DE602004009392T2 - Magnetisches Aufzeichnungsmittel - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie, Biotechnologie oder Verfahrenstechnik für die Herstellung von Proteinen oder Peptiden. Die Erfindung betrifft Methoden zur Herstellung und Isolierung rekombinanter Proteine unter Verwendung von Fusionsproteinkonstrukten, die spezifische Erkennungsstellen für eine reifende Protease umfassen. Die Erfindung betrifft spezifisch die Verwendung von Caspase-Proteasen für die Reifung gentechnisch hergestellter rekombinanter Fusionsproteine oder Polypeptide. Diese Moleküle werden unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnologie gentechnisch hergestellt, um eine spezifische Zielsequenz für eine Caspase zwischen einem ersten Fusionsteil und dem Polypeptid von Interesse zu umfassen. Nach der Prozessierung wird das gewünschte reife Format des Proteins oder Polypeptids erhalten.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Die heterologe Expression von rekombinanten Proteinen wird durch mehrere technologische Schwierigkeiten behindert. Das Expressionslevel kann aufgrund einer Vielzahl von Ursachen beeinträchtigt sein.
  • Erstens kann das Translationslevel ein vernünftiges Proteinherstellungslevel behindern. Dies muss für jedes einzelne Protein gentechnisch eingestellt und optimiert werden, was eine zeitaufwendige Aufgabe ist. Zweitens kann das Protein von Interesse instabil sein. Diese Instabilität kann mehrere Ursachen haben. Es wurde beschrieben, dass der N-Terminus eines Proteins die gesamte Stabilität des Proteins bestimmt, was die Wahrscheinlichkeit bestimmen wird, mit der das Protein durch Wirtproteasen abgebaut wird. Drittens ist, trotz hoher Expressionsausbeute an rekombinanten Proteinen, der wesentliche Rückschlag bei der Herstellung rekombinanter Proteine in E. coli die Bildung von unlöslichen Präzipitaten des exprimierten Proteins. Diese „Einschlusskörperchen" sind in den meisten Fällen biologisch inaktiv. Daher ist ein Rückfaltungsverfahren erforderlich, um ein lösliches Protein zurückzugewinnen, das biologisch aktiv ist. Dies ist ein schwerfälliges Verfahren, und die Implementierung in eine Herstellungsumgebung erhöht die Kosten des Verfahrens beträchtlich. Das Rückfaltungsverfahren ist keineswegs eine Garantie für die volle biologische Aktivität des Proteins. Es können sich Isomere mit den gleichen biophysikalischen Merkmalen, aber mit einer viel geringeren biologischen Aktivität bilden. Üblicherweise haben diese faltenden Isomere eine unterschiedliche hydrophobe Oberfläche und können mit Umkehrphasenchromatographie identifiziert werden. Außerdem kann, bei der Herstellung reifer Proteine im Cytoplasma von E. coli, das Entfernen der obligatorischen N-terminalen Methioninaminosäure nicht allzu effizient sein, was zu einer nicht kontrollierten Heterogenität bei der Proteinpräparation führt. Das N-terminale Methionin wird in E. coli auch formyliert, was unerwünscht ist, da es ein spezifisches immunogenes Signal bei Mensch und Tier ist.
  • Diese Probleme können gelöst werden, indem eine Fusionsproteinstrategie angepasst wird. Fusionsproteine sind Extensionen des Proteins von Interesse mit einer oder mehreren Aminosäuren. Fusionsproteine können konstruiert werden, um einen Peptid-Tag an das Protein von Interesse zu koppeln, oder um eine Fusion mit einem größeren Polypeptid zu erzeugen. Eine bevorzugte Strategie ist es, den zusätzlichen Polypeptidteil an den N-Terminus des Polypeptids von Interesse zu fusionieren. Die Vorteile der Verwendung dieser Fusionsproteinstrategie beinhalten die Tatsache, dass mit einem passenden Fusionspartner die Expression generell hoch ist, und keine weitere Optimierung nötig ist, da der N-Terminus gewählt werden kann, um das Fusionsprotein gegen Abbau zu stabilisieren, wobei das Fusionsprotein generell besser gegen Proteaseabbau geschützt ist, und die Löslichkeit des Fusionskonstrukts häufig verbessert ist. Außerdem kann eine spezifische einfache Reinigungsmethode konzipiert werden, die den Fusionsteil zum Ziel hat, und es dem Fusionsprotein ermöglicht, in einem einfachen chromatographischen Schritt isoliert zu werden. Wenn ein solcher Reinigungsschritt für den Fusionsteil nicht existiert, können Affinitäts-„Tags” mit dem Fusionsteil fusioniert werden. Der neu zusammengesetzte Fusionsteil hat dann spezifische charakteristische Verhaltensweisen auf einer Adsorptionssäule erworben. Beispiele sind Peptid-Tags, die von spezifischen Antikörpern erkannt werden, Peptid-Tags mit einer Affinität zu einem bestimmten Protein, Proteindomänen mit einer Affinität zu einem anderen Protein oder einer anderen Proteindomäne, spezifisch isolierte Bindungspeptide, Proteindomänen oder Proteine, und Proteine oder deren Domänen, die spezifisch an ein nicht zähes Substrat binden. Einer oder mehrere dieser Affinitäts-Tags können in dem Fusionsprotein kombiniert werden.
  • Zu diesem Zweck wurden Fusionspartner auf der Basis dessen, wie gut sie in E. coli hergestellt werden, oder auf der Basis ihrer Hydrophilie empirisch identifiziert. Beispiele für empirisch identifizierte Partner, die die lösliche Expression des Proteins erhöhen, das mit dem Polypeptid von Interesse fusioniert, sind GST, Thioredoxin oder MBP. Beispiele für Fusionspartner, die auf der Basis ihres stark hydrophilen Charakters gewählt werden, sind NusA und GrpE. Das Ergebnis ist jedoch noch immer unvorhersehbar, da es von den intrinsischen Eigenschaften des Proteins abhängt, das exprimiert wird. Beispiele für die erwähnten Affinitäts-Tags sind Polyhistidin-Tags, Polyarginin-Tags, Peptidsubstrate für Antikörper, Chitin-Bindedomäne, das RNase-S-Peptid, Maltose-Bindungsprotein, Gluthathion-S-Transferase, Protein A, beta-Galactosidase.
  • Obgleich interessant, verschiebt der Fusionsproteinansatz den Engpass des Herstellungsverfahrens auf ein anderes Level: Das Entfernen des Fusionsteils und die Reifung des Proteins von Interesse.
  • Um, ausgehend von dem Fusionsprotein, ein reifes Protein von Interesse zu erhalten, müssen die Fusionspartner oder der zusammengesetzte Fusionsteil aus dem Protein von Interesse entfernt werden. Zu diesem Zweck wurden mehrere Methoden beschrieben. Chemische Spaltungsmethoden wurden für das Spalten nach spezifischen Aminosäuren erdacht. Jedoch sollte die Aminosäure, die der ersten Aminosäure des reifen Teils eines Proteins von Interesse vorausgeht, dann einmalig sein, oder mindestens nicht in dem Protein von Interesse auftreten. Auch können die harten chemischen Bedingungen, die für die Induzierung dieser Spaltung notwendig sind, zu chemischem Proteinabbau führen: Oxidation, Desaminierung, cyclische Imidbildung, Iso-Aspartatbildung sind hierfür nur Beispiele. Der chemische Proteinabbau wird zu Heterogenität im fertigen Proteinpräparat führen; er kann antigene Determinanten in das Protein einführen oder dessen Aktivität verringern, wodurch es für die Verwendung als therapeutische Substanz weniger geeignet wird. Es wurden Proteasen beschrieben, die eine gewisse Spezifität für bestimmte Peptidsequenzen haben. Um diese Proteasen zu verwenden, wird ein Linker zwischen den Fusionsteil und das Protein von Interesse eingeführt, um ein Fusionsprotein mit der folgenden Formel zusammenzusetzen: Fi-L-P
  • Wobei F dem Fusionsteil entspricht, der aus unterschiedlichen Einheiten F1, F2, ...Fn zusammengesetzt sein kann, L eine Linkersequenz ist, die eine Erkennungssequenz für die verwendete Protease, und möglicherweise auch einen Spacer enthält, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die Proteasestelle zugänglich ist, und P das Protein von Interesse ist.
  • Einige der zu diesem Zweck verwendeten Proteasen schneiden innerhalb des Linkers, da ihre Spezifität sowohl von der stromaufwärts gelegenen Sequenz der Spaltungsstelle (Pi Positionen, die von der Spaltungsstelle weg hin zum N-Terminus nummeriert sind) als auch von der stromabwärts gelegenen Sequenz der Spaltungsstelle (P'i Positionen, die von der Spaltungsstelle weg hin zum C-Terminus nummeriert sind) bestimmt wird. Prozessierung mit diesen Enzymen wird nicht dazu führen, dass ein reifes Protein erhalten wird, sondern ein Protein, das noch immer mit einer Anzahl von nicht nativen Aminosäuren fusioniert. Während dies für eine Reihe biochemischer Zecke sehr wohl akzeptabel sein kann, ist es bei der Entwicklung eines therapeutischen Reagens höchst wünschenswert, nur die reife Sequenz des gewünschten Proteins des Peptids von Interesse zu erhalten. Beispiele für solche Proteasen und Beispiele für die Schnittsequenzen sind:
    Figure 00060001
  • Die Notation '|^|' bezieht sich auf die Position in der Sequenz, an der die Protease schneidet.
  • Andere Enzyme zeigen keine oder nur geringe Präferenz für die P'1- und P'2-Position, und ermöglichen somit die Reifung des Fusionsproteins, um das Protein von Interesse zu erhalten, ohne dass eine künstliche Aminosäure mit ihm fusioniert ist. Offensichtlich ist dies die am stärksten bevorzugte Option für den Erhalt von Material für die therapeutische Verwendung in Mensch und Tier.
  • Beispiele für solche restringierten Proteasen und ein Beispiel für die Schnittsequenz ohne Spezifität C-terminal zum Spaltpunkt sind:
    Figure 00060002
  • Enzyme wie Trypsin haben offensichtlich nur einen sehr begrenzten Nutzen, da es eine hohe Wahrscheinlichkeit gibt, dass sie auch das Protein von Interesse abbauen.
  • Die Spezifität von Thrombin ist ebenfalls gering. Optimale Spaltungsstellen für Thrombin werden unten angegeben. In den ersten drei Beispielen ist die Formel für die Erkennungsstelle: P4-P3-P-R/K|^|P1'-P2' wobei P3 und P4 hydrophobe Aminosäure sind, und P1' und P2' nicht azide Aminosäuren sind. Die Bindung hinter R/K wird gespalten. Mögliche Spaltungsstellen von Thrombin sind jedoch variabel (Einbuchstabencode für Aminosäuren wird gezeigt):
    P4 P3 P2 P1 P1' P2'
    1 M Y P R G N
    2 I R P K L K
    3 L V P R G S
    4 A R G
    5 G K A
  • In den oben gezeigten Fällen 4 und 5 ist die Spaltungsstelle weniger definiert und Stellen, die diesen Sequenzen ähnlich sind, werden in natürlichen Proteinen regelmäßig gefunden. Thrombin scheint daher nur ein wenig spezifischer als Trypsin zu sein. Aus diesem Grund wird die Thrombinspaltung auch eine hohe Wahrscheinlichkeit haben, das Protein von Interesse zu hydrolysieren.
  • Die Spezifität von Faktor Xa ist weniger stringent und es sind Beispiele bekannt, in denen das Protein von Interesse an unerwarteten Stellen gespalten wird, und die Spezifität nicht höher ist als diejenige, die mit Thrombin beobachtet wurde. Dies führt häufig zu Prozessierung und Abbau des Proteins von Interesse. Der weitere Abbau der trunkierten Proteinteile ist häufig auf die Aktivität der kontaminierenden Proteasen zurückzuführen. überdies ist die Herstellung von Faktor Xa ziemlich schwierig, da er in einem auf Säugetierzellen basierenden Expressionssystem hergestellt werden muss, und er nach der Herstellung Aktivierungsschritte erfordert (Aktivierung durch Russell-Viperngift). Dies macht aus dem Enzym nicht die erste Wahl für die Herstellung in großtechnischem Umfang, da die Enzymkosten die Herstellungskosten des Fusionsproteins, das das Protein von Interesse umfasst, übersteigen könnten.
  • Abgesehen von der fehlenden Spezifität dieser Proteasen, ist die Prozessierungseffizienz und die Ausbeute an erhaltenem reifen Protein eher niedrig, und reicht häufig nicht aus, um die Entwicklung eines Herstellungsverfahrens unter Verwendung dieser Enzyme zu erwägen.
  • Bovine Enterokinase ist ein Enzym mit einem höheren Spezifitätsgrad, aber es sind mehrere Fälle bekannt, in denen das Enzym das Protein von Interesse nicht gespalten, oder das Protein von Interesse auf unerwartete Weise abgebaut hat. Überdies ist die Enterokinase oder deren katalytische Domäne schwer herzustellen und zu reinigen.
  • Über die Verwendung eines Caspase-Enzyms für die Reifung gentechnisch hergestellter rekombinanter Polypeptidfusionen wurde auf dem Stand der Technik berichtet.
  • WO 00/61768 richtet sich zum Beispiel auf die Präparation von biologisch aktiven Molekülen aus deren biologisch inaktiven Vorläufern, indem deren native Spaltungsstelle zu einer Stelle mutiert wird, die von einer Protease gespalten werden kann, und Spaltung des mutierten Moleküls, um ein biologisch aktives Molekül zu erbringen. In diesem Dokument wird eine cDNA offenbart, die einen mutierten Vorläufer des pro-IL-18LETD-Proteins kodiert, optional mit einer Glutathion-S-Transferase (GST) kodierenden Sequenz fusioniert und stromabwärts eines IPTG induzierbaren fac-Promoter. Dieses Dokument offenbart ferner die Expression und Reinigung eines GST-proIL-18LETD-Fusionsproteins, die Bindung des inaktiven Vorläuferproteins an die Gluthation-Agaroseperlen und dessen Spaltung unter Verwendung einer Caspase-8 (Gruppe III), um humanes IL-18 herzustellen.
  • EP 1 013 768 A1 offenbart canines Interleukin-18 und ein canines Interleukin-1-beta umwandelndes Enzym (CE, Caspase-1) für die Behandlung von immunologischen Erkrankungen bei Hunden. Canine Interleukin-1-beta-Convertase kann Vorläuferformen von Interleukin-18 und Interleukin-1-beta spalten, um die aktiven Formen zu ergeben.
  • In einem anderen Beispiel offenbaren Gu et al. (1997, Science, Band 275, Seiten 206 bis 209) die Aktivierung des inaktiven IL-1-beta-Vorläufers in das proinflammatorische Cytokin durch das Interleukin-1-beta umwandelnde Enzym (ICE, Caspase-1). ICE hat gezeigt, dass es den Vorläufer des Interferon-gamma induzierenden Faktors (IGIF) an der echten Prozessierungsstelle spalten kann, wodurch IGIF aktiviert und sein Export erleichtert wird. Die Koexpression von proIGIGF mit ICE oder dessen Homolog (Caspase-4) zeigte, dass sie zur Spaltung von proIGIF in das Polypeptid mit ähnlicher Größe wie der natürlich auftretende 18-kdIGIF führen kann. überdies führte die Koexpression mit einer Caspase-3 (Gruppe II, CPP32) zur Spaltung von proIGIF in 14kd-Polypeptid.
  • Zusätzlich wurden auch Polynukleinsäuren, die Fusionsproteine kodieren, die ein Polypeptid, eine Linkersequenz mit einer Caspase-Erkennungsstelle und ein Polypeptid von Interesse umfassen, auf dem Stand der Technik offenbart.
  • Zum Beispiel offenbart WO 02/06458 ein gereinigtes Polypeptid, das eine Luciferase-Aktivität und eine Erkennungsstelle aufweist, die von einer Caspase spezifisch spaltbar ist. Insbesondere offenbart dieses Dokument eine Polynukleinsäure, die ein Protein kodiert, das a) ein aminoterminales Polypeptid (eine Zielsequenz), b) eine Linkersequenz, die eine Caspase-Gruppe-II-Erkennungsstelle (insbesondere einen spaltbaren Linker, der die DEVD- und/oder DEHD-Stelle umfasst) umfasst, und c) das Polypeptid von Interesse (Luciferase) umfasst. Das Polypeptid wird als Reporterkonstrukt verwendet, wobei die Spaltung zu einer Abnahme der Luciferase-Aktivität führt.
  • In einem anderen Beispiel offenbart WO 00/73437 eine Polynukleinsäure, die ein Fusionsprotein kodiert, das eine Sequenz aus Aminosäuren umfasst, in denen GFP gentechnisch verändert wird, um eine Gruppe-II-Caspasestelle zu enthalten. Die (Linker) Sequenz umfasst mindestens eine Caspase-Spaltungsstelle und Beispiele hierfür beinhalten Caspase-Gruppe-II-Erkennungsstellen (z. B. DXXD, DEVD, DEHD, DELD). Die Fusionsproteine werden verwendet, um Caspase-Aktivatoren oder Caspase-Inhibitoren in lebenden Zellen oder in vitro zu identifizieren.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung verwendet ein Verfahren zum Erhalt eines reifen Proteins, einer Proteindomäne oder eines Peptids, das mit irgend einer Aminosäure der Wahl an deren N-Terminus beginnt, indem es als Fusionsprotein an einen N-terminalen Fusionspartner über die Verbindung mit einer gentechnisch veränderten Linkersequenz hergestellt wird, und danach auf spezifische Weise durch Inkubation mit einer Protease, die zur Caspasefamilie der Cysteinproteasen gehört, freigesetzt wird. Die Erfindung betrifft auch die Konzeption von Peptidlinkern, die verwendet werden, um einen Fusionspartner mit dem reifen Protein zu verbinden, wobei der Linker von einer solchen Caspase spezifisch verdaut wird. Die Erfindung betrifft ferner die Expression und Reinigung von Fusionsproteinen, die einen Fusionsteil und ein reifes Protein oder Peptid von Interesse umfassen, die eine Linkersequenz umfassen, die konzipiert wird, um durch eine Caspase-Protease prozessiert zu werden. Diese Erfindung kann verwendet werden, um die Herstellung eines rekombinanten Proteins in funktionaler und/oder reifer Form zu erleichtern, und um die Wiedergewinnungsverfahren zu erleichtern.
  • Diese Erfindung beschreibt die Verwendung von Caspasen als Reifungsproteases für rekombinante Fusionsproteine, die eine gentechnisch veränderte Caspase-Erkennungsstelle in dem Linker enthalten, der das Fusionsprotein und das Protein von Interesse verbindet. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren unter Verwendung von Caspasen, um den Fusionsteil und die Linkersequenz von einem Protein von Interesse zu trennen, ohne Wahlbeschränkung der ersten Aminosäure des reifen Proteins, was die Methode für die Herstellung von Arzneimitteln für Mensch und Tier geeignet macht. Die Caspase-Enzyme können auf effiziente und preisgünstige Weise auch in einem E.-coli-Expressionssystem hergestellt werden, und können anschließend gereinigt werden, ohne Spuren von Wirtproteasen zu hinterlassen. Diese Merkmale machen die Erfindung geeignet für die Entwicklung von Verfahren zur Herstellung von Peptiden, Proteinen oder Teilen von Proteinen in großtechnischem Umfang.
  • Die vorliegende Erfindung führt zu einer Methode, die den Fusionsteil und die Linkersequenz mit hoher Spezifität spaltet, und es können, abhängig von der verwendeten Caspase, in dem Linker mehrere Spezifitäten gentechnisch hergestellt werden. überraschenderweise wurde herausgefunden, dass sogar Proteine mit vermuteten Spaltungsstellen auf der Basis ihrer Proteinsequenz nur an der gentechnisch veränderten Stelle geschnitten wurden und nicht an kryptischen Stellen innerhalb des Proteins. Ferner kann eine kurze Spaltungszeit von mehreren Minuten bis zu einer Stunde erreicht werden. Das Enzym kann aus der Prozessierungsreaktion spezifisch entfernt werden und mehrere Proteaseinhibitoren sind dem Fachmann bekannt, die es ermöglichen, die Prozessierungsreaktion auf kontrollierte Weise zu beenden.
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode, wie in Anspruch 1 definiert, zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse in einer biologisch aktiven Form, in einem geeigneten Wirt, bevorzugt einem Prokaryoten, stärker bevorzugt Escherichia coli.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Methode, wie in Anspruch 1 definiert, wobei die Caspase-Erkennungsstelle die Aminosäure DEDL (SEQ ID NO 20) DXXD (SEQ ID NO 63), bevorzugt DEVD (SEQ ID NO 13) oder DEHD (SEQ ID NO 14) umfasst.
  • Die Erfindung betrifft ferner irgend eine der oben definierten Methoden, wobei die Caspase aus der Gruppe, bestehend aus Caspase-2, Caspase-3, Caspase-7, CED-3, reverse Caspase-3 oder reverse Caspase-7 ausgewählt ist.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung irgend eine der oben definierten Methoden, wobei die Linkersequenz in dem Fusionsprotein mindestens 4, bevorzugt mindestens 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Aminosäuren, starker bevorzugt mindestens 25, 30 oder 40 Aminosäure umfasst; bevorzugt entspricht die Linkersequenz einer der Sequenzen SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 oder 10.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Methoden der Erfindung umfasst die Caspase-Erkennungsstelle des Fusionsproteins eine Aminosäuresequenz, wie in Anspruch 7 definiert.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Methode, wie oben definiert, wobei die Linkersequenz, wie oben definiert, mindestens 2, 3, 4 oder 5 hydrophile, oder mindestens 2, 3, 4 oder 5 geladene, oder mindestens 2, 3, 4 oder 5 kleine Aminosäuren umfasst.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Methode, wie oben definiert, wobei die Spaltung des Fusionsproteins durch die Caspase in vitro erfolgt; es wird bevorzugt eine Ausbeute von mindestens 80 des reifen Polypeptids von Interesse innerhalb von 60 Minuten erhalten, gemessen oder ermittelt durch densitometrische Bestimmung.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Methode gemäß einer der oben beschriebenen Methoden, die ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass das Caspase-Protein in dem gleichen Wirt hergestellt wird wie das Fusionsprotein; bevorzugt wird die Caspase-Proteinsequenz von der Sequenz des Fusionsproteins umfasst, d. h. ist Teil der Sequenz des Fusionsproteins.
  • In einer Ausführungsform in den Methoden der Erfindung verläuft die Herstellung (und/oder die Induzierung der Herstellung) des Caspase-Proteins und die Herstellung (und/oder die Induzierung der Herstellung) des Fusionsproteins sequentiell, bevorzugt wird das Caspase-Protein nach der Herstellung (und/oder der Induzierung der Herstellung) des Fusionsproteins hergestellt (und/oder die Herstellung des Caspase-Protein wird induziert).
  • Die Erfindung betrifft ferner irgendeine der oben beschriebenen Methoden, wobei die Spaltung des Fusionsproteins in vivo erfolgt.
  • Gemäß einer andern Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Methode zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse einer biologisch aktiven (und/oder reifen) Form, wie in Anspruch 16 definiert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Methode zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse einer biologisch aktiven (und/oder reifen) Form, wie in Anspruch 17 definiert.
  • Die Erfindung betrifft ferner irgendeine der oben beschriebenen Methoden, wobei eine einzelne Polynukleinsäure das Fusionsprotein und die Caspase kodiert, oder alternativ, wobei unterschiedliche Polynukleinsäuren das Fusionsprotein und die Caspase kodieren.
  • Gemäß noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Polynukleinsäure, die irgendeine der oben beschriebenen Fusionsproteine kodiert. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Polynukleinsäure wie in Anspruch 22 definiert.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Polynukleinsäure, wie oben definiert, die ferner ein Caspase-Protein kodiert. Bevorzugt ist das Caspase-Protein aus der Gruppe, bestehend aus Caspase-2, Caspase-3, Caspase-7, CED-3 reverse Caspase-3 und reverse Caspase-7, ausgewählt.
  • Gemäß anderer Ausführungsformen der Erfindung ist das aminoterminale Polypeptid, das von den Polynukleinsäuren der Erfindung kodiert wird, bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus, aber nicht beschränkt auf Glutathion-S-Transferase Gen GST, E. coli Thioredoxin TRX, NusA, Chitin-Bindedomäane CBD, Chloramphenicolacetyltransferase CAT, Protein A (prot A), LysRS, Maltose-Bindungsprotein (MBP), Ubiquitin, Calmodulin, DsbA, DsbC und Lambda gpV.
  • Bevorzugt umfasst die Linkersequenz der Polynukleinsäure der Erfindung mindestens 5, bevorzugt mindestens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens 25, 30 oder 40 Aminosäuren; bevorzugt entspricht die Linkersequenz einer der Sequenzen SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 oder 10.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform besteht die Linkersequenz aus 4 Aminosäuren, die eine Caspase-Erkennungsstelle umfassen, die aus der Aminosäure besteht, wie in Anspruch 26 definiert.
  • Die Erfindung betrifft ferner irgend eine der oben beschriebenen Polynukleinsäuren, wobei die Expression des Fusionsproteins und/oder des Caspase-Proteins von einem geeigneten Promoter kontrolliert wird, wobei der Promoter bevorzugt ein induzierbarer Promoter ist, und wobei das Fusionsprotein und das Caspase-Protein sogar noch stärker bevorzugt von einem unterschiedlichen induzierbaren Promoter kontrolliert werden.
  • Die Erfindung betrifft ferner irgend eine der oben beschriebenen Polynukleinsäuren, wobei das Fusionsprotein ferner einen Detektions- oder Affinitäts-Tag umfasst, wobei der Detektions- oder Affinitäts-Tag aus der Gruppe, bestehend aus Polyhistidin-Tag, Polyarginin-Tag, Streptavidin-Bindungs-Tag, biotinylierten Tag und Tag, der von einem Antikörper erkannt wird, ausgewählt ist.
  • Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der irgendeine der oben beschriebenen Polynukleinsäuren umfasst, und eine Wirtszelle, die den Vektor oder irgendeine der Polynukleinsäuren umfasst.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Fusionsprotein, das von den oben beschriebenen Nukleinsäuren kodiert wird, und einen Antikörper, der spezifisch an das Fusionsprotein bindet.
  • Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung irgendeiner der oben beschriebenen Polynukleinsäuren, Vektoren, Wirtszellen oder Fusionsproteine für die Herstellung eines Polypeptids von Interesse in reifer und/oder biologisch aktiver Form.
  • Die Erfindung betrifft ferner einen Bioreaktor, der für die Herstellung von biologisch aktiven, d. h. funktionalen, und/oder reifen Proteinen von Interesse geeignet ist, wie in Anspruch 36 definiert. Bevorzugt ist das Substrat in einer Affinitätssäule enthalten.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Bioreaktor, der für die Herstellung von biologisch aktiven, d. h. funktionalen, und/oder reifen Proteinen von Interesse geeignet ist, wie in Anspruch 37 definiert.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung eines Proteins von Interesse, wie in Anspruch 38 definiert.
  • Bevorzugt ist das Substrat in einer Affinitätssäule enthalten.
  • AUSFÜHRLICHE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • überraschenderweise haben wir herausgefunden, dass eine hoch spezifische und hoch effiziente Prozessierung durch die Verwendung von Caspasen als spezifischen Proteasen erhalten werden kann, wenn ein spezifisch konzipiertes Fusionsprotein als Substrat verwendet wird.
  • Caspasen sind Cysteinproteasen, die nach einem Aspartylrest spezifisch spalten. Somit enthält die Caspase-Genfamilie mindestens 14 Säugetiermitglieder, von denen mindestens 11 humane Enzyme bekannt sind. Eine erste Klassifikation kann nach der phylogenetischen Analyse gemacht werden und teilt die Familie in zwei Klassen auf:
    die Caspase-1(ICE)-abhängigen Enzyme und die Caspase-3(CED-3)-abhängigen Enzyme.
  • Eine weitere Einteilung kann auf der Basis von kurzen (Caspase-3, -6 und -7) oder langen (Caspase-1, -2, -4, -5, und Caspasen-8 bis -14) Prodomänen gemacht werden. Alternativ können die Proteasen auf der Basis ihrer Substratspezifität unterteilt werden. Dies würde die Caspasen in drei unterschiedliche Gruppen aufteilen. Gruppe-I-Caspasen (Caspasen 1, 4, 5, 13) sind frei für Substitutionen an der P4 Position, bevorzugen aber voluminöse hydrophobe Aminosäuren, wie etwa Tyr oder Trp. Gruppe-II-Caspasen (Caspasen 2, 3, 7) sind im Wesentlichen stringenter in S4, da sie an P4 eine Asp erfordern. Das bevorzugte Spaltungsmotif für diese Gruppe ist DEXD, aber es wurden viele Substrate der Formel DXXD identifiziert. Caspase-2 weist sogar an Position P5 Stringenz auf. Tabelle I gibt eine Liste an nicht beschränkenden Beispielen für natürliche Substratproteine. Es lässt sich feststellen, dass es eine starke Präferenz des natürlichen Substrats für kleine hydrophile Aminosäuren an Position P1' gibt, und dass die Consensus-Sequenz mit einer großen Gruppe von Zielsequenzen nicht übereinstimmt. Es sollte auch daran erinnert werden, dass nicht alle Ziele mit der gleichen Effizienz gespalten werden. Gruppe-III-Caspasen (Caspasen 6, 8, 9, 10) bevorzugen verweigtkettige aliphatische Aminosäuren an P4.
  • Fusionsproteinstrategien zur Erhöhung des Expressionslevels, Verbesserung der Löslichkeit und der Erleichterung der Reinigung des Proteins gibt es seit 1983 und früher. Keine dieser Strategien wurde in einem großtechnischen Herstellungsverfahren verwendet. Offensichtlich liegt der Engpass beim Anpassen einer Fusionsproteinstrategie für die Entwicklung eines großtechnischen Verfahrens in der Spezifität, Aktivität, Verfügbarkeit und Reinheit des verwendeten Proteaseenzyms. Die Spezifität muss hoch genug sein, um mindestens zu ermöglichen, dass eine Anzahl von zu spaltenden Proteinen nur an der gentechnisch veränderten Spaltungsstelle in der verbindenden Linkersequenz gespalten wird. Die Aktivität des Enzyms muss hoch genug sein, um ausreichend Spaltung in einem kurzen Zeitraum zu ermöglichen. Dies wird Rückhaltezeit während der Herstellung vermeiden und minimiert den Abbau des Proteins von Interesse während der Inkubation. Die Protease muss zu niedrigen Kosten verfügbar sein, also sind ein effizientes Expressionssystem und eine kostengünstige Herstellungsmethode notwendig. Daher könnte eine gentechnisch hergestellte Protease, die einen Affinitäts-Tag enthält, eine gute Lösung sein. Die Protease sollte auch ausreichend rein sein, speziell sogar frei von Spurenkontamination von nicht spezifischen Proteasen des Wirtsorganismus. Da keine Protease diese Anforderungen für alle möglichen Proteine von Interesse erfüllen wird, wird die Industrie eine Reihe von Proteasen für die Verwendung in einem solchen Verfahren entwickeln müssen. Diese Proteasen werden bevorzugt eine unterschiedliche Spezifität aufweisen. Ein Fall-zu-Fall-Screening kann die optimale Prozessierungsstrategie für irgendein Polypeptid von Interesse bestimmen.
  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Caspase-Aktivität, um ein künstliches Fusionsprotein zu schneiden, das einen ersten Teil umfasst, der ein Protein oder Peptid als Fusionsteil, einen zweiten Teil, der einen Linker umfasst, der konzipiert ist, um das Schneiden mit dem Enzym zu maximieren, und einen dritten Teil umfasst, der das Protein oder Peptid von Interesse umfasst, das in reifer oder funktionaler Form isoliert werden soll.
  • Das Caspase-Protein selbst kann Teil eines Fusionsproteins sein, z. B. mit der Absicht, das Expressionslevel oder die Löslichkeit des Caspase-Enzyms zu optimieren, oder die leichte Rückgewinnung des Caspase-Enzyms zu optimieren, oder das Caspase-Enzym zu befähigen, effizient an einen festen Träger gekoppelt zu werden.
  • Die ersten Schritte bei der Erarbeitung der Prozessierung bestehen darin, eine Caspase auszuwählen, gefolgt von der Konzeptionserstellung, Wahl oder Auswahl einer Linkersequenz, die von der Caspase der Wahl geschnitten wird.
  • Klonieren von Caspasen
  • Gensequenzen von Caspasen sind im National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) zu finden. Caspasen können aus cDNA unter Verwendung geeigneter Primer kloniert werden, die am Beginn und am Ende der kodierenden Sequenz hybridisieren. Unter Verwendung der PCR-Reaktion kann eine amplifizierte DNA erhalten und in einem geeigneten Plasmid kloniert werden. Alternativ wird die cDNA-Bibliothek kloniert und in einzelne Kolonien geimpft. Die Kolonielysate können dann mit einem markierten Oligonukleotid sondiert werden, das spezifisch mit dem Caspase-Gen hybridisiert. Diese Techniken sind einem Fachmann bekannt.
  • Konzeption eines Caspase-verdaubaren Linkers in einem Fusionsprotein
  • Bevorzugt umfasst die Linkersequenz eine Zielsequenz eines natürlich vorkommenden Substrats der Caspasen. Am stärksten bevorzugt umfasst der Linker die effizienteste Zielsequenz, die für die verwendete Caspase bekannt oder isoliert ist. Es ist möglich, dass diese Sequenz keine natürlich vorkommende Zielsequenz ist, sondern von einer Consensus-Sequenz abgeleitet, oder durch eine Screeningmethode isoliert, oder aus einer biologischen Anreicherungsmethode ausgewählt ist, oder nach einer biologischen Auswahlmethode erhalten wird.
  • Tabelle I gibt Beispiele für Zielsequenzen, die durch den Vergleich natürlicher Zielsequenzen, oder durch Synthetisieren von Sequenzen, die die durch regelloses Screenen einer Bibliothek isoliert wurden. Die optimierten Sequenzen können auch erhalten werden, indem die spezifische Enzym-Aktivität der Caspase auf einem Peptidsubstrat verglichen wird.
  • Einige bevorzugte Zielsequenzen sind:
    Caspase-Gruppe Caspasen Bevorzugte Sequenz
    Gruppe I 1, 4, 5, 13 WEHD (SEQ ID NO 11)
    LEHD (SEQ ID NO 12)
    Gruppe II 2, 3, 7, CED-3 DEVD (SEQ ID NO 13)
    DEHD (SEQ ID NO 14)
    Gruppe III 6, 8, 9, 10, VEHD (SEQ ID NO 15)
    LEHD (SEQ ID NO 16)
  • Bevorzugt umfasst die Linkersequenz ferner eine Spacer-Region, um den Raum zwischen dem Fusionspartner F und der Caspase-Schnittstelle in dem Linker zu erhöhen. Am stärksten bevorzugt ist der Linker auf eine solche Weise konzipiert oder optimiert, dass die Caspase-Zielsequenzen für das Caspase-Enzym leicht erreichbar sind.
  • Die Linkersequenz kann ferner optimiert werden, um die Löslichkeit des Fusionsprodukts zu erhöhen. Dies kann, als nicht beschränkendes Beispiel, gemacht werden, indem die Sequenz mit hydrophilen Aminosäuren oder mit geladenen Aminosäuren angereichert wird. Der derzeitige Stand der Technik ermöglicht es, Experimente zur Auswahl von Linkersequenzen zu konzipieren, die die Löslichkeit verbessern würden, indem eine Anzahl von Varianten gescreent oder ausgewählt würden. Diese Varianten können eine definierte Anzahl von Optionen sein, die aus einer berechneten Auswahl abgeleitet sind, oder aus einer randomisierten Sequenzbibliothek abgeleitet sind.
  • Die Linkersequenz kann ferner auch optimiert werden, um Sequenzen zu umfassen, die von einem Liganden oder Antikörper erkannt werden, um als Affinitäts-Ziel in einem Affinitätsbasierten Trennungsschritt zu dienen, oder um zur einfachen und sensitiven Detektion des Proteins, in das die Sequenz eingebaut ist. Der Linker kann auch eine hohe Konzentration einer bestimmten Klasse von Aminosäuren enthalten, um die Adsorption für nicht spezifische Chromatographiesäulen zu verbessern, wie etwa Innenaustausch, hydrophobe Interaktion, Ligandenbindung.
  • Konstruktion eines Fusionsproteins
  • Das Fusionskonstrukt umfasst eine Kombination der allgemeinen Formel F-L-G wobei F ein Fusionspartner der Wahl ist, L die gewählte Linkersequenz ist, und G das Gen von Interesse ist, das das Polypeptid von Interesse kodiert.
  • Der Fusionspartner der Wahl kann aus Public-Domain-Wissen gewählt werden, auf der Basis bisheriger Erfahrung, dass das Fusionieren eine Gens G mit dem Fusionspartner F das Expressionslevel und/oder die Löslichkeit des gesamten Fusionsgens verbessern wird. Beispiele für Fusionspartner, die für diese Zwecke beschrieben wurden, sind:
    Das Gluthation-S-Transferase Gen GST, E. coli Thioredoxin TRX, NusA, Chitin-Bindedomäne CBD, Chloramphenicolacetyltransferase CAT, Protein A (prot A), LysRS, Maltose-Bindungsprotein (MBP), Ubiquitin, Calmodulin.
  • Andere Fusionspartner können auf der Basis von Regeln gewählt werden, die vorhersagen, dass Proteine als Fusionspartner effektiv sind, um eine höhere Expression zu erhalten und/oder um die Löslichkeit des Fusionskonstrukts zu verbessern. Die US-Patentschrift Nr. 6,207,420 beschreibt eine solche Methode basierend auf dem Hydrophilitätsindex des Proteins, das als Fusionspartner identifiziert wurde.
  • Der Fusionspartner kann auch so gewählt werden, dass er einen Detektions- oder Affinitätsreinigungs-Tag in das Fusionsprotein enthält. Von besonderem Interesse ist ein Tag, der die Affinitätsreinigung des Fusionsproteins ermöglicht. Diese Tags können auf chemischen Prinzipien basieren, oder werden als Epitope für spezifische Antikörper ausgewählt. Beispiele für Reinigungs-Tags, die auf einer starken chemischen Interaktion basieren, die als sehr selektiver Reinigungsschritt verwendet werden, sind ein Polyhistidin-Tag (H), der in immobilisierter Metallaffinitäts-Chromatographie verwendet werden kann, oder ein Polyarginin-Tag, der in hochsaliner Ionenaustausch-Chromatographie gehalten werden kann.
  • Die Fusionspartner können aus einer Kombination von Fusionsproteinen, einer Kombination von Tags oder einer Kombination von Tags und Fusionspartnern gewählt werden. Zum Beispiel könnte F aus einem GST-Fusionsprotein F' bestehen, das N-terminal mit einem HIS-Tag H fusioniert ist, wobei F-L-G = H-F'-L-G oder, im Fall einer Kombination von Fusionspartnern F1-F2-L-G.
  • In einem solchen Konstrukt können Affinitäts- oder Detektionspeptide (Tags t) in und zwischen den Fusionsproteinen oder Fusionsproteindomänen Fi angeordnet werden: (t)-F1-(t)-F2-(t)-L-G.
  • Der N-Terminus des Fusionsproteins, das die F-L-G-Struktur umfasst, kann mit einer Signalsequenz modifiziert sein. Eine Signalsequenz ist eine definierte funktionale Einheit, die es erlaubt, dass das Fusionsprotein sekretiert wird. In eukaryotischen Zellen wird dies zur Lieferung des Fusionsproteins an das endoplasmatische Reticulum, und möglicherweise an das extrazelluläre Medium führen. In Grampositiven Zellen leitet dieses Signalpeptid das Fusionsprotein durch die cytoplasmatische Membran in das Medium. In Gramnegativen Zellen leitet die Signalsequenz das Fusionsprotein zu dem periplasmatischen Raum zwischen der zellulären und der äußeren Membran, und gelegentlich wird das Fusionsprotein ebenfalls in das Kulturmedium freigesetzt.
  • In dem Beispiel, in dem das Fusionsprotein sekretiert wird, wäre die Formel für das Genkonstrukt S-F-L-G wobei S ein Signalpeptid ist und F der Fusionspartner ist, sie können auch aus einer Kombination von Sequenzen tn-Fi bestehen, wobei n und i gemäß der Anmeldung bestimmt werden. Andere Fusionspartner oder Tags können entweder zwischen dem Linker und dem Protein von Interesse oder am C-Terminal des Proteins von Interesse inseriert werden. Diese Sequenzen werden jedoch nicht aus dem Protein von Interesse entfernt, nachdem die Linkersequenz L durch ein Caspase-Enzym prozessiert wurde.
  • Das Fusionsprotein, das die F-L-G-Teile umfasst, wird mit DNA-Rekombinationstechniken erstellt. Die kodierende Sequenz des vollständigen Fusionsgens sollte bevorzugt vor dem Klonieren bestimmt werden. Die kodierenden Sequenzen der unterschiedlichen Teile in dem Fusionsgen können unter Verwendung von Restriktionsenzymen zusammengebaut werden, die spezifische Stellen in DNA-Molekülen schneiden. Kompatible Stellen können erneut religiert werden, und dies ermöglicht die Konstruktion der Fusionsgene. Alternativ können Teile des Fusionsgens oder das vollständige Fusionsgen konstruiert werden, indem Stücke einer synthetischen DNA zusammengebaut werden. Eine andere Möglichkeit ist es, die Regionen, die kombiniert werden sollen, durch die Polymerase-Kettenreaktionstechnologie (PCR-Technologie) zu amplifizieren, wobei amplifizierte DNA-Stücke zusammengebaut werden können, indem geeignete Restriktionsenzyme eingefügt werden und/oder indem ein ausreichendes Überlappen in den DNA-Stücken und das Durchführen einer Splice-Overlap-Extension-PCR-Reaktion eingeschlossen wird. Alle diese Techniken sind dem Fachmann bekannt, und sind in aktuellen Laborhandbüchern zu finden, die DNA-Rekombinationstechnologie zum Thema haben. Andere Variationen und Kombinationen dieser Techniken werden es ebenfalls ermöglichen, das Fusionsgen zu erhalten.
  • Herstellung des Fusionsproteins
  • Das Fusionsgen muss derart gentechnisch hergestellt werden, dass es durch den Wirtsorganismus in Protein translatiert wird. Als Wirtsorganismus eignet sich irgendeine lebende Zelle oder Organismus. Lebenden Zellen oder Organismen können prokaryotischer oder eukaryotischer Natur sein. Gängige Zellen, die als Wirte für die Expression von rekombinanten Genen dienen, sind zum Beispiel:
    Escherichia coli, Bacillus species, Streptomyces species, Hefestämme, wie etwa Saccharomyces-, Schizosacharomyces-, Pichia- oder Hansenul-Stämme, Insektenzellen, Säugetierzelllinien, Pflanzenzellen. Expressionswirte können auch auf dem Level eines multizellulären Organismus sein, wie etwa transgene Pflanzen, Schaf, Ziege, Kuh, Huhn und Kaninchen, wobei das Produkt entweder aus den Organen oder aus Körperflüssigkeiten, wie etwa Milch, Blut oder Eiern, isoliert werden kann.
  • Alternativ kann das Gen unter Verwendung von zellfreien Translationssystemen in Protein translatiert werden, möglicherweise gekoppelt an ein In-vitro-Transkriptionssystem. Diese Systeme stellen alle Schritte bereit, die notwendig sind, um Protein aus DNA zu erhalten, indem die notwendigen Enzyme und Substrate in einer In-vitro-Reaktion geliefert werden. Im Prinzip kann irgendeine lebende Zelle oder Organismus die notwendigen Enzyme für dieses Verfahren bereitstellen und Extraktionsprotokolle zum Erhalt solcher Enzymsysteme sind dem Fachmann bekannt. Gängige Systeme, die für die In-vitro-Transkription/Translation verwendet werden, sind Extrakte oder Lysate von Retikulozyten, Weizenkeim oder Escherichia coli.
  • Isolierung des rekombinanten Fusionsproteins, das mit Caspase gereift werden kann
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fusionspolypeptid isoliert und vor der Prozessierung mit der Caspase-Protease gereinigt. In dieser Strategie können die physikalisch-chemischen Merkmale des Fusionsteils für eine gleichmäßige, geglättete und hoch spezifische Reinigung des Fusionsproteins verwendet werden. Die Kennzeichen des Fusionsteils hinsichtlich des adsorptionschromatographischen Mediums oder der spezifischen Affinitätsreinigungsmethoden sollte berücksichtigt werden. Als nicht beschränkende Beispiele können Peptid-Tags eingeschlossen werden, die die Bindung an Ionenaustauschsäulen (z. B. Polyarginin), hydrophobe Interaktionssäulen (z. B. Polyphenylalanin) oder immobilisierte Metall-chelatbildende-Chromatographie (z. B. Polyhistidin) erhöhen. Andere nicht beschränkende Beispiele sind Fusionsproteine oder Fusionsdomänen, die eine Affinität für ein Substrat oder einen Liganden haben (z. B. Maltose-Bindungsprotein MBP, Gluthathion-S-Transferase GST, Protein A, biotinylierte Peptide oder Domänen, Chitin-Bindedomänen CBD). Weitere nicht beschränkende Beispiele sind die Verwendung von Fusionspartnern, die bei höherer Temperatur löslich bleiben (z. B. Thioredoxin), oder bei bestimmten Bedingungen reversierbar Präzipitieren werden. Ein Reinigungsschema, das auf den Eigenschaften des Fusionspartners basiert, wird höchstwahrscheinlich auf das vollständige Fusionsprotein anwendbar sein. Eine Kombination solcher spezifischer Reinigungsmethoden kann verwendet werden, wenn der Fusionsteil aus unterschiedlichen Peptiden, Domänen oder Proteinen zusammengesetzt ist, oder wenn er unterschiedliches selektives Verhalten auf unterschiedlichen chromatographischen Medien zeigt.
  • In-Vitro-Spaltungsreaktion
  • Die In-vitro-Spaltung eines rekombinanten Fusionsproteins mit einer Caspase sollte bevorzugt unter spezifischen Bedingungen erfolgen. Es wird keineswegs gesagt, dass die Erfindung auf diese Reaktionsbedingungen beschränkt ist. Der pH-Wert der Reaktion wird bevorzugt so eingestellt, dass er zwischen 6 und 9, stärker bevorzugt zwischen 7 und 8 liegt. Es ist nicht notwendig, der Reaktion Salz zuzufügen, aber die Spaltungsreaktion kann bis zu 1 M NaCl tolerieren. Bevorzugt ist die NaCl-Konzentration nicht höher als 0,2 M. Einige Zusatzstoffe können die Schnittreaktion der Caspasen verstärken. Solche Zusatzstoffe sind CHAPS 0,1%, Saccharose 10% oder Mannitol 10%. Caspase-Enzyme sind für die Oxidation des Cysteinrests in der Wirkzentrum sensitiv. Um dies zu vermeiden, Einschluss von Antioxidantien (wie etwa Ascorbinsäure), Reduktionsmittel (wie etwa β-Mercaptoethanol, DTT, Cysteine) und chelatbildende Salze (wie etwa EDTA), um die die Oxidation katalysierenden Ionen, wie etwa Zn++, einzufangen.
  • Spaltung direkt an der Säule
  • Es ist möglich, die Anzahl von Schritten zu reduzieren, die für die Reifung des Fusionsproteins im Anschluss an das Entfernen des Enzyms und das Entfernen des Fusionsteils, der aus dem Fusionsprotein geschnitten wurde, benötigt werden. Wenn ein Affinitäts-Tag in den Fusionsteil eingebaut wird, kann der gleiche Affinitäts-Tag, z. B. durch DNA-Rekombinationstechnologie, mit der Caspase fusioniert werden. Unter Verwendung dieser Strategie kann das Fusionsprotein auf einem festen Träger eingefangen werden (der eine chromatographische Säule sein kann), und dann mit einer Caspase inkubiert werden, die Affinität für den gleichen festen Träger zeigt. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die flüssige Phase des Reaktionsgefäßes das Protein von Interesse enthalten, während sowohl der Fusionsteil als auch das Enzym auf der festen Phase adsorbiert wurden. Es sollte Sorgfalt darauf verwendet werden, die Exposition der Caspase an oxidative Bedingungen zu reduzieren, da ansonsten das Wirkstellencystein oxidiert wird, und die Reaktion nicht ihr volles Potential erreicht. Reduktionsmittel (gegebenenfalls), Antioxidantien und chelatbildende Salze, um den Oxidationskatalysator einzufangen, können in die Reaktion eingeschlossen werden. Beispiele für solche Bedingungen sind 1–10 mM DTT oder β-Mercaptoethanol, oder 1% Ascorbinsäure, oder 1 mM EDTA.
  • In-vivo-Spaltung
  • Die Spaltung des Fusionspeptids kann auch in vivo induziert werden. Die Spaltung in der Zelle oder dem Medium des Bioreaktors hat den Vorteil, dass keine Prozessierung nach der Herstellung notwendig ist. Jedoch geht der Vorteil einer spezifischen Affinitätsreinigung auf der Basis von Eigenschaften des Fusionsteils in diesem Fall verloren.
  • Es können zwei alternative Strategien angewendet werden. Erstens, kann die Caspase gleichzeitig mit dem Fusionsprotein induziert werden. Das kann realisiert werden, indem ein transkriptionales Operon des Caspase-Enzyms und des Fusionsproteins konstruiert wird, oder indem eine translationale Fusion konstruiert wird, einschließlich der Caspase in dem Fusionsprotein, oder indem die Caspase hinter einem unterschiedlichen Promoter kloniert wird, der gleichzeitig mit demjenigen des Fusionsproteins induziert wird. Letzteres kann unter Verwendung der gleiche Promoter in zwei Transkriptionskassetten realisiert werden, oder unter Verwendung von zwei Promotern, die mit dem gleichen Induktor (z. B. IPTG/Lactose) induziert werden, oder unter Verwendung von zwei Promotern, die mit unterschiedlichen Agenzien induzierbar sind, wobei beide Agenzien gleichzeitig zugefügt werden. Alternativ kann das Caspase-Enzyme zu einem anderen Zeitpunkt als dem Beginn der Herstellung des Fusionsproteins induziert werden. Die Caspase kann vor, oder stärker bevorzugt, nach dem Herstellungsbeginn des Fusionsproteins hergestellt werden. In letzterem Fall ist es wahrscheinlicher, dass das Protein von Interesse sich zu einem löslichen, aktiven Protein faltet.
  • Ein erster Aspekt der Erfindung ist eine Methode zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse in reifer Form, umfassend
    • – Herstellung eines Fusionsproteins, das ein aminoterminales Polypeptid, eine Linkersequenz umfassend eine Caspase-Erkennungsstelle, und ein Polypeptid von Interesse umfasst, in einem geeigneten Wirt,
    • – Spaltung des Fusionsproteins durch eine Caspase
    • – Isolierung des reifen Polypeptides von Interesse.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Methode zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids, das einen vorbestimmten aminoterminalen Aminosäurerest aufweist, umfassend: a) Expression des Proteins oder Polypeptids in einer Wirtszelle als Fusionsprotein, wobei der Amino-Terminus des Proteins oder Polypeptids mit einem oder mehreren Fusionspartnern mit einem Linker fusioniert wird, wobei das Fusionsprotein durch eine Caspase an der Verbindungsstelle des Linkers mit dem aminoterminalen Aminosäurerest des Proteins oder Polypeptids spezifisch spaltbar ist, wobei die Wirtszelle keine Caspase hat, die das Fusionsprotein an der Verbindungsstelle des Linkers und des aminoterminalen Aminosäurerests des Proteins oder Polypeptids spaltet; b) Isolieren des Fusionsproteins aus der Wirtszelle; und c) Kontaktieren des Fusionsproteins mit einem Extrakt, der eine Caspase enthält, die das Fusionsprotein spezifisch an der Verbindungsstelle des Linkers und dem aminoterminalen Aminosäurerest des Proteins oder Polypeptids spaltet, wobei der Extrakt aus Zellen abgeleitet ist, die die Caspase durch DNA-Rekombinationsmethoden herstellen.
  • Der geeignete Wirt kann irgendein Wirt sein und umfasst sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Wirtszellen.
  • Als nicht beschränkendes Beispiel kann der Wirt eine Säugetierzelle und Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine vollständige Pflanze, eine Hefezelle, eine Pilzzelle, ein Gram-positives Bakterium, wie etwa Bacillus sp oder Milchsäurebakterien, oder ein Gram-negatives Bakterium, wie etwa E. coli sein. Bevorzugt ist der Wirt eine prokaryotische Zelle, starker bevorzugt ist der Wirt ein Gram-negatives Bakterium, am stärksten bevorzugt ist der Wirt Escherichia coli.
  • Bevorzugt umfasst die Caspase-Erkennungsstelle die Aminosäuresequenz DXXD. Stärker bevorzugt umfasst die Caspase-Erkennungsstelle die Sequenz DEVD oder DEHD.
  • Bevorzugt wurde die Linkersequenz für die optimale Caspase-Prozessierung optimiert. Methoden, um die Linkersequenz zu optimieren sind dem Fachmann bekannt, und beinhalten als nicht beschränkende Beispiele die Insertion einer Spacer-Region am aminoterminalen Ende der Caspase-Erkennungsstelle. Die Spacer-Region umfasst bevorzugt mindestens 1, starker bevorzugt mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 zusätzliche Aminosäure, stärker bevorzugt umfasst die Spacer-Region mindestens 15, 20 oder 25 zusätzliche Aminosäuren.
  • Die verwendete Caspase kann irgendeine Caspase sein. Bevorzugt ist die Caspase jedoch aus der Gruppe, bestehend aus Caspase-2, Caspase-3, Caspase-7, CED-3 reverse Caspase-3 und reverse Caspase-7, ausgewählt. Stärker bevorzugt ist die Caspase Caspase-3 oder Caspase-7. Noch starker bevorzugt ist die Caspase Caspase-3.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Spaltung durch die Caspase in vitro, nach der Isolierung des Fusionsproteins aus der Wirtszelle, indem das Fusionsprotein mit einer Caspase, bevorzugt einer gereinigten Caspase, in einem geeigneten Reaktionsgemisch gemischt wird. Die Spaltung der Caspase kann jedoch aus in vivo erfolgen, indem die Caspase-Aktivität in der gleichen Wirtszelle induziert wird, in der auch das Fusionsprotein hergestellt wird. Die Induzierung der Caspase-Aktivität kann gleichzeitig mit der Herstellung des Fusionsproteins stattfinden, oder die Herstellung von Caspase und Fusionsprotein kann sequentiell sein.
  • Die Caspasen-Prozessierung ist aufgrund ihrer hohen Effizienz sogar für reife Proteine interessant, die eine aminoterminale Aminosäure umfassen, die unter Verwendung anderer Proteasen schwer zu prozessieren ist. Für normale aminoterminale Aminosäuren (d. h. nicht P, D oder E) wird bevorzugt eine Ausbeute von mindestens 80%, bevorzugt 90 des reifen Polypeptids von Interesse innerhalb 60 Minuten nach der Initiierung der Spaltungsreaktion erhalten. Die Spaltung des Fusionsprotein kann z. B. auf SDS-Page-Gel ermittelt oder sichtgeprüft werden, oder kann durch densitometrische Bestimmung gemessen werden.
  • Wenn ein reifes Polypeptid mit einem Prolin als aminoterminaler Aminosäure prozessiert wird, wird bevorzugt eine Ausbeute von mindestens 20%, stärker bevorzugt eine Ausbeute von 25% des reifen Polypeptids erhalten. Wenn ein reifes Polypeptid entweder mit einem Glutamin oder einem Asparagin als aminoterminaler Aminosäure prozessiert wird, wird bevorzugt eine Ausbeute von mindestens 60%, stärker bevorzugt eine Ausbeute von 75% des reifen Polypeptids erhalten. Bevorzugt werden diese Ausbeuten innerhalb von 60 Minuten nach der Initiierung der Spaltungsreaktion erhalten.
  • Definitionen
  • Die Angabe der folgenden Definitionen dient der Illustration und der Definition der Bedeutung und des Umfangs verschiedener Begriffe, die verwendet werden, um diese Erfindung zu beschreiben.
  • Die Notation 'DEVD/S' (SEQ ID NO 17) bedeutet, dass ein Serin (S) auf die DEVD-Erkennungssequenz folgt und nach der Prozessierung als erste Aminosäure des reifen Proteins freigesetzt wird.
  • Die Notation 'DEVD/' bedeutet, dass das Polypeptid nach dem letzten D geschnitten wird, unabhängig von der ersten Aminosäure, die auf die Schnittstelle folgt.
  • Die Begriffe 'Protein' und 'Polypeptid', wie in dieser Anmeldung verwendet, sind austauschbar. 'Polypeptid' bezieht sich auf ein Polymer aus Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls. Dieser Begriff beinhaltet auch post-translationale Modifikationen des Polypeptids, wie etwa Glycosylierung, Phosphorylierung und Acetylierung.
  • Der Begriff 'Polypeptid von Interesse' bedeutet das Polypeptid, das durch die Prozessierung hergestellt werden soll, und das für weitere Anwendungen verwendet werden wird. Bevorzugt ist es ein biologisch aktives Molekül, wie etwa ein Enzym eines Cytokins.
  • Die 'reife Form' oder 'reifes Polypeptid' von Interesse bezieht sich auf das Polypeptid von Interesse in seiner biologisch aktiven Form ohne Präpeptide oder Leader-Sequenzen. Reife Form und reifes Polypeptid wird verwendet, wenn wir betonen wollen, dass das Protein mit der aminoterminalen Aminosäure des Polypeptids von Interesse beginnt, das in seiner biologisch aktiven Form auftritt. Bevorzugt ist die biologisch aktive Form mit der reifen Form des Polypeptids von Interesse, wie es in der Natur auftritt, identisch.
  • Die 'Ausbeute' der Spaltungsreaktion ist definiert als das Verhältnis des Proteins von Interesse, das durch die Spaltungsreaktion erhalten wird, zur theoretischen Menge des Proteins von Interesse, die unter der Annahme erhalten werden kann, dass das gesamte Fusionsprotein gespalten würde, ausgedrückt in Prozent.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1: Caspase-Klassifikation gegenüber Spezifität. Die Figur zeigt die Zielsequenz in der Wirkstelle des Enzyms. Die Enzym-aufnehmenden Taschen werden mit S1–S4 bezeichnet, während die Aminosäurepositionen der Zielsequenz mit P1–P4 bezeichnet werden. Während Gruppe-II-Caspasen ein Aspartyl an Position P4 bevorzugen, bevorzugen Gruppe-I-Caspasen an dieser Position einen hydrophoben Rest und Gruppe-III-Caspasen bevorzugen eine aliphatische Gruppe an der P4-Position.
  • 2: Konzeption eines Fusionsproteins Unterschiedliche Linkersequenzen (1 bis 5, die den SEQ ID NO. 1 bis 10 entsprechen: gerade Nummern Aminosäuresequenzen, ungeraden Nummern Nukleinsäuresequenzen) wurden gentechnisch zwischen den Fusionspartnern und dem Protein von Interesse hergestellt. Alle Konstrukte wurden in gleicher Weise als lösliches Protein exprimiert. F: Fusionspartner, L: Linker, P: Polypeptid von Interesse.
  • 3a) und b): Enterokinase gelingt es entweder nicht, einen gentechnisch hergestellten Linker zu prozessieren, oder sie kann das Zielprotein von Interesse abbauen. Sowohl Caspase-3 als auch reverse Caspase-7 verarbeiten das Fusionsprotein mit größerer Effizienz in einer sehr kurzen Zeit. EK: Enterokinase-Erkennungsstelle; H: Histidin-Tag; GST: Glutathion-S-Transferase; TRX: Thioredoxin; F, L und P wie in 2.
  • 4: Thrombin-Schnitt eines GST-mLIF-Fusionsproteins benötigt eine lange Prozessierungszeit. Dies kann mit Caspase-3 effizienter in sehr kurzer Zeit erledigt werden. Zwei Schnittstellen (DEVD/ und DEVD/S), die in der Prozessierungsreaktion auf die gleiche Weise funktionierten, wurden verglichen. Abkürzungen wie in 3.
  • 5: Die Figur zeigt eine Enzymtitration während 16 Std. Inkubation für Thrombin, und eine 45-minütige Inkubation für Caspase-3. Eine Menge von 50 ng ist ausreichend, um > 90% von 10 Mikrogramm eines GST-mLIF-Fusionsproteins zu prozessieren.
  • 6A: Einfluss der P1'-Stelle (erste Aminosäure hinter, d. h. stromabwärts der Schnittstelle) auf die Schnitteffizienz. Die P1'-Stelle wurde zu allen 20 möglichen Aminosäuren verändert, und auf die Inhibition der Prozessierung getestet.
  • 6B und 6C: Einfluss der Linkersequenz auf die Schnitteffizienz. Linkersequenzen, die nur aus einer Erkennungsstelle bestehen sind beim Schneiden des Fusionsproteins weniger effizient. In 6C wird gezeigt, dass mindestens 2 μg Caspase 3 benötigt wird (linkes Konstrukt) verglichen mit der Kontrolle (rechtes Konstrukt), bei der nur 100 ng zu einer effizienten Spaltung des Fusionsproteins führten.
  • 7: Sowohl mLIF als auch hIFN-alpha wurden unter Verwendung von entweder Caspase-3 oder reverse Caspase-7, entweder mit der Erkennungsstelle DEVD/ oder DEVD/S, effizient geschnitten.
  • 8: Screenen der Aminosäuresequenz von mLIF, hIFN alpha, GST und TRX. Die Consensus-Sequenzen für Caspase-Gruppe-II-Erkennungsstellen (DXXD) sind mit einem Kasten markiert.
  • 9: Expression und Reinigung von Caspase-Enzymen. Silberfärbung von Caspase-3, die in Escherichia coli hergestellt und wie beschrieben gereinigt wurde.
  • 10: Koexpression von Caspase mit einem Fusionsprotein ermöglicht die Spaltung in vivo. A) Plasmidkarten für gleichzeitige oder unterschiedliche Induzierung von Caspase 3. B) Proteingelanalyse von Bakterien, die Caspase 3 mit einem spaltbaren Fusionsprotein koexprimieren.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1 Konzeption einer spaltbaren Linkersequenz für die Caspasen-Reifung
  • Um die Methode der Erfindung zu verwenden, sollte zuerst ein Expressionsvektor für ein Fusionsproteinkonstrukt konzipiert werden, bei dem das Fusionskonstrukt durch eine Linkersequenz von dem reifen Protein getrennt ist. Die Linkersequenz muss eine bevorzugte Erkennungssequenz für ein Caspase-Protein enthalten. Beispiele für solche Erkennungssequenzen werden in Tabelle I gegeben. 2 zeigt einige Beispiele für Linker, die für die Spaltung mit Caspase 3 verwendet wurden.
  • Beispiel 2 Spaltung mit Caspase 3 übertrifft die Spaltung mit Industristandardproteasen, denen es an Effizienz oder Spezifität fehlt
  • Industriestandardenzyme zur Prozessierung von Fusionsproteinen, um ein reifes Protein ohne irgend eine zusätzliche Aminosäure zu erhalten, die aus der Konzeption der Spaltungsstelle übrig bleibt, sind nicht immer effizient und können den Engpass bei der Konzeption eines effizienten Herstellungsverfahrens bilden. 3a) zeigt ein Spaltungsexperiment eines Thioredoxin-murinen-Interleukin-15-Fusionsgens, die voneinander mit einer Erkennungsstelle für Enterokinase (TRX-EK-mIL15) getrennt werden. Die Spaltung mit Enterokinase erforderte eine lange Inkubationszeit, um das Molekül zu prozessieren. Am Ende war das Molekül prozessiert, was durch die Freisetzung des Thioredoxin(TRX)-Proteins offensichtlich wurde, aber das murine Interleukin-15-Protein (mIL15) ist ebenfalls durch das Enzym oder das Enzympräparat abgebaut. In dem anderen Beispiel in 3b), wurde ein Fusionsprotein von TRX mit humanem Interferon-alpha (hIFNα), umfassend eine Linkersequenz, die eine Erkennungsstelle für Enterokinase (DDDK) kodiert, TRX-EK-hIFNa, mit einen Fusionskonstrukt von Gluthathion-S-Tranferase (GST) mit hIFNα, umfassend eine Caspase-3-Erkennungsstelle (DEVD) in der Linkersequenz, GST-C-hIFNα in der Linkersequenz, verglichen. Die Fusionsproteine wurden hergestellt, gereinigt und mit Enterokinase bzw. Caspase-3 prozessiert. 16 Std. Inkubation mit Enterokinase führten nur zu einer geringen Prozessierungsmenge des Fusionsproteins. Caspase-3 ergab andererseits eine hohe Prozessierungsausbeute sogar nach nur 45 Minuten Inkubation. Ein anderer Industriestandard für eine Protease zum Einstellen von Fusionsproteinen, um eine unmodifizierte reife Proteinsequenz zu erhalten, ist Thrombin. 4 zeigt ein Beispiel, bei dem murine LIF mit einem GST-Fusionspartner und einem Hexahistidin-Fusionspartner (H) fusioniert wird, die jeweils eine Thrombinprotease-Erkennungssequenz in dem verbindenden Linker (H-GST-T-mLIF), oder eine Caspase-3-Erkennungssequenz (H-GST-C-mLIF) umfassen. Zwei unterschiedliche Stellen für Caspase-3 wurden eingeführt. Da aus der Analyse der natürlichen Caspase-3-Stellen geschlossen werden kann, dass es eine eindeutige Präferenz für eine kleine Aminosäure an der P1'-Position gibt, wurde eine Linkersequenz, die eine DEVD/Erkennungssequenz umfasst, bei der die reife mLIF-Sequenz auf die Sequenz folgt und nach der Prozessierung freigesetzt wird, mit einer Linkersequenz verglichen, die eine DEVD/S umfasst, bei der eine Serin-mLIF auf die DEVD-Erkennungssequenz folgt und die nach der Prozessierung freigesetzt wird. Die Prozessierung mit Caspase-3 war verglichen mit Thromin weitaus effizienter, und die Reaktion war unter Verwendung von Caspase-3 nach 45 Minuten beendet, während bis zu 16 Std. notwendig waren, um das H-GST-T-mLIF-Fusionsprotein mit Thrombin zu prozessieren. Zu unserer Überraschung konnten wir keinerlei Unterschied bei der Prozessierungseffizienz beobachten, wenn die H-GST-DEVD/mLIF- oder H-GST-DEVD/S-mLIF-Fusionsproteine verwendet wurden.
  • Um die Schnitteffizient eines solchen gentechnisch hergestellten Fusionsproteins zu testen, titrierten wir das Enzym auf Fusionsprotein. 5 zeigt ein Beispiel eines solchen Titrationsexperiments auf einem H-GST-DEVD/mLIF und einem H-GST-DEVD/S-mLIF. Wieder konnte kein Unterschied zwischen beiden Konstrukten beobachtet werden, und die Titrationsreaktion zeigt, dass die geringe Menge von nur 50 ng Enzym ausreichend ist, um 10 Mikrogramm Protein zu prozessieren.
  • Um die Grenzen der Caspase-3-Prozessierung und die Beschränkungen bei der Prozessierung von Fusionsproteinen aufgrund der P1'-Sequenz zu testen, haben wir 20 unterschiedliche Aminosäuren an der P1'-Position eingeführt, die der mLIF-Sequenz vorausgeht. Alle 20 Fusionsproteine der Formel H-GST-DEVD/X-mLIF, wobei X irgend eine der möglichen 20 Aminosäuren ist, die durch ihren Einbuchstabencode beschrieben sind, wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und als Substrat für die Spaltung mit Caspase-3 verwendet. 6 zeigt die Ergebnisse des Schnittexperiments. Zu unserer großen Überraschung konnten alle Aminosäuren in der P1'-Position mit Caspase-3 prozessiert werden. Prolin (P) an Position P1' inhibierte die Prozessierung zu etwa 75%, und die aziden Aminosäuren Glutamin (E) und Asparagin (D) inhibierten die Prozessierung zu etwa 25%, aber keine Aminosäure inhibierte die Prozessierung mit Caspase zu 100%.
  • Als nächsten untersuchten wir den Einfluss der vorausgehenden Aminosäuren, indem wir die Linkersequenzen kürzten und variierten. Unterschiedliche Längen und Sequenzen der Linkersequenzen vor der DEVD-Stelle hatten keinen Einfluss auf die Spaltungsreaktion (2). Wenn jedoch keine vorausgehende Linkersequenz vorhanden war und die DEVD-Stelle direkt auf das Fusionsprotein folgte, wurde ein deutlicher Rückgang der Schnitteffizienz festgestellt. 6B zeigt das Fusionsprotein von GST und mLIF, aber jetzt nur mit der DEVD-Stelle in dem Linker (L0: (L0: DEVD) verglichen mit dem Konstrukt, bei dem der DEVD-Stelle eine GPGS-Sequenz (L1: GPGSDEVD) vorausgeht. Während 90% des Fusionsprodukts, das L1 enthielt, prozessiert wurde (gemessen durch densitometrische Bestimmung des Gels), waren unter diesen Bedingungen nur 10% Prozessierungsausbeute zu beobachten, wenn der Linker L0 verwendet wurde.
  • 6C zeigt ein zweites Beispiel, bei dem 2 Mikrogramm Caspase 3 notwenig waren, um nur 50% von 10 Mikrogramm MBP-L0-hIFNalpha zu prozessieren. Für 10 Mikrogramm des Kontrollkonstrukts führten nur 100 ng Caspase 3 zur effizienten Spaltung.
  • 7 zeigt, dass im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten werden können, indem Caspase-7 oder reverse Caspase 7 verwendet werden. Bei uns war die murine Caspase-7 nicht so aktiv wie die murine Caspase 3 und es musste mehr Enzym zugefügt werden, um die gleiche Spalteffizienz zu erhalten.
  • Die Spezifität der Schnittreaktion wird durch die Analyse der Sequenz des Zielproteins, das in dem Beispiel verwendet wird, illustriert: Sowohl mLIF als auch hIFNa enthalten eine Consensus-Zielsequenz für Gruppe-II-Caspasen (DXXD/). Auch die in diesen Experimenten verwendeten Fusionspartner enthalten die DXXD-Consensus-Sequenz für Gruppe-II-Caspase. Thioredoxin (TRX) enthält eine Stelle, während der GST-Fusionspartner sogar 2 Zielsequenzen enthält (8). Es wäre ein weiterer Abbau eines Fusionsprodukts zu erwarten, das diese Proteine umfasst. Zu unserer großen Überraschung wurde keine dieser Stellen geschnitten, sogar bei verlängerter Inkubation mit Caspase-3 oder Caspase-7, was die Spezifität der Reaktion gegenüber der gentechnisch hergestellten Sequenz in dem Linker beweist.
  • Wir schließen daraus, dass die Caspasen eine gute Wahl für die Verwendung als Prozessierungsenzym für Fusionsproteine sind, da jede Aminosäure an der P1'-Position toleriert werden kann, sie sind effizient beim Schneiden (üblicherweise vollständig nach 45 Minuten Reaktionszeit), und die Sequenzspezifität ist ausreichend, um die Prozessierung an der gentechnisch veränderten Stelle zu bevorzugen, sogar dann, wenn das Zielprotein Consensus-Erkennungssequenzen für die Caspase-Enzyme enthält.
  • Beispiel 3 Expression und Reinigung von Caspasen
  • Die primäre Struktur des Caspase-Zymogens oder der Procaspasen besteht aus einer Prodomäne, gefolgt von einer großen Subdomäne von etwa 20 kDa (p20), und einer kleineren Subdomäne von etwa 10 kDa (p10). Ein Kombination von p10 und p20 wird als p30 bezeichnet. Aktive Caspase kann durch Koexpression der prozessierenden Subeineinheiten als getrennten Subeinheiten erhalten werden. In eukaryotischen Expressionswirten kann dies durch Kotransfektion von zwei Plasmiden gemacht werden, die beide einen Promoter, gefolgt von einem p10 oder einem p20 kodierenden Gen enthalten. Alternativ kann ein IRES-Element verwendet werden, um beide Subeinheiten aus einem einzelnen Transkript zu exprimieren. In Prokaryoten kann auch ein Zwei-Promoter-Konstrukt erstellt werden, oder die beiden Gene können in einem einzelnen Operon angeordnet werden. Die korrekte Startposition für beide kodierenden Sequenzen sollte gentechnisch hergestellt werden, um die Translationsinitiiierung in der gewählten Wirtszelle zu optimieren, wie dem Fachmann bekannt ist.
  • Das Caspase-Enzym kann auch als p30 oder als Procaspase exprimiert werden. Für die meisten Caspasen wird die Überexpression die Selbstaktivierung durch Autoprozessierung induzieren, was zur Freisetzung von p10 und p20 aus p30 oder der Procaspase in vivo führt. Die p10- und die p20-Form eines Heterodimers, das seinerseits dimerisieren wird, so dass das fertige Enzym ein (p10–p20)2-Tetramer ist. Volllängen-cDNA der Caspase-Gene wurde verwendet, um die p30-Caspasen zu klonieren. Unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidprimer, wurden geeignete Restriktionsstellen für das anschließende Klonieren gentechnisch hergestellt. Die p30-Caspase-cDNA wurde hinter dem Lambda-PL-Promoter kloniert, wie von Van de Craen et al. 1999, Cell Death and Differentiation a, 1117–1124 beschrieben, und durch Induzierung eines Antirepressors, wie in WO9848025 beschrieben, induziert Der Einfachheit halber wurden die Caspase-Enzyme mit einer Hexahistidinsequenz am N-Terminus der p20-Sequenz markiert, oder am C-Terminus der p10-Sequenz, wenn die Caspase in natürlicher Orientierung ist. Eine reverse Orientierung kann auch gentechnisch hergestellt werden, wie in der US-Patentschrift Nr. 26379950 beschrieben ist. In diesem Fall war der Polyhistidin-Tag entweder am N-Terminus von p10, oder am C-Terminus von 20.
  • Bei der Induzierung des Caspase-Gens in Escherichia coli gemäß WO9848025 , wurden die prozessierten Formen von p10 und von p20 erhalten. Das bakterielle Pellet wurde in einem Puffer A resuspendiert, der 20 mM Tris HCl, pH-Wert 7,5; 10% Glycerol; 1 mM oxidiertes Gluthathion, 500 mM NaCl, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 50 mM Leupeptin und 20 μg/ml Aprotinin enthält. Das resuspendierte Pellet wurde durch Beschallung oder in einer French Press lysiert. Unlösliche Proteine wurden durch Zentrifugieren oder Ultrafiltrieren entfernt. Das geklärte Lysat der bakteriellen Kultur wurde über eine DEAE-Säule gegeben, um die bakterielle DNA zu entfernen. Der Durchfluss wurde auf eine immobilisierte Metall-chelatbildende Säule geladen, die 50 mM Imidazol enthielt. Gebundenes Material wurde aus der Säule unter Verwendung von 200 mM Imidazol mit 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10% Glycerol, 1 mM oxidiertem Gluthathion, 50 mM NaCl eluiert, und zum PBS-Puffer dialysiert, der 1 mM oxidiertes Gluthathion enthält. Die Probe wurde über einer Mono-Q-säule (Amersham Bioscience) aufgetragen und mit einem Gradienten von 0 bis 1 M NaCl eluiert. 9 zeigt eine typische Präparation von gereinigter muriner Caspase-3 aus Escherichia coli.
  • Die Expression der Caspasen könnte durch die Verwendung von Fusionsproteinen erhöht werden. Die Caspasen werden mit dem C-Terminus eines Fusionspartnern, wie etwa Thioredoxin, Gluthathion-S-Transferase, Maltose-Bindungsprotein, NusA oder anderen fusioniert. Die Fusion zwischen den Fusionspartnern und dem Caspasegen kann eine Proteasestelle enthalten, um die Caspase nach der Herstellung freizusetzen. Diese Proteasestelle kann auch eine Zielstelle für die Caspase selbst sein, so dass das Fusionsprotein bei der Herstellung der aktiven Caspase autoprozessiert wird.
  • Beispiel 4 Caspasen-Reifung von Fusionsproteinen in vivo
  • Die Spaltungsreaktion kann in vivo durch das Kotransfizieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor für das Caspase-Enzym induziert werden. Wir haben dies durch das Klonieren des Caspasegens hinter dem Lambda-Protein-Promoter illustriert, der auf dem pICA2-Plasmid vorhanden ist, das in WO9848025 beschrieben wird. Ein Derivat von pICA2 ließ den Promoter, der ant kontrolliert (PN25/O2) zum Ptac-Promoter (pICA10) werden. Als nächstes wurde das Gen für murine Caspase-3 hinter dem PR-Promoter kloniert. Der resultierende pICA11-Vektor induziert Caspase zusammen mit dem Fusionsprotein (10A). Diese Ergebnisse bei der Spaltung eines Fusionsproteins, das eine DEVD in der Linkersequenz umfasst. 10B illustriert dies unter Verwendung einer GST-L1-IFNalpha-Fusion und eines spaltbaren Fusionsproteins, das mLIF enthält. Die quantitative Spaltung fand in vivo statt und es konnte kein unprozessiertes Fusionsprotein F-L1-P detektiert werden. Da in einigen Fällen das Protein von Interesse eine gewisse Zeit braucht, um sich korrekt zu falten, sogar wenn es mit dem Fusionspartner fusioniert wird, ist es bevorzugt, dass die Induzierung des Caspase-Enzyms unabhängig von der Induzierung des Fusionsproteins reguliert wird. Bei dieser Strategie ist es am stärksten bevorzugt, zuerst das Fusionsprotein zu induzieren und nach einer Zeit, die experimentell zu bestimmen ist, die Caspase-Enzyme zu induzieren. Da die Caspase-Enzyme im Cytoplasma von E. coli und anderen Wirtsorganismen aktiv sind, wird das Fusionsprotein in vivo geschnitten und das reife Protein wird freigesetzt. Diese Strategie verliert den Vorteil einer Möglichkeit zur Affinitätsreinigung, aber vermeidet das Verfahren der In-vivo-Spaltung und den Verbrauch von gereinigten Caspase-Enzymen.
  • Ein Caspase-3-p30-Protein wurde kloniert, fusioniert mit einem Hexahistidin-Tag hinter einem Xanthosin-Promoter, wie in PT102705 beschrieben. Das H-GST-DEVD/mLIF-Fusionsprotein wurde induziert unter Verwendung des Lambda PL/ant-Induzierungssystems, wie in WO9848025 beschrieben. Nach 4 Std. Induzierung durch die Zugabe von IPTG 1 mM, wurden dem Medium 0,2% Xanthosin zugefügt. Die Caspase-3-Aktivität wird induziert und prozessiert das Fusionsprotein in vivo. In einer anderen Strategie wurde das Caspase-3-Gen hinter dem Arabinosepromoter kloniert und in pICA10 inseriert. Das resultierende pICA12 (10A) induziert Caspase bei der Zugabe von 0,1% Arabinose, während das Fusionsprotein durch die Zugabe von Lactose oder IPTG induziert wird.
  • Beispiel 5 Ein Caspasen-Reifungsbioreaktor
  • Um sich die Möglichkeit, das Fusionskonstrukt zur Affinitätsreinigung zu verwenden, zunutze zu machen, aber den Verbrauch von gereinigten Enzymen zu minimieren, kann ein Bioverfahrensreaktor erdacht werden, der auf Caspase-Enzym basiert, das an einen festen Träger gekoppelt ist. Auf diese Weise kann eine leichte Wiedergewinnung erreicht werden und der Enzymreaktor kann mehrmals wieder verwendet werden. Das Entfernen des Enzyms ist ebenfalls nicht mehr notwendig, da das Enzym an den Festphasenträger gebunden bleibt und somit das Protein von Interesse nicht verunreinigt, das in flüssiger Phase vorliegt. Die Caspase wurde gereinigt und an eine voraktivierte NHS-Säule (Amersham Bioscience) gekoppelt, Gemäß den Anweisungen des Lieferanten. Nicht gebundene Enzyme wurden durch mehrere Wäschen entfernt. Eine gereinigte Fraktion von GST-L-mLIF wurde in den Reaktor geladen und 2 Stunden lang inkubiert. Der Reaktor wurde gespült und das eluierte Protein auf einer immobilisierten Metall-Affinitätssäule eingefangen. Der Durchfluss enthält das prozessierte Protein von Interesse, während der Fusionsteil auf der IMAC-Säule eingefangen ist. Der Caspase-3-Reaktor könnte mehr als einmal verwendet werden.
  • Tabelle I
  • Alle Proteine sind in Earnshaw, Martins and Kaufmann, Mammalian caspases: structure, activation, substrates and functions during apoptosis. Annu. Rev. Biochem; 1999, 68: 383–424, referenziert.
    Natürlich auftretende Zielstellen für Gruppe-II-Caspasen (2, 3, 7)
    Consensus P3 Glu fehlt P4 Asp fehlt
    Protein P4–P1 P1' Protein P4–P1 P1' Protein P4-P1 P1'
    PARP DEVD G MEKK-1 DTVD G Stat1 MELD (40*) A
    RepC LS DEVD G FAK (a) DQTD (25*) S Cytokeratin 18 VEVD (41*) A
    BetaII-spectrin DEVD S PKSrelK2 DITD (26*) C Lamin B1 VEVD S
    Fodrin (a) DETD (18*) S PKCdelta DMQD (27*) M FLIPL LEVD (42*) G
    Mst1 K DEMD (19) S Fodrin (a) DSLD (28*) S P3 Glu + P4 Asp fehlt
    Mst2 K DELD (20*) S 70kDaU1snR NP DGPD (29*) G Bid LQTD (43*) G
    D4 GDP DI DELD S mdm2 DVPD (30*) C FAK (a) VSWD (44*) S
    SREB DEPD (21*) S lkappaB DRHD (31*) A PITSLRE 2–1 YVPD (45*) S
    Rb DEAD (22*) G Waf1 DHVD (32*) L p21 K2 SHVD (46*) G
    PP2A Aalpha DEQD (23*) S Kip1 DPSD (33*) S Bcl-X HLAD (47*) S
    ICAD DEPD S Huntington DSVD (34*) L Presenilin-1 ARQD (48*) S
    PPLA DELD A DPAP DSLD (35*) S Caspasen PK IV PAPD (49*) A
    Presenilin -2 DSYD (36*) S pro-IL-6 SSTD (50*) s
    Größeres P1' Gelsolin DQTD (37*) G PKN LGTD (51*) S
    DNA-P-Kos DEVD (24*) N Topol DDVD (38*) Y DCC LSVD (52*) R
    PKCteta DEVD K Bcl-2 DAGD (39*) v Calpastatin (a) ALDD (53*) S
    RAS-GAP DTVD G Calpastatin (b) LSSD (54*) F
    Calpastatin (c) LSSD (55*) S
    Bax FIQD (56*) R
  • *Die Zahlen in Klammern verweisen auf die entsprechenden SEQ ID NOs.
  • LITERATURHINWEISE
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00490001

Claims (37)

  1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides von Interesse in einer biologisch aktiven Form, umfassend: – Herstellung eines Fusionsproteins, umfassend ein aminoterminales Polypeptid, eine Linkersequenz umfassend eine Erkennungsstelle für eine Caspase Gruppe II und den Polypeptides von Interesse, in einem geeigneten Wirt, – Spaltung des Fusionsproteins durch eine geeignete Caspase für die Erkennung der Erkennungsstelle der Caspase Gruppe II, die spezifisch das Fusionsprotein an der Verbindungsstelle der Linkersequenz und dem aminoterminalen Aminosäurerest des reifen Polypeptides von Interesse spaltet, und – Isolierung des biologisch aktiven Polypeptides von Interesse.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der geeignete Wirt ein Prokaryot ist.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Prokaryot Escherichia coli ist.
  4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Caspase-Erkennungsstelle die Aminosäuresequenz DELD, DXXD, DEVD oder DEHD umfasst.
  5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Caspase aus der Gruppe, bestehend aus Caspase-2, Caspase-3, Caspase-7, CED-3, reverse Caspase-3 oder reverse Caspase-7, ausgewählt ist.
  6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Linkersequenz mindestens 5 Aminosäuren umfasst.
  7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Linkersequenz einer der Sequenzen SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 13, 14, 20 oder 63 entspricht.
  8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Spaltung des Fusionsproteins durch die Caspase in vitro erfolgt.
  9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei eine Ausbeute, ermittelt durch densiometrische Bestimmung, von mindestens 80% des reifen Polypeptides von Interesse innerhalb von 60 Minuten erreicht wird.
  10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Caspase-Protein im gleichen Wirt hergestellt wird wie das Fusionsprotein.
  11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein die Sequenz des Caspase-Proteins umfasst.
  12. Das Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung des Caspase-Proteins und des Fusionsproteins sequentiell verläuft.
  13. Das Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Caspase Protein nach dem Fusionsprotein hergestellt wird.
  14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Spaltung des Fusionsproteins in vivo erfolgt.
  15. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides von Interesse in einer biologisch aktiven Form, umfassend: – Herstellung eines Fusionsproteins, umfassend ein aminoterminales Polypeptid, eine Linkersequenz umfassend eine Erkennungsstelle für eine Caspase Gruppe II und den Polypeptid von Interesse, in E. coli, wobei die Linkersequenz einer der Sequenzen SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 13, 14, 20 oder 63 entspricht, – Spaltung des Fusionsproteins durch eine geeignete Caspase für die Erkennungsstelle der Caspase Gruppe II, die spezifisch das Fusionsprotein an der Verbindung der Linkersequenz und dem aminoterminalen Aminosäurerestes des reifen Polypeptides von Interesse spaltet, und – Isolierung des biologisch aktiven Polypeptides von Interesse.
  16. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides von Interesse in einer biologisch aktiven Form, umfassend: – Herstellung in E. coli (1) eines Fusionsprotein umfassend ein aminoterminales Polypeptid, eine Linkersequenz umfassend eine Erkennungsstelle der Caspase Gruppe II, den Polypeptides von Interesse, und (2) eines geeigneten Caspase-Proteins für die Erkennungsstelle der Caspase Gruppe II, wobei das Fusionsprotein und das Caspase-Polypeptid von dem gleichen oder einem unterschiedlichen Promoter kontrolliert werden, – Induzierung der Expression des Fusionsproteins – Induzierung der Expression des Caspase-Proteins – Spaltung des Fusionsproteins durch das Caspase-Protein in vivo, wobei die Caspase das Fusionsprotein an der Verbindungsstelle der Linkersequenz und des aminoterminalen Aminosäurerest des reifen Polypeptides von Interesse spaltet, und – Isolierung des biologisch aktiven Polypeptides von Interesse.
  17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Aminosäuresequenz des Linkers einer der Sequenzen SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 13, 14, 20 oder 63 entspricht.
  18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Caspase-Protein Caspase-3 oder Caspase-7 ist.
  19. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei eine einzelne Polynukleinsäure das Fusionsprotein und die Caspase kodiert.
  20. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei unterschiedliche Polynukleinsäuren das Fusionsprotein und die Caspase kodieren.
  21. Eine Polynukleinsäure kodierend ein Caspase-Protein und kodierend ein Fusionsprotein umfassend ein aminoterminales Polypeptid, ein reifes Polypeptid von Interesse und eine Linkersequenz kodierend ein Peptid einer der Sequenzen SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10 zwischen dem aminoterminalen Polypeptid und dem reifen Polypeptid von Interesse, wobei die Linkersequenz eine Erkennungsstelle der Caspase Gruppe II an der Verbindung zwischen dem Linker und der aminoterminalen Aminosäure des reifen Polypeptides von Interesse umfasst.
  22. Die Polynukleinsäure nach Anspruch 21, wobei das Caspase-Protein aus der Gruppe, bestehend aus Caspase-2, Caspase-3, Caspase-7, CED-3, reverse Caspase-3 und reverse Caspase-7, ausgewählt ist.
  23. Die Polynukleinsäure nach Anspruch 21 oder 22, wobei das aminoterminale Polypeptid aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion-S-Transferase Gen GST, E. coli Thioredoxin TRX, NusA, Chitin-Bindedomäne CBD, Chloramphenicolacetyltransferase CAT, Protein A (prot A), LysRS, Maltose-Bindungsprotein (MBP), Ubiquitin, Calmodulin, DsbA, DsbC und Lambda gpV, ausgewählt ist.
  24. Die Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Linkersequenz mindestens 5 Aminosäuren umfasst.
  25. Die Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die Caspase-Erkennungsstelle aus der Aminosäuresequenz DELD, DXXD, DEVD oder DEHD besteht.
  26. Die Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei die Expression des Fusionsproteins und/oder des Caspase-Proteins von einem geeigneten Promoter kontrolliert wird.
  27. Die Polynukleinsäure nach Anspruch 26, wobei das Fusionsprotein und das Caspase-Protein von dem gleichen oder einem unterschiedlichen Promoter kontrolliert werden.
  28. Die Polynukleinsäure nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Promoter induzierbar ist.
  29. Die Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 28, wobei das Fusionsprotein ferner einen Detektions- oder Affinitäts-Tag umfasst.
  30. Die Polynukleinsäure nach Anspruch 29, wobei der Detektions- oder Affinitäts-Tag aus der Gruppe, bestehend aus Polyhistidin-Tag, Polyarginin-Tag, Streptavidin-Bindungs-Tag, biotinylierten Tag und Tag, der von einem Antikörper erkannt wird, ausgewählt ist.
  31. Ein Vektor, der die Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 30 umfasst.
  32. Eine Wirtszelle, die die Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 30 oder den Vektor nach Anspruch 31 umfasst.
  33. Ein Fusionsprotein, das durch die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 30 kodiert wird.
  34. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 bis 30, einem Vektor nach Anspruch 31 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 32 für die Herstellung eines Polypeptides von Interesse in einer reifen und/oder biologisch aktiven Form.
  35. Ein geeigneter Bioreaktor für die Herstellung von reifen Proteinen von Interesse, umfassend: (a) ein Fusionsprotein, das von einer Polynukleinsäure nach Anspruch 29 kodiert wird, wobei das Fusionsprotein einen Affinitäts-Tag mit einer spezifischen Affinität für ein Substrat umfasst, und (b) ein Substrat, wobei der Teil des Affinitäts-Tags des Fusionsproteins an das Substrat gebunden ist.
  36. Ein geeigneter Bioreaktor für die Herstellung von reifen Proteinen von Interesse, umfassend: (a) ein Fusionsprotein, das von einer Polynukleinsäure nach Anspruch 29 kodiert wird, wobei das Fusionsprotein einen Affinitäts-Tag mit einer spezifischen Affinität für ein Substrat umfasst, und (b) einem Caspase-Enzym gekoppelt an oder mit Affinität für einen festen Träger, wobei das Caspase-Enzym spezifisch die Caspase-Erkennungsstelle in dem Fusionsprotein spaltet.
  37. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse, umfassend: (a) Herstellung eines Fusionsproteins nach Anspruch 29, wobei das Fusionsprotein einen Affinitäts-Tag oder ein aminoterminales Polypeptid mit einer spezifischen Affinität für ein Substrat umfasst, (b) Einsetzen des Fusionsproteins in einen Bioreaktor umfassend ein Caspase-Enzym, an das ein fester Träger gekoppelt ist, (c) Inkubieren des Fusionsproteins mit dem Caspase-Enzym während einer geeigneten Inkubationszeit, und (d) Waschen des Reaktors und Einfangen des eluierten Fusionsproteins durch die Bindung an das Substrat.
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