DE10101962A1 - DNA-Sequenz mit regulatorischen Bereichen zur Expression von Proteinen - Google Patents
DNA-Sequenz mit regulatorischen Bereichen zur Expression von ProteinenInfo
- Publication number
- DE10101962A1 DE10101962A1 DE10101962A DE10101962A DE10101962A1 DE 10101962 A1 DE10101962 A1 DE 10101962A1 DE 10101962 A DE10101962 A DE 10101962A DE 10101962 A DE10101962 A DE 10101962A DE 10101962 A1 DE10101962 A1 DE 10101962A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- expression
- sequence
- promoter
- protein
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Es werden eine DNA-Sequenz, die das Triosephosphatisomerasegen einschließlich seiner regulatorischen Sequenzen umfaßt, eine DNA-Sequenz, die als Promotor aktiv ist, diese Sequenz enthaltende Expressions- und Sekretions-Systeme und deren Verwendung und Verfahren zur Herstellung von Proteinen beschrieben.
Description
Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die das Triosephosphatisomerasegen ein
schließlich seiner regulatorischen Sequenzen umfaßt, eine DNA-Sequenz, die als Pro
motor aktiv ist, diese Sequenz enthaltende Expressions- und Sekretions-Systeme, mit
dieser DNA transformierte Wirtszellen, die Verwendung der Sequenzen für in Hefe
zellen aktive Expression- und Sekretionssysteme sowie Verfahren zur Herstellung von
Polypeptiden und RNA mit Hilfe solcher Systeme.
Zur gentechnischen Herstellung von Proteinen stehen verschiedene Systeme zur Ver
fügung, z. B. rekombinante Mikroorganismen, die Expressionsplasmide tragen, bei
denen unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen die Expression von Fremd
genen gesteuert wird. Häufig werden Bakteriensysteme verwendet, da sie leicht zu
vermehren sind. Sie haben aber den Nachteil, dass sie pyrogene Substanzen erzeu
gen, die bei der Gewinnung von Medikamenten oder Impfstoffen vor der Verwendung
entfernt werden müssen. Außerdem können in Bakterien keine glykosylierten Poly
peptide hergestellt werden. Es wurden daher auch eine Reihe anderer Systeme für die
Expression von Polypeptiden oder Proteinen in eukaryontischen Zellen entwickelt.
Außer Zellkulturen werden hierfür Hefen inbetracht gezogen, insbesondere die weit
verbreitete Hefe Saccharomyces cerevisiae, deren Genom inzwischen bekannt ist und
für die einige Vektoren und Expressionssysteme erhältlich sind.
Eine weitere Hefe-Gattung, die aufgrund günstiger Eigenschaften für bio
technologische Verfahren inbetracht gezogen wird, ist Kluyveromyces. Die Arten
K. lactis und K. marxianus werden als GRAS (Generally Recognized As Save) einge
stuft und können daher mit derselben Sicherheit wie Saccharomyces verwendet wer
den. Darüberhinaus kann K. marxianus eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen und Ener
giequellen für das Wachstum nutzen und ist nicht sehr temperaturempfindlich.
Kluyveromyces marxianus kann bei Temperaturen bis zu 45°C wachsen und bietet
daher in dieser Hinsicht gegenüber den temperaturempfindlicheren Saccharomyces-
Stämmen Vorteile bei der Züchtung. Die Zellen von schnell wachsenden K. marxianus-
Stämmen können sich bei optimalen Bedingungen alle 35 Minuten teilen. Allerdings
konnten diese guten Eigenschaften bisher nicht optimal ausgenutzt werden, da für
diese Hefeart kaum Expressionssysteme zur Verfügung stehen, mit denen Proteine in
guter Effektivität hergestellt werden können, und es an klonierten und zuverlässigen,
getesteten, expressionsstarken Promotoren mangelt.
Bei der Herstellung von Proteinen und Polypeptiden auf gentechnischem Weg ist es
darüberhinaus wünschenswert, dass die entstehenden Produkte nicht in der Zelle ver
bleiben, sondern in das umgebende Medium ausgeschieden werden, da sie sich dann
leichter gewinnen lassen.
Aufgabe der Erfindung war es daher, Promotoren mit verbesserter Effektivität bereit
zustellen, die die Expression von Proteinen und Peptiden in Hefezellen steuern kön
nen. Eine weitere Aufgabe war es, Vektoren zur Verfügung zu stellen, mit denen Po
lypeptide und Proteine exprimiert und die exprimierten Produkte aus der Zelle ausge
schleust werden können.
Diese Aufgaben werden mit den erfindungsgemäß bereitgestellten DNA-Sequenzen,
Expressionskassetten und -vektoren, Plasmiden und Verfahren, die in den Ansprüchen
definiert sind, gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstellung einer neuen DNA-Sequenz, neu
er regulatorischer Elemente, eines Verfahrens zum Ausschleusen von Proteinen aus
der Zelle sowie die Bereitstellung geeigneter Expressionskassetten, Plasmide und Mi
kroorganismen.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr.
1 zur Verfügung gestellt:
Die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 ist eine Nucleinsäuresequenz, die die regulato
rischen Regionen und den offenen Leserahmen für das Enzym Triosephosphatisomerase
codiert. Im Bereich der Nucleotide 1 bis 1112 finden sich als Promotor aktive
regulatorische Regionen dieses Gens.
Das Enzym Triosephosphatisomerase (im Folgenden auch als TPI bezeichnet) ist ein
glycolytisches Enzym, das an dem Abbau von Glucose und Fructose, der zur Energie
gewinnung in Zellen stattfindet, beteiligt und daher weit verbreitet ist. Die Triose
phosphatisomerase dient dazu, das bei der Spaltung von Fructose-1,6-biphosphat
neben dem Glycerinaldehyd-3-phosphat entstehende Dihydroxyacetonphosphat eben
falls zu Glycerinaldehyd-3-phosphat zu isomerisieren, das dann schließlich über meh
rere Stufen unter Energiegewinnung in Pyruvat umgewandelt wird. Das Enzym ist
auch am Metabolismus komplexer Lipide beteiligt. Es ist ein Homodimer, dessen Un
tereinheiten aus etwa 250 Aminosäuren bestehen.
Die Aminosäure- und Nucleotidsequenz des Enzyms Triosephosphatisomerase (EC
5.3.1.1) aus der Hefeart Kluyveromyces marxianus var. marxianus wurde von den
Erfindern aufgeklärt und letztere ist in SEQ ID Nr. 1 angegeben. Sequenzen des En
zyms TPI in anderen Organismen sind bekannt; die Sequenz für TPI in S. cerevisiae
wurde aufgeklärt und mit der Nummer YDR050CCDS bezeichnet. Bei einem Sequenz
vergleich wurde gefunden, dass die Übereinstimmung der TPI codierenden DNA-
Sequenzen in verschiedenen Mikroorganismen im Hinblick auf den offenen Leserah
men hoch ist, im Hinblick auf die regulatorischen Sequenzen jedoch gering.
Bei der Untersuchung der Expression dieses Enzyms in dem speziellen Organismus K.
marxianus wurde gefunden, dass der die Expression von TPI steuernde Promotor ein
sehr starker Promotor ist und sowohl in funktioneller Verbindung mit Fremdproteinen
als auch in Zellen von anderen Hefearten und -stämmen effizient ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Bereitstellung eines neuen Promo
tors, der die Nucleotide 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 oder Teile davon, die als Promo
tor aktiv sind, aufweist. Der erfindungsgemäße Promotor kann in an sich bekannter
Weise in funktioneller Verbindung mit Fremdgenen eingesetzt werden.
Eine DNA-Sequenz mit den Nucleotiden 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 wird im folgen
den auch als Promotor-Sequenz bezeichnet.
Erfindungsgemäß wird ein Promoter zur Verfügung gestellt, der in Hefen aktiv ist und
ein Expressionssystem liefert, das sehr variabel ist. Es ist unter anderem für
Kluyveromyces und andere Hefearten geeignet und kann z. B. für Hefearten wie Sac
charomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis eingesetzt werden. Versuche, die im
experimentellen Teil beschrieben werden, haben gezeigt, dass unter der Kontrolle des
erfindungsgemäßen Promotors eine hocheffektive Expression von Fremdprotein er
folgt.
Der neue erfindungsgemäß bereitgestellte konstitutive Promotor ist für die Expression
von rekombinanten Proteinen in Hefezellen geeignet. Unter Promotor wird hier eine
DNA-Sequenz verstanden, von der aus die Transkription eines Genes gesteuert wird.
Die Bezeichnung "als Promotor aktiver Teil" bedeutet eine Teilsequenz des Promotors,
die in Verbindung mit einem offenen Leserahmen zur Expression des von dem Le
serahmen codierten Polypeptids führt.
Es wurde festgestellt, dass der Promotor, der in K. marxianus die Expression von TPI
reguliert, im Folgenden auch als KmTPI-Promotor bezeichnet, sieben mögliche Tran
skriptionsstartstellen aufweist. Diese sind in der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 als Tran
skriptionsstart #1 bis #7 bezeichnet. Es wurde auch gefunden, dass zur Expression
verschiedene Mikroorganismen verschiedene Sequenzmotive als Transkriptionsstart
punkt nutzen. Die Leistung des Promotors hängt unter anderem davon ab, welche der
Transkriptionsstartpunkte bei der Expression verfügbar sind und daher läßt sich die
Stärke des Promotors durch Auswahl der Sequenzteilstücke jeweils maßgenau für den
Mikroorganismus, in dem die Expression erfolgen soll, einstellen.
Zum Beispiel wirkt der KmTPI-Promotor in Kluyveromyces marxianus so stark, dass
schon ein Teilbereich der Promotor-DNA mit nur einer Transkriptionsstartstelle zur
Expression eines Polypeptides führt. In anderen Kluyveromyces-Arten, wie z. B. K.
lactis, ist es vorteilhaft, wenn mindestens drei, bevorzugter mindestens fünf Tran
skriptionsstartpunkte in der Sequenz enthalten sind. Daher wird für die Expression in
Kluyveromyces-Arten, wie K. lactis bevorzugt als Promotor eine Sequenz verwendet,
die mindestens fünf Transkriptionsstartstellen umfasst, z. B. eine Sequenz mindestens
mit den Nukleotiden 352 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1.
Der erfindungsgemäß bereitgestellte KmTPI-Promotor ist auch in Saccharomyces
funktionell. Um eine zufriedenstellende Expression zu erreichen, wird allerdings emp
fohlen, in Organismen dieser Gattung den KmTPI-Maximalpromotor mit den Nucleoti
den 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 zu verwenden.
Die beschriebenen Nucleinsäuresequenzen mit Promotor-Aktivität schließen solche
Sequenzen ein, die durch Modifikation, Substitution, Deletion oder Insertion oder
Kombinationen hiervon entstanden sind. Hierzu kann auch die Promotor-Sequenz mit
weiteren regulatorischen Upstream-Sequenzen mit Enhancer-, Aktivator- und/oder
Repressorfunktionen versehen sein. Als Sequenz mit Promotor-Aktivität werden sol
che Sequenzen angesehen, die einen Teil der beanspruchten Sequenz oder ein Derivat
davon umfassen, das noch als Promotor für die Expression von Proteinen wirkt
Erfindungsgemäß werden weiterhin auch solche Sequenzen inbetracht gezogen, die
mit der beanspruchten Nucleotidsequenz bzw. den beanspruchten Teilen davon, z. B.
der Promotorsequenz, eine Homologie von mindestens 70%, bevorzugter mindestens
90% und insbesondere mindestens 95% aufweisen, solange die jeweiligen Sequen
zen auch eine vergleichbare biologische Funktion haben. Für die Zwecke der vorlie
genden Erfindung wird die Homologie dabei in üblicher Weise unter Verwendung der
üblichen Algorithmen bestimmt. Teil der Erfindung sind auch solche Sequenzen, die
unter stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren.
Erfindungsgemäß werden darüberhinaus auch solche Nucleinsäuren inbetracht gezo
gen, die zu TPI homologe Polypeptide codieren, insbesondere solche mit mindestens
80% Homologie. Der Ausdruck "homologes Polypeptid" umfasst in der vorliegenden
Beschreibung ein Polypeptid, das im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und
im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität aufweist, wie das beanspruchte Po
lypeptid. Ein Homolog kann sich von dem Ausgangspolypeptid dadurch unterschei
den, dass es mehr, weniger oder andere Aminosäuren aufweist, wobei die Funktion
aber erhalten bleibt. Der Fachmann kennt Verfahren, um entsprechend modifizierte
Polypeptide zu erzeugen.
Die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Promotors erfolgt in an sich bekannter
Weise, indem entweder die natürlich vorkommende Sequenz isoliert wird, was bevor
zugt ist, oder die Sequenz gentechnisch hergestellt oder chemisch synthetisiert wird.
Verfahren zur Gewinnung oder Synthese sind dem Fachmann bekannt und bedürfen
hier keiner näheren Erläuterung. Wesentlich ist nur, dass der Promotor der Triose
phosphatisomerase aus K. marxianus, mit den Nucleotiden bis einschließlich 1112
von SEQ ID Nr. 1, oder ein aktiver Teil davon verwendet wird.
Um die Verwendung des erfindungsgemäßen Promotors zu erleichtern, wird weiterhin
ein Expressionssystem bzw. eine Expressionskassette zur Verfügung gestellt, die die
Promotor-Sequenz, wie oben definiert, oder einen als Promotor aktiven Teil davon,
einen Terminator und gegebenenfalls weitere regulatorische Sequenzen, wie Enhan
cer, und einen Insertionsklonierungsort aufweist. In den Insertionsklonierungsort kann
das gewünschte zu exprimierende Gen oder die DNA für ein zu exprimierendes
Fremdprotein eingesetzt werden, die unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Pro
motors transkribiert werden kann.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt in ihrer einfachsten Form eine
Promotorsequenz oder einen als Promotor aktiven Teil davon, einen Insertionsklonie
rungsort, in den das Polynucleotid für das zu exprimierende Protein einkloniert werden
kann, und eine als Terminator wirksame Nucleotidsequenz. Als Insertionsklonierungs
ort geeignete Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner nähe
ren Erläuterung. Als Terminator kann z. B. die bei der Expression von TPI als Termina
tor wirkende Sequenz verwendet werden. Letzere umfasst die Nucleotide 1860 bis
2163 von SEQ ID Nr. 1 oder als Terminator aktive Teile davon. Gute Ergebnisse wur
den auch erzielt bei Verwendung der Terminatorregion des Endopolygalacturonase
gens aus Kluyveromyces marxianus.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann vielfältig verwendet werden. Der
Insertionsklonierungsort ist eine Schnittstelle, an der die Sequenz aufgeschnitten
werden kann und das Polynucleotid für das gewünschte Protein oder Peptid einligiert
werden kann. In dieser einfachsten Form wird bei der Expression das Protein intrazel
lulär produziert und nicht aus der Zelle ausgeschleust. Es kann dann nach Aufschluß
der Zelle in an sich bekannter Weise gewonnen werden. Diese Ausführungsform eig
net sich sowohl für kleine Peptide und Proteine, die außerhalb der Zelle instabil sind
als auch für Proteine, die generell intrazellulär lokalisiert sind.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können zur Expression von DNA-
Sequenzen in Zellen, insbesondere Hefezellen, verwendet werden. Besonders geeig
net sind die erfindungsgemäßen Expressionskassetten zur Expression in Hefezellen
der Gattungen Saccharomyces und Kluyveromyces, z. B. S. cerevisieae, K. lactis, K.
marxianus und andere.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette eignet sich sowohl zum Einbau in sich
autonom replizierende Plasmide als auch zum Einbau in Hefechromosomen über inte
grative Vektoren.
Es ist jedoch bevorzugt, eine Expressionskassette, in die das gewünschte Polynucleo
tid zur Expression eines Peptids oder Proteins einligiert wurde, in einem E.coli-Plasmid
zu amplifizieren und dann die E.coli-Plasmide zu gewinnen, die Expressionskassette
mit geeigneten Restriktionsendonucleasen, für die Schnittstellen an den Rändern der
Expressionskassette vorgesehen sind, auszuschneiden und die Expressionskassette in
einen Hefevektor einzuligieren. Die Vektoren enthalten üblicherweise Selek
tionsmarker, um erfolgreich transformierte Zellen in an sich bekannter Weise selek
tieren zu können.
Die Plasmide können gegebenenfalls in E.coli vermehrt und dann in Kluyveromyces
marxianus oder einen anderen Kluyveromyces-Stamm oder auch einen anderen He
festamm eingesetzt werden. Als Transformationssystem können beispielsweise be
kannte Plasmide auf Basis des Kluyveromyces drosophilarum-Plasmides pKD1 ver
wendet werden. Abkömmlinge dieses Plasmids eignen sich zur Verwendung in
Kluyveromyces marxianus und führen bei Verwendung des erfindungsgemäßen Ex
pressionssystems zu einer effektiven Expression von Fremdproteinen im entsprechen
den Wirt.
In einer anderen Ausführungsform kann aus den erfindungsgemäßen, wie oben vorbe
reiteten Plasmiden die Expressionskassette einschließlich des zu exprimierenden Po
lynucleotids herausgeschnitten und als lineare oder zirkularisierte DNA als Integrati
onskassette direkt mit Hefezellen in Kontakt gebracht werden, um von diesen aufge
nommen zu werden. Ein stabiler Einbau in die Wirtszelle kann dann über homologe
Rekombination erfolgen, sofern ein Teil der Nucleinsäuren für die Wirtszelle homolog
ist. Aufgrund einer Homologie von Teilen der Expressionskassette, z. B. des TPI-Gens
oder der regulatorischen Sequenzen davon, mit dem Genom der Hefe wird dann in
einem Teil der behandelten Zellen die DNA in die entsprechenden Chromosomen
durch Austausch mit den entsprechenden Sequenzen aufgenommen.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette wird stabil in Chromosomen eingebaut
und führt, wenn die Zellen unter optimalen Bedingungen gezüchtet werden, zu einer
guten Ausbeute des gewünschten Proteins. Abhängig von der Art des zu expri
mierenden Proteins oder Peptids kann die Kopienzahl des Systems eingestellt werden.
Falls eine höhere Kopienzahl erwünscht ist, werden in an sich bekannter Weise an die
Enden der Expressionskassette Sequenzen eines in größerer Kopienzahl in dem Chro
mosomensatz vorliegenden Gens, z. B. für rDNA, anligiert, um eine höhere Anzahl an
Austauschereignissen zu bewirken.
In an sich bekannter Weise kann zusätzlich noch ein Markergen in die Sequenz mit
eingebaut werden, damit die erfolgreich transformierten Zellen selektiert werden können.
Verfahren und hierzu geeignete Marker sind dem Fachmann bekannt und bedür
fen hier keiner näheren Erläuterung.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem ist geeignet zur Expression verschiedener
heterologer und homologer Proteine. Vorteilhaft ist die Expression homologer Proteine
dann, wenn die Expression eines in dem verwendeten Organismus vorhandenen Pro
teins verstärkt werden soll, da der erfindungsgemäße Promotor die Menge an produ
ziertem Protein stark verbessern kann. Bevorzugt wird das System verwendet zur
Expression von Hormonen, z. B. Wachstumshormonen und Wachstumsfaktoren, im
munmodulierenden Faktoren, z. B. Interferonen und Interleukinen, Enzymen, z. B.
Endopolygalacturonase, Reportergenen, z. B. EGFP, oder Antigenen, z. B. Oberflächen
antigenen von Viren, unter anderem S-Antigene von Hepatitis-B-Virus oder Virus
protein 1 aus Polyoma-Virus. Letztere Proteine können besonders vorteilhaft als Impf
stoffe eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette ist unter anderem für Hefen der Stämme
Kluyveromyces und Saccharomyces geeignet und wird bevorzugt in Hefestämmen der
Art Kluyveromyces marxianus var, marxianus verwendet.
TPI ist ein intrazellulär wirkendes Enzym und katalysiert Stoffwechselvorgänge, die
normalerweise innerhalb der Zelle ablaufen. TPI wird daher üblicherweise nicht in dem
die Zelle umgebenden Medium erwartet und auch nicht gefunden. Wie nicht anders
bei einem Enzym mit intrazellulärer Wirkung zu erwarten, wurde daher auch keine
Signalsequenz gefunden.
Überraschenderweise wurde nun bei einem speziellen Mikroorganismus, nämlich
Kluyveromyces marxianus, TPI im Zellüberstand nachgewiesen. Daraufhin wurde im
offenen Leserahmen, der TPI codiert, nach Signalsequenzen gesucht, es konnten aber
keine typischen Sequenzen gefunden werden. Die Ausschleusung dieses Enzyms, das
im folgenden auch als KmTPI bezeichnet wird, scheint daher auf anderen, Golgiunabhängigen
Mechanismen zu beruhen. Die Eigenschaft des Enzyms KmTPI, die
Zelle zu verlassen, macht sich die vorliegende Erfindung zunutze.
Natürlicherweise werden Peptide und Proteine dann aus der Zelle ausgeschleust,
wenn sie über eine Signalsequenz verfügen. Diese Signalsequenz erzeugt bei der
Translation einen Abschnitt, der für den Membranenkontakt und den Durchtritt des
auszuschleusenden Proteins sorgt. Dieser Mechanismus liegt bei KmTPI aber offen
sichtlich nicht vor, sondern die spezielle Triosephosphatisomerase aus K. marxianus
weist Eigenschaften auf, die ein Durchdringen der Zellmembranen ermöglichen. Dar
überhinaus wurde festgestellt, dass auch ein durch Fusion angehängtes Peptid oder
Protein zusammen mit der Triosephosphatisomerase aus der Zelle ausgebracht wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass einerseits KmTPI
nicht nur in K. marxianus nach der Expression aus der Zelle ausgeschleust wird, son
dern dass es nach Transformation von anderen Hefestämmen mit autonom replizie
renden Plasmiden, die das KmTPI-Gen exprimieren können, zu einer Überexpression
und Ausschüttung von TPI in das Kulturmedium kommt, und dass es andererseits
möglich ist, durch Bildung von Fusionsproteinen mit TPI, Fremdproteine nach der
Transkription und Translation als Fusionsproteine in das umgebende Zellmedium aus
zuschleusen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Ausschleusen ei
nes Fremdproteins in Form eines Fusionsproduktes mit Triosephosphatisomerase, bei
dem man eine Sequenz, die mindestens regulatorische Sequenzen und eine Fusions-
DNA, die für Triosephosphatisomerase und das gewünschte Peptid oder Protein co
diert, zur Expression bringt, das gebildete Fusionsprotein isoliert und das Fremdpro
tein abtrennt.
Auf diese Weise ist es möglich, ein Fusionsprodukt im Zellüberstand zu erhalten. Das
Fusionsprodukt kann sowohl ein Hybridmolekül sein, d. h. aus einem homologen und
einem heterologen Anteil bestehen, als auch ein Fusionsprotein sein, das aus zwei,
oder gegebenenfalls mehr, heterologen Teilen besteht. Bei dem Fusionsprotein kann
der TPI-Teil an dem Fremdprotein sowohl N-terminal als auch C-terminal vorhanden
sein. Für die Ausschleusung aus der Zelle ist der TPI-Teil am N-terminalen Ende des
Fremdproteins bevorzugt. Das Fusionsprodukt kann anschließend in an sich bekannter
Weise getrennt werden.
Um die Trennung des Fusionsproduktes zu erleichtern, wird bevorzugt zwischen die
beiden die Proteine codierenden DNA-Sequenzen noch eine DNA-Sequenz, die einen
Abstandshalter codiert, in an sich bekannter Weise eingefügt. Der Abstandshalter
zwischen beiden Molekülteilen sollte groß genug sein, um ein leichtes Auftrennen zu
ermöglichen und stellt in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Schnitt
stelle für Enzyme bereit.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass durch Ankopplung an Triosephos
phatisomerase sogar hydrophobe Peptide oder Proteine aus Zellen ausgeschleust
werden, die bei Verwendung üblicher Signalsequenzen nicht oder nur in geringem
Maße im Überstand zu finden sind. Dies wurde gezeigt für das Oberflächenantigen
von Hepatitis B, (Hbs), das mit den üblichen Verfahren nicht aus der Zelle ausge
bracht werden kann.
Das Ausschleusen von Proteinen über die Fusion mit TPI ist daher besonders geeignet
für solche Proteine, die aufgrund ihrer Hydrophobizität oder fehlender Signalpeptide
normalerweise nicht aus der Zelle ausgeschleust werden.
Im experimentellen Teil werden Expressionsversuche gezeigt, die bei Verwendung
dieser erfindungsgemäßen Kombinationen zu hohen Ausbeuten führen.
Wenn es erwünscht ist, ein Polypeptid oder Protein nach der Expression aus der Zelle
auszuschleusen, wird dies daher bewirkt, indem ein Fusionsprodukt aus KmTPI und
dem gewünschten Fremdprotein erzeugt wird. Dazu kann in den Insertionsklonie
rungsort der oben beschriebenen Expressionskassette z. B. ein ein Fusionsprotein codierendes
Polynucleotid mit N-terminaler oder C-terminaler TPI, einligiert werden. Be
vorzugt wird zwischen den Sequenzen für die beiden Proteine noch eine einen Linker
codierende DNA-Sequenz vorgesehen, um später die Spaltung des Fusionsproduktes
zu erleichtern. Das Fremdprotein wird dann nach der Expression aufgrund der "Aus
schleusungsfähigkeit" von KmTPI zusammen mit diesem als Fusionsprodukt aus der
Zelle ausgetragen und kann dann nach Abtrennung aus dem Zellmedium und durch
Abspaltung von KmTPI in eleganter Weise gewonnen werden.
Natürlich kann zum Ausschleusen eines exprimierten Proteins auch eine an sich be
kannte Signalsequenz eingesetzt werden. Diese wird zwischen den Promotor und das
zu exprimierende Fremdgen in an sich bekannter Weise einligiert. Bevorzugt wird als
Signalsequenz eine solche, die für den verwendeten Organismus homolog ist, ver
wendet. Besonders gute Ergebnisse wurden erzielt mit einer Kombination aus dem
Promotor der Triosephosphatisomerase, bzw. einem als Promotor wirksamen Teil da
von, und der Signalsequenz des Endopolygalacturonase-Gens aus Kluyveromyces
marxianus.
Eine weitere Verbesserung der Expression und Sekretion wird erhalten, wenn die aus
schleusende Wirkung von TPI durch die Bereitstellung einer Signalsequenz verstärkt
wird. Erfindungsgemäß kann daher auch die oben beschriebene Ausführungsform, in
der eine DNA-Sequenz, die ein Fusionsprodukt aus KmTPI mit dem gewünschten
Fremdprotein codiert, in Kombination mit einer bekannten Signalsequenz, wie im vor
hergehenden Abschnitt beschrieben, verwendet werden. Auch diese Kombination ist
Teil der vorliegenden Erfindung.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Expressions- und
Sekretionssystem bereitgestellt, das in operativer Verbindung die oben definierte
Promotorsequenz oder einen als Promotor aktiven Teil davon, eine als Terminator ak
tive Sequenz, und, zwischen diesen beiden Sequenzen eine Signalsequenz aufweist.
Bevorzugt wird als Signalsequenz eine bekannte Sequenz eingesetzt. Dabei handelt es
sich um die Signalsequenz des Enzyms Endopolygalacturonase (EPG) aus K. marxianus.
Bevorzugt wird daher die Signalsequenz des Enzyms EPG aus K. marxianus ver
wendet.
Bei beiden eben erwähnten Ausführungsformen erfolgt die Züchtung in an sich be
kannter Weise, wobei entweder in einem kontinuierlichen Verfahren das Protein stän
dig ins Medium abgegeben wird und aus der Fermentationsbrühe kontinuierlich ge
wonnen werden kann oder in einem diskontinuierlichen Verfahren die Zellen gezüch
tet, geerntet und dann das Protein aus der Brühe gewonnen werden kann.
Das erfindungsgemäße System ist sehr variabel. So kann z. B. nur die oben definierte
erfindungsgemäße Promotor-Sequenz oder ein als Promotor aktiver Teil davon zu
sammen mit anderen Nucleinsäuresequenzen, die weitere regulatorische Sequenzen
bereitstellen, und mit einer heterologen Nucleotidsequenz kombiniert werden. Es kann
die erfindungsgemäß definierte Promotor-Sequenz oder ein als Promotor aktiver Teil
davon mit einer Terminator-Sequenz, zum Beispiel der oben definierten, kombiniert
werden, um ein für Kluyveromyces marxianus homologes System bereitzustellen, in
das das Polynucleotid für das zu exprimierende Protein eingesetzt wird, oder aber es
kann ein System aus dem erfindungsgemäßen Promotor, einer Signalsequenz und
einem Terminator zusammen mit einem zu exprimierenden Gen, das ein gewünschtes
Protein codiert, kombiniert werden, um ein in die Kultur abzugebendes Protein zu er
zeugen. Schließlich kann die erfindungsgemäße Promotorsequenz oder ein als Promo
tor aktiver Teil davon mit einer Terminator-Sequenz und einer Nucleinsäure aus Km
TPI und dem gewünschten Fremdgen kombiniert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Plasmide, die erfindungsgemäße Expres
sionssysteme enthalten, insbesondere Plasmide, die den Promotor, das TPI-Gen und
den Terminator von TPI aus K. marxianus enthalten. Beispiele sind die in den Fig.
1 bis 4 näher erläuterten Plasmide R64, R53, R48 und R11. Diese Plasmide sind re
kombinante Plasmide und können in der vorliegenden Form zur Amplifikation der Ex
pressionskassetten und zur Erzeugung der von der einligierten DNA codierten Proteine
in Hefen verwendet werden.
Das Plasmid pD1, das die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 enthält, wurde in E.coli DH5α
als Wirtszelle bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSMZ) mit der
Hinterlegungsnr. DSM 13973 hinterlegt.
Da Kluyveromyces marxianus-Zellen mit vielen verschiedenen C-Quellen wachsen
können und bezüglich weiterer Nährstoffe nicht sehr anspruchsvoll sind, darüber hin
aus temperaturunempfindlich sind, wird hier ein sehr effektives System bereitgestellt.
Die zuverlässige Expression der Fremdproteine wird durch die erfindungsgemäß be
reitgestellte regulatorische Sequenz der Erfindung erreicht.
Erfindungsgemäß wird ein System bereitgestellt, das es zuläßt, die aufgrund ihrer
außergewöhnlichen physiologischen Leistungen als Wirt vielversprechende Hefeart
Kluyveromyces marxianus zu nutzen.
Das erfindungsgemäße System eignet sich zur Expression von RNA, Peptiden, Poly
peptiden, Proteinen und Hybridmolekülen einschließlich glycosylierter Proteine.
Im folgenden werden einige Definitionen für Begriffe angegeben, die in der Beschrei
bung verwendet werden.
Als "Expressionsvektor" wird ein DNA-Molekül bezeichnet, das linear oder ringförmig
sein kann und ein Segment enthält, das eine Sequenz für ein interessierendes Protein
oder Peptid codiert, das operativ verbunden ist mit regulatorischen Sequenzen. Diese
regulatorischen Sequenzen schließen mindestens Promotor- und Terminatorsequenzen
ein. Der Expressionsvektor kann zusätzlich selektierbare Marker und weitere regulato
rische Elemente enthalten und muß die Übertragung und Vermehrung in Wirtszellen
ermöglichen. Die Replikation der Expressionsvektoren kann autonom oder durch Inte
gration in das Wirtsgenom erfolgen.
Der Ausdruck "DNA" oder "Polynucleotid" schließt polymere Formen von Desoxyri
bonucleotiden beliebiger Länge und beliebiger Modifikation in einzel- und doppel
strängiger Form ein.
"Sekretionsvektor" bezeichnet in dieser Beschreibung einen Expressionsvektor der
zusätzlich zur Expression eines Polypeptids auch die Ausschleusung des Polypeptids
in Form eines Fusionsproteins bzw. durch die Signalsequenz bewirkt.
Der Ausdruck "operativ verbunden" bedeutet, dass die einzelnen Segmente so ange
ordnet sind, dass sie dem vorgesehenen Zweck dienen, d. h. die Transkription initiie
ren und terminieren können und die Expression fördern können bzw. die Expression
und Sekretion ermöglichen.
Die beanspruchten Sequenzen können weitere kurze Sequenzen aufweisen, die die
biologische Aktivität des Moleküls nicht stören. Weiterhin umfassen die beanspruch
ten Sequenzen auch allelische Varianten der Sequenz, d. h. alternative Formen des
Gens, die durch Mutation entstanden sind.
Der Begriff "Protein oder Peptid" bezieht sich auf eine molekulare Kette von Ami
nosäuren mit biologischer Aktivität. Der Ausdruck Polypeptid bezeichnet üblicherwei
se Aminosäuresequenzen mit bis zu 200 Aminosäuren, während längere Ketten in der
Regel als Proteine bezeichnet werden. In der vorliegenden Beschreibung soll der Aus
druck Polypeptid auch Proteine umfassen bzw. umgekehrt der Ausdruck Proteine
auch Polypeptide mitumfassen. Die Proteine und/oder Polypeptide können in vivo oder
in vitro modifiziert werden, z. B. durch Glycosylierung und Phosphorylierung.
Als unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors zu exprimierendes Gen
wird jede DNA verstanden, deren Expression gewünscht wird. "Fremd-DNA" ist dabei
jede DNA, die normalerweise nicht unter der Kontrolle des TPI-Promotors exprimiert
wird. Fremd-DNA kann Gene, Teile von Genen, fusionierte Gene, cDNA oder andere
DNA-Sequenzen umfassen, sowie DNA, die Polypeptide oder Proteine oder auch RNA
oder anti-sense-RNA codiert. Fremd-DNA kann auch ein Reportergen sein. Die Fremd-
DNA kann eine natürlich vorkommende, gentechnisch hergestellte oder chemisch syn
thetisierte Sequenz oder eine Kombination davon sein. Die verwendete Nucleotidse
quenz und das Verfahren ihrer Herstellung sind nicht kritisch.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines rekom
binanten Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Hefezelle mit einem
sich autonom replizierenden Plasmid transformiert, das eine erfindungsgemäße Ex
pressionskassette und ein Polynucleotid, das ein Fremdprotein kodiert, umfaßt, die
Hefezelle unter Bedingungen, die zur Expression des Fremdproteins geeignet sind,
züchtet und das Protein gewinnt.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine erfindungsgemäße Expressi
onskassette in eine Hefezelle bringt, wo die Expressionskassette in das Genom der
Wirtszelle eingebaut wird, die Zelle züchtet und anschließend das Protein gewinnt.
Besonders bevorzugt wird die erfindungsgemäße Expressionskassette als Modul ein
gesetzt das die Konstruktion von episomalen oder integrativen Expressionsvektoren,
die die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen und ggf. Signalsequenzen ent
halten, ermöglicht.
Wie in den Figuren und den Beispielen gezeigt, führt die Verwendung des erfindungs
gemäßen Promotors in Kombination mit einer Sequenz für ein gewünschtes Protein
und mit einem Terminator zur Expression des gewünschten Proteins, insbesondere in
Hefezellen. Um zu prüfen, wie stark der erfindungsgemäß bereitgestellte Promotor ist,
wurde die Expression des Gens EGFP (enhanced green fluorescent protein) unter Kon
trolle des CMV-(Cytomegalie-Virus)-Promotors mit der des EGFP-Gens unter der
Steuerung des TPI-Promotors verglichen. Dabei wurde gefunden, dass die Expression
unter dem erfindungsgemäßen TPI-Promotor etwa das 50-fache der Expression des
CMV-Promotors bewirkt, was zeigt, dass der erfindungsgemäße Promotor zu einer
Verstärkung der Expression von Fremdproteinen führt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert.
In den Figuren zeigt
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette
(R64), in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis
1115 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der Leserahmen des EGFP-Gens und ein funktio
neller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID
Nr. 1) operativ miteinander verbunden sind.
Fig. 2 die erfindungsgemäße Expressionskassette R53, in der ein funktioneller Teil
des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der
Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens und ein funktioneller Teil des Km-TPI-
Terminators (Position 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr. 1) operativ miteinander
verbunden sind.
Fig. 3 die erfindungsgemäße Expressionskassette R48, in der ein funktioneller Teil
des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der
Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens, der Leserahmen für Triosephosphati
somerase ohne Start-Methionin (Position 1116 bis 1859 entsprechend SEQ ID Nr. 1)
und ein funktioneller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1860 bis 2127 entspre
chend SEQ ID Nr. 1) operativ miteinander verbunden sind.
Fig. 4 die erfindungsgemäße Expressionskassette R11, in der ein funktioneller Teil
des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1112 entsprechend SEQ ID Nr. 1), der
Leserahmen für Triosephosphatisomerase (Position 1113 bis 1856 entsprechend SEQ
ID Nr. 1) der Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens, und ein funktioneller Teil
des Km-TPI-Terminators (Position 1857 bis 2037 entsprechend SEQ ID Nr. 1) operativ
miteinander verbunden sind.
Fig. 5 den Vergleich der Expression des TPI-Gens im K. marxianus Ausgangsstamm
und nach Transformation mit dem Plasmid pKmarTI, das aus der Sequenz entspre
chend SEQ ID Nr. 1 und dem K. marxianus-Vektor pKDU8 besteht. Neben den Kultur
überständen der K. marxianus Stämme wurden Kulturüberstände nicht transformierter
Stämme von K. lactis und S. cerevisiae in gleicher Menge aufgetragen.
Fig. 6 den Vergleich der Sekretierbarkeit von HBs Antigen nach Expression mittels
verschiedener Expressionskassetten.
Fig. 7 den Vergleich der Expression von HBs-Antigen mit Hilfe verschiedener Expres
sionskassetten.
Um eine Expressionskassette mit dem erfindungsgemäßen Promotor bereitzustellen,
wird durch PCR mittels der Primer P23 und P36 ein DNA-Fragment amplifiziert, das
aus Promotor, codierendem Bereich und Terminator des KmTPI-Gens besteht und an
den Enden durch künstliche Restriktionsenzymerkennungsstellen für MluI begrenzt
wird. Dieses Fragment wird in den MluI Site des Plasmides pSL1180 kloniert. Im co
dierenden Bereich des KmTPI-Gens befindet sich eine Restriktionserkennungsstelle für
das Restriktionsenzym Ach (AACGTT). Durch PCR wird an dieser Stelle eine stumme
Mutation eingeführt, die den Ach Site zerstört, jedoch die durch GTT codierte Ami
nosäure Valin nicht verändert (AACGTT zu AACGTC). Ein Site für Acht kann nun
durch PCR unmittelbar vor dem Startcodon generiert werden, da sich hier die Nucleo
tidsequenz AAC ATG befindet (AACgtt ATG).
Unmittelbar vor dem Stopcodon des TPI codierenden Bereiches (GTC TAA) kann
ebenfalls mittels PCR ein künstlicher Ac/I Ort generiert werden (aacGTt TAA). Durch
Verbindung des MluI/Ac/I Promoterfragmentes mit dem Ac/I/MluI Terminatorfragment
entsteht eine leere Expressionskassette mit einem unikalen Ac/I Ort für die Insertion
von fremden Leserahmen (Kassette = pTIMex).
Die KmTPI Kassetten mit unikalem Ac/I Ort vor dem Startcodon bzw. vor dem Stop
codon stellen die Sekretionskassetten dar, die eine Expression von Fremdproteinen als
Fusionsproteine mit TPI am N- oder C-terminaten Ende ermöglichen und zu einer Se
kretion der entsprechenden Fusionsproteine führen (Kassetten = pTIMfusN und
pTI MfusC).
Die Kassetten können in bekannter Weise über MluI in entsprechende integrative-
oder sich autonom replizierende Vektoren eingebaut und mit diesen in Rezipientenzel
len eingebracht werden.
Die Generierung von Expressionseinheiten kann auf der Basis der regulatorischen Se
quenzen des KmTPI auch generell durch sich überlappende PCR Reaktionen mittels
Hybridprimern erfolgen, ohne dass Ac/I Schnittstellen in der Sequenz generiert wer
den müssen. Dem Fachmann sind entsprechende Techniken und PCR-Regimes be
kannt. Das in Beispiel 1 beschriebene System ist deshalb nicht ausschließlich, son
dern nur beispielhaft zu sehen.
Es wurden einige spezielle Expressionskassetten, die als R64, R53, R48 und R11
bezeichnet werden, durch PCR-Techniken generiert. Diese Kassetten sind durch
Schemata und Restriktionskarten in den Fig. 1 bis 4 näher charakterisiert.
Die Kassette enthält den KmTPI-Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115
von SEQ ID Nr. 1, den EGFP Leserahmen und den KmTPI-Terminator mit den Nucleo
tiden 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr. 1 (TPIpr-MetEGFP-TPItr).
Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115
von SEQ ID Nr. 1 (einschließlich Met), den Leserahmen für Hepatitis B Virus S-
Antigen und den KmTPI-Terminator mit den Nucleotiden 1860 bis 2127 entspre
chend Sequenz SEQ ID Nr. 1 (TPIpr-HBS-TPItr)
Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115
von SEQ ID Nr. 1 (einschließlich Met), den Leserahmen für Hepatitis B Virus S-
Antigen an dessen C-Terminus der Leserahmen für TPI ohne Methionin fusioniert ist
und den KmTPI-Terminator mit den Nucleotiden 1860 bis 2127 entsprechend Se
quenz SEQ ID NR.1 (TPIpr-HBS-TPI-TPItr).
Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter und den gesamten Leserahmen für
KmTPI an dessen C-Terminus mit Methionin beginnend der Leserahmen für Hepatitis
B Virus S-Antigen fusioniert ist. Dieser endet mit eigenem Stopcodon (UAG). Der hier
verwendete funktionelle Teil des KmTPI-Terminators überlappt mit dem Stopcodon
der HBs-Sequenz (TAAATTAAATTAGG) und beginnt mit dem Stopcodon UAA bei
Position 1857 entsprechend SEQ ID Nr. 1. Er umfaßt lediglich 180 Basenpaare. Diese
Kassette wurde über stumpfe Enden in den SmaI Ort entsprechender Plasmide klo
niert (TPIpr-TPI-HBS-TPItr).
Claims (32)
1. DNA-Sequenz umfassend die Nucleotide 1 bis 2163 von SEQ ID Nr. 1 oder
Teilsequenzen davon.
2. DNA-Sequenz enthaltend die Nucleotide 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 oder
Teilsequenzen davon, die als Promotor aktiv sind.
3. Promotor-Sequenz nach Anspruch 2 umfassend mindestens die Nucleotide
352 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1.
4. Promotor-Sequenz nach Anspruch 2 oder ein als Promotor wirksamer Teil da
von zur Verwendung als regulatorische Region zur Steuerung der Transkription
eines Fremdgens.
5. Promotor-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche oder ein als
Promotor wirksamer Teil davon in operativer Verbindung mit der DNA-Sequenz
für ein zu exprimierendes Protein.
6. Promotor-Sequenz nach Anspruch 2 oder ein Derivat davon in operativer Ver
bindung mit der Signalsequenz des EPG-Gens aus K. marxianus.
7. DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 umfassend regulatorische Sequenzen und
den offenen Leserahmen des Enzyms Triosephosphatisomerase aus K. marxia
nus.
8. DNA-Sequenz enthaltend die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID Nr. 1 oder
einen als Terminator aktiven Teil davon.
9. Hefeexpressionskassette enthaltend in operativer Verbindung die Promotor-
Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 6, eine Insertionsklonierungsstelle
und die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID Nr. 1 oder einen als Terminator
aktiven Teil davon.
10. Hefeexpressions- und Sekretionskassette umfassend in operativer Verbindung
eine Promotor-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 6 oder einen als Pro
motor aktiven Teil davon, eine Signalsequenz, eine Insertionsklonierungsstelle
und die Terminator-Sequenz, wie in Anspruch 8 definiert.
11. Plasmid pD1 enthaltend die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 hinterlegt mit
der Hinterlegungsnr. DSM 13973.
12. Expressionsvektor enthaltend in operativer Verbindung einen Promotor gemäß
einem der Ansprüche 2 bis 6, ein Polynucleotid, das ein Fremdprotein kodiert,
und eine Terminatorsequenz.
13. Expressionsvektor nach Anspruch 12, der zusätzlich noch eine Signalsequenz
zwischen Promotor und Polynucleotid enthält.
14. Expressionsvektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Si
gnalsequenz die Signalsequenz des EPG-Gens von K. marxianus enthalten ist.
15. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekenn
zeichnet, dass das Polynucleotid ein Wachstumshormon, einen Wachstumsfak
tor, ein Interferon oder ein antigenes Protein oder Peptid kodiert.
16. Expressionsvektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Po
lynucleotid ein Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen kodiert.
17. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekenn
zeichnet, dass der Vektor ein integrativer oder episomaler Vektor ist.
18. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekenn
zeichnet, dass der Vektor ein in Hefe replizierbares Plasmid ist.
19. Expressions- und Sekretionsvektor umfassend in operativer Verbindung eine
Promotor-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, eine KmTPI codieren
de DNA 3' oder 5' benachbart zu einem Fremdgen und eine Terminator-
Sequenz gemäß Anspruch 8.
20. Expressions- und Sekretionsvektor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeich
net, dass zwischen KmTPI-DNA und Fremdgen noch eine DNA-Sequenz ist, die
einen Abstandshalter codiert.
21. Wirtszelle transformiert mit einem Plasmid gemäß Anspruch 11 oder einem
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 bis 20.
22. Wirtszelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zelle der
Art Kluyveromyces marxianus ist.
23. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, dadurch gekennzeich
net, dass man eine Hefezelle mit einem Plasmid transformiert, das einen Ex
pressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 bis 20 mit einem Polynucleotid,
das ein Fremdprotein oder ein Fusionsprotein codiert, enthält, die Hefezelle un
ter Bedingungen, die zur Expression des Fremd- oder Fusionsproteins geeignet
sind, züchtet und das Protein gewinnt.
24. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, dadurch gekennzeich
net, dass man eine Hefezelle mit einem Expressionsvektor nach einem der An
spruche 12 bis 20 transformiert, die Zellen, die den Expressionsvektor in das
Genom eingebaut haben, selektiert, und die transformierten Zellen züchtet und
anschließend das Protein gewinnt.
25. Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten Proteins, wobei man Hefezellen
mit einem Sekretionsvektor nach Anspruch 19 oder 20 transformiert, das bei
der Expression entstehende Fusionsprodukt aus dem Überstand gewinnt und
TPI in an sich bekannter Weise von dem Fremdprotein abtrennt.
26. Verfahren nach. Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Sekre
tionsvektor als regulatorische Sequenzen Promotor und Terminator von TPI
verwendet werden.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass als Promotor eine
Sequenz gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6 und als Terminator eine Sequenz
gemäß Anspruch 8 verwendet wird.
28. Verfahren zum Ausschleusen eines Fremdproteins in Form eines Fusionspro
duktes mit Triosephosphatisomerase, bei dem man eine Sequenz, die minde
stens regulatorische Sequenzen und eine Fusions-DNA, die für Triosephospha
tisomerase und das gewünschte Peptid oder Protein codiert, zur Expression
bringt, das gebildete Fusionsprotein isoliert und das Fremdprotein abtrennt.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die ausschleu
sende Wirkung von TPI durch Kombination mit einer Signalsequenz verstärkt
wird.
30. Verwendung einer DNA-Sequenz mit den Nucleotiden 1 bis 1112 gemäß SEQ
ID Nr. 1 oder einem Teil davon als Promotor zur Expression von homologen
oder heterologen Polypeptiden in Hefezellen.
31. Verwendung einer KmTPI-codierenden DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 in
operativer Verbindung mit regulatorischen Bereichen und in Kombination mit
einem Fremdgen zur Erzeugung eines Fusionsproduktes aus TPI und einem
Polypeptid, das nach Expression aus der Zelle ausgeschleust wird.
32. Verwendung einer Promotor-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6 oder
eines Teils davon als regulatorische Sequenz für die Expression eines Polypep
tids in Kombination mit einer Signalsequenz, um ein Polypeptid zu exprimieren
und aus der Zelle auszuschleusen.
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10101962A DE10101962B4 (de) | 2001-01-17 | 2001-01-17 | DNA-Sequenz mit regulatorischen Bereichen zur Expression von Proteinen |
US10/466,758 US20040161841A1 (en) | 2001-01-17 | 2002-01-16 | Dna sequence comprising regulatory regions for expressing proteins |
CA002436815A CA2436815A1 (en) | 2001-01-17 | 2002-01-16 | Dna sequence from kluyveromyces marxianus comprising regulatory regions for expressing proteins |
PCT/EP2002/000400 WO2002070713A2 (de) | 2001-01-17 | 2002-01-16 | Dna-sequenz aus kluyveromyces marxianus mit regulatorischen bereichen zur expression von proteinen |
JP2002570738A JP2004519239A (ja) | 2001-01-17 | 2002-01-16 | タンパク質発現のための調節領域を含むdna配列 |
EP02748300A EP1354052A2 (de) | 2001-01-17 | 2002-01-16 | Dna-sequenz aus kluyveromyces marxianus mit regulatorischen bereichen zur expression von proteinen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10101962A DE10101962B4 (de) | 2001-01-17 | 2001-01-17 | DNA-Sequenz mit regulatorischen Bereichen zur Expression von Proteinen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10101962A1 true DE10101962A1 (de) | 2002-08-01 |
DE10101962B4 DE10101962B4 (de) | 2006-07-27 |
Family
ID=7670860
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10101962A Expired - Fee Related DE10101962B4 (de) | 2001-01-17 | 2001-01-17 | DNA-Sequenz mit regulatorischen Bereichen zur Expression von Proteinen |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040161841A1 (de) |
EP (1) | EP1354052A2 (de) |
JP (1) | JP2004519239A (de) |
CA (1) | CA2436815A1 (de) |
DE (1) | DE10101962B4 (de) |
WO (1) | WO2002070713A2 (de) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7429480B2 (en) * | 2005-01-10 | 2008-09-30 | National Taiwan University | Promoter sequences from WSSV immediate early genes and their uses in recombinant DNA techniques |
JP5804378B2 (ja) * | 2010-02-09 | 2015-11-04 | 国立大学法人山口大学 | クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター |
CN102242108A (zh) * | 2010-05-14 | 2011-11-16 | 浙江大学 | 一种提高亚油酸异构酶活性的方法 |
CN117777275B (zh) * | 2024-02-23 | 2024-05-31 | 北京国科星联科技有限公司 | 一种促进人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4599311A (en) * | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
WO1993003159A1 (fr) * | 1991-08-02 | 1993-02-18 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
EP0268772B1 (de) * | 1986-09-19 | 1995-04-26 | ZymoGenetics, Inc. | Expression des biologisch aktiven Faktors XIII |
FR2635115B1 (fr) * | 1988-08-05 | 1992-04-03 | Rhone Poulenc Sante | Procede de preparation de la serum albumine humaine a partir d'une levure |
-
2001
- 2001-01-17 DE DE10101962A patent/DE10101962B4/de not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-01-16 JP JP2002570738A patent/JP2004519239A/ja not_active Withdrawn
- 2002-01-16 US US10/466,758 patent/US20040161841A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-16 WO PCT/EP2002/000400 patent/WO2002070713A2/de not_active Application Discontinuation
- 2002-01-16 CA CA002436815A patent/CA2436815A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-16 EP EP02748300A patent/EP1354052A2/de not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4599311A (en) * | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
WO1993003159A1 (fr) * | 1991-08-02 | 1993-02-18 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Compagno, C. et al., Appl. Env. Microbiol. 65(9), 1999, 4216-9 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004519239A (ja) | 2004-07-02 |
WO2002070713A3 (de) | 2003-03-13 |
CA2436815A1 (en) | 2002-09-12 |
DE10101962B4 (de) | 2006-07-27 |
US20040161841A1 (en) | 2004-08-19 |
WO2002070713A2 (de) | 2002-09-12 |
EP1354052A2 (de) | 2003-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3280422T2 (de) | Verfahren und produkte zur leichten mikrobiologischen expression von dns-sequenzen. | |
DE3111405C2 (de) | ||
DE3689802T2 (de) | "Hervorrufung somatischer Veränderungen in Pflanzen durch Verwendung von minussträngigen RNAs". | |
DE3486216T2 (de) | Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren. | |
DE3023627A1 (de) | Mikrobielle expression von quasi- synthetischen genen | |
DD212982A5 (de) | Verfahren zur herstellung von rinder-wachstumshormon-aehnlichen polypeptiden | |
DD203330A5 (de) | Verfahren zur herstellung hybrider human-leukozyten-interferone | |
EP0513073A1 (de) | VERFAHREN ZUR ENZYMATISCHEN SPALTUNG REKOMBINANTER PROTEINE UNTER VERWENDUNG VON IgA-PROTEASEN. | |
DE19620649A1 (de) | Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus | |
WO1995026406A2 (de) | Riboflavin-biosynthese in pilzen | |
DD267511A5 (de) | Neues Expressionssystem | |
DE69233653T2 (de) | Herstellung gegen sclerotinia sclerotiorum resistenter pflanzendurch einführung eines für oxalatoxydase kodierenden gens | |
DE60133422T2 (de) | Verfahren zur transformation von agaricus bisporus | |
DE10101962B4 (de) | DNA-Sequenz mit regulatorischen Bereichen zur Expression von Proteinen | |
EP0882129B1 (de) | Rekombinante expression von s-layer-proteinen | |
DE112019000467T5 (de) | Rekombinanter Mikroorganismus, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung bei der Herstellung von Coenzym Q10 | |
DE19943383A1 (de) | Regulatorische Sequenzen und Expressionskassetten für Hefen | |
DE69936363T2 (de) | DNAs die für neue fusions-Proteine kodieren und Verfahren zur Herstellung von nützlichen Polypeptiden durch Expression der DNAs | |
EP1282715B1 (de) | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von difructoseanhydrid-iii, dafür einsetzbarer mikroorganismus sowie enzym mit inulase-ii-aktivität und dafür kodierende dna-sequenzen | |
DE69629767T2 (de) | Promoter und dessen Verwendung zum Expressionsverfahren | |
EP0569806B1 (de) | DNA-Verbindungen und rekombinante, die Ribloflavinsynthetaseaktivität von S. cerevisiae codierende DNA-Expressionsvektoren | |
EP2185710A1 (de) | Eukaryotische promotoren zur genexpression | |
EP0708180B1 (de) | Verbessertes, induktionsfreies Verfahren zur Gentechnischen Herstellung von Glutarylamidase | |
DE19919124A1 (de) | Nukleinsäuremolekül, umfassend eine für ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität kodierende Nukleinsäure | |
DE69813185T2 (de) | Klonierung und Expression eines neuen Glukoamylasegens aus endomyces fibuliger |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |
Effective date: 20110802 |