DE102004023053A1

DE102004023053A1 - Kleinkultivierungssystem mit geregelter Gasventilation, Abgasanalyse, zusätzlicher Sensorik, und Dosierung

Info

Publication number: DE102004023053A1
Application number: DE200410023053
Authority: DE
Inventors: Werner Zang
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-05-10
Filing date: 2004-05-10
Publication date: 2005-12-08

Abstract

Technische Aufgabe der Erfindung DOLLAR A Herkömmliche Kleinkultivierungssysteme weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Eintauchende Sensoren stören die Hydrodynamik, machen die Präparation aufwändig und die Sterilisation problematisch. Die Dosierung in parallele Reaktoren erfolgt bisher volumetrisch und mit jeweils einer eigenen Pumpe pro Reaktor, die regelmäßig kalibriert werden muss. Die Systeme werden wegen der aufwändigen Handhabung ungern verwendet. Die Erfindung beschreibt ein modulares Kleinkultivierungssystem, das die Nachteile der bekannten Systeme vermeidet, durch vereinfachten Aufbau Kosten spart und einfach zu handhaben ist. DOLLAR A Lösung der technischen Aufgabe DOLLAR A Durch die Aufteilung des Systemaufbaus in ein sterilisierbares und ein nicht sterilisierbares Modul wird der Präparationsaufwand auf ein Mindestmaß reduziert. Durch ein Kapillarsystem wird die Gasversorgung der einzelnen Reaktoren vereinfacht und der Kalibrieraufwand minimiert. Durch eine selbstkalibrierende Gassensorik werden Genauigkeit, Messempfindlichkeit und Langzeitkonstanz der Apparatur erhöht. DOLLAR A Durch spezielle Anbringung eintauchender Sensoren wird bei empfindlichen Mikroorganismen eine Beeinflussung des Wachstums vermieden. DOLLAR A Weitere Ansprüche betreffen Luftanfeuchtung, Dosiermethoden und einfache Sterilisierbarkeit. DOLLAR A Anwendungsgebiet DOLLAR A Die Erfindung kann u. a. eingesetzt werden für die Kultivierung von Mikroorganismen und Zellen.

Description

Die Erfindung betrifft Kleinkultivierungssysteme für Mikroorganismen und Zellen und entsprechende Reaktor-Systeme für Anwendungen in anderen Bereichen, z.B. der Chemie, entsprechend den Ansprüchen 1 bis 15.

Es ist bekannt, dass Kleinkultivierungssysteme eingesetzt werden, um Entwicklungsprozesse zu verkürzen, z.B. in der Biotechnologie für die beschleunigte Entwicklung von Produktionsstämmen, oder zur Medienoptimierung. Die zur Zeit eingeführten Systeme unterscheiden sich in vielen Punkten. Als Reaktoren (bzw. Kulturgefäße) werden verschiedene Gefäße, in der Biotechnologie z.B. bevorzugt Schüttelkolben eingesetzt.

Einige Geräte für die Biotechnologie ermöglichen die Messung des pH-Wertes oder des Sauerstoffgehalts in der Flüssigkeit, andere die Messung der Atmungsrate (Sauerstofftransfer- und Kohlendioxidtransferrate). Ein Messverfahren für ein System zur Messung der Atmungsrate in Schüttelkolben wurde von J. Büchs zum Patent angemeldet (Europa Pat. EP 0 905 229 A2 , 1999 ).

Die Gaszuführung bei dem von Büchs beschriebenem System und die Handhabung sind aufwändig, da hier für jeden einzelnen Schüttelkolben eine Durchflussregelung vorgesehen ist. Die Sensoren müssen vor der Sterilisation des Kolbens abgenommen werden. Die deshalb erforderlichen Sterilmembranen zwischen Gasraum im Kolben und Sensor sind eine potentielle Quelle für Undichtigkeiten. Insbesondere in der Zellkultur, aber auch bei anderen langsam wachsenden Organismen, ist die Verdunstung durch den Gasstrom zu hoch. Die Verdunstung kann durch Anfeuchten der Luft vermieden werden. Eine einfache Anfeuchtung mittels Durchperlen durch Wasser (Waschflasche) hat eine zu hohe Beeinflussung durch Verdunstungskälte. Eine weitere Fehlerquelle ist, dass schon durch kleine Temperaturunterschiede im Inkubator das Gas zu Kondensation oder nicht vorher bestimmbarer Unterschreitung der Sättigung kommt. Dies führt entweder zu einer instabilen Luftfeuchte, welche die Gasmessung stört, oder zur Kondensation in den Sterilfiltern oder an den Sensoren.

Die Dosierung in parallele Reaktoren erfolgt bisher aus Kostengründen volumetrisch und mit jeweils einer eigenen Pumpe pro Reaktor. Bei höheren Ganauigkeitsanforderungen müssen die bisher üblichen volumetrischen Dosierkreise regelmäßig einzeln kalibriert werden, indem z.B. für eine gewisse Zeit auf eine Waage gefördert wird. Anwendungstechnisch wäre die gravimetrische Dosierung über Massendurchflusssensor oder mit online Gewichtskontrolle über eine Waage vorzuziehen, wie sie an Einzelreaktorsystemen Standard ist. Dies scheitert bisher am zu großen Aufwand und zu hohen Kosten.

Sensoren, die in die Strömung eintauchen, stören die Hydrodynamik und können damit die Wachstumsbedingungen von Mikroorganismen erheblich stören. Dadurch sind die Ergebnisse nicht mehr vergleichbar mit den Messergebnissen aus normalen Kulturgefäßen z.B. Schüttelkolben.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein modulares Kleinkultivierungssystem zu schaffen, das die Nachteile der bekannten Systeme vermeidet, durch vereinfachten Aufbau Kosten spart und einfach zu handhaben ist. Diese Aufgabe wird durch das System mit den in den Ansprüchen 1 bis 15 beschriebenen Merkmalen gelöst.

Die Akzeptanz von Kultivierungssystemen hängt in erster Linie von der Benutzerfreundlichkeit ab. Die aktuellen Systeme, die zur Sterilisation zerlegt und anschließend wieder zusammengesetzt werden müssen, werden wegen der aufwändigen Handhabung größtenteils abgelehnt. Durch die Aufteilung des Aufbaus (z.B. auf einem Schütteltablar) in ein sterilisierbares und ein nicht sterilisierbares Modul (Anspruch 1), wird der Präparationsaufwand auf ein Mindestmaß reduziert. Das sterile und das nicht sterile Modul können mit wenigen Handgriffen getrennt werden. Die Dosierkreise bleiben sicher steril, da Vorratsgefäße, die angeschlossenen Schläuche und mögliche Verteiler mitsterilisiert werden.

Durch die vereinfachte Gasversorgung der einzelnen Reaktoren (Anspruch 3) wird insgesamt nur noch ein Massendurchflusssensor benötigt und ist nur noch ein einzelner durch Schnellkupplung zu lösender Schlauch zu dem Reaktorsystem (bei Schüttelkolben auf das Schütteltablar) zu führen. Da die Flüsse auf Grund der geringen Fertigungstoleranzen der Kapillaren untereinander nur geringfügige Abweichungen haben, wird eine bessere Vergleichbarkeit der Messergebnisse aus den einzelnen Reaktoren erreicht, ist weniger Kalibrieraufwand erforderlich und wird eine wesentlich kostengünstige Fertigung ermöglicht.

Durch eine alternativ vom Reaktor weg zu verlagerte Gassensorik wird die Messung weiterer Gase möglich und bei geschüttelten Bioreaktoren Gewichts- und Sterilisationsprobleme vermieden. Bei diesem System wird die Gassensorik über Ventile im Zeitmultiplexverfahren mit den einzelnen Sensoren verbunden. Der Vorteil ist, dass nur ein Sensorsatz erforderlich ist. Dieser liegt außerhalb des Sterilbereiches. Die Sterilmembranen zwischen Gassensor und Reaktor entfallen.

Durch alternativ angewendete Absaugung der Gasproben aus dem Schüttelkolben, mit Hilfe einer Hohlnadel, die durch den in üblicher Weise als Sterilbarriere dienenden Wattestopfen gestochenen wird, sind unveränderte Kultiverungsbedingungen gewährleistet. Alternativ kann bei diesem System eine geschlossene Messschleife verwendet werden und das gemessene Gas über eine zweite Hohlnadel wieder in die Reaktoren zurückgeführt werden.

Alternativ werden hermetisch geschlossene Reaktoren verwendet. Die Gasversorgung erfolgt dann nicht mehr durch Diffusion durch die Wattestopfen, sondern über Ein- und Auslassanschlüsse, wobei die Abluft an die Umgebung abgeblasen wird. Da beliebige Gasgemische über einen Schlauch von außen zugeführt werden, erübrigt sich die Verwendung spezieller Inkubatoren.

Durch das zyklische Umschalten der Messschleife auf Umgebungsluft oder ein Kalibriergasgemisch werden Genauigkeit, Messempfindlichkeit und Langzeitkonstanz der Apparatur erhöht.

Durch einen alternativ fest im Reaktor eingebauten sterilisierbaren Sensor z.B. auf keramischer Basis (Festelektrolyt), kann die Sterilmembran zwischen Sensor und Reaktor und damit eine potentielle Undichtigkeitsstelle entfallen.

Durch das Platzieren zusätzlicher, nur zum Zeitpunkt der Messung eintauchender Sensoren in eine Vertiefung im Zentrum des Schüttelkolbenbodens oder in der natürlichen Rührtrombe im Reaktor, wird bei empfindlichen Miroorganismen eine Beeinflussung des Wachstums auf Grund der durch die Sonden veränderten Hydrodynamik vermieden. Die Sensoren werden so platziert, dass sie sich im geschüttelten/gerührten Reaktor oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche befinden und nur bei ruhender Flüssigkeit eintauchen. Für den Messvorgang wird der Schüttler/Rührer kurz angehalten.

Die Luftanfeuchtung wird mittels einer genau thermostatisierten, als Dewar-Gefäß ausgeführten Gaswaschflasche durchgeführt. Die Thermostatisierung wird z.B. mit einer Heizpatrone mit PID-Regelung durchgeführt. Dadurch ist es möglich, die Feuchte genau auf Werte knapp unter der Sättigung bzw. auf den Dampfdruck der Kulturflüssigkeit einzustellen und instabile Feuchte und Kondensation zuverlässig zu vermeiden.

Durch die Zeitmultiplexdosierung aus einem Vorlagegefäß, das sich auf einer Präzisionswaage befindet, wird die allgemein angestrebte gravimetrische Dosierung mit einem Bruchteil der Kosten realisiert und ganze Besteck kann zusammenhängend sterilisiert werden.

Als alternative Dosiermethoden sind vorgesehen: Volumetrische Dosierung mit einer Schlauchpumpe, Verteilung auf die Reaktoren und Umschaltung auf mehrere Vorlagen (Substrat, pH-Regelung...) mittels Schlauchquetschventilen. Volumetrische Dosierung mittels Spritzendosierern mit Dosiergenauigkeiten bis < 0,001 ml. Vorteile: Verwendung handelsüblicher, steriler Einmalspritzen. Keine Kalibrierung erforderlich, da Einmalspritzen mit geringen Fertigungstoleranzen verfügbar sind. Kompakte sterilisierbare Einheiten aus Reaktor, Spritze und Zuführungsschlauch.

Claims

Vorrichtung zur parallelen Durchführung biologischer und chemischer Prozesse in gerührten oder geschüttelten Reaktoren auch unter sterilen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufbau in zwei Module unterteilt wird (1, 2, 4 – 6, 8 – 11). Modul 1 ist z.B. durch Autoklavieren unzerlegt sterilisierbar und enthält Reaktoren, Sterilbarrieren, alle Schlauchleitungen, Vorlagengefäße mit den Dosiermedien und die sterilisierbaren Sensoren. Modul 2 ist nicht sterilisierbar und enthält alle nicht sterilisierbaren Komponenten wie Gasventile, Gassensoren, Schlauchquetschventile und Schlauchpumpen, sowie die Mess- und Steuerelektronik. Die Module werden durch einfaches Aufstecken des nichtsterilen Moduls 2 auf das sterile Modul 1 verbunden. Die Dosierkreise bleiben steril, da Vorratsgefäße, die angeschlossenen Schläuche und mögliche Verteiler mitsterilisiert werden können. Die Dosiermedien werden durch eine oder mehrere Schlauchpumpen, sterilisierbare Piezopumpen (Anspruch 13) oder sterile Spritzendosierer (Anspruch 14) gefördert, die sich auf dem nichtsterilisierbaren Modul befinden.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass geregelte Begasung, geregelte Befeuchtung, Abgasanalyse, zusätzliche Sensorik und Dosierung, bei einfacher Handhabung gleichzeitig möglich sind (1 bis 12).
Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die parallele Gasversorgung mehrerer Reaktoren eines Kleinkultivierungssystems die gleichmäßige Verteilung des Gasstromes auf durch ein einfaches Kapillarsystem realisiert wird. Die Gleichverteilung wird durch parallel geschaltete präzise Fließwiderstände in Form von Kapillaren erreicht (2).
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gassensorik vom Reaktor weg verlagert wird und Gasproben aus den einzelnen Reaktoren im Zeitmultiplex durch die Messschleife an den Sensoren vorbei gefördert wird. Das Umschalten der Sensor-Messschleife auf die einzelnen Reaktoren, erfolgt durch Ventilblöcke oder Multiwegeventile (3).
Vorrichtung nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gas aus den Reaktoren (z.B. Erlenmeyer-Kolben) mit Hilfe einer durch den üblicher Weise als Sterilbarriere dienenden Wattestopfen gestochenen Hohlnadel (Kanüle) abgesaugt und den Sensoren zugeführt wird (4).
Vorrichtung nach Anspruch 1, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gas aus den Reaktoren über Hohlnadeln (Kanülen) in den Wattestopfen in einem geschlossenen Messkreislauf an den Sensoren vorbei gefördert wird (5).
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Reaktoren ohne Wattestopfen mit Ein- und Auslassstutzen verwendet werden und das Abgas über einen Ventilblock oder Multiwegeventile an den Sensoren vorbeigeführt und an die Umgebung abgeblasen wird (6).
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 4 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass durch zyklisches Umschalten der Sensoren auf einen Kalibrierungszweig (dieser Zweig ist identisch mit der Gasversorgung der Reaktoren, enthält aber keinen Reaktor) die Sensoren vor jeder Messung mit dem Versorgungsgasgemisch oder Referenzgasen kalibriert werden (6).
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sterilisierbare Sensoren z.B. auf keramischer Basis (Festelektrolyt) direkt in den Gasraum des Reaktors eingebaut werden.
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche Sensoren zur Erfassung von Messgrößen in der Flüssigphase in der natürlichen Rührtrombe oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche so platziert werden, dass sie die Hydrodynamik im Normalbetrieb nicht stören. Um den Messvorgang einzuleiten, wird der Rührer oder der Schüttler kurz angehalten, wodurch die Rührtrombe verschwindet und Sensoren von der Kulturflüssigkeit benetzt werden. Durch eine Vertiefung im Zentrum des Reaktorbodens kann ggf. die Eintauchtiefe des Sensors erhöht werden (7).
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass durch photometrische Messung bei mindestens zwei Wellenlängen und einer Software zur Farberkennung durch die Glaswand hindurch der charakteristische Farbumschlag einer im Medium vorhandenen Indikatorsubstanz z.B. von Phenolrot, zur Messung verschiedener Messgrößen im Kulturmedium, z.B. des pH-Wertes genutzt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass aus einem Vorlagegefäß, das sich auf einer Präzisionswaage befindet, das Medium durch eine Pumpe, Druckbeaufschlagung oder hydrostatischen Druck gefördert und mit Ventilen (z.B. Schlauchquetschventilen) im Zeitmultiplex auf die einzelnen Reaktoren verteilt wird. Das ganze, aus Vorlage(n), Schläuchen etc. bestehende Besteck kann zusammenhängend sterilisiert werden. Die Gewichtsabnahme auf der Waage wird per Softwareprogramm für jeden einzelnen Reaktor bilanziert und die Pumpe (oder der Vordruck oder die Behälterhöhe) und die Ventile so angesteuert, dass sich die für jeden Reaktor individuell vorgegebene Dosierrate einstellt (8). Alternativ zur Waage kann ein Durchflusssensor verwendet werden. Alternativ kann das Dosiersystem ohne Waage und Durchflusssensor nur mit einer präzise fördernden Pumpe betrieben werden (9). Das Vorratsgefäß kann entweder zusammenhängend mit dem sterilisierbaren Modul sterilisiert werden oder alternativ können unsterile Medien über ein Sterilfilter zugeführt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass jedem Reaktor ein Vorlagegefäß mit einer sterilisierbaren Pumpe (z.B. Mikro-Piezo-Pumpe) zugeordnet ist ( 10). Pumpe und Vorlage gehören zum sterilisierbaren Modul.
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass jedem Reaktor ein Spritzendosierer, bestehend aus handelsüblicher Einmalspritze und einem Antrieb, zugeordnet ist (11). Durch die Verwendung handelsüblicher, steriler Einmalspritzen kann die Dosiermedienpräparation unabhängig vom Reaktorsystem erfolgen. Die Genauigkeit ist sehr hoch und der Dosierratenbereich und die Gesamtdosiermenge kann sehr einfach durch die Wahl der Einmalspritzen bestimmt werden. Die Handhabung ist sehr einfach, da kein Einlegen der Schläuche in Ventile und Pumpen erforderlich ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 4, 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das zugeführte Gas in einer z.B. als Dewar-Gefäß ausgeführten, mit Wasser gefüllten Waschflasche, über die Wassertemperatur präzise auf eine vorgegebene Gasfeuchtigkeit eingestellt wird (12). Der Regelkreis kann den Istwert vom Wasserdampfpartialdrucksensor der Messschleife während der Kalibrierungsphase beziehen.