur Polypeptide in ihrer nativen Struktur löslich sind und ihre entsprechende Funktion ausüben können.
Weisen hingegen Polypeptide eine von ihrer nativen Struktur abweichende Struktur auf, die auch als abweichende Raumstruktur (aRu) bezeichnet wird, so neigen diese häufig zur Ausbildung unlöslicher Polypeptidaggregate, wobei Polypeptide mit einer aRu oder in aggregierter Form im Vergleich zu löslichen nativen Polypeptiden im Allgemeinen entweder nicht ihre angestammte Funktion ausüben können oder unerwünschte Eigenschaften aufweisen. Dabei werden unter dem Begriff der aRu solche Strukturen verstanden, die von der nativen Struktur eines Polypeptids abweichen, so zum Beispiel denaturierte Polypeptide, teildenaturierte Polypeptide oder nichtnative Polypeptide.
Native Polypeptide lassen sich beispielsweise mittels denaturierender Substanzen wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid in solche mit einer aRu überführen. Durch eine Absenkung der Konzentration dieser Substanzen oder durch ihre Entfernung kann dieser Vorgang unter Umständen unter geeigneten Bedingungen umgekehrt werden. Die Wissenschaftsliteratur summiert diese Verfahren häufig unter dem Begriff der Proteinfaltung oder der Proteinrückfaltung.
Gegenwärtig beruht die Herstellung von Polypeptiden im Wesentlichen auf drei Verfahren, nämlich auf der Genexpression (in vivo-Expression), auf der in vitro-Translation (auch in vitro-Expression genannt) und auf der chemischen Synthese.
Die Genexpression von Polypeptiden beruht wie die in vitro-Translation auf der rekombinanten DNA-Gentechnik. Diese Technik erlaubt es, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die Polypeptide mit einer beliebigen Aminosäuresequenz kodieren.
Bei der in vitro-Translation an sich wird eine DNA-Sequenz außerhalb einer biologischen Zelle ribosomal zu einem entsprechenden Polypeptid translatiert (siehe hierzu z.B. Ying, B. et al.: BBRC 320(2004)1359–64). Bei der Genexpression hingegen wird die DNA-Sequenz in einem geeigneten Expressionsvektor in eine biologische Zelle eingeführt, in welcher dann das entsprechende Protein produziert wird.
Die Methoden der Genexpression und der in vitro-Translation sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise im Lexikon der Biochemie, Spektrum-Verlag oder in T. Spahl u. T. Deichmann, Lexikon der Gentechnik, Eichhorn-Verlag beschrieben.
Auch die chemische Synthese von Polypeptiden, bei der häufig Polypeptidsegmente synthetisiert und nachträglich zu Polypeptiden verknüpft werden (Ligation), z.B. mittels der Inteintechnik (Dawson et al., Science, 266(1994), 776–9), sind im Stand der Technik bekannt und umfangreich publiziert (vgl. hierzu Merrifield Angew. Chem. 97(1985)799–810).
Auch Kombinationen der drei vorgenannten Techniken werden eingesetzt, um Polypeptide herzustellen, wie z.B. in den Dokumenten EP 1 621 556 , US 2005100987 , US 2004166561 oder US 2004172688 beschrieben.
Unabhängig davon, welche der drei vorgenannten Methoden oder welche Kombination dieser Methoden zur Herstellung eines Polypeptids eingesetzt wird, enthalten diese Methoden bzw. Kombinationen dieser Methoden allesamt eine Vielzahl von Teilschritten, von denen einer oder mehrere für die Herstellung von löslichen Polypeptiden mit einer nativen Struktur kritisch sein können, einschließlich der Schritte, welche die Aufreinigung des gewünschten Polypeptids betreffen, um das gewünschte Polypeptid von unerwünschten Begleitstoffen zu trennen.
Die genannten kritischen Schritte zeichnen sich in der Regel dadurch aus, dass es innerhalb dieser zur Ausbildung von intramolekularen oder intermolekulare Wechselwirkungen zwischen Polypeptidsegmenten eines Polypeptids bzw. verschiedener Polypeptidmoleküle kommt. Diese intra- oder intermolekularen Wechselwirkungen können einen nachteiligen Einfluss auf die Ausbildung der nativen Struktur eines entsprechenden Polypeptids haben und entsprechend die Bildung von Polypeptiden mit einer unerwünschten aRu begünstigen.
Die Herstellung von Polypeptiden gestaltet sich häufig auch deshalb als problematisch, da, wenn ein gewünschtes Polypeptid einmal eine aRu eingenommen hat, dieses oft zunächst in seine native Struktur überführt werden muss, um den Herstellungsprozess weiter fortzusetzen. Um die Ausbildung einer aRu eines gewünschten Polypeptids während der Herstellung oder Lagerung zu vermeiden oder rückgängig zu machen, sind für sämtliche Teilschritte des Produktionsprozesses von Polypeptiden eine Vielzahl von Techniken und Methoden entwickelt worden, die sich von der Herstellung des Polypeptids an sich, einschließlich der Herstellungsbedingungen, über die Aufreinigung des Polypeptids bis hin zu dessen Lagerung erstrecken.
Zahlreiche so genannter Proteinfaltungs- und Proteinentfaltungsstudien wurden vorgenommen, um zu ergründen, wie eine vorgegebene beliebige Raumstruktur eines Polypeptids in vitro beeinflusst werden kann. In diesen Studien wurden unter anderem verschiedenste Substanzen darauf hin untersucht, inwieweit sie in der Lage sind, ein Polypeptid mit einer unerwünschten Raumstruktur aRu in ein Polypeptid mit einer nativen Struktur zu überführen.
Bei den vorgenannten Studien wurden eine Vielzahl von Substanzen und Substanzgemischen aufgefunden, die geeignet sind, das Verhältnis des Anteils von einem Polypeptid mit einer nativen Struktur zu dem entsprechenden Polypeptid mit einer aRu in Richtung des Polypeptids mit der nativen Struktur zu beeinflussen (siehe hierzu beispielsweise die US 2004049012 ). So können z.B. verschiedene Salze (vgl. hierzu die NZ 512098) wie TRIS (vgl. hierzu die US 5,618,927 , DE 40 37 196 ) oder Zitrat in Kombination mit den unterschiedlichsten chemischen Verbindungen (vgl. hierzu die US 5,352,453 ), Polyionen (vgl. hierzu die JP 2004315541 , WO 9640784), Aminosäuren (vgl. hierzu Arakawa T. et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 304(2003), 148–152) oder auch Proteine, wie z.B. ein oder auch mehrere kleine Hitzeschockproteine (vgl. hierzu die JP 7025897 , DE 42 39 969 , US 2004157289 ), Chaperone wie GroEL, GroES, Dank oder DnaJ (vgl. hierzu die EP 556 726 ), Bindeproteine (vgl. hierzu die US 2004033564 , WO 3059945) oder kleine Bindemoleküle (vgl. hierzu die WO 0 032 175) die Raumstruktur von Polypeptiden in Richtung der nativen Struktur des Polypeptids beeinflussen.
Generell konnte gezeigt werden, dass Substanzen oder Substanzgemische, welche das Verhältnis des Anteils von einem Polypeptid mit einer nativen Struktur zu dem entsprechenden Polypeptid mit einer aRu in Richtung des Polypeptids mit der nativen Struktur begünstigen, den Faltungsweg des Polypeptids beeinflussen, wobei den vorgenannten aufgefundenen Substanzen diese beeinflussenden Eigenschaften nicht generell für jedes beliebige Polypeptid zukommen, sondern die Art der Substanz oder des Substanzgemisches sowie dessen Konzentration vielmehr individuell auf das jeweilige Polypeptid abgestimmt und optimiert werden muss. Dazu wurden mehrere Optimierungsstrategien entwickelt, die in der Literatur ausführlich beschrieben sind (vgl. hierzu Clark E. D. B. et al., Current Opinion in Biotechnology, 9(1998), 157–163; Maeda Y. et al., 9(1996), 461–465; Wetlaufer D. B. et al., Protein Sci, 4(1995), 1535–43).
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sich das Verhältnis des Anteils von einem Polypeptid mit einer nativen Struktur zu dem entsprechenden Polypeptid mit einer aRu in Richtung des Polypeptids mit der nativen Struktur verschieben lässt, indem physikalische Parameter wie z.B. Temperatur und/oder Druck unter Umständen auch in Gegenwart verschiedenster Substanzen oder Substanzgemische variiert werden. Dabei konnten auch verschiedenste „Faltungsintermediate" isolieren werden, die strukturell zwischen einem vollständig denaturierten Polypeptid und seiner nativen Form anzusiedeln sind.
Offensichtlich bewirken die oben genannten Substanzen und Substanzgemische sowie eine Variation der physikalischen Parameter wie Druck und Temperatur die Bevorzugung eines von mehreren möglichen Faltungswegen, was zu einem höheren Anteil an Polypeptid mit nativer Struktur führen kann (vgl. hierzu die US 6,613,398 ).
Gegenstand des Interesses waren auch solche Methoden, mit welchen die Raumstruktur eines Polypeptids in vivo beeinflusst werden kann, wobei in diesem Zusammenhang von besonderer Bedeutung war, wie sich die Raumstruktur eines Polypeptids beeinflussende Mitteln in das zelluläre Milieu der Zelle, in der das gewünschte Polypeptid hergestellt werden soll, einbringen lassen.
In diesem Zusammenhang hat sich in einigen Fällen die Coexpression von solchen Proteinen als durchaus vorteilhaft erwiesen, welche die Bildung der nativen Struktur eines Polypeptids unterstützen. So führte z.B. die Coexpression von Chaperonen parallel zum gewünschten Polypeptid in einigen Fällen zu einer erhöhten Löslichkeit desselben, was als ein Indikator dafür angesehen wird, dass das entsprechende Polypeptid in seiner nativen Struktur vorliegt (vgl. hierzu Venkatesh B. et al., Biosci, Biotechnol. Biochem, 68(2004), 2096–2103).
Die Wirkung der Chaperone beruht vermutlich auf ihrer Wechselwirkung mit hydrophoben Bereiche des gewünschten Polypeptids, so dass intra- und intermolekulare Wechselwirkungen zwischen diesen Bereichen vermieden und dadurch eine Aggregation der Polypeptide oder deren fehlerhafte Faltung umgangen werden (vgl. hierzu Houry W. A. et al., Nature, 402(1999), 147–154; Hartel F. U., Nature, 381(1996), 571–580).
Neben den Chaperonen, die keine auf eine Peptidkette gerichtete Enzymaktivität besitzen, sind auch Proteine, die eine Isomerisierungsaktivität bezüglich der cis/trans-Isomerisierung des Polypeptidrückgrates aufweisen, hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Faltung von Polypeptiden untersucht worden. So konnte anhand von in vitro-Untersuchungen in einigen Fällen gezeigt werden, dass sich durch Zusatz von PPIasen, welche die Geschwindigkeit der cis/trans-Isomerisierung von Prolyl-Peptidbindungen katalytisch erhöhen können, der Anteil an löslichem gewünschtem Proteinen steigern lässt (vgl. hierzu Golbik R. et al., Biochemistry, 44(2005), 16026–16034; Kim S. G. et al., Protein Expression & Purification, 41(2005), 426–432).
Durch den Zusatz einer PPIase zu einem gewünschten Polypeptid kann vermutlich durch deren katalytische Aktivität die Beweglichkeit des Peptidrückgrates eines entfalteten Polypeptids erhöht werden, wodurch vermutlich vermehrt solche Faltungswege eingeschlagen werden können, welche zur Ausbildung eines Polypeptids mit nativer Struktur führen.
Durch Hemmung der Faltungshelferenzymaktivität von entsprechenden Enzymen mittels geeigneter Substanzen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass einige dieser Faltungshelferenzyme auch Chaperon-Eigenschaften besitzen, wie z.B. der Trigger Factor (vgl. hierzu Zarnt, T. et al., J. Mol. Biol, 271(1997), 827–37), das SurA (vgl. hierzu Behrens et al., EMBO J, 20(2001), 285–294), das DsBA (vgl. hierzu Frech C. et al., EMBO J, 15(1996), 392–98), das FkpA und das SlyD (vgl. hierzu US 6,962,982 ).
Obwohl zahlreiche dieser Faltungshelferenzyme in den zur Polypeptid-Produktion eingesetzten Zellen von Natur aus vorkommen, konnte in mehreren Untersuchungen gezeigt werden, dass eine Erhöhung der Konzentration dieser Faltungshelferenzymen, auch von wirtsfremden oder biochemisch veränderten Faltungshelferenzyme, in den für die Produktion des gewünschten Polypeptids wichtigen Zellkompartimenten, beispielsweise durch Coexpression, die Bildung des gewünschten Polypeptids in seiner nativen Struktur vorteilhaft beeinflussen können (vgl. hierzu die WO 99/22010, US 20030096352 , JP 11092495 ).
Dabei werden unter dem Begriff der Coexpression im Allgemeinen alle die Prozesse verstanden, bei welchen in zeitlicher Nähe zur Expression des gewünschten Polypeptids die Expression des die Faltung des gewünschten Polypeptids beeinflussenden Polypeptids so erfolgt, dass in mindestens einem Zellkompartiment der Faltungshelfer mit dem gewünschten Polypeptid in Kontakt treten kann.
Im Unterschied zu den PPIasen, deren Substratspezifität auf die cis/trans-Isomerisierung von Prolyl-Peptid-Bindungen gerichtet ist, ist die Substratspezifität der neu entdeckten Familie der Sekundär-Amid Peptidbindungs cis/trans-Isomerasen (APIasen) auf die cis/trans-Isomerisierung von sekundären Amidpeptidbindungen gerichtet (vgl. hierzu Schiene-Fischer C. et al., Biological Chemistry, 383(2002), 1865–1873; Schiene-Fischer C. et al., Nature Structural Biology, 9(2002), 419–424; WO 03/018618).
Zwar konnte auch in in vitro-Untersuchungen gezeigt werden, dass Vertreter der APIasen effektive Katalysatoren sind, welche den Anteil an löslichem gewünschtem Proteinen erhöhen können (vgl. hierzu Schiene-Fischer C. et al., Biological Chemistry, 383(2002), 1865–1873). Aber entgegen den Erwartungen führte die Coexpression von einer APIase mit verschiedenen gewünschten Polypeptiden nur zu einer marginalen Erhöhung des Anteils an löslichem gewünschtem Polypeptid.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Möglichkeit bereitzustellen, mit welcher sich auf einfache und damit kostengünstige Weise verschiedenste Polypeptide in löslicher Form herstellen lassen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Proteinkonstrukt gelöst, umfassend ein Fusionsprotein mit einem ersten Aminosäuresequenzabschnitt und einem zweiten Aminosäuresequenzabschnitt, wobei der erste Aminosäuresequenzabschnitt eine Sekundär-Amid Peptidbindungs spezifische cis/trans-Isomerase (APIase) kodiert und der zweite Aminosäuresequenzabschnitt ein beliebiges erstes Polypeptid kodiert, oder umfassend ein Polypeptidassoziat, enthaltend ein mit einem ersten Tag versehenes erstes Polypeptidmolekül und ein mit einem zweiten Tag versehenes zweites Polypeptidmolekül, wobei das erste Polypeptidmolekül eine APIase ist und das zweite Polypeptidmolekül ein beliebiges zweites Polypeptid ist und wobei der erste Tag an dem zweiten Tag spezifisch bindet, vorzugsweise mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM.
Erfindungsgemäß wird unter einer APIase ein Polypeptid verstanden, das eine APIase-Aktivität aufweist, d.h. eine katalytische Aktivität, welche die cis/trans-Isomerisierung von sekundären Amid-Peptidbindungen beschleunigt. Um eine solche katalytische Aktivität nachzuweisen, sind dem Fachmann mehrere Untersuchungsmethoden aus dem Stand der Technik bekannt, welche durch die nachstehenden Referenzen in die vorliegende Erfindung miteinbezogen werden (Schiene-Fischer C. et al., Biological Chemistry, 383(2002), 1865–1873; Schiene-Fischer C. et al., Nature Structural Biology, 9(2002), 419–424; WO 03/018618).
Neben den in der Natur vorkommenden, eine APIase-Aktivität aufweisenden Polypeptiden, deren Aminosäuresequenz genkodiert vorliegt, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „APIase" auch solche APIasen verstanden, bei welchen mittels dem Fachmann bekannter Methoden die Aminosäuresequenz einer natürlichen APIase durch Verlängern oder Verkürzen der Sequenz, den Einbau einer oder mehrer neuer zusätzlicher Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen, oder dem Ausschneiden einer oder mehrere Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen so verändert worden ist, dass die veränderte Aminosäuresequenz zur natürlichen Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität von größer/gleich 15% aufweist, vorzugsweise eine von größer als 50%, bevorzugt eine von größer als 70%, weiter bevorzugt eine von größer als 90%, mehr bevorzugt eine von größer als 95%, mehr bevorzugt eine von größer als 98% und am meisten bevorzugt eine von größer als 99%. Die Identitätswerte in % können beispielsweise mit WU-BLAST-2 ermittelt werden (Tatusova TA 1999).
Darüber hinaus werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „APIase" auch solche APIasen verstanden, bei welchen mittels dem Fachmann bekannter und im Allgemeinen als Derivatisierung bezeichneter Methoden ein oder mehrere Aminosäurereste der Aminosäuresequenz einer natürlichen APIase, beispielsweise eine Seitenkette eines Aminosäurerestes oder der N- oder C-Terminus, derivatisiert sind, beispielsweise chemisch modifiziert. Solche Veränderungen an der APIase können beispielsweise dazu dienen, wie im Allgemeinen für Proteine bekannt, die Löslichkeit der APIase zu ändern, die Stabilität gegenüber Proteasen zu erhöhen, unerwünschten oder gewünschten Interaktion zu anderen Polypeptiden oder Zellstrukturen entgegenzuwirken bzw. zu bewirken oder um Vorteile für einen Polypeptid-Herstellungsprozeß zu bewirken, wie z.B. eine gewünschte Affinität zu Trennmaterialien.
Ferner werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „APIase" auch solche APIasen verstanden, die durch strukturelle Komplementierung gebildet werden. Dabei beinhaltet der Begriff der „strukturellen Komplementierung" die Ausbildung einer deutlichen APIase-Aktivität erst durch Assoziation von mehreren inaktiven APIase-Komponenten, d.h. die APIase des Fusionsprotein oder des Polypeptidassoziats ist in diesem Fall eine Komponente einer APIase. Unter inaktiven APIase-Komponenten sollen dabei solche Komponenten verstanden werden, welche weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 1%, APIase-Aktivität im Vergleich zur APIase-Aktivität einer komplementierten APIase aufweisen, oder vorzugsweise eine APIase-Aktivität von kleiner 0,01%. Bei den inaktiven APIase-Komponenten kann es sich beispielsweise um APIase-Teilsequenzen handeln oder um ein oder mehrere Aktivatormoleküle, deren Interaktion mit einer anderen inaktiven APIase-Komponente eine solche strukturelle Veränderung hervorruft, dass eine deutliche APIase-Aktivität entsteht.
Die inaktiven APIase-Komponenten können beispielsweise aber auch ein Fängermolekül enthalten, wobei nach spezifischer Bindung einer entsprechenden Substanz an das Fängermolekül eine an die APIase gebundene, die Aktivität der APIase unterdrückende Substanz freigesetzt oder entfernt und so die strukturelle Komplementierung der APIase herbeigeführt wird. Das Konzept der strukturellen Komplementierung ist ausführlich in der US 2005019829 beschrieben.
Umfasst das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt ein Polypeptidassoziat, so beinhaltet dieses die APIase sowie das zweite Polypeptid, die über eine nicht-kovalente Bindung miteinander über zwei sogenannte Tags verbunden sind. Unter Tags werden spezifische Bindungspartner in Form von Oligo- oder Polypeptiden verstanden, die beispielsweise mittels dem Fachmann bekannter gentechnischer Methoden (vgl. hierzu JP 20055315688 , US 2005221308 , US 2005214900 oder Lichty J. J. et al., 41(2005), 98–105.) auf DNA-Ebene so mit der APIase oder dem zweiten Polypeptid verknüpft werden können, dass durch die ribosomale Proteinsynthese die APIase und/oder das zweite Polypeptid zusammen mit der Tag-Sequenz synthetisiert werden.
Beispiele für bevorzugte Tags sind das Biotin-Tag (Tucker J. and Grisshammer R., Biochem. J, 317(1996), 891–899; BioMethods: "A laboratory guide to biotin-lableing in biomolecule analysis", Vol. 7, Birkhäuser Verlag, ISBN 3-7643-5206-X), das Streptavidin-Tag (Cass B. et al., Protein Expr. Purif, 40(2005), 77–85), das PinPoint-Tag ( US 5,252,466 , US 5,276,062 ), das CBD-Tag (Tomme, P. et al., Protein Engineering, 7(1994), 117–123), das MBP-Tag (R. Gräf, Anal. Biochem, 289(2001), 297–300) oder auch Tags wie FLAG, GST, ProteinA oder Thioredoxin (WO 00/73464). Die an die vorgenannten Tags spezifisch bindenden Bindepolypeptide werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung entsprechend auch als Tags bezeichnet.
Darüber hinaus sind zahlreiche Methoden bekannt, die es dem Fachmann erlauben, immer neue Tags aufzufinden (siehe hierzu Yu C. et al., Angew. Chemie, 44 (2005), 1408–1412; Verge et al., Tetrahedron Letters, 43(2002), 2363–6); Cooper M. A., Analytical & Bioanalytical Chemistry, 377(2003), 834–842.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter den Begriffen Oligopeptide und Polypeptide Peptide verstanden, die 2 bis 9 bzw. mehr als 9 Aminosäurereste enthalten.
Das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats werden im Folgenden auch als gewünschtes Polypeptid oder als Zielpolypeptid bezeichnet.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung genannten thermodynamischen Affinitätskonstanten lassen sich mittels vielfältiger, dem Fachmann bekannter Methoden, wie z.B. mittels Kalorimetrie (vgl. z.B.: Bruylants, G. et al.: Current Medicinal Chemistry 12(2005)2011–2020) oder mittels Surface Plasmone Resonanz Techniken (vgl. z.B. Plattnaik P.: Applied Biochemistry & Biotechnology 126(2005)79–92) bestimmen. Die Konstante selbst lässt sich ausdrücken als Bruch zweier kinetischer Konstanten, der Anlagerungsgeschwindigkeit (k_on) und der Dissoziationsgeschwindigkeit (k_off) der das Polypeptidassoziat ausbildenden Bestandteile.
Das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt hat den Vorteil, dass sich mittels ihm verschiedenste Polypeptide in löslicher Form, das heißt Polypeptide mit ihrer nativen Struktur, herstellen lassen, insbesondere auch solche, die in anderen Herstellungsverfahren nur in unlöslicher oder nur in geringen Mengen in löslicher Form anfallen.
Ist das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt ein Fusionsprotein umfassendes Konstrukt, so enthält das Fusionsprotein vorzugsweise nur eine APIase und nur ein Zielpolypeptid, wobei das Zielpolypeptid beispielsweise sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus der APIase fusioniert sein kann. Das Fusionsprotein kann aber auch mehrere APIasen und/oder mehrere Zielpolypeptide enthalten, die in beliebiger Reihenfolge miteinander verknüpft sein können.
Ist das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt ein Polypeptidassoziat umfassendes Konstrukt, so enthält das Assoziat vorzugsweise nur eine getagte APIase und nur ein getagtes Zielpolypeptid, wobei die APIase und das Zielpolypeptid unabhängig voneinander beispielsweise entweder am N-Terminus oder am C-Terminus getagt sein können. Das Polypeptidassoziat kann aber auch mehrere APIasen und/oder mehrere Zielpolypeptide enthalten, die in beliebiger Reihenfolge miteinander verknüpft sein können. Beispielsweise kann die APIase sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus mit einem Tag versehen sein, wobei die beiden Tags voneinander verschieden sind. Durch Inkontaktbringen einer derart ausgebildeten APIase mit zwei voneinander verschiedenen Zielpolypeptiden, von denen das eine mit einem Tag versehen ist, das an dem N-terminalen Tag der APIase spezifisch bindet, und das andere mit einem Tag versehen ist, welches das C-terminale Tag der APIase spezifisch bindet, bildet sich ein Polypeptidassoziat aus, welches ein Molekül APIase und zwei voneinander verschiedene Moleküle Zielpolypeptid enthält.
Mittels des erfindungsgemäßen Polypeptidkonstrukts lassen sich Zielpolypeptide mit nahezu beliebiger Größe in löslicher Form herstellen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der Anteil an löslichem Zielpolypeptid umso höher ist, je kleiner das Zielpolypeptid ist. Vorzugsweise besteht das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats aus 10 bis 1000 Aminosäureresten, weiter vorzugsweise aus 20 bis 500 Aminosäureresten, bevorzugt aus 30 bis 300 Aminosäureresten und besonders bevorzugt aus 50 bis 200 Aminosäureresten.
Insbesondere Polypeptide, die in nativer Form eine definierte Tertiärstruktur aufweisen, neigen unter anderem aufgrund hoher Expressionsgeschwindigkeiten zur Ausbildung von aRu, die in der Regel mit der Aggregation der Zielproteine und der Ausbildung fester Inclusionbodies einhergeht. Daher eignet sich das erfindungsgemäße Konstrukt insbesondere zur Herstellung löslicher Zielpolypeptide, die in nativer Form eine definierte Tertiärstruktur aufweisen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts weist daher das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats in seiner nativen Form eine definierte Tertiärstruktur auf.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Polypeptidkonstrukte enthaltend spezielle Zielpolypeptide beschränkt. Aus wirtschaftlichen und damit auch aus Kostengründen kann das erfindungsgemäße Polypeptidkonstrukt insbesonders vorteilhaft zur Herstellung von Zielpolypeptiden eingesetzt werden, die beispielsweise bei ihrer Expression zur Bildung von Inclusionbodies führen oder sich nur in geringen Mengen in Bakterien oder eukaryote-Wirtszellenh in löslicher Form herstellen lassen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Konstrukts ist daher das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats ein Polypeptid, das bei separater Expression in E. coli, in Hefezellen, in Insektenzellen oder in Pflanzenzellen zur Ausbildung von Inclusionbodies führt oder das sich bei separater Expression in Bakterien oder in eukaryontischen Wirtszellen nur in geringen Mengen in löslicher Form herstellen lässt, vorzugsweise in Mengen von im Mittel weniger als 1 Pikogramm (pg) pro Bakterium oder Wirtszelle.
Das Zielpolypeptid kann auch jegliches Polypeptid sein, dessen Herstellung für allgemein wirtschaftliche, wissenschaftliche, für diagnostische oder für therapeutische Zwecke in der Human- oder Tiermedizin von Bedeutung ist. Dies können z.B. sein Zytokine, Hormone, aktivierende oder inhibierende Faktoren oder Enzyme.
Günstig ist es, wenn das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zytokinen, Hormonen, Enzymen, Membranproteinen, Strukturproteinen, Transportproteinen und aktivierenden oder inhibierenden Faktoren. Insbesondere diese Polypeptide lassen sich mittels eines entsprechenden Proteinkonstrukts in verhältnismäßig großer Ausbeute in löslicher Form herstellen.
Es kann vorgesehen sein, dass die APIase mit einer oder mehreren posttranslationalen Modifikationen versehen ist.
Bevorzugt ist es, wenn die APIase eine mittels eines Aktivatormoleküls aktivierbare APIase ist. Bei dem Einsatz einer derartig ausgebildeten APIase kann die APIase-Aktivität über die Konzentration an Aktivatormolekül gesteuert und damit für ein jeweiliges Zielpolypeptid angepasst werden.
Ferner kann es bevorzugt sein, dass die APIase eine mittels Inaktivierung eines Inhibitors aktivierbare APIase ist. Auch bei dem Einsatz einer derart ausgebildeten APIase kann die APIase-Aktivität über die Konzentration an Aktivatormolekül gesteuert und damit an ein jeweiliges Zielpolypeptid angepasst werden.
Die APIase hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli weist eine verhältnismäßig hohe APIase-Aktivität auf. Es konnte gezeigt werden, dass sich mittels dieser APIase auch besonders hydrophobe Polypeptide in löslicher Form herstellen lassen. Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts ist daher die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli oder ein Ortholog davon desselben oder eines anderen Organismus.
Günstig ist es, wenn die APIase an ein Trägermaterial gebunden ist. Zum einen kann die Gegenwart eines Trägermaterials die Stabilität der Raumstruktur der APIase erhöhen, insbesondere wenn denaturierende Agenzien zugegen sind. Zum anderen kann sich dass erfindungsgemäße Proteinkonstrukt durch die Bindung an einen Träger, die beispielsweise kovalenter Natur sein kann, verhältnismäßig einfach, beispielsweise durch zentrifugieren, von einer Lösung abgetrennt werden. Geeignete Trägermaterialien sind beispielsweise Polymerpartikel aus Polypropylen oder -ethylen.
Es kann bevorzugt sein, dass das Fusionsprotein einen dritten Aminosäuresequenzabschnitt umfasst, der zwischen dem ersten und dem zweiten Aminosäuresequenzabschnitt angeordnet ist und der einen Peptidlinker kodiert. Dadurch wird gewährleistet, dass das katalytisch aktive Zentrum der APIase auch bei sterisch anspruchsvollen Zielpolypeptiden sämtliche, die Faltung beeinflussende Peptidbindungen des Zielpolypeptids verhältnismäßig ungehindert erreichen kann. Von Vorteil ist dabei auch, wenn der Peptidlinker aus solchen Aminosäureresten gebildet ist, die dem Linker eine verhältnismäßig hohe Flexibilität verleihen, so dass diese in ihrer räumlichen Anordnung zu keiner sterischen Behinderung der Annäherung des aktiven katalytischen Zentrums der APIase an das Zielpolypeptid führen.
In Abhängigkeit von der Natur der APIase und/oder des Zielpolypeptids kann es bevorzugt sein, wenn der Peptidlinker aus bis zu 1000 Aminosäureresten besteht, vorzugsweise aus bis zu 100 Aminosäureresten und besonders bevorzugt aus 5 bis 30 Aminosäureresten.
Besitzt die verwendete APIase und das Zielpolypeptid im Bereich einer potentiellen Bindung aneinander aber solche Aminosäurereste, die es erlauben, dass das Zielpolypeptid und das aktive Zentrum der APIase problemlos zusammenwirken können, so dass es zur vermehrten Bildung an löslichem Zielpolypeptid kommen kann, so ist kein Peptidlinker von nöten.
Wird ein Peptidlinker eingesetzt, kann es von Vorteil sein, einen solchen Linker zu verwenden, der sich mittels im Stand der Technik beschriebener geeigneter Methoden gezielt spalten lässt, um das gewünschte Polypeptid ohne APIase in ungebundener Form zu erhalten. Sowohl geeignete Linker als auch entsprechende Methoden zur Spaltung der Linker sind im Stand der Technik bekannt, wobei die in der nachstehenden Referenz zitierten in die vorliegende Erfindung miteinbezogen werden (WO 99/13091).
Der Linker kann zum Beispiel die Sequenz Ile-Glu-Gly-Arg enthalten, die sich durch den Faktor Xa, eine Protease, spalten lässt. Es gibt beispielsweise auch Peptidlinker, die sich mittels anderer Proteasen spalten lassen, wie z.B. Thrombin, Enterokinase, Trypsin oder Collagenase. Der Linker kann auch so ausgeführt sein, dass er erst nach einer Behandlung mit geeigneten Chemikalien, wie z.B. Hydroxylamin, Bromcyan oder bei niedrigen pH-Werten gespalten wird.
Je nach Art der APIase und/oder des Zielpolypeptids kann es bevorzugt sein, wenn der Peptidlinker auf chemischem Weg oder mittels einer Protease spaltbar ist.
Dabei kann gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Konstrukts der Peptidlinker derart ausgebildet sein, dass er spezifisch mittels Faktor Xa, Thrombin, Enterokinase, Trypsin oder Collagenase spaltbar ist.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann es von Vorteil sein, wenn der Peptidlinker mittels Behandlung von Hydroxylamin, Bromcyan oder durch ein saures Milieu spaltbar ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Polynukleotid, dass das Fusionsprotein umfassende erfindungsgemäße Proteinkonstrukt kodiert oder eine mit einem Tag versehene APIase, wobei das Tag vorzugsweise an ein komplementäres Oligo- oder Polypeptid mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM spezifisch binden kann.
Die Erfindung betrifft ferner einen Vektor, umfassend das erfindungsgemäße Polynukleotid.
Die Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, enthaltend das erfindungsgemäße Proteinkonstrukt, das erfindungsgemäße Polynukleotid und/oder den erfindungsgemäßen Vektor.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Wirtszelle ist diese eine eukaryontische oder eine prokaryontische Zelle.
Besonders bevorzugt ist es, wenn die Wirtszelle ein E. coli ist, eine Hefezelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine humane Zelle.
Beispielsweise entsprechend den ausgewählten Vektoren kann das das Fusionsprotein umfassende Proteinkonstrukt in eukaryotischen oder in prokaryotischen Zellen hergestellt werden. Die für die Genexpression ausgewählten Zellen können selbst gezielt gentechnisch veränderte Zellen oder Organismen (Prokaryonten, Eukaryonten) sein (vgl. hierzu WO 2006014899, CN 1271777 ), deren Kultivierung wiederum unter für die Genexpression löslicher Proteine optimierten Kulturbedingungen erfolgten kann. Neben der Optimierung physikalischer Parameter (wie z.B. der Temperatur) oder der Optimierung physiologischer Parameter der zur Produktion verwendeten Zellen (z.B. Startpunkt der Expression oder Expressionsdauer in Abhängigkeit von physiologischen Zellzuständen, wie z.B. Alter oder Wachstumsphase) sind dem Fachmann zahlreiche weitere Methoden bekannt, um durch die gezielte Fusion eines herzustellenden Polypeptids mit einem weiteren Polypeptid ein Fusionsprotein zu erzeugen, welche ebenfalls in gewünschter Weise die Löslichkeit des gewünschten Polypeptids beeinflusst.
So sind dem Fachmann zahlreiche Methoden und Polypeptidsequenzen bekannt, z.B. H. Bannai et al., Bioinformatics, 18(2002), 298–305; M. Cokol et al., EMBO Rep, 1(2000)411–415, die es erlauben, die Konzentration eines Polypeptids gezielt in einem Zellkompartiment zu erhöhen (vgl. hierzu die WO 2005085431) oder auch das Polypeptid ganz aus der Zelle auszuschleusen (vgl. hierzu Novy, R. et al., inNovations, 7(1997), 4–7), wobei die vorgenannten Polypeptidsequenzen hiermit ausdrücklich in die Erfindung miteinbezogen werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte:

a) die in vivo- oder in vitro-Expression des Fusionsprotein umfassenden erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts unter Bedingungen, welche die Expression des Proteinkonstrukts erlauben;
b) die Spaltung des Proteinkonstrukts unter Freisetzung des ersten Polypeptids; und gegebenenfalls
c) die Gewinnung des ersten Polypeptids durch Aufreinigung.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte:

a) die Bereitstellung einer mit einem Tag versehenen APIase;
b) das Inkontaktbringen eines mit einem Tag versehenen Zielpolypeptids mit der APIase unter für das Zielpolypeptid denaturierenden Bedingungen, wobei der Tag des Zielpolypeptids unter den denaturierenden Bedingungen spezifisch an dem Tag der APIase bindet;
c) die Absenkung der Konzentration der die denaturierenden Bedingungen bewirkenden Substanzen auf eine Konzentration, die für das Zielpolypeptid nicht denaturierend wirkt;
d) die Lösung der Bindung zwischen dem Tag der APIase und dem Tag des Zielpolypeptids, vorzugsweise durch den Zusatz von geeigneten Substanzen; und gegebenenfalls
e) die Gewinnung des Zielpolypeptids durch Aufreinigung.

Neben dem Verfahren zur Herstellung löslicher Zielpolypeptide über die Expression von Fusionspolypeptide kann es von Vorteil sein, wenn das gewünschte lösliche Zielpolypeptid mittels einer getagten APIase hergestellt wird. Bei diesem Verfahren wird in der Regel zunächst die Bildung von Aggregaten des getagten Zielpolypeptids, dem Fachmann als „Inclusionbodies" (vgl. hierzu Markossian KA. et al., Biochemistry, 69(2004), 971–984; Klikova M., Chemicke Listy, 89(1995), 377–381) bekannt, als gewünschter Zwischenschritt ausgenutzt.
Um gezielt „Inclusionbodies" herzustellen, sind dem Fachmann zahlreiche Methoden bekannt, die umfangreich in der Literatur dokumentiert sind (vgl. hierzu US 2005283000 , US 2003104581 , EP 1 603 938 ). Die Herstellung löslicher Polypeptide über den Zwischenschritt der Herstellung von Inclusionbodies hat den Vorteil, dass diese festen Aggregate das Zielpolypeptid in der Regel schon in angereicherter Form enthalten und sich relativ einfach und kostengünstig von den übrigen Bestandteilen der zur Produktion eingesetzten Zellkultur abtrennen lassen.
Während es in wenigen speziellen Fällen mit guter Ausbeute gelingt, Inclusionbodies in Lösungen mit stark chaotropen Substanzen wie Urea, Guanidinhydrochlorid oder Thiocyanaten zu Solubilisieren (vgl. hierzu Tsumoto K. et al., Protein Expression & Purification, 28(2003), 1–8), und dann das Zielpolypeptid durch Absenkung der Konzentration an chaotroper Substanz in seiner native Struktur und damit in ein lösliches Polypeptid zu überführen, ist dieser Schritt für zahlreiche Polypeptide oft sehr problematisch und Gegenstand vielfältigster Studien.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das Tag wie vorstehend bezüglich des erfindungsgemäßen Proteinkonstrukts definierte.
Für das Zielpolypeptid denaturierende bzw. nicht denaturierende Bedingungen können beispielsweise durch die Aufnahme von Circular-Dichroismus-Spektren des Zielpolypeptids in Abhängigkeit von der Konzentration der entsprechenden denaturierenden Reagenzien bestimmt werden, wie dies umfangreich in der Literatur beschrieben ist.
Die Vorteile der nachfolgenden bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den entsprechenden obigen Ausführungen zu dem erfindungsgemäßen Proteinkonstrukt.
Bevorzugt ist es, wenn das Zielpolypeptid aus 10 bis 1000 Aminosäureresten besteht, vorzugsweise aus 20 bis 500 Aminosäureresten, bevorzugt aus 30 bis 300 Aminosäureresten und besonders bevorzugt aus 50 bis 200 Aminosäureresten.
Ferner kann es bevorzugt sein, dass das Zielpolypeptid in seiner nativen Form eine definierte Tertiärstruktur aufweist.
Darüber hinaus kann es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aus oben genannten Gründen von Vorteil sein, dass das Zielpolypeptid ein Polypeptid ist, das bei separater Expression in E. coli, in Hefezellen, in Insektenzellen oder in Pflanzenzellen zur Ausbildung von Inclusionbodies führt oder das sich bei separater Expression in Bakterien oder in eukaryontischen Wirtszellen nur in geringen Mengen in löslicher Form herstellen lässt, vorzugsweise in Mengen von im Mittel weniger als 1 pg pro Bakterium oder Wirtszelle.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Zielpolypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zytokinen, Hormonen, Enzymen, Membranproteinen, Strukturproteinen, Transportproteinen und aktivierenden oder inhibierenden Faktoren.
Ferner kann es bevorzugt sein, wenn die APIase mit einer oder mehreren posttranslationalen Modifikationen versehen ist.
Bevorzugt ist ferner, wenn die APIase eine mittels eines Aktivatormoleküls aktivierbare APIase ist.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die APIase eine mittels Inaktivierung eines Inhibitors aktivierbare APIase ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli oder ein Ortholog davon desselben oder eines anderen Organismus.
Weiter bevorzugt ist es, wenn die APIase an ein Trägermaterial gebunden ist.
Abwandlungen der APIase wurden bereits oben erwähnt und beziehen sich auch auf die Stabilität der Struktur der APIase und damit auch auf deren APIase-Aktivität. Ziel von Veränderungen der APIase kann es zum Beispiel sein, dass die APIase-Aktivität unter Bedingungen erhalten bleibt, die für das getagte Zielpolypeptid denaturierend wirken. Die Durchführung und die Art solcher Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt, umfangreich in der Literatur dokumentiert und geeignet, die APIase-Aktivität einer APIase auch unter Bedingungen zu erhalten, die für das Zielpolypeptid denaturierend wirken.
Abwandlungen der APIase, um die APIase-Aktivität unter Bedingungen zu erhalten, die für ein getagtes Zielpolypeptid denaturierend wirken, schließen auch die Immobilisierung der getagten APIase an einen Träger ein, wobei die Bindung der APIase an den Träger sowohl kovalenter als auch nicht- kovalenter Natur sein kann. Das Trägermaterial kann beispielsweise ein Polymermaterial sein (vgl. hierzu die US2003176638 über die Stabilisierung von Troponin), Mikrosphären (vgl. hierzu die WO 03062199) oder eine entsprechende Affinitätsmatrize, an welcher die APIase beispielsweise mittels eines His-Tag bindet.
Die Erhöhung der Stabilität der Struktur von APIase und damit der Beibehaltung von deren APIase-Aktivität auch unter denaturierenden Bedingungen gelingt auch durch die räumlich gezielte Einführung von Cysteinen in eine APIase, wobei die Stabilisierung letztendlich durch die Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken erfolgt, wie dies beispielsweise in der WO 02103024 beschrieben ist.
Entsprechend einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bindet das Tag des Zielpolypeptids spezifisch an dem Tag der APIase mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM.
Die Erfindung betrifft ferner ein lösliches Polypeptid, gewonnen aus dem erfindungsgemäßen Proteinkonstrukt, wobei das lösliche Polypeptid entweder das erste Polypeptid des Fusionsproteins ist oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats mit oder ohne Tag.
Die Erfindung betrifft ferner eine APIase, die mit einem Tag versehen ist, vorzugsweise mit einem Oligo- oder Polypeptidtag, das spezifisch an ein Oligo- oder Polypeptid oder an ein Oligo- oder Polypeptidtag binden kann.
Bevorzugt ist es, wenn das Tag an ein an ein Polypeptid gebundenes Tag unter Bedingungen spezifisch binden kann, welche für das Polypeptid denaturierend sind.
Ferner kann es von Vorteil sein, wenn das Tag der APIase an dem Tag des Polypeptids mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM spezifisch binden kann.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen APIase ist die APIase an ein Trägermaterial gebunden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen APIase ist die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli oder ein Ortholog davon desselben oder eines anderen Organismus.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen APIase bei der Herstellung eines löslichen Polypeptids.
Die nachfolgende Zeichnung dient im Zusammenhang mit den Beispielen der Erläuterung der Erfindung. Es zeigt:
1: Ausbeute an aktiver Luziferase bei einer APIase-Coexpression gemäß Vergleichsbeispiel und bei der Expression eines Luziferase-APIase-Fusionsproteins gemäß Beispiels 1.
Vergleichsbeispiel: Coexpression von APIase und Zielpolypeptid
Um die Ausbeute an mittels der Erfindung und mittels einer einfachen Coexpression gewonnenem nativem Zielpolypeptid bestimmen und entsprechend vergleichen zu können, wurde Luziferase als Zielpolypeptid ausgewählt. Luziferase produziert bei der Umsetzung des Substrates Luziferin Lichtquanten, deren Anzahl zur Menge an aktivem und damit korrekt gefaltetem Enzym (Luziferase) proportional ist.
a) Luziferase-Assay
Als Kontroll- oder Prüflösung wurde eine Luziferaselösung bereitgestellt, welche die nachstehenden Parameter aufwies: 100 mM TRIS-HCl, 200 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, pH 7.8. 80 μl dieser Lösung wurden zu Messung verwendet.
Unmittelbar vor dem Start der Messung wurde nach dem Vermischen mit 400 μl einer Lösung mit den Parametern 2,5 mM ATP, 5 mM MgSO₄, 100 mM TRIS-HCl, 200 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, pH 7.8 aus einer Stammlösung Luziferin zur Luziferaselösung hinzugegeben, so dass das Luziferin eine Endkonzentration von 100 μM im Messansatz von 500 μl erreichte. Die Luminszenz läßt sich bei 550 nm bei einer spektralen Bandbreite von 30 nm an einem Spektralphotometer (Shimadzu RF2000) spektralphotometrisch bei ausgeschalteter Photometer-Lampe oder an einem Lumineszenz-Meßgerät (Berthold) verfolgen.
b) Coexpression von Luziferase und APIase
Dnak als APIase wurde zusammen mit Luciferase in E. coli exprimiert. Dabei wurde die Ausbeute an löslicher Luziferase durch Änderung des Temperaturregimes der E. coli-Kultur (bis zu 40°C) optimiert. Zu verschiedenen Zeiten nach IPTG-Zugabe zu den E. coli-Zellen wurden die Zellen geerntet und entsprechend einer von A. A. Michels et al. (Eur. J. Biochem. 234(1995), 382–389) erarbeiteten Vorschrift lysiert. Nach Abzentrifugation der unlöslichen Zellbestandteile von dem entsprechenden Lysat wurde die Luziferase-Aktivität der verbleibenden Lösung wie oben angegeben bestimmt. Die Luziferase-Aktivität des Versuchs der Coexpression von Luziferase und DnaK ist in der 1 gezeigt (linke Säule).
Beispiel 1: Herstellung eines DnaK-Luciferase-Fusionsproteins
Zunächst wurde ein DNA-Fragment, kodierend für die Aminosäuresequenz DnaK-(GGGS)2GG und eingeschlossen durch NdeI- and BamHI-Restriktionsseiten, sowie ein DNA-Fragment, kodierend für die Aminosäuresequenz (GGGS)2GGG-Luciferase und eingeschlossen durch BamHI- and XhoI-Restriktionsseiten, mittels gentechnischer Methoden hergestellt. Als Primer wurden dazu folgende Sequenzen benutzt: (a): SEQ ID. No 1; (b): SEQ ID. No 2; (c) SEQ ID. No 3; (d) SEQ ID. No 4.
Anschließend wurden die DNA-Fragmente unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme gespalten und mittels Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt.
Die entsprechende DnaK-Luciferase-Kassette wurde durch Ligation der entsprechenden DNA-Fragmente in einen pET28a-Vektor hergestellt, wobei die NdeI/BamHI-Restriktionsschnittstelle des Vektors von dem DnaK-(GGGS)2GG-Konstrukt und die BamHI/XhoI-Schnittstelle von dem (GGGS)2GGG-Luciferase-Konstrukt flankiert wurde. Die Richtigkeit der Sequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung überprüft. Die zusätzlichen Glycin- bzw. Serinreste dienen dabei als Linker.
Die Expression des Fusionsproteins wurde durch IPTG im E. coli-Stamm BL21 induziert. Die Aufarbeitung des Fusionsproteins und die Bestimmung der Luziferase-Aktivität erfolgte wie im Vergleichsbeispiel beschrieben.
Die Luziferase-Aktivität der durch das Fusionsprotein gewonnenen Luziferase ist in der 1 gezeigt (rechte Säule). Die Ausbeute an aktiver Luziferase ist hier deutlicher höher als bei der Coexpression (vgl. 1, linke Säule).
Beispiel 2: Polypeptidassoziat mit einer getagten Dnak und einer getagten Luziferase
Mittels gentechnischer Methoden wurde ein Vektor mit einer DNA-Sequenz hergestellt, die eine C-terminal Strep(II) (SEQ ID. No 5)-getagte Luziferase kodiert, sowie ein Vektor mit einer DNA-Sequenz, die ein N-terminal Streptactin (eine Streptavidin-Mutante)-getagtes Dnak kodiert. Die Plasmid-Konstrukte wurden entsprechend dem Standardprotokoll (J. Sambrook & D. W. Russel: „A laboratory manual", 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory 2001) hergestellt. Die Affinitätskonstante zwischen Streptactin und dem Strep(II)-Tag ist größer als 10¹³ M^–1.
Mit den beiden vorgenannten Vektoren transfizierte E. coli Zellen wurden bei 37°C in LB (Luria-Bertani)-Medium, versetzt mit AMP (200 μg/ml), Tetracyclin (10 μg/ml) und Streptomycin (50 μg/ml), angezogen. Für die Expression wurden die Bakterienstämme E. coli BL21(DE3), E. coli BL21(DE3) pLysS und E. coli Rosetta(DE3) mit den entsprechenden pASK Vektoren eingesetzt. Zur Verbesserung der Expressionsrate können die Konstrukte aber auch in einen pET28a-Vektor mit einem T7-Promomotor kloniert werden.
Nach Induktion der Polypeptidsynthese wurde die Coexpression beider Proteinkonstrukte durch Variation von Temperatur und Inkubationszeit optimiert. Die Aufarbeitung des Polypeptidassoziats bzw. der Luziferase und die Bestimmung der Luziferase-Aktivität erfolgten wie im Vergleichsbeispiel beschrieben.
In dem Beispiel 2 war die Luziferase-Aktivität verhältnismäßig höher als die in der 1, linke Säule gezeigte.
Beispiel 3: Herstellung einer N-terminal Streptactin-getagten und C-terminal His-getagten DnaK und Einsatz derselben bei einer Polypeptidrückfaltung
Ein mit einem C-terminalen His-Tag (6 aufeinander folgende Histidin) und N-terminalen Streptactin-Tag versehene DnaK wurde entsprechend der von E. Rungeling et al. angegebenen Prozedur (FEMS Microbiol Lett. 170(1999)119–123) hergestellt. Statt des dort angegebenen E. coli-Stammes kann auch der DnaK defiziente Stamm BB1553 (B. Bukau & G. C. Walker: EMBO J. 9(1990)4027–4036) dazu verwendet werden.
Sowohl der His-Tag als auch der Streptactin-Tag kann zur Aufreinigung der APIase aus dem entsprechenden Zelllysat genutzt werden. So wurde das in Rede stehende Konstrukt gemäß einer Standardprozedur (Sigma) an ein Nickel-NTA-Säulenmaterial gebunden und aufgereinigt. Anstatt das Polypeptid jedoch von dem Säulenmaterial mittels einer Imidazol-Lösung abzutrennen und so zu gewinnen, wurde es auf dem Material belassen und zusammen mit diesem in einer Rückfaltung eines Zielpolypeptids eingesetzt. Als Zielpolypeptid kam dabei C-terminal Strep(II)-getagte Luciferase zum Einsatz, die bei ihrer Expression in E. coli in Form von Inclusionbodies angefallen war.
Dazu wurden 100 mg der vorgenannten Inclusionbodies in 1 ml einer 6 M Harnstofflösung, enthaltend 5 mg DTT, solubilisiert und die erhaltene Lösung zur Abtrennung von Feststoffen filtriert.
In einem mit einem Rührer versehenen Becherglas wurden 100 μl des an dem Nickel-NTA-Säulenmaterial gebundenen DnaK-Konstrukts in 100 ml TRIS-HCL-Puffer (100 mM, pH 7,6) bei Raumtemperatur suspendiert. Unter starkem Rühren wurde dann bei Raumtemperatur zu dieser Suspension in Aliquoten von jeweils 20 μl 1 ml der polypeptidhaltigen Harnstofflösung gegeben.
Danach wurde das Gemisch bei 5°C über Nacht aufbewahrt. Anschließend wurde das Säulenmaterial in eine Mikrosäule überführt und mit 50 ml Waschpuffer (100 mM Tris, pH 8,0) gewaschen. Das Zielpolypeptid ließ sich anschließend mit einem Elutionspuffer (100 mM Tris, 5 mM Desthiobiotin, pH 8,0) von dem DnaK-Konstrukt ablösen. Die Ausbeute an rückgefalteter Luciferase war sehr hoch im Vergleich zu einem entsprechenden Rückfaltungsversuch in Abwesenheit einer APIase.
Aufgrund der sehr hohen Ausbeute an rückgefaltetem Zielpolypeptid ist ein fester Träger, beispielsweise eine Sepharose, auf dem eine mit einem Tag versehene APIase fest, z.B. kovalent, gebunden ist, von besonderem kommerziellen Interesse.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Proteinkonstrukt, umfassend ein Fusionsprotein mit einem ersten Aminosäuresequenzabschnitt und einem zweiten Aminosäuresequenzabschnitt, wobei der erste Aminosäuresequenzabschnitt eine Sekundär-Amid Peptidbindungs spezifische cis/trans Isomerase (APIase) kodiert und der zweite Aminosäuresequenzabschnitt ein beliebiges erstes Polypeptid kodiert, oder umfassend ein Polypeptidassoziat, enthaltend ein mit einem ersten Tag versehenes erstes Polypeptidmolekül und ein mit einem zweiten Tag versehenes zweites Polypeptidmolekül, wobei das erste Polypeptidmolekül eine APIase ist und das zweite Polypeptidmolekül ein beliebiges zweites Polypeptid ist und wobei der erste Tag an dem zweiten Tag spezifisch bindet, vorzugsweise mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM.
Proteinkonstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats aus 10 bis 1000 Aminosäureresten besteht, vorzugsweise aus 20 bis 500 Aminosäureresten, bevorzugt aus 30 bis 300 Aminosäureresten und besonders bevorzugt aus 50 bis 200 Aminosäureresten.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats in seiner nativen Form eine definierte Tertiärstruktur aufweist.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats ein Polypeptid ist, das bei separater Expression in E. coli, in Hefezellen, in Insektenzellen oder in Pflanzenzellen zur Ausbildung von Inclusionbodies führt oder das sich bei separater Expression in Bakterien oder in eukaryontischen Wirtszellen nur in geringen Mengen in löslicher Form herstellen lässt, vorzugsweise in Mengen von im Mittel weniger als 1 pg pro Bakterium oder Wirtszelle.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polypeptid des Fusionsproteins oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zytokinen, Hormonen, Enzymen, Membranproteinen, Strukturproteinen, Transportproteinen und aktivierenden oder inhibierenden Faktoren.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase mit einer oder mehreren posttranslationalen Modifikationen versehen ist.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase eine mittels eines Aktivatormoleküls aktivierbare APIase ist.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase eine mittels Inaktivierung eines Inhibitors aktivierbare APIase ist.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli ist oder ein Ortholog davon desselben oder eines anderen Organismus.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase an ein Trägermaterial gebunden ist.
Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein einen dritten Aminosäuresequenzabschnitt umfasst, der zwischen dem ersten und dem zweiten Aminosäuresequenzabschnitt angeordnet ist und der einen Peptidlinker kodiert.
Proteinkonstrukt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidlinker aus bis zu 1000 Aminosäureresten besteht, vorzugsweise aus bis zu 100 Aminosäureresten und besonders bevorzugt aus 5 bis 30 Aminosäureresten.
Proteinkonstrukt nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidlinker auf chemischem Weg oder mittels einer Protease spaltbar ist.
Proteinkonstrukt nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidlinker mittels Faktor Xa, Thrombin, Enterokinase, Trypsin oder Collagenase spaltbar ist.
Proteinkonstrukt nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidlinker mittels Behandlung von Hydroxylamin, Bromcyan oder durch ein saures Milieu spaltbar ist.
Polynukleotid, welches das Fusionsprotein umfassende Proteinkonstrukt nach einem der voranstehenden Ansprüche kodiert oder eine mit einem Tag versehene APIase, wobei das Tag vorzugsweise an ein komplementäres Polypeptid mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM spezifisch binden kann.
Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 16.
Wirtszelle, enthaltend das Proteinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 15, das Polynukleotid nach Anspruch 16 und/oder den Vektor nach Anspruch 17.
Wirtszelle nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine eukaryontische oder eine prokaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ein E. coli ist, eine Hefezelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine humane Zelle.
Verfahren zur Herstellung eines löslichen Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte: a) die in vivo- oder in vitro-Expression des Fusionsprotein umfassenden Proteinkonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 15 unter Bedingungen, welche die Expression des Proteinkonstrukts erlauben; b) die Spaltung des Proteinkonstrukts unter Freisetzung des ersten Polypeptids; und gegebenenfalls c) die Gewinnung des ersten Polypeptids durch Aufreinigung.
Verfahren zur Herstellung eines löslichen Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte: a) die Bereitstellung einer mit einem Tag versehenen APIase; b) das Inkontaktbringen eines mit einem Tag versehenen Zielpolypeptids mit der APIase unter für das Zielpolypeptid denaturierenden Bedingungen, wobei der Tag des Zielpolypeptids unter den denaturierenden Bedingungen spezifisch an dem Tag der APIase bindet; c) die Absenkung der Konzentration der die denaturierenden Bedingungen bewirkenden Substanzen auf eine Konzentration, die für das Zielpolypeptid nicht denaturierend wirkt; d) die Lösung der Bindung zwischen dem Tag der APIase und dem Tag des Zielpolypeptids, vorzugsweise durch den Zusatz von geeigneten Substanzen; und gegebenenfalls e) die Gewinnung des Zielpolypeptids durch Aufreinigung.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielpolypeptid aus 10 bis 1000 Aminosäureresten besteht, vorzugsweise aus 20 bis 500 Aminosäureresten, bevorzugt aus 30 bis 300 Aminosäureresten und besonders bevorzugt aus 50 bis 200 Aminosäureresten.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielpolypeptid in seiner nativen Form eine definierte Tertiärstruktur aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielpolypeptid ein Polypeptid ist, das bei separater Expression in E. coli, in Hefezellen, in Insektenzellen oder in Pflanzenzellen zur Ausbildung von Inclusionbodies führt oder das sich bei separater Expression in Bakterien oder in eukaryontischen Wirtszellen nur in geringen Mengen in löslicher Form herstellen lässt, vorzugsweise in Mengen von im Mittel weniger als 1 pg pro Bakterium oder Wirtszelle.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielpolypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zytokinen, Hormonen, Enzymen, Membranproteinen, Strukturproteinen, Transportproteinen und aktivierenden oder inhibierenden Faktoren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase mit einer oder mehreren posttranslationalen Modifikationen versehen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase eine mittels eines Aktivatormoleküls aktivierbare APIase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase eine mittels Inaktivierung eines Inhibitors aktivierbare APIase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli ist oder ein Ortholog davon desselben oder eines anderen Organismus.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase an ein Trägermaterial gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Tag des Zielpolypeptids an dem Tag der APIase mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM spezifisch bindet.
Lösliches Polypeptid, gewonnen aus dem Proteinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das lösliche Polypeptid entweder das erste Polypeptid des Fusionsproteins ist oder das zweite Polypeptid des Polypeptidassoziats mit oder ohne Tag.
APIase, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase mit einem Tag versehen ist, vorzugsweise mit einem Oligo- oder Polypeptidtag, das spezifisch an ein Oligo- oder Polypeptid oder an ein Oligo- oder Polypeptidtag binden kann.
APIase nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Tag an ein an ein Polypeptid gebundenes Tag unter Bedingungen spezifisch binden kann, welche für das Polypeptid denaturierend sind.
APIase nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Tag der APIase an dem Tag des Polypeptids mit einer thermodynamischen Affinitätskonstante von kleiner als 1 μM spezifisch binden kann.
APIase nach einem der Ansprüche 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase an ein Trägermaterial gebunden ist.
APIase nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die APIase das hsp70 Chaperon DnaK aus E. coli ist oder ein Ortholog davon desselben oder eines anderen Organismus.
Verwendung der APIase nach einem der Ansprüche 34 bis 38 bei der Herstellung eines löslichen Polypeptids.