DE102005060057A1

DE102005060057A1 - Sandwich immunoassay for detecting small haptens, useful, e.g. for determining asymmetrical dimethylarginine, uses a single antibody and excess of detection-derivatization agent

Info

Publication number: DE102005060057A1
Application number: DE200510060057
Authority: DE
Inventors: Karl Heinz Dr. Kellner
Original assignee: Kellner Karl-Heinz Dr; Immundiagnostik AG
Current assignee: Kellner Karl-Heinz Dr; Immundiagnostik AG
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2007-06-28

Abstract

Sandwich immunoassay for detecting small haptens (A) to which only one antibody can bind. Sandwich immunoassay for detecting small haptens (A) to which only one antibody can bind comprises: (A) adding to a sample that contains (A) a stoichiometric excess of a reactive detection and derivatization reagent (B), containing a chemically reactive group, a spacer and a detectable group (DG), so that this reacts quantitatively with (A) to form an analyte (A1) consisting of (A) linked to DG, through the spacer; (B) preparing a specific capture antibody (Ab1) directed against (A), optionally bound to a solid phase, and combining this with the sample from (a) to form a complex (C) of A1 and Ab1, optionally bound to a solid phase; (C) combining (C) with a binding protein (BP) that binds specifically to DG; and (D) detecting the amount of BP that has become bound to (C). An independent claim is included for a kit for the new process comprising a set of chemicals for derivatization of (A); Ab1 and BP, also a set of chemicals for detection.

Description

GEBIET DER ERFINDUNGAREA OF INVENTION

Die Erfindung betrifft einen Sandwich-Immunoassay für kleine Haptenmoleküle und ein Bestimmungsverfahren.The The invention relates to a sandwich immunoassay for small hapten molecules and a Determination method.

HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND THE INVENTION

Viele kleine Haptenmoleküle sind für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung. Beispiele für physiologisch wichtige kleine Haptene sind verschiedene natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, physiologische Amine, Katecholamine; cholergene Amine; Oligopeptide und kleine Peptidhormone wie Vasopressin, Oxytocin, Angiotensin-I, Triiodothyronin und Thyroxin.Lots small hapten molecules are for medical diagnostics of great importance. Examples of physiological Important small haptens are various natural and non-natural amino acids, physiological Amines, catecholamines; cholergenic amines; Oligopeptides and small ones Peptide hormones such as vasopressin, oxytocin, angiotensin-I, triiodothyronine and thyroxine.

Ihre Konzentration in Proben wie Blut, Serum oder Plasma wird zumeist durch einen kompetitiven Immunoassay bestimmt. Hierbei wird der Probe eine bekannte Menge derivatisiertes oder markiertes Tracerhapten zugesetzt und dann die Probe mit Anti-Hapten-Antikörpern zusammengebracht, so dass die nativen Haptenmoleküle in der Probe und der Tracer um die Bindung an den Anti-Hapten-Antikörpern konkurrieren. Die Menge an gebundenem Tracer wird dann immunologisch durch markierte Sekundärantikörper bestimmt. Je mehr natives Hapten beziehungsweise Analyt in der Probe vorhanden ist, desto weniger Tracer kann binden und aus dieser Abnahme wird über eine Vergleichsreihe die Konzentration des Analyten in der Probe ermittelt.Your Concentration in samples such as blood, serum or plasma is mostly determined by a competitive immunoassay. Here is the Sample a known amount of derivatized or labeled tracer hapten added and then the sample combined with anti-hapten antibodies, so that the native hapten molecules in the sample and the tracer compete for binding to the anti-hapten antibodies. The amount of bound tracer is then labeled immunologically Secondary antibody determined. The more native hapten or analyte present in the sample is, the less tracer can bind and from this decrease is over one Comparison series determines the concentration of the analyte in the sample.

US 4 818 683 (Morel et al.) beschreibt einen kompetitiven Immunoassay für den Nachweis von Monoaminen und cholergene Aminen. Hierzu werden die kleinen Haptenmoleküle quantitativ in höhermolekulare immunogene Derivate derivatisiert. Die Derivatisierung erfolgt bei primären oder sekundären Amingruppen in der Regel über aktivierte Ester wie N-Hydroxysuccinimid oder ein anderes Acylierungsreagens. Die resultierenden Derivate sind immunogener als die nicht-acylierten Spezies und leichter zu bestimmen. In dem beschriebenen Immunoassay wird die Konzentration von acyliertem Hapten schließlich wieder indirekt über die Menge an gebundenem Tracer gemessen. Es gibt Hunderte von Verfahren, größere und kleinere Haptene durch Kopplung mit weiteren Gruppen immunogener zu machen, siehe beispielsweise Ellman GL, Arch. Biochem. Biophys. 74 (1958) 443-450; Riddles PW, Anal. Biochem. 94 (1979) 75-81; Muckerheide A et al., J. Immunol. 138 (1987) 833; Apple RJ et al, J. Immunol. 140 (1987) 3290; Domen PJ, J. Immunol. 139 (1987) 3195). US 4,818,683 (Morel et al.) Describes a competitive immunoassay for the detection of monoamines and cholergenic amines. For this purpose, the small hapten molecules are quantitatively derivatized into higher molecular weight immunogenic derivatives. The derivatization is carried out in primary or secondary amine groups usually via activated esters such as N-hydroxysuccinimide or another acylating reagent. The resulting derivatives are more immunogenic than the non-acylated species and easier to determine. Finally, in the described immunoassay, the concentration of acylated hapten is again measured indirectly via the amount of bound tracer. There are hundreds of methods to make larger and smaller haptens more immunogenic by coupling to other groups, see, for example, Ellman GL, Arch. Biochem. Biophys. 74 (1958) 443-450; Riddles PW, anal. Biochem. 94 (1979) 75-81; Muckerheide A et al., J. Immunol. 138 (1987) 833; Apple RJ et al, J. Immunol. 140 (1987) 3290; Domen PJ, J. Immunol. 139 (1987) 3195).

Die Menge an asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA) im Serum oder Plasma ist ein wichtiger Prognosewert bei Patienten mit Arteriosklerose, koronarer Herzerkrankung, peripherer arterieller Verschlusskrankheit, Hypertonie, Herzinsuffizienz, Hypercholesterinämie, Nierenerkrankungen oder Diabetes mellitus. Die ADMA-Bestimmung erfolgt einerseits durch chromatographische Verfahren wie Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), da strukturell sehr ähnliche, in ihrer Funktion aber verschiedene Isomere ADMA und SDMA zu untersuchen sind. Die Messung mittels HPLC ist nachteilig, da sehr zeit- und personalintensiv, und weil sie eine aufwändige Probenvorbereitung erfordert. Andererseits wurde jüngst ein einfach zu handhabender Enzymimmunoassay für ADMA entwickelt und validiert (Schulze F et al., Clin. Chem. Lab. Med. (2004) 42:1377-1383; Böger RH et al, Clin. Chem. Lab. Med. (2003) 41:1467-1472; Böger RH et al., Atherosclerosis (1998) 136:67-77. Dieser kompetitive Assay erlaubt jedem Labor, das über ein Mikrotiterplatten-Lesegerät verfügt, die ADMA-Messung in humanem Serum oder Plasma vorzunehmen. Die Kreuzreaktivitäten mit anderen im Plasma vorhandenen Analyten wie Monomethylarginin, SDMA und L-Arginin sind vernachlässigbar gering.The Amount of asymmetric dimethylarginine (ADMA) in serum or plasma is an important prognostic value in patients with arteriosclerosis, coronary heart disease, peripheral arterial disease, Hypertension, heart failure, hypercholesterolemia, kidney disease or Diabetes mellitus. The ADMA determination is made on the one hand by chromatographic methods, such as high pressure liquid chromatography (HPLC), because structurally very similar, in their function, however, to investigate various isomers ADMA and SDMA are. The measurement by HPLC is disadvantageous because very time and labor intensive, and because it requires elaborate sample preparation. On the other hand, was recently developed and validated an easy-to-use enzyme immunoassay for ADMA (Schulze F et al., Clin. Chem. Lab. Med. (2004) 42: 1377-1383; Böger RH et al, Clin. Chem. Lab. Med. (2003) 41: 1467-1472; Böger RH et al., Atherosclerosis (1998) 136: 67-77. This competitive assay allows every lab to the above a microtiter plate reader features, perform the ADMA measurement in human serum or plasma. The cross reactivities with other analytes present in the plasma, such as monomethylarginine, SDMA and L-arginine are negligible low.

Kompetitive Immunoassays haben aber den Nachteil, dass bei niedriger Analytkonzentration die Konzentration an gebundenen Sekundärantikörpern der Null-Referenz von einer mangels Kompetition kaum verringerten Konzentration gebundener Sekundärantikörper unterschieden werden muss. Bei niedriger Analytkonzentration ist daher die Messgenauigkeit stark beeinträchtigt. Es wäre besser, wenn der Analyt direkt in der Probe bestimmt werden könnte. Für kleine Moleküle beziehungsweise Haptene können aber keine Sandwich-Immunoassays aufgebaut werden, weil die Moleküle für die Bindung von zwei Antikörpern zu klein sind. Zwar versucht man für diese Moleküle direktmessende anti-idiotypische Immunoassays aufzubauen, wobei der Sekundärantikörper den Hapten-Fängerantikörper-Komplex und das Hapten selbst erkennt, jedoch wurde kein derartiger Test bislang marktreif.competitive However, immunoassays have the disadvantage that at low analyte concentration the concentration of bound secondary antibodies of the zero reference of one Due to lack of competition, hardly any reduced concentration of bound secondary antibodies can be distinguished must become. At low analyte concentration, therefore, the measurement accuracy severely impaired. It would be better if the analyte could be determined directly in the sample. For small molecules or haptens can but no sandwich immunoassays are built because the molecules are binding of two antibodies are too small. Although one tries for these molecules direct measuring build up anti-idiotypic immunoassays, wherein the secondary antibody the Hapten-immobilized antibody complex and the hapten itself recognizes, but no such test until now ready for the market.

Für Angiotensin-II wurde ein Quasi-Sandwichaufbau realisiert, indem das Hapten nach der Bildung des Hapten-Fängerantikörper-1-Komplexes über einen Spacer kovalent an den Antikörper gebunden wird. Danach wird der Hapten-Fängerantikörper-Komplex so gebrochen, dass das Hapten nur über den Spacer an den Primär- beziehungsweise Fängerantikörper gebunden ist. Es kann dann in einem zweiten Schritt mit einem markierten Primärantikörper das kovalent gebundene Hapten detektiert werden; siehe EP 0 139 552 . Dieses Verfahren kann nicht auf andere Haptene übertragen werden.For angiotensin II, a quasi-sandwich construction was realized by covalently attaching the hapten to the antibody via a spacer after formation of the hapten-capture antibody-1 complex. Thereafter, the hapten-capture antibody complex is broken so that the hapten is bound to the primary or capture antibody only via the spacer. It can then be detected in a second step with a labeled primary antibody, the covalently bound hapten; please refer EP 0 139 552 , This method can not be transferred to other haptens.

Es ist Aufgabe der Erfindung, einen Immunoassay für kleine Haptenmoleküle wie ADMA zur Verfügung zu stellen, welcher die Nachteile des Stands der Technik nicht aufweist und der insbesondere bei kleinen Analytkonzentrationen sehr genaue Messergebnisse liefert.It is an object of the invention to provide an immunoassay for small hapten molecules such as ADMA, which has the disadvantages of the state does not have the technique and provides very accurate results especially at low analyte concentrations.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY THE INVENTION

Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.These Task is solved by a sandwich immunoassay according to claim 1. Preferred embodiments The invention are described in the subclaims.

Die Erfindung betrifft also einen Sandwich-Immunoassay für die Bestimmung kleiner Haptenmoleküle, an die im wesentlichen nur ein Antikörper binden kann. Diese werden für das Prinzip des Sandwich-Immunoassay vorbereitet, in dem zu einer Probe, die zu bestimmende Haptenmoleküle enthält, ein stöchiometrischer Überschuss eines Detektions- und Derivatisierungsagens zugesetzt wird. Dieses reaktive Agens enthält eine chemisch reaktive Gruppe, einen Spacer und eine Detektionsgruppe, das sich mit den zu bestimmenden Haptenmolekülen quantitativ umsetzt, so dass man eine Analytverbindung erhält, in der das kleine Hapten über einen Spacer mit einer Detektionsgruppe verknüpft ist. Es folgt ein Bereitstellen von spezifischen ersten Fänger-Antikörpern gegen das Hapten, fakultativ gebunden an einer festen Phase, das Zusammenbringen der Probe mit der Analytverbindung mit den spezifischen ersten Fänger-Antikörpern, das Herstellen eines Komplexes aus Analytverbindung und erstem Antikörper, fakultativ gebunden an einer festen Phase; das Zusammenbringen des Komplexes aus erstem Antikörper und Analytverbindung mit einem Bindeprotein, das spezifisch an die Detektionsgruppe bindet, und das Detektieren der Menge an Bindeprotein, das an dem Komplex aus erstem Antikörper und Analytverbindung gebunden ist.The The invention thus relates to a sandwich immunoassay for the determination small hapten molecules, to which essentially only one antibody can bind. These will for the Principle of sandwich immunoassay prepared in which to a sample, the hapten molecules to be determined contains one stoichiometric excess a detection and derivatization agent is added. This reactive Agent contains a chemically reactive group, a spacer and a detection group, which quantitatively reacts with the hapten molecules to be determined, see above that one receives an analyte compound in which the small hapten via a spacer linked to a detection group is. It follows to provide specific first capture antibodies against hapten, optionally bound to a solid phase, bringing together the Sample containing the analyte compound with the specific first scavenger antibody, the Preparation of a Complex of Analyte Compound and First Antibody, Optional bound to a solid phase; the matching of the complex from first antibody and analyte compound with a binding protein specific to the Detection group binds, and detecting the amount of binding protein, bound to the complex of first antibody and analyte compound is.

Das zu bestimmende kleine Haptenmolekül enthält bevorzugt eine primäre oder sekundäre Aminogruppe. Das chemisch reaktive Detektionsagens enthält dann eine esteraktivierende oder eine acylierende Gruppe. Enthält das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine einfache Keto- oder Aldehydgruppe, besitzt das chemisch reaktive Detektionsagens eine Hydrazin- oder eine Carbodiimid-Gruppe. Enthält das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine SH-Gruppe, so kann diese mit einer Maleinimid-Gruppe derivatisiert werden. Bevorzugt enthält das chemisch reaktive Detektionsagens eine N-Hydroxysuccinimid-Gruppe und ist beispielsweise Biotin-X-NHS (Biotin-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester) oder Biotin-(X)_1-5-NHS, wobei X 7-Aminocapronsäure oder ein Spacer mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen ist.The small hapten molecule to be determined preferably contains a primary or secondary amino group. The chemically reactive detection agent then contains an ester-activating or an acylating group. If the small hapten molecule to be determined contains a simple keto or aldehyde group, the chemically reactive detection agent has a hydrazine or a carbodiimide group. If the small hapten molecule to be determined contains an SH group, it can be derivatized with a maleimide group. The chemically reactive detection agent preferably contains an N-hydroxysuccinimide group and is, for example, biotin-X-NHS (biotin-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester) or biotin (X) _1-5 -NHS, where X is 7-aminocaproic acid or Spacer with up to 24 carbon atoms is.

Die Detektionsgruppe ist bevorzugt ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Desthiobiotin, substituierten und derivatisierten Aminosäuren, Oligopeptiden, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Avidin, Streptavidin, Protein-A, Protein-G und dergleichen. Das kleine Haptenmolekül kann sein: natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin; physiologische Amine, Serotonin, Histamin; Katecholaminen, Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine; cholergene Aminen, Adrenalin; Oligopeptide und kleine Peptidhormonen mit bis zu 12 Aminosäuren; Nonapeptide, Vasopressin Oxytocin; Dekapeptide, Angiotensin-I; Oktapeptide, Angiotensin-II; T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin); Steroide, Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron.The Detection group is preferably selected from biotin, digoxigenin, Desthiobiotin, substituted and derivatized amino acids, oligopeptides, Fluorescein isothiocyanate (FITC), avidin, streptavidin, protein A, Protein G and the like. The small hapten molecule can be: natural and non-natural Amino acids, asymmetric dimethylarginine (ADMA), L-arginine, homocysteine, citrulline, D-serine, cysteine, methionine, tryptophan, carnitine; physiological Amines, serotonin, histamine; Catecholamines, dopamine, metanephrines, normetanephrine; cholergenic amines, adrenaline; Oligopeptides and small peptide hormones with up to 12 amino acids; Nonapeptides, vasopressin oxytocin; Decapeptides, angiotensin-I; Octapeptides, angiotensin II; T3 (triiodothyronine), and T4 (thyroxine); Steroids, Pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone, androsterone, DHEA (dehydroepiandrosterone), DHEAS (dehydroepiandrosterone sulfate), testosterone.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Bestimmung von ADMA in Plasma, Serum oder Blut; die Bestimmung von Pregnenolon in Plasma, Serum oder Blut; und die Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivität in Plasma, Serum oder Blut. Die Erfindung umfasst ferner Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend einen Chemikaliensatz für die Derivatisierung des kleinen Haptens, Antikörper und/oder Bindeprotein, sowie einen Chemikaliensatz für die Detektion.The inventive method is particularly suitable for the determination of ADMA in plasma, serum or blood; the determination of pregnenolone in plasma, serum or blood; and the determination of Diamine oxidase activity in plasma, serum or blood. The invention further includes kits for execution of the method according to the invention, containing a chemical kit for the derivatization of the small Haptens, antibodies and / or binding protein, as well as a chemical kit for detection.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGENDESCRIPTION THE PICTURES

Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den beiliegenden Zeichnungen. Es zeigt:Further Advantages, features and embodiments The invention will become apparent from the following examples and the enclosed drawings. It shows:

1 Reaktionsschema für die Kopplung von ADMA mit Biotin-(ε-aminocapronsäure)₂-N-hydroxysuccinimidester; der Einfachheit halber ist nur eine Spacergruppe gezeigt; 1 Reaction scheme for the coupling of ADMA with biotin (ε-aminocaproic acid) _2- N-hydroxysuccinimide ester; for the sake of simplicity, only one spacer group is shown;

2 das Diagramm einer Eich- und Standardkurve für die Kopplung von ADMA mit einem esteraktivierten Biotin-X-X-NHS und den Nachweis des Konjugats mit einem Sandwich-Immunoassay; 2 the diagram of a calibration and standard curve for the coupling of ADMA with an ester-activated biotin-XX-NHS and the detection of the conjugate with a sandwich immunoassay;

3 Reaktionsschema für die Hydrazinkopplung von Pregnenolon mit Biotin-6-Aminocaproylhydrazin. 3 Reaction scheme for the hydrazine coupling of pregnenolone with biotin-6-aminocaproylhydrazine.

4a-c Reaktionsschemata für den Nachweise der Diaminooxidase-Aktivität. 4a -c reaction schemes for the detection of diaminooxidase activity.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION THE INVENTION

Kleine Haptene gemäß der Erfindung sind Moleküle, die so klein sind, dass sie nicht gleichzeitig zwei Antikörper binden können. In Oligopeptiden sind für ein spezifisches Hapten beziehungsweise eine spezifische Antikörperbindungsstelle in der Regel mindestens fünf Aminosäuren erforderlich, bei zyklischen oder verzweigten Peptiden in manchen Fällen sogar mehr. Oligopeptide, die erfindungsgemäß kleine Haptenmoleküle darstellen, besitzen somit zumeist weniger als 12 Aminosäuren, in der Regel weniger als 10 Aminosäuren. Typische Vertreter für Moleküle, die nur einen Antikörper binden können und somit kleine Haptene im Sinne der Erfindung darstellen, sind natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren wie asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), symmetrisches Dimethylarginin, L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin und dergleichen; physiologische Amine wie Serotonin, Histamin, und dergleichen; Katecholamine wie Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine und dergleichen; cholergene Amine wie Adrenalin; und kleine Oligopeptide beziehungsweise kleine Peptidhormone wie die Nonapeptide Vasopressin und Oxytocin, das Dekapeptid Angiotensin-I und oder das Oktapeptid Angiotensin-II, T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin), Steroide wie Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron, und allgemein Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1200 Dalton. Zu den kleinen Haptenmolekülen gehören die meisten Cholesterin-Abkömmlinge und Derivate, da diese in der Regel weniger als zwei Antikörperbindungsstellen besitzen.Small haptens according to the invention are molecules that are so small that they can not simultaneously bind two antibodies. In oligopeptides are for a specific hapten or a specific antibody binding site in the rule at least five amino acids are required, with cyclic or branched peptides in some cases even more. Oligopeptides, which are small hapten molecules according to the invention, thus generally have less than 12 amino acids, generally fewer than 10 amino acids. Typical representatives of molecules which can bind only one antibody and thus represent small haptens in the sense of the invention are natural and non-natural amino acids such as asymmetric dimethylarginine (ADMA), symmetric dimethylarginine, L-arginine, homocysteine, citrulline, D-serine, Cysteine, methionine, tryptophan, carnitine and the like; physiological amines such as serotonin, histamine, and the like; Catecholamines such as dopamine, metanephrines, normetanephrines and the like; cholergenic amines such as adrenaline; and small oligopeptides or small peptide hormones such as the nonapeptides vasopressin and oxytocin, the decapeptide angiotensin-I and the octapeptide angiotensin-II, T3 (triiodothyronine), and T4 (thyroxine), steroids such as pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone, androsterone, DHEA (dehydroepiandrosterone ), DHEAS (dehydroepiandrosterone sulfate), testosterone, and generally molecules with a molecular weight of less than 1200 daltons. The small hapten molecules include most cholesterol derivatives and derivatives, as these usually have less than two antibody binding sites.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassays werden die Haptenmoleküle in der Probe beispielsweise durch eine Acylierung quantitativ zu einem Moleküle mit zwei Haptenen derivatisiert. Hierzu wird bevorzugt ein Derivatisierungsreagens gewählt, das über einen Spacer mit einer Gruppe gekoppelt ist, die durch einen markierten Sekundärantikörper oder ein Bindeprotein eindeutig und mit hoher Selektivität nachgewiesen werden kann. Ein bevorzugtes Derivatisierungsreagens für diesen Zweck ist beispielsweise D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-Spacer-NHS), wobei mehrere N-Aminocapron-Spacer vorhanden sein können. Besonders bevorzugt ist ein Biotin-Spacer-NHS-Derivatisierungsreagens mit zwei gekoppelten Aminocapronsäure-Spacereinheiten. Allgemein kann das Derivatisierungsreagens für Amino-Haptene folgende allgemeine Formel (I) besitzen R'-(CH₂)_n-(CONH)_m-(CH₂)_p-COOR (I)wobei R eine esteraktivierende Gruppe ist, n und p gleich oder verschieden sind und eine ganze Zahl von 0 bis 12, m gleich 0 bis 4 ist und R' ein Hapten ist, an das ein Antikörper oder ein Bindeprotein binden kann. Als esteraktivierende Gruppen werden bevorzugt N-Hydroxyestergruppen wie zum Beispiel die Hydroxysuccinimidylgruppe, Imidazolide, Pyridazolide, Aminoalkylcarbonsäuren, wobei die Alkylgruppe 2 bis 24 Kohlenstoffatome besitzen kann, oder aktivierte Arylestergruppen wie p-Nitrophenylester. Im Weiteren kann auch die Carboxylfunktion aktiviert werden, beispielsweise mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCCl). Aminogruppenhaltige Haptene können entweder in organischen Medien wie Dioxan oder Dimethylformamid (DMF) unter Zusatz von Triethylamin oder in Puffergemischen, bevorzugt Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 oder höher, mit einem Überschuss Derivatisierungsreagens umgesetzt werden. Ketogruppenhaltige Haptene hingegen werden bevorzugt mit einem Hydrazin-Derivatisierungreagens umgesetzt. SH-haltige Haptene können mit einem Maleinimido-Derivatisierungsreagens umgesetzt werden. Sowohl beim Hydrazin- als auch beim Maleinimido-Derivatisierungsreagens ist die reaktive Gruppe und die Haptengruppe durch einen Spacer der oben beschriebenen Art getrennt, so dass nach der Umsetzung die beiden Haptene voneinander getrennt durch Bindeproteine wie Antikörper, Avidin und Streptavidin gebunden werden können.In a preferred embodiment of the sandwich immunoassay according to the invention, the hapten molecules in the sample are derivatized quantitatively, for example by acylation, to give a molecule with two haptens. For this purpose, a derivatizing reagent is preferably selected which is coupled via a spacer to a group which can be detected clearly and with high selectivity by a labeled secondary antibody or a binding protein. A preferred derivatizing reagent for this purpose is, for example, D-biotinoyl-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (biotin spacer NHS), it being possible for a plurality of N-aminocapron spacers to be present. Particularly preferred is a biotin spacer NHS derivatizing reagent having two coupled aminocaproic acid spacer units. Generally, the amino-haptene derivatizing reagent may have the following general formula (I) R '- (CH ₂ ) _n - (CONH) _m - (CH ₂ ) _p -COOR (I) wherein R is an ester-activating group, n and p are the same or different and an integer of 0 to 12, m is 0 to 4 and R 'is a hapten to which an antibody or a binding protein can bind. Preferred ester activating groups are N-hydroxyester groups such as the hydroxysuccinimidyl group, imidazolides, pyridazolides, aminoalkylcarboxylic acids, wherein the alkyl group may have 2 to 24 carbon atoms, or activated arylester groups such as p-nitrophenyl ester. In addition, the carboxyl function can also be activated, for example with dicyclohexylcarbodiimide (DCCl). Amino group-containing haptens can be reacted either in organic media such as dioxane or dimethylformamide (DMF) with the addition of triethylamine or in buffer mixtures, preferably potassium phosphate buffer, pH 7.5 or higher, with an excess of derivatizing reagent. On the other hand, ketone-containing haptens are preferably reacted with a hydrazine derivatization reagent. SH-containing haptens can be reacted with a maleimido-derivatizing reagent. In both the hydrazine and maleinimido derivatizing reagents, the reactive group and the hapten group are separated by a spacer of the type described above so that after reaction, the two haptens can be bound separately by binding proteins such as antibody, avidin, and streptavidin.

Der haptenspezifische Fängerantikörper ist bevorzugt auf der Festphase gebunden und bindet aus der derivatisierten Probe heraus das Hapten an der Oberfläche. Nicht-bindende Substanzen werden weggewaschen. Markierte Sekundärantikörper oder Bindeproteine werden zugegeben. Bevorzugtes Bindeprotein im Fall einer Biotin-Spacer-NHS-Markierung ist Peroxidase markiertes Streptavidin. Es kann aber auch ein anderes übliches Bindeprotein wie Avidin und dergleichen verwendet werden. Das Bindeprotein bindet an der Detektionsgruppe, wobei die Fängerantikörper-Haptenbindung erhalten bleibt. Der Nachweis erfolgt über die Detektion der Markierung. Die Markierung kann beispielsweise ein Enzym sein wie Peroxidase, ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Marker oder unter Umständen auch eine radioaktive Markierung.Of the Hapten-specific capture antibody is preferred bound on the solid phase and binds from the derivatized sample hapten out at the surface. Non-binding substances are washed away. Labeled secondary antibodies or binding proteins are added. Preferred binding protein in the case of a biotin spacer NHS label is peroxidase-labeled streptavidin. But it can also be another usual Binding protein such as avidin and the like can be used. The binding protein binds to the detection group, preserving the capture antibody hapten binding remains. The proof is over the detection of the mark. The mark can be, for example an enzyme such as peroxidase, a fluorescent or chemiluminescent marker or maybe also a radioactive marker.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Analyt ein primäres oder sekundäres Monoamin wie asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), symmetrisches Dimethylarginin (SDMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin und dergleichen; physiologische Amine wie Serotonin, Histamin, und dergleichen; Katecholamine wie Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine und dergleichen; cholergene Amine wie Adrenalin; und kleine Oligopeptide beziehungsweise kleine Peptidhormone wie die Nonapeptide Vasopressin und Oxytocin, das Dekapeptid Angiotensin-I und oder das Oktapeptid Angiotensin-II, T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin). In einer anderen Ausführungsform wird der Analyt durch eine enzymatische Aktivität gebildet oder umgesetzt, mit einem Derivatisierungsreagens gemäß der Erfindung umgesetzt und dann in einem Sandwich-Immunoassay direkt nachgewiesen. Ein Beispiel für diese alternative Ausführungsform ist die Bestimmung der Plasma-Diaminooxidase-Aktivität. Hierbei im Stand der Technik zugesetztes Cadaverin oder Putrescin von der Plasma-DAO in 2,3,4-Trihydropyrrol beziehungsweise 2,3,4,5-Tetrahydropyridin umgewandelt und die DAO-Aktivität über die Edukte nachgewiesen. Statt Cadaverin kann auch 3-(2-Amino-ethyl)-pentan-1,5-diamin eingesetzt werden (siehe 4a). Das enzymatisch gebildete 2-(2,3,4,5-Tetrahydropyridin-4-yl)-ethylamin wird dann mit D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester umgesetzt und das resultierende Derivat in einem Sandwich-Immuno assay direkt nachgewiesen. Alternativ kann auch die Abnahme von eingesetztem Histamin, Cadaverin oder Putrescin bestimmt werden (siehe 4c).In a preferred embodiment, the analyte is a primary or secondary monoamine such as asymmetric dimethylarginine (ADMA), symmetric dimethylarginine (SDMA), L-arginine, homocysteine, citrulline, D-serine, cysteine, methionine, tryptophan, carnitine and the like; physiological amines such as serotonin, histamine, and the like; Catecholamines such as dopamine, metanephrines, normetanephrines and the like; cholergenic amines such as adrenaline; and small oligopeptides or small peptide hormones such as the nonapeptides vasopressin and oxytocin, the decapeptide angiotensin-I and / or the octapeptide angiotensin-II, T3 (triiodothyronine), and T4 (thyroxine). In another embodiment, the analyte is formed or reacted by an enzymatic activity, reacted with a derivatizing reagent according to the invention, and then directly detected in a sandwich immunoassay. An example of this alternative embodiment is the determination of the plasma di amino oxidase activity. Cadaverine or putrescine added in the prior art is converted from the plasma DAO into 2,3,4-trihydropyrrole or 2,3,4,5-tetrahydropyridine and the DAO activity is detected via the educts. Instead of cadaverine, it is also possible to use 3- (2-aminoethyl) pentane-1,5-diamine (cf. 4a ). The enzymatically formed 2- (2,3,4,5-tetrahydropyridin-4-yl) -ethylamine is then reacted with D-biotinoyl-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester and the resulting derivative detected directly in a sandwich immunoassay. Alternatively, the decrease in histamine, cadaverine or putrescine used can also be determined (see 4c ).

Die Erfindung eignet sich auch für kleine Haptenmoleküle, die keine Amine sind. So können beispielsweise kleine Haptenmoleküle mit einer Ketogruppe mit einem spezifischen Hydrazin-Derivatisierungsreagens wie Biotin-6-aminocaprylhydrazin, Biotin-di(6-aminocapryl)hydrazin, Biotin-(6-aminocapryl)_n-hydrazin, wobei n gleich 1 bis 10 ist, umgesetzt werden. Geeignete Steroide für diesen Nachweis sind beispielsweise Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron, und allgemein Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1200 Dalton, wie die meisten Cholesterin-Abkömmlinge und Derivate.The invention is also suitable for small hapten molecules that are not amines. For example, small hapten molecules having a keto group with a specific hydrazine derivatizing reagent such as biotin-6-aminocaprylhydrazine, biotin-di (6-aminocapryl) hydrazine, biotin- (6-aminocapryl) _n -hydrazine, where n is 1 to 10, be implemented. Suitable steroids for this detection are, for example, pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone, androsterone, DHEA (dehydroepiandrosterone), DHEAS (dehydroepiandrosterone sulfate), testosterone, and generally molecules with a molecular weight of less than 1200 daltons, like most cholesterol derivatives and derivatives.

1 zeigt das Reaktionsschema für die Koppelung von beispielsweise ADMA mit einem esteraktivierten Derivatisierungsreagens, wobei das Reagens selbst die notwendige weitere haptenische Gruppe, nämlich Biotin enthält. 2 zeigt eine typische Standardkurve bei der anschließenden Detektion durch eine standardisierte Farbreaktion mit Peroxidase gekoppelten Streptavidin und Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat. Alternative Substrate wären beispielsweise OPD (1,2-Phenyldiamin × 2 HCl), ABTS und andere. Die Ordinate zeigt die optische Dichte als Mittelwert von zwei Messungen bei 450 nm; die Abszisse die Konzentration an ADMA in μMol/L. 3 zeigt ein Reaktionsschema für die Kopplung von Pregnenolon mit hydrazinaktivierten Derivatisierungsreagens zur Koppelung der Pregnenolon-Gruppe mit einem weiteren Hapten, hier Biotin. Wenngleich diese Derivatisierungsreagenzien seit langem bekannt sind, wurden sie aber bislang nicht eingesetzt, um kleine Moleküle mit nur einem Hapten um ein weiteres Hapten zu vergrößern UND zwar zu dem Zweck, das so erweiterte Hapten direkt in einem Sandwich-Immunoassay zu bestimmen. Die Detektion niedrigkonzentrierter Steroidanalyten kann also über biotingekoppelte Konjugate erfolgen. Die Kopplung kann bei einfachen Ketogruppen, wie im Pregnenolon vorhanden, quantitativ durch eine Hydrazinkopplung mit einem aktivierten Biotin-Derivatisierungsreagens erfolgten. Es sind dann zwei Haptene (Biotin und Pregnenolon) über eine Spacergruppe miteinander gekoppelt. 4 ist ein Beispiel für die Bestimmung der Plasma-Diaminooxidase-Aktivität. Hierbei wird 3-(2-Aminoethyl)-pentan-1,5-diamin von Plasma-DAO zu 2-(2,3,4,5-Tetrahydro-pyridin-4-yl)-ethylamin oxidiert und zyklisiert, die resultierende zyklische Zwischenverbindung mit D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester derivatisiert und das resultierende Derivat in einem Sandwich-Immunoassay nachgewiesen. 1 shows the reaction scheme for the coupling of, for example, ADMA with an ester-activated derivatizing reagent, wherein the reagent itself contains the necessary additional haptenic group, namely biotin. 2 shows a typical standard curve in the subsequent detection by a standardized color reaction with peroxidase-coupled streptavidin and tetramethylbenzidine (TMB) as substrate. Alternative substrates would be, for example, OPD (1,2-phenyldiamine.times.2 HCl), ABTS and others. The ordinate shows the optical density as the mean of two measurements at 450 nm; the abscissa the concentration of ADMA in μMol / L. 3 shows a reaction scheme for the coupling of pregnenolone with hydrazine-activated derivatizing reagent for coupling the pregnenolone group with another hapten, here biotin. Although these derivatization reagents have been known for a long time, they have hitherto not been used to increase small molecules with only one hapten by one more hapten for the purpose of directly determining the hapten thus extended directly in a sandwich immunoassay. The detection of low-concentration steroidanalytes can thus take place via biotin-coupled conjugates. The coupling can be carried out quantitatively by simple hydrazine coupling with an activated biotin derivatizing reagent in the case of simple keto groups, as present in the pregnenolone. There are then two haptens (biotin and pregnenolone) coupled together via a spacer group. 4 is an example of the determination of plasma diaminooxidase activity. Here, 3- (2-aminoethyl) pentane-1,5-diamine is oxidized from plasma DAO to 2- (2,3,4,5-tetrahydropyridin-4-yl) -ethylamine and cyclized, the resulting cyclic Derivatized intermediate compound with D-biotinoyl-ε-aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimidester and the resulting derivative detected in a sandwich immunoassay.

BEISPIELEXAMPLE

Beispiel 1example 1

Kopplung von ADMA mit Biotin-X-X-NHSCoupling of ADMA with biotin-X-X-NHS

Es wurde jeweils 20 μL Probe (Serum, Standard beziehungsweise Kontrolle) in die Vertiefung einer 96er Mikrotiterplatte pipettiert; nachstehend auch Kopplungsplatte genannt. Die Probe wurde durch Zusatz von 60 μL 100 mM Carbonatpuffer, pH 9 auf der Kopplungsplatte konditioniert, und 20 μL 100 mM Biotin-X-N-Hydroxysuccinimid [Biotin-(ε-aminocapronsäure)₂-N-hydroxysuccinimidester] in Dimethylformamid zugesetzt und die Platte rotierend bewegt. Es lag im Reaktionsansatz ein etwa 10facher Überschuss an Acylierungsreagens vor bezogen auf die im Serum vorhandenen primären und sekundären Aminogruppen (ca. 2mM Aminosäuren, < 1 mM Amine, 5-10 mM Amin im Humanserumalbumin). Die Serumprobe wurde 45 Minuten bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Danach wurden dem Reaktionsansatz 300 μL Stopp- und Verdünnungspuffer (3 mM Ammoniumchlorid/1% BSA, pH 6,0) zugegeben und dann 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so dass sich bislang nichtumgesetztes Succinimid mit Ammonium abreagieren konnte und der pH für den ELISA zwischen 7,5 und 8 eingestellt war. Anschließend wurde 100 μL gekoppelte Haptenprobe in den Sandwich-Immunoassay eingesetzt.In each case 20 μL sample (serum, standard or control) was pipetted into the well of a 96-well microtiter plate; hereinafter also called coupling plate. The sample was conditioned by the addition of 60 μL of 100 mM carbonate buffer, pH 9 on the coupling plate, and 20 μL of 100 mM biotin-XN-hydroxysuccinimide [biotin (ε-aminocaproic acid) ₂ -N-hydroxysuccinimide ester] in dimethylformamide and the plate was rotated emotional. In the reaction mixture there was an about 10-fold excess of acylating reagent relative to the primary and secondary amino groups present in the serum (about 2 mM amino acids, <1 mM amines, 5-10 mM amine in human serum albumin). The serum sample was reacted at ambient temperature for 45 minutes. Thereafter, 300 μL of stop and dilution buffer (3 mM ammonium chloride / 1% BSA, pH 6.0) were added to the reaction mixture and then incubated for 45 minutes at room temperature, so that previously unreacted succinimide could react with ammonium and the pH for the ELISA between 7.5 and 8 was set. Subsequently, 100 μL coupled hapten sample was used in the sandwich immunoassay.

Enzym-Linked-Immunoassay (ELISA)Enzyme-linked immunoassay (ELISA)

Es wurde eine 96er Mikrotiterplatte mit Fängerantikörper (polyklonale Kaninchen-Anti-ADMA-Antikörper) in herkömmlicher Weise beschichtet. Hierzu wurde in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte jeweils 200 ng Anti-ADMA-Antikörper gegeben, gelöst in 100 μL 60 mM NaHCO₃, pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Anti-ADMA-AK-Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween-20) gewaschen.A 96-well capture antibody microtiter plate (polyclonal rabbit anti-ADMA antibody) was coated in a conventional manner. For this purpose, in each case 200 ng of anti-ADMA antibody was added to the wells of the microtiter plate, dissolved in 100 .mu.l 60 mM NaHCO ₃ , pH 9.6, and the plate incubated overnight at 4 ° C. The anti-ADMA-AK solution in the wells was removed and each well washed five times with 200 μl wash buffer (PBS, pH 7.4 with 0.05% Tween-20).

Dann wurde 100 μL der Biotin-gekoppelten Haptenprobe (Serum, ADMA-Standard beziehungsweise Kontrolle) in Doppelbestimmung in die Vertiefungen der Anti-ADMA-Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte pipettiert, die Vertiefungen mit Folienstreifen abgedeckt, und entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht (15 bis 20 Stunden) bei 2 bis 8°C inkubiert. Die Haptenprobe wurde aus den Vertiefungen entnommen und die Wände der Vertiefungen erneut fünfmal mit 200 μL Waschpuffer und zwischendurch Ausklopfen auf saugfähigem Papier gewaschen. Die quantitative Bestimmung erfolgte mit 100 μL Peroxidase markiertem Streptavidin (1:1 000 verdünnt in Waschpuffer, entsprechend ca. 100 ng). Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden Streptavidin-Lösungen abgenommen und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Für die Farb reaktion wurden 100 μl Tetramethylbenzidin(TMB)-Substrat-Lösung (gebrauchsfertig von NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) in die Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur (18-26°C) im Dunkeln inkubiert. Nach 10 bis 25 Minuten wurde die Farbentwicklung durch Zugabe von 50 μl 2 M H₂SO₄ pro Vertiefung gestoppt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte sofort im Anschluss, wobei die Extinktion im Mikrotiterplatten-Photometer (ELISA-Reader) bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 nm (oder 690 nm) gemessen wurde. Übersteigt die Extinktion des höchsten Standards den Messbereich des Photometers, kann bei 405 nm gegen 620 nm (690 nm) nachgemessen werden. 2 zeigt die Ergebnisse einer typischen Eichkurve am ADMA-Standard. Die eingesetzten Standardkonzentrationen betrugen: 0,01 μM, 0,02 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM und 10 μM. Die Eichkurve ist stetig und im relevanten Messbereich nahezu linear (bei logarithmischen Maßstab), so dass auch geringe Konzentrationen exakt bestimmt werden können. Die physiologische Konzentration von ADMA im Serum beträgt normalerweise etwa 0,3 bis 5 μMol/L.Then 100 μL of the biotin-coupled hapten sample (serum, ADMA standard or control) was pipetted in duplicate into the wells of the anti-ADMA antibody coated microtiter plate, the wells with slides covered and incubated either at room temperature for 4 hours or overnight (15 to 20 hours) at 2 to 8 ° C. The hapten sample was removed from the wells and the wells were washed again five times with 200 μL wash buffer and tapping on absorbent paper. The quantitative determination was carried out with 100 μL peroxidase-labeled streptavidin (1: 1000 diluted in washing buffer, corresponding to about 100 ng). It was incubated for one hour at room temperature. Thereafter, streptavidin solutions were removed and each well was washed five times with 200 μl wash buffer each time. For the color reaction, 100 μl of tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution (ready for use by NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) were added to the wells and incubated at room temperature (18-26 ° C.) in the dark. After 10 to 25 minutes, color development was stopped by adding 50 μl 2 MH ₂ SO ₄ per well. The measurement of the optical density was carried out immediately after the absorbance in the microtiter plate photometer (ELISA reader) was measured at 450 nm against the reference wavelength 620 nm (or 690 nm). If the absorbance of the highest standard exceeds the measuring range of the photometer, it can be measured at 405 nm against 620 nm (690 nm). 2 shows the results of a typical calibration curve on the ADMA standard. The standard concentrations used were: 0.01 μM, 0.02 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM and 10 μM. The calibration curve is continuous and almost linear in the relevant measuring range (at logarithmic scale), so that even low concentrations can be determined exactly. The physiological concentration of ADMA in serum is normally about 0.3 to 5 μmol / L.

Beispiel 2Example 2

Kopplung von Pregnenolon mit Biotin-6-AminocaprylhydrazinCoupling of pregnenolone with biotin-6-aminocaprylhydrazine

Hierzu wurde jeweils 20 μL Probe (Serum, Standard bzw. Kontrolle) in eine vertiefung einer 96er Mikrotiterplatte, der Kopplungsplatte pipettiert. Die Probe wurde durch Zugabe von 60 μL 100 mM Phosphatpuffer, pH 7.5 konditioniert, 20 μL 10 mM Biotin-6-Aminocaprylhydrazin zugesetzt und die Platte rotierend bewegt. Es lag im Reaktionsansatz dann vor ein etwa 10-facher Überschuss an Derivatisierungsreagens bezogen auf die im Serum vorhandenen Aldehyd- und Ketogruppen. Die Probe wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Danach wurden dem Reaktionsansatz 300 μL Stopp- und Verdünnungspuffer (1 mM Aceton in Phosphatpuffer/1% BSA, pH 7.5) zugesetzt und der Ansatz 45 Minuten bei Raumtemperatur rotierend inkubiert, so dass nicht umgesetztes Hydrazinreagens abreagieren konnte. Schließlich wurde das Biotin gekoppelte Pregnenolon in einem Sandwich-Immunoassay (ELISA) analog Beispiel 1 direkt gemessen. Als Fänger-Antikörper wurden kommerzielle anti-Pregnenolon-Antikörper (Immundiagnostik AG, Bensheim, DE), erzeugt gegen ein weiteres Pregenolon-Derivat eingesetzt, For this each was 20 μL Sample (serum, standard or control) into a well 96-well microtiter plate, the coupling plate pipetted. The sample was made by adding 60 μL 100 mM phosphate buffer, pH 7.5 conditioned, 20 μL 10 mM biotin-6-aminocaprylhydrazine added and the plate is rotated. It was in the reaction mixture then about a 10-fold excess on derivatizing reagent based on those present in the serum Aldehyde and keto groups. The sample was left at room temperature for 45 minutes implemented. Thereafter, the reaction mixture was subjected to 300 μL stop and dilution buffer (1 mM acetone in phosphate buffer / 1% BSA, pH 7.5) was added and the Incubated for 45 minutes at room temperature, rotating so that unreacted hydrazine reagent could react. Finally became the biotin-coupled pregnenolone in a sandwich immunoassay (ELISA) directly measured analogously to Example 1. As catcher antibodies were commercial anti-pregnenolone antibodies (Immunodiagnostik AG, Bensheim, DE), generated against another pregenolone derivative,

Beispiel 3Example 3

Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivitätdetermination the diaminooxidase activity

Die DAO-Aktivität kann entweder über die Umsetzung von Histamin oder ersatzweise über Diaminverbindungen wie 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin, Cadaverin oder Putrescin erfolgen.The DAO activity can either over the conversion of histamine or, alternatively, via diamine compounds such as 3- (2-amino-ethyl) -pentane-1,5-diamine, cadaverine or putrescine done.

Bei der Umsetzung von Histamin ist in dem Assay bei einem Endvolumen von 250 μL enthalten: 100 μL 100 mM Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 50 μL 5 mM Histamin mit 5 mM Biotin-6-Aminocaproyl-hydrazin. Das von der DAO gebildete Histamin-Acetaldehyd wird in situ zur Analytverbindung umgesetzt, die dann über einen Sandwich-Immunoassay mit Hilfe von Peroxidase markiertem Streptavidin direkt nachgewiesen und gemessen wird (siehe 4b). Als Fänger-Antikörper wird ein polyklonaler Antikörper gegen ein anderes Histamin-Derivat eingesetzt.In the conversion of histamine, the assay at a final volume of 250 μL contains: 100 μL of 100 mM phosphate buffer, pH 7.2; 100 μL plasma and 50 μL 5 mM histamine with 5 mM biotin-6-aminocaproyl-hydrazine. The histamine-acetaldehyde formed by the DAO is converted in situ to the analyte compound, which is then directly detected and measured by a sandwich immunoassay using peroxidase-labeled streptavidin (see 4b ). The catcher antibody used is a polyclonal antibody against another histamine derivative.

Alternativ kann die Oxidation von Histamin über dessen Abnahme im Ansatz bestimmt werden. Dann ist in dem Assay bei einem Endvolumen von 250 μL enthalten: 100 μL 0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 25 μL 5 mM Histamin. Das Histamin wird zum Histamin-Acetaldehyd abgebaut. Verbliebenes Histamin wird nach Umsetzung mit Biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM Biotin-XX-NHS in DMF), Bindung an einen ersten Fänger-Antikörper auf einer festen Phase, und Nachweis über Peroxidase markiertes Streptavidin wie in Beispiel 1 in einem Sandwich-Immunoassay direkt gemessen (siehe 4c). Als Fänger-Antikörper wird ein polyklonaler Antikörper gegen ein anderes Histamin-Derivat eingesetzt.Alternatively, the oxidation of histamine via its decrease in the approach can be determined. Then the assay at a final volume of 250 μL contains: 100 μL 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2; 100 μL plasma and 25 μL 5 mM histamine. The histamine is degraded to histamine acetaldehyde. Residual histamine, after reaction with biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM biotin-XX-NHS in DMF), binds to a first capture antibody on a solid phase, and detection via peroxidase-labeled streptavidin as in Example 1 in a Sandwich immunoassay measured directly (see 4c ). The catcher antibody used is a polyclonal antibody against another histamine derivative.

In einer weiteren Alternative kann in dem Assayansatz bei einem Endvolumen von 250 μL enthalten sein: 100 μL 0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.2; 100 μL Plasma und 25 μL Substrat (z.B. 5 mM 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin). Das resultierende zyklische Substrat wird mit Biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM Biotin-XX-NHS in DMF) wie in Beispiel 1 derivatisiert und in einem Sandwich-Immunoassay mit Peroxidase markiertem Streptavidin wie in Beispiel 1 bestimmt (siehe 4a). Als Fänger-Antikörper wird ein polyklonaler Antikörper gegen ein Derivat von 3-(2-Amino-ethyl)-pentane-1,5-diamin eingesetzt.In a further alternative, the assay batch may be included at a final volume of 250 μL: 100 μL 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2; 100 μL plasma and 25 μL substrate (eg 5 mM 3- (2-aminoethyl) pentane-1,5-diamine). The resulting cyclic substrate is derivatized with biotin-XX-NHS (25 μL, 10 mM biotin-XX-NHS in DMF) as in Example 1 and determined in a sandwich immunoassay with peroxidase-labeled streptavidin as in Example 1 (see 4a ). As a catcher antibody, a polyclonal antibody against a derivative of 3- (2-amino-ethyl) pentane-1,5-diamine is used.

Claims

Sandwich-Immunoassay für die Bestimmung kleiner Haptenmoleküle, an die nur ein Antikörper binden kann, umfassend die Verfahrensschritte in der angegebenen Folge: (i) Zusetzen zu einer Probe, in die zu bestimmenden Haptenmoleküle vorliegen, eines stöchiometrischen Überschusses eines reaktiven Detektions- und Derivatisierungsmittels, beinhaltend eine chemisch reaktive Gruppe, einen Spacer und eine Detektionsgruppe, das sich mit den zu bestimmenden Haptenmolekülen quantitativ umsetzt, so dass man eine Analytverbindung erhält, in der das kleine Hapten über einen Spacer mit einer Detektionsgruppe verknüpft ist; (ii) Bereitstellen von spezifischen ersten Fänger-Antikörpern gegen das Hapten, fakultativ gebunden an einer festen Phase, Zusammenbringen der Probe mit der Analytverbindung mit den spezifischen ersten Fänger-Antikörpern, und Herstellen eines Komplexes aus Analytverbindung und erstem Antikörper, fakultativ gebunden an einer festen Phase; (iii) Zusammenbringen des Komplexes aus erstem Antikörper und Analytverbindung mit einem Bindeprotein, das spezifisch an die Detektionsgruppe bindet, und (iv) Detektieren der Menge an Bindeprotein, das an dem Komplex aus erstem Antikörper und Analytverbindung gebunden ist.Sandwich immunoassay for the determination of small hapten molecules, to which only one antibody (i) adding to a sample in which hapten molecules to be determined are present, a stoichiometric excess of a reactive detection and derivatization agent, including a chemically reactive group, a spacer, and a detection group that forms quantitatively reacted with the hapten molecules to be determined so that an analyte compound is obtained in which the small hapten is linked to a detection group via a spacer; (ii) providing specific first capture antibodies against the hapten, optionally bound to a solid phase, contacting the sample with the analyte compound with the specific first capture antibody, and preparing a complex of analyte compound and first antibody, optionally attached to a solid Phase; (iii) contacting the complex of first antibody and analyte compound with a binding protein that specifically binds to the detection group, and (iv) detecting the amount of binding protein bound to the complex of first antibody and analyte compound.

Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine primäre oder sekundäre Aminogruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine esteraktivierende oder eine acylierende Gruppe aufweist.The sandwich immunoassay of claim 1, wherein the determining small hapten molecule one primary or secondary Amino group and the chemically reactive detection means an ester-activating or an acylating group.

Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine einfache Keto- oder Aldehydgruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Hydrazingruppe aufweist.The sandwich immunoassay of claim 1, wherein the determining small hapten molecule one simple keto or aldehyde group and the chemically reactive detection agent having a hydrazine group.

Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine einfache Keto- oder Aldehydgruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Hydrazin- oder eine Carbodiimid-Gruppe aufweist.The sandwich immunoassay of claim 1, wherein the determining small hapten molecule one simple keto or aldehyde group and the chemically reactive detection agent having a hydrazine or a carbodiimide group.

Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1, wobei das zu bestimmende kleine Haptenmolekül eine SH-Gruppe und das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Maleinimid-Gruppe aufweist.The sandwich immunoassay of claim 1, wherein the determining small hapten molecule one SH group and the chemically reactive detection agent a maleimide group having.

Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 2, wobei das chemisch reaktive Detektionsmittel eine N-Hydroxysuccinimid-Gruppe aufweist.Sandwich immunoassay according to claim 2, wherein the chemically reactive detection agent having an N-hydroxysuccinimide group.

Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 6, wobei das chemisch reaktive Detektionsmittel Biotin-X-NHS (Biotin-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester) oder Biotin-(X)_1-5-NHS ist, wobei X 7-Aminocapronsäure oder ein Spacer mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen ist.Sandwich immunoassay according to claim 6, wherein the chemically reactive detection agent is biotin-X-NHS (biotin-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester) or biotin (X) _1-5 -NHS, wherein X 7-aminocaproic acid or a spacer with up to 24 carbon atoms.

Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, wobei das chemisch reaktive Detektionsmittel eine Gruppe aufweist, ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Desthiobiotin, substituierten und derivatisierten Aminosäuren, Oligopeptiden, FITC, Avidin, Streptavidin.Sandwich immunoassay according to one of the preceding claims 1 to 6, wherein the chemically reactive detection agent is a group has selected from biotin, digoxigenin, desthiobiotin, substituted and derivatized Amino acids, Oligopeptides, FITC, avidin, streptavidin.

Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, wobei das kleine Haptenmolekül ausgewählt ist aus natürlichen und nichtnatürlichen Aminosäuren, asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA), L-Arginin, Homocystein, Citrullin, D-Serin, Cystein, Methionin, Tryptophan, Carnitin; physiologischen Aminen, Serotonin, Histamin; Katecholaminen, Dopamin, Metanephrine, Normetanephrine; cholergenen Aminen, Adrenalin; Oligopeptiden und kleine Peptidhormonen mit bis zu 12 Aminosäuren; Nonapeptiden, Vasopressin Oxytocin; Dekapeptiden, Angiotensin-I; Oktapeptiden, Angiotensin-II; T3 (Triiodothyronin), und T4 (Thyroxin); Steroiden, Pregnenolon, 17-Hydroxypregnenolon, Androsteron, DHEA (Dehydroepiandrosteron), DHEAS (Dehydroepiandrosteron-Sulfat), Testosteron.Sandwich immunoassay according to one of the preceding claims 1 to 8, wherein the small hapten molecule is selected from natural and not natural Amino acids, asymmetric dimethylarginine (ADMA), L-arginine, homocysteine, citrulline, D-serine, cysteine, methionine, tryptophan, carnitine; physiological Amines, serotonin, histamine; Catecholamines, dopamine, metanephrines, normetanephrine; cholergenic amines, adrenaline; Oligopeptides and small peptide hormones with up to 12 amino acids; Nonapeptides, vasopressin oxytocin; Decapeptides, angiotensin-I; Octapeptides, angiotensin II; T3 (triiodothyronine), and T4 (thyroxine); Steroids, Pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone, androsterone, DHEA (dehydroepiandrosterone), DHEAS (dehydroepiandrosterone sulfate), testosterone.

Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung von ADMA in Plasma, Serum oder Blut.Sandwich immunoassay according to one of the preceding claims 1 to 9 for the determination of ADMA in plasma, serum or blood.

Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung von Pregnenolon in Plasma, Serum oder Blut.Sandwich immunoassay according to one of the preceding claims 1 to 9 for the determination of pregnenolone in plasma, serum or blood.

Sandwich-Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9 zur Bestimmung einer Enzymaktivität in Plasma, Serum oder Blut, wobei das in der Enzymreaktion umgesetzte Substrat ein kleines Hapten mit weniger als 1200 Dalton ist.Sandwich immunoassay according to one of the preceding claims 1 to 9 for the determination of an enzyme activity in plasma, serum or blood, wherein the substrate reacted in the enzyme reaction is a small hapten with less than 1200 daltons.

Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 12 zur Bestimmung der Diaminooxidase-Aktivität in Plasma, Serum oder Blut.Sandwich immunoassay according to claim 12 for the determination the diaminooxidase activity in plasma, serum or blood.

Kit für einen Sandwich-Immunoassay nach einem der Ansprüche 1 bis 13, enthaltend einen Chemikaliensatz für die Derivatisierung des kleinen Haptens, Antikörper und/oder Bindeprotein, sowie einen Chemikaliensatz für die Detektion.Kit for A sandwich immunoassay according to any one of claims 1 to 13, containing one Chemical kit for the derivatization of the small hapten, antibody and / or binding protein, and a chemical kit for the detection.