DE102005060057A1 - Sandwich immunoassay for detecting small haptens, useful, e.g. for determining asymmetrical dimethylarginine, uses a single antibody and excess of detection-derivatization agent - Google Patents
Sandwich immunoassay for detecting small haptens, useful, e.g. for determining asymmetrical dimethylarginine, uses a single antibody and excess of detection-derivatization agent Download PDFInfo
- Publication number
- DE102005060057A1 DE102005060057A1 DE200510060057 DE102005060057A DE102005060057A1 DE 102005060057 A1 DE102005060057 A1 DE 102005060057A1 DE 200510060057 DE200510060057 DE 200510060057 DE 102005060057 A DE102005060057 A DE 102005060057A DE 102005060057 A1 DE102005060057 A1 DE 102005060057A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- sandwich immunoassay
- group
- antibody
- hapten
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
GEBIET DER ERFINDUNGAREA OF INVENTION
Die Erfindung betrifft einen Sandwich-Immunoassay für kleine Haptenmoleküle und ein Bestimmungsverfahren.The The invention relates to a sandwich immunoassay for small hapten molecules and a Determination method.
HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND THE INVENTION
Viele kleine Haptenmoleküle sind für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung. Beispiele für physiologisch wichtige kleine Haptene sind verschiedene natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, physiologische Amine, Katecholamine; cholergene Amine; Oligopeptide und kleine Peptidhormone wie Vasopressin, Oxytocin, Angiotensin-I, Triiodothyronin und Thyroxin.Lots small hapten molecules are for medical diagnostics of great importance. Examples of physiological Important small haptens are various natural and non-natural amino acids, physiological Amines, catecholamines; cholergenic amines; Oligopeptides and small ones Peptide hormones such as vasopressin, oxytocin, angiotensin-I, triiodothyronine and thyroxine.
Ihre Konzentration in Proben wie Blut, Serum oder Plasma wird zumeist durch einen kompetitiven Immunoassay bestimmt. Hierbei wird der Probe eine bekannte Menge derivatisiertes oder markiertes Tracerhapten zugesetzt und dann die Probe mit Anti-Hapten-Antikörpern zusammengebracht, so dass die nativen Haptenmoleküle in der Probe und der Tracer um die Bindung an den Anti-Hapten-Antikörpern konkurrieren. Die Menge an gebundenem Tracer wird dann immunologisch durch markierte Sekundärantikörper bestimmt. Je mehr natives Hapten beziehungsweise Analyt in der Probe vorhanden ist, desto weniger Tracer kann binden und aus dieser Abnahme wird über eine Vergleichsreihe die Konzentration des Analyten in der Probe ermittelt.Your Concentration in samples such as blood, serum or plasma is mostly determined by a competitive immunoassay. Here is the Sample a known amount of derivatized or labeled tracer hapten added and then the sample combined with anti-hapten antibodies, so that the native hapten molecules in the sample and the tracer compete for binding to the anti-hapten antibodies. The amount of bound tracer is then labeled immunologically Secondary antibody determined. The more native hapten or analyte present in the sample is, the less tracer can bind and from this decrease is over one Comparison series determines the concentration of the analyte in the sample.
Die Menge an asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) im Serum oder Plasma ist ein wichtiger Prognosewert bei Patienten mit Arteriosklerose, koronarer Herzerkrankung, peripherer arterieller Verschlusskrankheit, Hypertonie, Herzinsuffizienz, Hypercholesterinämie, Nierenerkrankungen oder Diabetes mellitus. Die ADMA-Bestimmung erfolgt einerseits durch chromatographische Verfahren wie Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), da strukturell sehr ähnliche, in ihrer Funktion aber verschiedene Isomere ADMA und SDMA zu untersuchen sind. Die Messung mittels HPLC ist nachteilig, da sehr zeit- und personalintensiv, und weil sie eine aufwändige Probenvorbereitung erfordert. Andererseits wurde jüngst ein einfach zu handhabender Enzymimmunoassay für ADMA entwickelt und validiert (Schulze F et al., Clin. Chem. Lab. Med. (2004) 42:1377-1383; Böger RH et al, Clin. Chem. Lab. Med. (2003) 41:1467-1472; Böger RH et al., Atherosclerosis (1998) 136:67-77. Dieser kompetitive Assay erlaubt jedem Labor, das über ein Mikrotiterplatten-Lesegerät verfügt, die ADMA-Messung in humanem Serum oder Plasma vorzunehmen. Die Kreuzreaktivitäten mit anderen im Plasma vorhandenen Analyten wie Monomethylarginin, SDMA und L-Arginin sind vernachlässigbar gering.The Amount of asymmetric dimethylarginine (ADMA) in serum or plasma is an important prognostic value in patients with arteriosclerosis, coronary heart disease, peripheral arterial disease, Hypertension, heart failure, hypercholesterolemia, kidney disease or Diabetes mellitus. The ADMA determination is made on the one hand by chromatographic methods, such as high pressure liquid chromatography (HPLC), because structurally very similar, in their function, however, to investigate various isomers ADMA and SDMA are. The measurement by HPLC is disadvantageous because very time and labor intensive, and because it requires elaborate sample preparation. On the other hand, was recently developed and validated an easy-to-use enzyme immunoassay for ADMA (Schulze F et al., Clin. Chem. Lab. Med. (2004) 42: 1377-1383; Böger RH et al, Clin. Chem. Lab. Med. (2003) 41: 1467-1472; Böger RH et al., Atherosclerosis (1998) 136: 67-77. This competitive assay allows every lab to the above a microtiter plate reader features, perform the ADMA measurement in human serum or plasma. The cross reactivities with other analytes present in the plasma, such as monomethylarginine, SDMA and L-arginine are negligible low.
Kompetitive Immunoassays haben aber den Nachteil, dass bei niedriger Analytkonzentration die Konzentration an gebundenen Sekundärantikörpern der Null-Referenz von einer mangels Kompetition kaum verringerten Konzentration gebundener Sekundärantikörper unterschieden werden muss. Bei niedriger Analytkonzentration ist daher die Messgenauigkeit stark beeinträchtigt. Es wäre besser, wenn der Analyt direkt in der Probe bestimmt werden könnte. Für kleine Moleküle beziehungsweise Haptene können aber keine Sandwich-Immunoassays aufgebaut werden, weil die Moleküle für die Bindung von zwei Antikörpern zu klein sind. Zwar versucht man für diese Moleküle direktmessende anti-idiotypische Immunoassays aufzubauen, wobei der Sekundärantikörper den Hapten-Fängerantikörper-Komplex und das Hapten selbst erkennt, jedoch wurde kein derartiger Test bislang marktreif.competitive However, immunoassays have the disadvantage that at low analyte concentration the concentration of bound secondary antibodies of the zero reference of one Due to lack of competition, hardly any reduced concentration of bound secondary antibodies can be distinguished must become. At low analyte concentration, therefore, the measurement accuracy severely impaired. It would be better if the analyte could be determined directly in the sample. For small molecules or haptens can but no sandwich immunoassays are built because the molecules are binding of two antibodies are too small. Although one tries for these molecules direct measuring build up anti-idiotypic immunoassays, wherein the secondary antibody the Hapten-immobilized antibody complex and the hapten itself recognizes, but no such test until now ready for the market.
Für Angiotensin-II
wurde ein Quasi-Sandwichaufbau realisiert, indem das Hapten nach
der Bildung des Hapten-Fängerantikörper-1-Komplexes über einen
Spacer kovalent an den Antikörper
gebunden wird. Danach wird der Hapten-Fängerantikörper-Komplex so gebrochen,
dass das Hapten nur über
den Spacer an den Primär-
beziehungsweise Fängerantikörper gebunden
ist. Es kann dann in einem zweiten Schritt mit einem markierten
Primärantikörper das
kovalent gebundene Hapten detektiert werden; siehe
Es ist Aufgabe der Erfindung, einen Immunoassay für kleine Haptenmoleküle wie ADMA zur Verfügung zu stellen, welcher die Nachteile des Stands der Technik nicht aufweist und der insbesondere bei kleinen Analytkonzentrationen sehr genaue Messergebnisse liefert.It is an object of the invention to provide an immunoassay for small hapten molecules such as ADMA, which has the disadvantages of the state does not have the technique and provides very accurate results especially at low analyte concentrations.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY THE INVENTION
Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.These Task is solved by a sandwich immunoassay according to claim 1. Preferred embodiments The invention are described in the subclaims.
Die Erfindung betrifft also einen Sandwich-Immunoassay für die Bestimmung kleiner Haptenmoleküle, an die im wesentlichen nur ein Antikörper binden kann. Diese werden für das Prinzip des Sandwich-Immunoassay vorbereitet, in dem zu einer Probe, die zu bestimmende Haptenmoleküle enthält, ein stöchiometrischer Überschuss eines Detektions- und Derivatisierungsagens zugesetzt wird. Dieses reaktive Agens enthält eine chemisch reaktive Gruppe, einen Spacer und eine Detektionsgruppe, das sich mit den zu bestimmenden Haptenmolekülen quantitativ umsetzt, so dass man eine Analytverbindung erhält, in der das kleine Hapten über einen Spacer mit einer Detektionsgruppe verknüpft ist. Es folgt ein Bereitstellen von spezifischen ersten Fänger-Antikörpern gegen das Hapten, fakultativ gebunden an einer festen Phase, das Zusammenbringen der Probe mit der Analytverbindung mit den spezifischen ersten Fänger-Antikörpern, das Herstellen eines Komplexes aus Analytverbindung und erstem Antikörper, fakultativ gebunden an einer festen Phase; das Zusammenbringen des Komplexes aus erstem Antikörper und Analytverbindung mit einem Bindeprotein, das spezifisch an die Detektionsgruppe bindet, und das Detektieren der Menge an Bindeprotein, das an dem Komplex aus erstem Antikörper und Analytverbindung gebunden ist.The The invention thus relates to a sandwich immunoassay for the determination small hapten molecules, to which essentially only one antibody can bind. These will for the Principle of sandwich immunoassay prepared in which to a sample, the hapten molecules to be determined contains one stoichiometric excess a detection and derivatization agent is added. This reactive Agent contains a chemically reactive group, a spacer and a detection group, which quantitatively reacts with the hapten molecules to be determined, see above that one receives an analyte compound in which the small hapten via a spacer linked to a detection group is. It follows to provide specific first capture antibodies against hapten, optionally bound to a solid phase, bringing together the Sample containing the analyte compound with the specific first scavenger antibody, the Preparation of a Complex of Analyte Compound and First Antibody, Optional bound to a solid phase; the matching of the complex from first antibody and analyte compound with a binding protein specific to the Detection group binds, and detecting the amount of binding protein, bound to the complex of first antibody and analyte compound is.
Das zu bestimmende kleine Haptenmolekül enthält bevorzugt eine primäre oder sekundäre Aminogruppe. Das chemisch reaktive Detektionsagens enthält dann eine esteraktivierende oder eine acylierende Gruppe. Enthält das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine einfache Keto- oder Aldehydgruppe, besitzt das chemisch reaktive Detektionsagens eine Hydrazin- oder eine Carbodiimid-Gruppe. Enthält das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine SH-Gruppe, so kann diese mit einer Maleinimid-Gruppe derivatisiert werden. Bevorzugt enthält das chemisch reaktive Detektionsagens eine N-Hydroxysuccinimid-Gruppe und ist beispielsweise Biotin-X-NHS (Biotin-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester) oder Biotin-(X)1-5-NHS, wobei X 7-Aminocapronsäure oder ein Spacer mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen ist.The small hapten molecule to be determined preferably contains a primary or secondary amino group. The chemically reactive detection agent then contains an ester-activating or an acylating group. If the small hapten molecule to be determined contains a simple keto or aldehyde group, the chemically reactive detection agent has a hydrazine or a carbodiimide group. If the small hapten molecule to be determined contains an SH group, it can be derivatized with a maleimide group. The chemically reactive detection agent preferably contains an N-hydroxysuccinimide group and is, for example, biotin-X-NHS (biotin-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester) or biotin (X) 1-5 -NHS, where X is 7-aminocaproic acid or Spacer with up to 24 carbon atoms is.
Die Detektionsgruppe ist bevorzugt ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Desthiobiotin, substituierten und derivatisierten Aminosäuren, Oligopeptiden, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Avidin, Streptavidin, Protein-A, Protein-G und dergleichen. Das kleine Haptenmolekül kann sein: natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin; physiologische Amine, Serotonin, Histamin; Katecholaminen, Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine; cholergene Aminen, Adrenalin; Oligopeptide und kleine Peptidhormonen mit bis zu 12 Aminosäuren; Nonapeptide, Vasopressin Oxytocin; Dekapeptide, Angiotensin-I; Oktapeptide, Angiotensin-II; T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin); Steroide, Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron.The Detection group is preferably selected from biotin, digoxigenin, Desthiobiotin, substituted and derivatized amino acids, oligopeptides, Fluorescein isothiocyanate (FITC), avidin, streptavidin, protein A, Protein G and the like. The small hapten molecule can be: natural and non-natural Amino acids, asymmetric dimethylarginine (ADMA), L-arginine, homocysteine, citrulline, D-serine, cysteine, methionine, tryptophan, carnitine; physiological Amines, serotonin, histamine; Catecholamines, dopamine, metanephrines, normetanephrine; cholergenic amines, adrenaline; Oligopeptides and small peptide hormones with up to 12 amino acids; Nonapeptides, vasopressin oxytocin; Decapeptides, angiotensin-I; Octapeptides, angiotensin II; T3 (triiodothyronine), and T4 (thyroxine); Steroids, Pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone, androsterone, DHEA (dehydroepiandrosterone), DHEAS (dehydroepiandrosterone sulfate), testosterone.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Bestimmung von ADMA in Plasma, Serum oder Blut; die Bestimmung von Pregnenolon in Plasma, Serum oder Blut; und die Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivität in Plasma, Serum oder Blut. Die Erfindung umfasst ferner Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend einen Chemikaliensatz für die Derivatisierung des kleinen Haptens, Antikörper und/oder Bindeprotein, sowie einen Chemikaliensatz für die Detektion.The inventive method is particularly suitable for the determination of ADMA in plasma, serum or blood; the determination of pregnenolone in plasma, serum or blood; and the determination of Diamine oxidase activity in plasma, serum or blood. The invention further includes kits for execution of the method according to the invention, containing a chemical kit for the derivatization of the small Haptens, antibodies and / or binding protein, as well as a chemical kit for detection.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGENDESCRIPTION THE PICTURES
Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den beiliegenden Zeichnungen. Es zeigt:Further Advantages, features and embodiments The invention will become apparent from the following examples and the enclosed drawings. It shows:
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION THE INVENTION
Kleine Haptene gemäß der Erfindung sind Moleküle, die so klein sind, dass sie nicht gleichzeitig zwei Antikörper binden können. In Oligopeptiden sind für ein spezifisches Hapten beziehungsweise eine spezifische Antikörperbindungsstelle in der Regel mindestens fünf Aminosäuren erforderlich, bei zyklischen oder verzweigten Peptiden in manchen Fällen sogar mehr. Oligopeptide, die erfindungsgemäß kleine Haptenmoleküle darstellen, besitzen somit zumeist weniger als 12 Aminosäuren, in der Regel weniger als 10 Aminosäuren. Typische Vertreter für Moleküle, die nur einen Antikörper binden können und somit kleine Haptene im Sinne der Erfindung darstellen, sind natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren wie asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), symmetrisches Dimethylarginin, L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin und dergleichen; physiologische Amine wie Serotonin, Histamin, und dergleichen; Katecholamine wie Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine und dergleichen; cholergene Amine wie Adrenalin; und kleine Oligopeptide beziehungsweise kleine Peptidhormone wie die Nonapeptide Vasopressin und Oxytocin, das Dekapeptid Angiotensin-I und oder das Oktapeptid Angiotensin-II, T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin), Steroide wie Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron, und allgemein Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1200 Dalton. Zu den kleinen Haptenmolekülen gehören die meisten Cholesterin-Abkömmlinge und Derivate, da diese in der Regel weniger als zwei Antikörperbindungsstellen besitzen.Small haptens according to the invention are molecules that are so small that they can not simultaneously bind two antibodies. In oligopeptides are for a specific hapten or a specific antibody binding site in the rule at least five amino acids are required, with cyclic or branched peptides in some cases even more. Oligopeptides, which are small hapten molecules according to the invention, thus generally have less than 12 amino acids, generally fewer than 10 amino acids. Typical representatives of molecules which can bind only one antibody and thus represent small haptens in the sense of the invention are natural and non-natural amino acids such as asymmetric dimethylarginine (ADMA), symmetric dimethylarginine, L-arginine, homocysteine, citrulline, D-serine, Cysteine, methionine, tryptophan, carnitine and the like; physiological amines such as serotonin, histamine, and the like; Catecholamines such as dopamine, metanephrines, normetanephrines and the like; cholergenic amines such as adrenaline; and small oligopeptides or small peptide hormones such as the nonapeptides vasopressin and oxytocin, the decapeptide angiotensin-I and the octapeptide angiotensin-II, T3 (triiodothyronine), and T4 (thyroxine), steroids such as pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone, androsterone, DHEA (dehydroepiandrosterone ), DHEAS (dehydroepiandrosterone sulfate), testosterone, and generally molecules with a molecular weight of less than 1200 daltons. The small hapten molecules include most cholesterol derivatives and derivatives, as these usually have less than two antibody binding sites.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassays werden
die Haptenmoleküle
in der Probe beispielsweise durch eine Acylierung quantitativ zu
einem Moleküle mit
zwei Haptenen derivatisiert. Hierzu wird bevorzugt ein Derivatisierungsreagens
gewählt,
das über einen
Spacer mit einer Gruppe gekoppelt ist, die durch einen markierten
Sekundärantikörper oder
ein Bindeprotein eindeutig und mit hoher Selektivität nachgewiesen
werden kann. Ein bevorzugtes Derivatisierungsreagens für diesen
Zweck ist beispielsweise D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester
(Biotin-Spacer-NHS), wobei mehrere N-Aminocapron-Spacer vorhanden sein können. Besonders
bevorzugt ist ein Biotin-Spacer-NHS-Derivatisierungsreagens mit zwei gekoppelten
Aminocapronsäure-Spacereinheiten.
Allgemein kann das Derivatisierungsreagens für Amino-Haptene folgende allgemeine
Formel (I) besitzen
Der haptenspezifische Fängerantikörper ist bevorzugt auf der Festphase gebunden und bindet aus der derivatisierten Probe heraus das Hapten an der Oberfläche. Nicht-bindende Substanzen werden weggewaschen. Markierte Sekundärantikörper oder Bindeproteine werden zugegeben. Bevorzugtes Bindeprotein im Fall einer Biotin-Spacer-NHS-Markierung ist Peroxidase markiertes Streptavidin. Es kann aber auch ein anderes übliches Bindeprotein wie Avidin und dergleichen verwendet werden. Das Bindeprotein bindet an der Detektionsgruppe, wobei die Fängerantikörper-Haptenbindung erhalten bleibt. Der Nachweis erfolgt über die Detektion der Markierung. Die Markierung kann beispielsweise ein Enzym sein wie Peroxidase, ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Marker oder unter Umständen auch eine radioaktive Markierung.Of the Hapten-specific capture antibody is preferred bound on the solid phase and binds from the derivatized sample hapten out at the surface. Non-binding substances are washed away. Labeled secondary antibodies or binding proteins are added. Preferred binding protein in the case of a biotin spacer NHS label is peroxidase-labeled streptavidin. But it can also be another usual Binding protein such as avidin and the like can be used. The binding protein binds to the detection group, preserving the capture antibody hapten binding remains. The proof is over the detection of the mark. The mark can be, for example an enzyme such as peroxidase, a fluorescent or chemiluminescent marker or maybe also a radioactive marker.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Analyt ein primäres
oder sekundäres
Monoamin wie asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), symmetrisches
Dimethylarginin (SDMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin,
Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin und dergleichen; physiologische Amine
wie Serotonin, Histamin, und dergleichen; Katecholamine wie Dopamin,
Metanephrine, Normetanephrine und dergleichen; cholergene Amine
wie Adrenalin; und kleine Oligopeptide beziehungsweise kleine Peptidhormone
wie die Nonapeptide Vasopressin und Oxytocin, das Dekapeptid Angiotensin-I und
oder das Oktapeptid Angiotensin-II, T3 (Triiodothyronin), und T4
(Thyroxin). In einer anderen Ausführungsform wird der Analyt
durch eine enzymatische Aktivität
gebildet oder umgesetzt, mit einem Derivatisierungsreagens gemäß der Erfindung
umgesetzt und dann in einem Sandwich-Immunoassay direkt nachgewiesen.
Ein Beispiel für
diese alternative Ausführungsform
ist die Bestimmung der Plasma-Diaminooxidase-Aktivität. Hierbei
im Stand der Technik zugesetztes Cadaverin oder Putrescin von der
Plasma-DAO in 2,3,4-Trihydropyrrol beziehungsweise 2,3,4,5-Tetrahydropyridin
umgewandelt und die DAO-Aktivität über die
Edukte nachgewiesen. Statt Cadaverin kann auch 3-(2-Amino-ethyl)-pentan-1,5-diamin
eingesetzt werden (siehe
Die Erfindung eignet sich auch für kleine Haptenmoleküle, die keine Amine sind. So können beispielsweise kleine Haptenmoleküle mit einer Ketogruppe mit einem spezifischen Hydrazin-Derivatisierungsreagens wie Biotin-6-aminocaprylhydrazin, Biotin-di(6-aminocapryl)hydrazin, Biotin-(6-aminocapryl)n-hydrazin, wobei n gleich 1 bis 10 ist, umgesetzt werden. Geeignete Steroide für diesen Nachweis sind beispielsweise Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron, und allgemein Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1200 Dalton, wie die meisten Cholesterin-Abkömmlinge und Derivate.The invention is also suitable for small hapten molecules that are not amines. For example, small hapten molecules having a keto group with a specific hydrazine derivatizing reagent such as biotin-6-aminocaprylhydrazine, biotin-di (6-aminocapryl) hydrazine, biotin- (6-aminocapryl) n -hydrazine, where n is 1 to 10, be implemented. Suitable steroids for this detection are, for example, pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone, androsterone, DHEA (dehydroepiandrosterone), DHEAS (dehydroepiandrosterone sulfate), testosterone, and generally molecules with a molecular weight of less than 1200 daltons, like most cholesterol derivatives and derivatives.
BEISPIELEXAMPLE
Beispiel 1example 1
Kopplung von ADMA mit Biotin-X-X-NHSCoupling of ADMA with biotin-X-X-NHS
Es wurde jeweils 20 μL Probe (Serum, Standard beziehungsweise Kontrolle) in die Vertiefung einer 96er Mikrotiterplatte pipettiert; nachstehend auch Kopplungsplatte genannt. Die Probe wurde durch Zusatz von 60 μL 100 mM Carbonatpuffer, pH 9 auf der Kopplungsplatte konditioniert, und 20 μL 100 mM Biotin-X-N-Hydroxysuccinimid [Biotin-(ε-aminocapronsäure)2-N-hydroxysuccinimidester] in Dimethylformamid zugesetzt und die Platte rotierend bewegt. Es lag im Reaktionsansatz ein etwa 10facher Überschuss an Acylierungsreagens vor bezogen auf die im Serum vorhandenen primären und sekundären Aminogruppen (ca. 2mM Aminosäuren, < 1 mM Amine, 5-10 mM Amin im Humanserumalbumin). Die Serumprobe wurde 45 Minuten bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Danach wurden dem Reaktionsansatz 300 μL Stopp- und Verdünnungspuffer (3 mM Ammoniumchlorid/1% BSA, pH 6,0) zugegeben und dann 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so dass sich bislang nichtumgesetztes Succinimid mit Ammonium abreagieren konnte und der pH für den ELISA zwischen 7,5 und 8 eingestellt war. Anschließend wurde 100 μL gekoppelte Haptenprobe in den Sandwich-Immunoassay eingesetzt.In each case 20 μL sample (serum, standard or control) was pipetted into the well of a 96-well microtiter plate; hereinafter also called coupling plate. The sample was conditioned by the addition of 60 μL of 100 mM carbonate buffer, pH 9 on the coupling plate, and 20 μL of 100 mM biotin-XN-hydroxysuccinimide [biotin (ε-aminocaproic acid) 2 -N-hydroxysuccinimide ester] in dimethylformamide and the plate was rotated emotional. In the reaction mixture there was an about 10-fold excess of acylating reagent relative to the primary and secondary amino groups present in the serum (about 2 mM amino acids, <1 mM amines, 5-10 mM amine in human serum albumin). The serum sample was reacted at ambient temperature for 45 minutes. Thereafter, 300 μL of stop and dilution buffer (3 mM ammonium chloride / 1% BSA, pH 6.0) were added to the reaction mixture and then incubated for 45 minutes at room temperature, so that previously unreacted succinimide could react with ammonium and the pH for the ELISA between 7.5 and 8 was set. Subsequently, 100 μL coupled hapten sample was used in the sandwich immunoassay.
Enzym-Linked-Immunoassay (ELISA)Enzyme-linked immunoassay (ELISA)
Es wurde eine 96er Mikrotiterplatte mit Fängerantikörper (polyklonale Kaninchen-Anti-ADMA-Antikörper) in herkömmlicher Weise beschichtet. Hierzu wurde in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte jeweils 200 ng Anti-ADMA-Antikörper gegeben, gelöst in 100 μL 60 mM NaHCO3, pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Anti-ADMA-AK-Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween-20) gewaschen.A 96-well capture antibody microtiter plate (polyclonal rabbit anti-ADMA antibody) was coated in a conventional manner. For this purpose, in each case 200 ng of anti-ADMA antibody was added to the wells of the microtiter plate, dissolved in 100 .mu.l 60 mM NaHCO 3 , pH 9.6, and the plate incubated overnight at 4 ° C. The anti-ADMA-AK solution in the wells was removed and each well washed five times with 200 μl wash buffer (PBS, pH 7.4 with 0.05% Tween-20).
Dann
wurde 100 μL
der Biotin-gekoppelten Haptenprobe (Serum, ADMA-Standard beziehungsweise
Kontrolle) in Doppelbestimmung in die Vertiefungen der Anti-ADMA-Antikörper beschichteten
Mikrotiterplatte pipettiert, die Vertiefungen mit Folienstreifen
abgedeckt, und entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht
(15 bis 20 Stunden) bei 2 bis 8°C
inkubiert. Die Haptenprobe wurde aus den Vertiefungen entnommen
und die Wände
der Vertiefungen erneut fünfmal
mit 200 μL
Waschpuffer und zwischendurch Ausklopfen auf saugfähigem Papier
gewaschen. Die quantitative Bestimmung erfolgte mit 100 μL Peroxidase
markiertem Streptavidin (1:1 000 verdünnt in Waschpuffer, entsprechend
ca. 100 ng). Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurden Streptavidin-Lösungen
abgenommen und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer
gewaschen. Für
die Farb reaktion wurden 100 μl
Tetramethylbenzidin(TMB)-Substrat-Lösung (gebrauchsfertig von NOVUM
Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) in die Vertiefungen gegeben und
bei Raumtemperatur (18-26°C)
im Dunkeln inkubiert. Nach 10 bis 25 Minuten wurde die Farbentwicklung
durch Zugabe von 50 μl
2 M H2SO4 pro Vertiefung
gestoppt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte sofort im Anschluss,
wobei die Extinktion im Mikrotiterplatten-Photometer (ELISA-Reader) bei
450 nm gegen die Referenzwellenlänge
620 nm (oder 690 nm) gemessen wurde. Übersteigt die Extinktion des
höchsten
Standards den Messbereich des Photometers, kann bei 405 nm gegen
620 nm (690 nm) nachgemessen werden.
Beispiel 2Example 2
Kopplung von Pregnenolon mit Biotin-6-AminocaprylhydrazinCoupling of pregnenolone with biotin-6-aminocaprylhydrazine
Hierzu wurde jeweils 20 μL Probe (Serum, Standard bzw. Kontrolle) in eine vertiefung einer 96er Mikrotiterplatte, der Kopplungsplatte pipettiert. Die Probe wurde durch Zugabe von 60 μL 100 mM Phosphatpuffer, pH 7.5 konditioniert, 20 μL 10 mM Biotin-6-Aminocaprylhydrazin zugesetzt und die Platte rotierend bewegt. Es lag im Reaktionsansatz dann vor ein etwa 10-facher Überschuss an Derivatisierungsreagens bezogen auf die im Serum vorhandenen Aldehyd- und Ketogruppen. Die Probe wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Danach wurden dem Reaktionsansatz 300 μL Stopp- und Verdünnungspuffer (1 mM Aceton in Phosphatpuffer/1% BSA, pH 7.5) zugesetzt und der Ansatz 45 Minuten bei Raumtemperatur rotierend inkubiert, so dass nicht umgesetztes Hydrazinreagens abreagieren konnte. Schließlich wurde das Biotin gekoppelte Pregnenolon in einem Sandwich-Immunoassay (ELISA) analog Beispiel 1 direkt gemessen. Als Fänger-Antikörper wurden kommerzielle anti-Pregnenolon-Antikörper (Immundiagnostik AG, Bensheim, DE), erzeugt gegen ein weiteres Pregenolon-Derivat eingesetzt, For this each was 20 μL Sample (serum, standard or control) into a well 96-well microtiter plate, the coupling plate pipetted. The sample was made by adding 60 μL 100 mM phosphate buffer, pH 7.5 conditioned, 20 μL 10 mM biotin-6-aminocaprylhydrazine added and the plate is rotated. It was in the reaction mixture then about a 10-fold excess on derivatizing reagent based on those present in the serum Aldehyde and keto groups. The sample was left at room temperature for 45 minutes implemented. Thereafter, the reaction mixture was subjected to 300 μL stop and dilution buffer (1 mM acetone in phosphate buffer / 1% BSA, pH 7.5) was added and the Incubated for 45 minutes at room temperature, rotating so that unreacted hydrazine reagent could react. Finally became the biotin-coupled pregnenolone in a sandwich immunoassay (ELISA) directly measured analogously to Example 1. As catcher antibodies were commercial anti-pregnenolone antibodies (Immunodiagnostik AG, Bensheim, DE), generated against another pregenolone derivative,
Beispiel 3Example 3
Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivitätdetermination the diaminooxidase activity
Die DAO-Aktivität kann entweder über die Umsetzung von Histamin oder ersatzweise über Diaminverbindungen wie 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin, Cadaverin oder Putrescin erfolgen.The DAO activity can either over the conversion of histamine or, alternatively, via diamine compounds such as 3- (2-amino-ethyl) -pentane-1,5-diamine, cadaverine or putrescine done.
Bei
der Umsetzung von Histamin ist in dem Assay bei einem Endvolumen
von 250 μL
enthalten: 100 μL
100 mM Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 50 μL 5 mM Histamin
mit 5 mM Biotin-6-Aminocaproyl-hydrazin. Das von der DAO gebildete
Histamin-Acetaldehyd wird in situ zur Analytverbindung umgesetzt,
die dann über
einen Sandwich-Immunoassay mit Hilfe von Peroxidase markiertem Streptavidin
direkt nachgewiesen und gemessen wird (siehe
Alternativ
kann die Oxidation von Histamin über
dessen Abnahme im Ansatz bestimmt werden. Dann ist in dem Assay
bei einem Endvolumen von 250 μL
enthalten: 100 μL
0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 25 μL 5 mM Histamin.
Das Histamin wird zum Histamin-Acetaldehyd abgebaut. Verbliebenes
Histamin wird nach Umsetzung mit Biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM
Biotin-XX-NHS in DMF), Bindung an einen ersten Fänger-Antikörper auf einer festen Phase,
und Nachweis über
Peroxidase markiertes Streptavidin wie in Beispiel 1 in einem Sandwich-Immunoassay
direkt gemessen (siehe
In
einer weiteren Alternative kann in dem Assayansatz bei einem Endvolumen
von 250 μL
enthalten sein: 100 μL
0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 25 μL Substrat
(z.B. 5 mM 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin). Das resultierende
zyklische Substrat wird mit Biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM Biotin-XX-NHS in DMF)
wie in Beispiel 1 derivatisiert und in einem Sandwich-Immunoassay
mit Peroxidase markiertem Streptavidin wie in Beispiel 1 bestimmt
(siehe
Claims (14)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE200510060057 DE102005060057A1 (en) | 2005-12-15 | 2005-12-15 | Sandwich immunoassay for detecting small haptens, useful, e.g. for determining asymmetrical dimethylarginine, uses a single antibody and excess of detection-derivatization agent |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE200510060057 DE102005060057A1 (en) | 2005-12-15 | 2005-12-15 | Sandwich immunoassay for detecting small haptens, useful, e.g. for determining asymmetrical dimethylarginine, uses a single antibody and excess of detection-derivatization agent |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE102005060057A1 true DE102005060057A1 (en) | 2007-06-28 |
Family
ID=38108650
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE200510060057 Ceased DE102005060057A1 (en) | 2005-12-15 | 2005-12-15 | Sandwich immunoassay for detecting small haptens, useful, e.g. for determining asymmetrical dimethylarginine, uses a single antibody and excess of detection-derivatization agent |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE102005060057A1 (en) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012065912A1 (en) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Karl-Heinz Kellner | Automatic immunoassay for biogenic amines |
EP2313364B1 (en) | 2008-08-07 | 2020-09-02 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods for detecting symmetrical demethylarginine |
WO2022049213A1 (en) | 2020-09-02 | 2022-03-10 | Immundiagnostik Ag | Test kit and method of determining tryptophan in extracts of faecal samples |
US11422136B2 (en) | 2017-10-19 | 2022-08-23 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of symmetrical dimethylarginine |
US11913942B2 (en) | 2015-02-20 | 2024-02-27 | Idexx Laboratories, Inc. | Homogenous immunoassay with compensation for background signal |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE68914252T2 (en) * | 1988-11-10 | 1994-08-04 | Eiji Ishikawa | Method of determining an antigen. |
DE69520383T2 (en) * | 1994-02-18 | 2001-10-31 | Dade Behring Inc., Deerfield | Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagent |
-
2005
- 2005-12-15 DE DE200510060057 patent/DE102005060057A1/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE68914252T2 (en) * | 1988-11-10 | 1994-08-04 | Eiji Ishikawa | Method of determining an antigen. |
DE69520383T2 (en) * | 1994-02-18 | 2001-10-31 | Dade Behring Inc., Deerfield | Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagent |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Kobayashi,Norihiro, Goto,Junichi: Noncompetitive immunoassays for small molecules with high sensitivity and specificity. Advances in Clinical Chemistry, 2001, Vol. 36, S. 139-170. (abstract) CAPLUS (online). In: STN. Accession No. 2001: 813015 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2313364B1 (en) | 2008-08-07 | 2020-09-02 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods for detecting symmetrical demethylarginine |
WO2012065912A1 (en) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Karl-Heinz Kellner | Automatic immunoassay for biogenic amines |
US11913942B2 (en) | 2015-02-20 | 2024-02-27 | Idexx Laboratories, Inc. | Homogenous immunoassay with compensation for background signal |
US11422136B2 (en) | 2017-10-19 | 2022-08-23 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of symmetrical dimethylarginine |
WO2022049213A1 (en) | 2020-09-02 | 2022-03-10 | Immundiagnostik Ag | Test kit and method of determining tryptophan in extracts of faecal samples |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Stoilov et al. | Measurement of elastin, collagen, and total protein levels in tissues | |
US20040096900A1 (en) | Method for detection of vitamin d metabolites | |
EP2612147B1 (en) | Automatic immunoassay for biogenic amines | |
EP1488209A1 (en) | Identifying a midregional proadrenomedullin partial peptide in biological liquids for diagnostic purposes, and immunoassays for conducting an identification of this type | |
DE69612457T2 (en) | Screening method for ligand identification of target proteins | |
DE3834766A1 (en) | METHOD FOR DETERMINING A SPECIFICALLY BINDABLE SUBSTANCE | |
DE102005060057A1 (en) | Sandwich immunoassay for detecting small haptens, useful, e.g. for determining asymmetrical dimethylarginine, uses a single antibody and excess of detection-derivatization agent | |
EP0697021B1 (en) | Photo-activatable biotin derivatives and their use in suppressing interference in immuno assaying | |
EP0407904A2 (en) | Method for the determination of an analyte | |
CA1140439A (en) | Quantitative testing for vitamin b in12 xx | |
Apollonio et al. | Matrix effect and cross-reactivity of select amphetamine-type substances, designer analogues, and putrefactive amines using the Bio-Quant direct ELISA presumptive assays for amphetamine and methamphetamine | |
DE60310012T2 (en) | Method, assay and kit for the quantification of HIV protease inhibitors | |
DE102005057920A1 (en) | Immunoassay for the simultaneous immunochemical determination of an analyte (antigen) and a therapeutic antibody directed against the analyte in samples | |
DE19945947A1 (en) | Detection of the pyruvate kinase isoenzyme | |
KO et al. | Direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay for sulfamethazine | |
DE19811196C2 (en) | Use of anti-creatinine antibodies or other creatinine binding substances for the determination of creatinine in physiological liquids and methods for their production | |
Snitkoff et al. | Development of an Immunoassay for Monitoring the Levels of Ciprofloxacin Patient Samples | |
CN107002017A (en) | The accurate measure measurement of hydrophobicity haptens analyte | |
DE2537275C3 (en) | Immunochemical method for the determination of antigens or antibodies in biological fluids | |
DE3784465T2 (en) | DETERMINATION OF ANALYTIC CONCENTRATION WITH TWO LABELS. | |
US5601993A (en) | Anti-bile acid antibodies and method for assaying bile acids in feces by using the same | |
EP0874994A1 (en) | Detection of the end-position sialic acid groups of the human transferrin molecule | |
DE102020114278A1 (en) | Determination of disease-specific protein aggregates in stool samples | |
EP1941055A1 (en) | In vitro method for diagnosing neurodegenerative diseases | |
DE19856777B4 (en) | Anti-petasin antibodies, process for their preparation and their use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8131 | Rejection |