DE10064195A1 - Verwendung einer Zusammensetzung zur Stimulation des Nervenwachstums, zur Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder Reduktion eines Sekundärschadens - Google Patents
Verwendung einer Zusammensetzung zur Stimulation des Nervenwachstums, zur Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder Reduktion eines SekundärschadensInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, enthaltend ein Fusionsprotein und mindestens einen Transporter zur in-vivo-Stimulation des Nervenwachstums, der in-vivo-Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder in-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens, wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und mindestens eine Modulationsdomäne zur kovalenten Modifikation von kleinen GTP-bindenden Proteinen enthält und der Transporter die Aufnahme des Fusionsproteins in eine Zielzelle vermittelt.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung
enthaltend ein Fusionsprotein und mindestens einen Transporter zur In-vivo-
Stimulation des Nervenwachstums, der In-vivo-Inhibition der Narben
gewebsbildung und/oder In-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens, wobei das
Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und
mindestens eine Modulationsdomäne zur kovalenten Modifikation von kleinen
GTP-bindenden Proteinen enthält, und der Transporter die Aufnahme des
Fusionsproteins in eine Zielzelle vermittelt.
Rückenmark und Gehirn bilden bei den Wirbeltiere das zentrale Nervensystem
(ZNS). Das Rückmark verläuft in Körperlängsrichtung und wird von dem
Wirbelkanal umgeben. Es lässt sich beim Menschen in acht Hals-, zwölf Brust-,
fünf Lenden-, fünf Kreuzbein- und ein bis zwei Steißbeinsegmente gliedern. Die
zentrale graue Substanz mit ihren seitlichen Ausladungen (Vorder- und
Hinterhorn) wird von den Zellkörpern der Nervenzellen und die periphere weiße
Substanz durch die markhaltige Nervenfaserbündel gebildet. In der weißen
Substanz verlaufen afferente (aufsteigende, sensible) und efferente (absteigende,
effektorische) Leitungsbahnen. Die absteigenden Bahnen des Rückenmark werden
in die Pyramidenbahnen (willkürliche Bewegungen) und extrapyramidale Bahnen
(unwillkürliche Bewegungen; Verteilung des Muskeltonus) unterschieden. Der
größte Teil der pyramidalen Fasern verläuft gekreuzt in der Pyramidenseiten
strangbahn der Gegenseite und zum kleineren Teil ungekreuzt in der Pyramidenvorderstrangbahn
zu Vorderhorn- und Hinterhornzellen der verschiedenen
Rückenmarkssegmente.
Eine Verletzung des Rückenmarks z. B. infolge eines Unfalls führt zu einer dauer
haften Unterbrechung der Leitungsfunktion der betroffenen Nervenfasern. Eine
Lähmung in Folge eines völligen Ausfalls von mindestens einem Segment
bezeichnet man als Querschnittslähmung. Die Folge ist der Verlust der sensiblen
(z. B. Temperatur-, Schmerz- oder Druckempfindungen), motorischen (willkür
liche und unwillkürliche Bewegung) und vegetativen Funktionen (z. B. Blasen-
und Darmfunktion) für alle Gebiete unterhalb des betroffenen Segments.
Aufgrund der schlechten regenerativen Fähigkeiten der Nervenfasern bleibt die
Lähmung der Willkürmotorik und der vollständige Sensibilitätsverlust dauerhaft
bestehen.
Es sind aber auch neurologische und neurodegenerative Erkrankungen des
peripheren und zentralen Nervensystems bekannt, bei denen Nervenzellen
zugrunde gehen. Dies sind z. B. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple
Sklerose und ähnliche Erkrankungen, die mit einem Nervenfaserverlust und
Entmarkung einhergehen, sowie Amyotrophe Lateral Sklerose und andere
Motoneuonenerkrankungen, Ischämie, Schlaganfall, Epilepsie, Morbus
Huntington, AIDS Demenz Komplex und Prionen-Erkrankungen.
Ziel der Forschung ist es daher, bei Läsionen des Rückenmarks eine Regeneration
der Nervenaxone über die Verletzung hinweg zu bewerkstelligen und bei anderen
Krankheiten des peripheren und zentralen Nervensystems, das Nervenwachstum
zu stimulieren.. Die Narbenbildung im zentralen Nervensystem der Säugetiere
stellt ein enormes Regenerationshemmnis für wachsende Nervenfasern dar. Aus
diesem Grund sind die Verlangsamung oder Verhinderung der Narbenbildung
sowie die Stimulation des Nervenfaserwachstums wesentliche therapeutische
Ziele bei neuroregenerativen Behandlungskonzepten.
Einen Ansatzpunkt bietet die Einflußnahme auf Signaltransduktionswege in
Nervenzellen. Es ist bekannt, daß die Aktivierung kleiner GTP-bindender Proteine
aus der Familie der Rho-GTPasen (Rho A, B, C) zu einer starken Wachstums
hemmung von Nervenfasern unter Zellkulturbedingungen führt (Mueller BK,
1999, Annu. Rev. Neurosci. 22: 351-388). Experimentelle Belege sprechen dafür,
daß die spezifische Aktivierung von Rho A, B und/oder C im Inneren der
Nervenfasern durch potente, außen an der Membran angreifende
regenerationshemmende Proteine des adulten Säuger-Gehirns (NOGO, MAG,
RGM, Ephrin-A5) einen wesentlichen Mechanismus der Inhibition des
Nervenfaserwachstums darstellt (Jin Z und Strittmatter SM, 1997, J. Neurosci. 17:
6256-6263; Lehmann M, Fournier A, Selles-Navarro I, Dergham P, Sebok A,
Leclerc N, Tigyi G, McKerracher L, 1999, J. Neurosci. 19: 7537-7547; Wahl S,
Barth H, Ciossek T, Aktories K, Mueller BK, 2000, J. Cell. Biol. 149: 263-270).
Die Aktivierung von Rho A-C führt bei neu aussprossenden Nervenfasern zum
Kollaps des Wachstumskegels, der distalen Spitze des Neuriten, und verhindert
dadurch die Ausbildung neuer Nervenbahnen.
Aus dem Stand der Technik ist das bakterielle Exoenzym C3-Transferase als
spezifischer Inhibitor von Rho A, B und C bekannt (Aktories K, Schmidt G, Just
I, 2000, Biol. Chem. 381: 421-426). Dieses Protein ADP-ribosyliert Rho A-C am
Argeninrest 41 und inhibiert dadurch diese Rho-GTPasen (Aktories et al., 2000,
supra). Um eine ausreichende Aktivierungsblockade der Rho-GTPasen zu
erreichen, müssen über 90% der intrazellulären Rho A-C Proteine ADP-ribosyliert
und damit inaktiviert werden. Die C3-Transferase besitzt jedoch eine sehr
schlechte Membranpermeabilität und wird daher nur in geringsten Mengen (ca.
1% der Ausgangsmenge) von den Zellen aufgenommen. Für eine Inaktivierung
von 90% der intrazellulären Rho A-C Proteine sind folglich sehr hohe C3-
Transferasemengen erforderlich. Infolge dessen müßten für pharmazeutische
Anwendungen sehr hohe Mengen dieser als Toxine bekannten C3-Transferasen
verabreicht werden. Hierdurch können toxische Nebenwirkungen nicht
ausgeschlossen werden. Daher ist die pharmakologische Verwendung der C3-
Transferase alleine aufgrund ihrer Toxizität nicht geeignet.
Um einen besseren Transport der Wirkstoffkomponente C3-Transferase durch die
Plasmamembran der Zellen zu erreichen, wurde ein chimäres Fusionsprotein
hergestellt (DE 197 35 105). Zu diesem Zweck wurde das binäre Aktin ADP-
ribosylierende C2-Toxin aus Clostridium botulinum verwendet. Das C2-Toxin
besteht aus zwei Proteinen, der C2I-Komponente, die enzymatisch aktiv ist, sowie
der C2II-Komponente, die die Bindung an die Plasmamembran und eine
nachfolgende Translokation vermittelt. Die enzymatische Aktivität des C2I-
Proteins ist im C-terminalen Bereich lokalisiert, während die Bindung an C2II
über den N-terminalen Bereich erfolgt. Um die C3-Transferase mit Hilfe dieses
effizienten Aufnahmemechanismus in die Zellen einzuschleusen, wurde ein
chimäres Fusionsprotein aus C3-Transferase (aus Clostridium limosum) und aus
dem N-terminalen C2I-Protein hergestellt (Fig. 1). Dieses C3-C2IN-Fusions
protein gelangt nun mit Hilfe des Bindeproteins C2II ins Innere der Zellen (Barth
H, Hofmann C, Olenik C, Just I, Aktories K, 1998, Infect. Immun. 66: 1364-
1369). Der Komplex aus C3-C2IN und C2II wird über Rezeptor-vermittelte
Endozytose internalisiert und gelangt in intrazelluläre Vesikel. Aus diesen
Vesikeln gelangt das Fusionsprotein C3-C2IN ins Cytosol, kann dort seine
Wirkung entfalten und Rho A-C ADP-ribosylieren und dadurch inaktivieren.
Dieser binäre Proteinkomplex aus C3-C2IN und C2II verbindet die
Wirkeigenschaften der C3-Transferase mit einer um Faktor 100-1000 verbesserten
Membranpermeabilität und gewährleistet dadurch eine wesentlich bessere
intrazelluläre Verfügbarkeit. Dies ist auch der Grund dafür, daß nur noch geringe
Mengen an C3-C2IN nötig sind, um eine 90prozentige Hemmung von Rho A-C
zu erreichen. Die Wirksamkeit wurde bisher nur in In-vitro-Experimenten gezeigt
(Wahl S, Barth H, Ciossek T, Aktories K, Mueller BK, 2000, J. Cell. Biol. 149:
263-270). In diesen Experimenten mit embryonalen Zellen oder Zelllinien - also
proliferationskompetenten Zellen - konnten Neuritenwachstums-stimulierende
Effekte nachgewiesen werden (Wahl S, 2000, Dissertation zur Erlangung des
Grades eines Doktors der Naturwissenschaften. Fakultät der Biologie, Eberhard-
Karls-Universität Tübingen). Die mit C3-C2IN und C2II behandelten Neuriten
waren resistent gegenüber potenten Inhibitoren wie Ephrin-A5 und RGM (Wahl
S, 2000, supra).
Bisher ist jedoch keine Verwendung bekannt, mit der es möglich wäre, adulte
Nervenzellen - also Zellen mit stark eingeschränkten proliferativen Eigenschaften
in vivo dauerhaft zu stimulieren. Die In-vivo-Verwendung von C3 war nur an
frisch durchtrennten Nervenzellen möglich und führte nur zu kurzzeitigen
Effekten, da C3 von regenerierenden Nervenfasern nicht mehr aufgenommen wird
(Lehmann M, Fournier A, Selles-Navarro I, Dergham P, Sebok A, Leclerc N,
Tigyi G, McKerracher L, 1999, J. Neurosci. 19: 7537-7547). Deshalb und
aufgrund der hohen Dosen die eingesetzt werden müssen, ist dieses System nicht
geeignet, motorische oder sensorische Funktionen nach Rückenmarkstrennung
wieder herzustellen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, die Funktion von Nervenfasern
nach Verletzung oder infolge von Erkrankungen wieder herzustellen und damit sie
ihre Funktionen wieder zurückzuerlangen. Somit soll eine partielle oder totale
Regeneration bei Krankheiten oder Verletzungen des peripheren und zentralen
Nervensystems erreicht werden.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung einer
Zusammensetzung enthaltend ein Fusionsprotein und mindestens einen
Transporter zur In-vivo-Stimulation des Nervenwachstums, der In-vivo-Inhibition
der Narbengewebsbildung und/oder In-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens,
wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter
und mindestens eine Modulationsdomäne zur kovalenten Modifikation von
kleinen GTP-bindenden Proteine enthält, und der Transporter die Aufnahme des
Fusionsproteins in eine Zielzelle vermittelt.
Unter erfindungsgemäßer Verwendung der Zusammensetzung konnten
überraschenderweise nicht nur die Effekte von Myelin-assoziierten Inhibitoren
wie NOGO, MAG und CSPG, sondern auch die Effekte potenter anderer
Inhibitoren wie z. B. Semaphorin und RGM (Repulsive Guidance Molecule)
aufgehoben werden.
Überraschenderweise konnte unter Verwendung des oben beschriebenen Systems
nicht nur die Blockade des Neuritenwachstums durch regenerationshemmende
Proteine aufgehoben werden, sondern sogar das Nervenfaserwachstum aktiv
stimuliert werden.
Weiterhin war überraschend, daß die erfindungsgemäße Verwendung der
Zusammensetzung nicht nur die Inaktivierung von Rho A-C, sondern auch auf der
Aktivierung von Cdc42 und Rac bewirkte. Die Aktivierung von Rac und Cdc42 in
Nervenzellen führt zur Bildung von Finger-artigen Filopodien und Lamellipodien
(Häuten zwischen den Filopodien) (Kozma R, Sarner S, Ahmed S, Lim L, 1997,
Mol Cell Biol 17: 1201-1211). Filopodien und Lamellipodien sind für das
zielgerichtete Wachstum von Nervenfasern notwendig. Aktivatoren von Rho, wie
z. B. Myelin-Inhibitoren, RGM oder Ephrin-A5, die außen an der Nervenfaser
angreifen, hemmen jedoch die Fortbewegung der Nervenfasern, indem sie ein
drastisches Zurückziehen der Nervenfasern auslösen. Die Hemmung von Rho A-C
verhindert dies, führt jedoch alleine nicht zum Weiterwachsen der Nervenfasern,
denn dafür ist die Aktivierung von Cdc42 und Rac nötig. Somit ist die
Kombination von Hemmung der Rho A-C und Aktivierung von Cdc42 und Rac
besonders effizient zur Stimulation des Nervenfaserwachstums.
Ebenfalls überraschend war die Beobachtung, daß unter erfindungsgemäßer
Verwendung der Zusammensetzung die Bildung von Narbengewebe reduziert
war. Es entstand weniger Narbengewebe, welches auch in einer weniger
kompakten Weise wuchs, so daß Raum zum Wachstum der Nervenfasern blieb.
Die Lakunen- und Hohlraumbildung war stark herabgesetzt und damit die
sekundäre Schädigung drastisch reduziert. Hierdurch wurde die Regeneration von
Nervenfasern positiv beeinflußt.
Alle Effekte zusammen bewirkten nach Rückenmarksläsion eine Wiederher
stellung der motorischen, sensorischen und vegetativen Funktionen über die
Verletzungsstelle des Rückenmark hinaus. Insbesondere konnte gezeigt werden,
daß Ratten nach Läsion des Rückenmarks auf Höhe des achten Thorakalwirbels
(TH8) und einmaliger Injektion von C3-C2IN und C2II ihre Hinterbeine wieder
bewegen konnten und keine nennenswerten Lähmungserscheinungen übrig
behielten. Neben den motorischen wurden auch sensorische und vegetative
Funktionen wieder hergestellt. Die Ratten zeigten eine Reaktion auf äußere Reize
(z. B. Schmerz) und konnten ihre Blase wieder selbständig leeren (siehe Beispiel
2).
Unter einer In-vivo-Stimulation des Nervenwachstum in Sinne der vorliegenden
Erfindung wird eine beschleunigtes und/oder vermehrtes Nervenwachstum
verstanden, wobei sich dieses auf das Ausmaß und/oder die Geschwindigkeit des
Wachstums beziehen kann. Vorzugsweise wachsen die Nervenfaser mindestens
um ca. Faktor 2, bevorzugt um ca. Faktor 3, am meisten bevorzugt um ca. Faktor
4, schneller und/oder weiter. Alternativ ist die Anzahl der wachsenden Fasern
mindestens um ca. Faktor 2, bevorzugt um ca. Faktor 3, am meisten bevorzugt um
ca. Faktor 4, erhöht. Unter einer In-vivo-Inhibition der Narbengewebsbildung in
Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine ca. 50prozentige, bevorzugt eine ca.
75prozentige, am meisten bevorzugt eine ca. 90prozentige Reduktion des
Narbengewebes und/oder der Lakunen- oder Hohlraumbildung verstanden.
Daraus ergibt sich, daß die Inhibition eine völlige oder teilweise Inhibition sein
kann. Geeignete Tests zur Quantifizierung der Parameter sind in Beispiel 2
beschrieben. Unter einer In-vivo-Reduktion von Sekundärschäden versteht der
Fachmann Schäden, die erst als weitere Folge der anfänglichen Verletzung
auftreten. Beispiele hierfür sind eine ischämische Nekrose, die Apoptose von
Nervenfasern und anderen Zellen sowie inflammatorische Reaktionen. Unter einer
In-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens in Sinne der vorliegenden Erfindung
wird eine ca. 50prozentige, bevorzugt eine ca. 75prozentige, am meisten
bevorzugt eine ca. 90prozentige Reduktion eines Sekundärschadens verstanden.
Unter einem Fusionsprotein versteht man das Expressionsprodukt eines
fusionierten Gens. Ein fusioniertes Gen entsteht aus der Verknüpfung zweier oder
mehrerer Gene, wobei eine neue Kombination erzeugt wird. In der vorliegenden
Erfindung enthält das Fusionsprotein eine Modulationsdomäne und eine
Bindungsdomäne.
Ein GTP-bindendes Protein ist ein Protein, das GTP (Guanosintriphosphat) bindet
und infolge einer zellulären Signalkaskade zu GDP (Guanosindiphosphat)
hydrolysiert. Die Signalinduzierte Hydrolyse des GTP zu GDP bewirkt die
Interaktion des GTP-bindenden Proteins mit einem Effektormolekül. Man
unterscheidet zwischen heterotrimeren (großen) GTP-bindenden Proteinen und
monomeren (kleinen) GTP-bindenden Proteinen. Die heterotrimeren GTP-
bindenden Proteinen bestehen aus einer α-, einer β- und einer γ-Untereinheit,
wohingegen die monomeren GTP-bindenden Proteine nur aus einer Untereinheit
bestehen. Zu der Gruppe der kleinen GTP-bindenden Proteine gehören
beispielsweise die Mitglieder der Ras-, Rho-, Rab-, Art-, Sar- und Ran-Familie.
Die Rho-GTPasen der Säugetiere können in sechs verschiedene Klassen eingeteilt
werden: Rho (RhoA, RhoB, RhoC), Rac (Rac 1, Rac 2, Rac 3, Rho G), Cdc42
(Cdc42Hs, G25K, TC10), Rnd (RhoE/Rnd3, Rnd1/Rho6, Rnd2/Rho7), Rho D und
TTF.
Ein GTP-bindendes Protein besitzt eine Guaninnukleotid-Bindungstelle, an der
sowohl GTP oder GDP gebunden sein kann. In der GTP-gebundenen Form ist das
Protein aktiv, in der GDP-gebundenen Form inaktiv. Der Austausch von GDP und
GTP und somit die Aktivierung des GTP-bindenden Moleküls wird durch den in
der Signalkaskade dem GTP-bindenden Protein vorgeschalteten Aktivator
vermittelt. Die Aktivierung des Effektor, also des dem GTP-bindenden Protein in
der Signaltransduktion nachgeschalteten Moleküls, bewirkt die Spaltung des GTP
zu GDP und anorganischen Phosphat. Hierdurch wird das GTP-bindende Protein
wieder inaktiviert. Die Regulation der Signalkaskade auf Ebene des GTP-
bindenden Proteins wird in der Zelle durch mindestens drei weitere Proteine
reguliert; GTPase-aktivierende Proteine (GAP) unterstützen die GTP-Hydrolyse,
Guaninnukleotidaustausch-Faktoren (GEF) katalysieren den Austausch von GDP
zu GTP und GDP-Dissoziationsinhibitoren (GDI) unterdrücken die Dissoziation
des GDP vom kleinen GTP-bindenden Protein (siehe hierzu Hall A, 1998, Science
279: 509-514; Mueller BK, 1999, Annu Rev Neurosci 22: 351-388; Luo L, 2000,
Nature Review Neurosci 1,3: 173-180)
Bei erfindungsgemäßer Verwendung der Zusammensetzung wird die Aktivität des
kleinen GTP-bindenden Proteins geändert. Unter einer Änderung der Aktivität
von kleinen GTP-bindenden Proteinen im Sinne der vorliegenden Erfindung
versteht man eine Erhöhung oder Erniedrigung der Aktivität. Die Erniedrigung
kann zu einer teilweisen oder völligen Hemmung oder Inaktivierung führen. Die
Aktivität des kleinen GTP-bindenden Proteins wird mindestens um Faktor 2,
bevorzugt um ca. Faktor 3 oder um ca. Faktor 4, am meisten bevorzugt um ca.
Faktor 10, erhöht oder erniedrigt. Dem Fachmann sind einschlägige Methoden
bekannt, mit der die Aktivität von kleinen GTP-bindenden Proteinen bestimmt
werden kann. Beispielsweise könnte in einem Enzymtest die Hydrolyse-Aktivität
des kleinen GTP-bindenden Proteins mit GTP als Substrat, das an der γ-
Phosphatgruppe markiert ist (z. B. radioaktiv), bestimmt werden (Read PW und
Nakamoto RK, 2000, Methods in Enzymology 325: 15; Self AJ und Hall A, 1995,
Methods in Enzymology 256: 67).
Die Veränderung der Aktivität durch die Modulationsdomäne kann beispielsweise
durch Wechselwirkung mit GAP, GDI GEF oder dem kleinen GTP-bindenden
Protein erfolgen. Dabei kann u. a. die Geschwindigkeit der Hydrolyse von GTP zu
GDP, die Dissoziation von GDP oder die Bindung von GTP beeinflußt werden.
Dies könnte beispielsweise durch kovalente oder nicht-kovalente Modifikation
eines der beteiligten Proteine durch die Modulationsdomäne erfolgen. (Bishop AL
and Hall A, 2000, Rho GTPases and their effector proteins. Biochem J 348: 241-
255; Hall A, 1999, Signal transduction pathways regulated by the Rho family of
small GTPases. Br J Cancer 80 Suppl 1: 25-27; Kjoller L und Hall A, 1999,
Signaling to Rho GTPases. Exp Cell res 253: 166-179)
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das kleinen GTP-bindenden Molekül,
vorzugsweise Rho A-C, durch kovalente Modifikation teilweise oder völlig
gehemmt. Vorzugsweise geschieht dies durch ADP-Ribosylierung oder
Glykosylierung des kleinen GTP-bindenden Proteins, d. h. ADP-Ribose oder ein
Saccharid wird kovalent gebunden. Diese Modifikation führt zu einer veränderten
Signaltransduktion auf Ebene des kleinen GTP-bindenden Moleküls.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Änderung der Aktivität der kleinen
GTP-bindenden Proteine durch nicht-kovalente Modifikation erzielt. Beispiels
weise könnte ein Molekül an das kleine GTP-bindende Protein angelagert werden,
welches z. B. durch Änderung der Konformation des Proteins eine aktive oder
inaktive Form stabilisiert. In einer weiteren Ausführungsform könnte aber auch
ein Molekül in die Bindungstasche des kleinen GTP-bindenden Proteins
eingelagert werden, so daß das GTP nicht mehr gebunden werden kann, und so
die Aktivität des kleinen GTP-bindenden Proteins reduziert ist. Beispielsweise
kann die Aktivität von RhoGTPasen durch Rho-inhibierende Toxine wie z. B.
ExoS (Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S), SptP (Salmonella typhimurium
protein tyrosine Phosphatase) oder YopE (Yersinia pseudotuberculosis outer
protein E) oder durch Rho-aktivierende Toxine wie z. B. SopE (Salmonella
typhimurium outer protein E) verändert werden (Lerm M, Schmidt G, Aktories K,
2000, FEMS Microbiology Letters 188: 1-6; Aktories K, Schmidt G, Just I, 2000,
Biol Chem 381: 421-426).
In einer weiteren Ausführungsform wird die Modifikation nicht durch die
Modulationsdomäne selbst, sondern durch ein in der Signalkaskade dem kleinen
GTP-bindenden Protein vor- oder nachgeschalteten Signalmolekül bewirkt. Die
Modulationsdomäne würde dann ein solches Signalmolekül aktivieren, welches
dann wiederum z. B. das kleine GTP-bindende Protein phosphoryliert (indirekte
Modulation). Beispielsweise phosphoryliert die Proteinkinase A (PKA) in
Lymphozyten aktives GTP-gebundenes RhoA und induziert über Rho-GDI seine
Translokation von der Membran ins Cytosol, dadurch wird die Rho-Aktivierung
auf zweierlei Arten beendet. Das Signalmolekül cAMP aktiviert die PKA, diese
phosphoryliert RhoA und inhibiert es dadurch, gleichzeitig wird eine Aktivierung
von RhoA verhindert, indem es durch Rho-GDI von der Membran ins Cytosol
transportiert wird (Mueller BK, 1999, Annu Rev Neurosci 22: 351-388; Lang P,
Gespert F, Delespine-Carmagnat M, Stancou R, Pouchelet M, Bertoglio J, 1996,
EMBO J 15: 510-519; Laudanna C, Campbell JJ, Butcher EC, 1997, J Biol Chem
272: 24141-24144).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die GTP-bindenden
Proteine Rho A, B oder C kovalent modifiziert. Besonders bevorzugt ist die ADP-
Ribosylierung des Asparagin-Restes an Position 41. Damit verbunden ist eine
Inaktivierung des kleinen GTP-bindenden Proteins. In einer weiteren
Ausführungsfonn wird der Threonin-Rest an Position 35 bzw. 37 eines kleinen
GTP-bindenden Proteins der Rho-Familie glykosyliert. Dieses führt ebenfalls zur
Inaktivierung des kleinen GTP-bindenden Proteins. Gleichzeitig werden
vorzugsweise die kleinen GTP-bindenden Protein Cdc42 und/oder Rac aktiviert.
(Dies könnte beispielsweise durch Crosstalk der beiden Signaltransduktionswege
erfolgen. Unter Crosstalk versteht der Fachmann die wechselseitige Beeinflussung
verschiedener Signaltransduktionswege innerhalb einer Zelle. Im vorliegenden
Fall könnte beispielsweise die Inaktivierung des Signalweges, der die GTP-
bindenden Proteine Rho A, B oder C beinhaltet, eine Aktivierung des
Signalweges unter Beteiligung von Cdc42 und/oder Rac bewirken. (siehe hierzu
Mueller BK, 1999, Annu Rev Neurosci 22: 351-388; Wahl S, Barth H, Ciossek T,
Aktories K, Mueller BK, 2000, J. Cell. Biol. 149: 263-270; Sander EE, Ten
Klooster JP, Van Delft S, Van der Kammen RA, Collard JG, 1999, J Cell Biol
147: 1009-1022).
Vorzugsweise ist die Modulationsdomäne von einem Toxin abgeleitet. Hierbei
kann es sich z. B. um bakterielles Toxin handeln. Bakterielle Toxine könnten aus
einem Bakterium der Gattung Clostridium, Staphylococcus, Bacillus, Pseudo
monas, Salmonella oder Yersinia stammen. In einer bevorzugten Ausführungs
form handelt es sich um die C3-Transferase aus Clostridium botulinum oder eine
verwandte Transferase. Unter einer verwandten Transferase versteht man ein
Enzym das wie die C3-Transferase die ADP-Ribosylierung von GTP-bindenden
Proteinen der Rho-Familie bewirkt.
Einen weiteren Teil des Fusionsproteins bildet die Bindungsdomäne. Sie bewirkt
die Bindung an den Transporter. Die Bindung der Bindungsdomäne an den
Transporter erfolgt z. B. durch kovalente Bindung, durch elektrostatische
Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen oder Wasserstoff-
Brücken-Bindung. In einer Ausführungsform stammt die Bindungsdomäne von
einem binären bakteriellen Toxin, insbesondere dem C2-Toxin aus Clostridium
botulinum.
Unter einem binären Toxin versteht man ein Toxin, das aus zwei getrennten
Proteinen besteht. Die Proteine sind eine Enzym-Komponente und eine
Zellbindungs-/Translokationskomponente. Beispiele für binäre Toxine sind das
Anthrax-Toxin oder das Toxin aus Clostridium perfringens iota. Das Clostridium
perfringens iota Toxin ist ein Mitglied der Familie der binären Aktin ADP-
ribosylierenden Toxine. Besonders bevorzugt stammt die Bindungsdomäne von
dem C2-Toxin von Clostridium botulinum. In der am meisten bevorzugten
Ausführungsform handelt es sich bei der Bindungsdomäne um die N-terminale
C2I-Domäne des C2-Toxins von Clostridium botulinum.
Der Transporter vermittelt die Aufnahme des Fusionsproteins in die Zelle. Bei
dem Transporter kann es sich beispielsweise um ein Peptid oder Protein handeln.
Ein Beispiele für ein solches Protein oder Peptid ist das Antennapedia Peptid, ein
16 Aminosäuren-langes Peptid des Homoeobox-Gens Antennapedia, welches
eingesetzt wird, um exogene, hydrophile Komponenten ins Innere lebender Zellen
einzuschleusen (Prochiantz A, 1999, Ann NY Acad Sci 886: 172-179; Prochiantz
A, 1996, Curr Opin Neurobiol 6: 629-634)
Der Transporter könnte aber auch ein virales Protein oder einen Liganden für eine
Zelloberflächenstruktur darstellen oder davon abgeleitet sein. Ein Beispiel für ein
virales Transportprotein ist VP22, ein 38 kDA großes Strukturprotein des Herpes
Simplex-Virus-1. Diese Protein transloziert (permeiert) die Plasmamembranen
von Säugerzellen und kann als Transporter andere Proteine ins Innere der Zellen
transferieren (O'Hare P und Elliot G, 1997, Cell 88: 223-233; Phelan A; Elliott G;
O'Hare P, 1998, Nat Biotechnol 16: 440-443). Beispiele für Liganden von
Oberflächenstrukturen stellen das pflanzliche Toxin Ricin und das bakterielle
Shiga Toxin dar (Sandvig K und von Deurs B, 2000, EMBO J 19: 5943-5950).
Beispielsweise könnten aber auch Liposomen die Transporterfunktion erfüllen.
Mit Hilfe von liposomalen Transportern können neben Nukleinsäuren auch
Proteine in Zellen eingeschleust werden (Rao M und Alving CR, 2000, Adv Drug
Delv Res 30: 171-188). Die Aufnahme in die Zelle kann beispielsweise durch die
Fusion durch die Zellmembran, durch Durchtritt durch Zellporen, durch
erleichterte Diffusion, aktiven Transport mittels Carrier in der Zellmembran oder
durch Pinozytose und Phagozytose erfolgen. In einer Ausführungsform wird die
Aufnahme des Fusionsproteins über die Bindung des Transporters an eine
Struktur an der Zelloberfläche bewirkt. Diese Struktur könnte z. B. ein Rezeptor,
ein Kanal oder ein anderes Membranprotein sein. Die Struktur an der Oberfläche
bewirkt die Aufnahme der Zusammensetzung oder eines Teils davon in die Zelle.
Die Aufnahme des Fusionsproteins könnte z. B. durch Endozytose eines
Rezeptor-Protein-Komplexes erfolgen. In der Zelle könnte der Proteinkomplex
freigesetzt werden und anschließend die Aktivität des kleinen GTP-bindende
Proteins verändern.
Bei dem Transporter kann es sich z. B. um einen Liganden handeln. Liganden
sind Moleküle, die spezifisch an bestimmte Rezeptoren binden. Bei diesen
Liganden könnte es sich beispielsweise um körpereigene Moleküle wie Hormone,
Neurotransmitter wie z. B. Acetylcholin oder um körperfremde Moleküle wie
künstlich hergestellte Liganden handeln. Die Liganden können peptidergen,
proteinergen oder nicht-proteinergen Ursprungs sein. In einer Ausführungsform
könnte der Transporter die variablen Region eines Antikörpers z. B. eines
monoklonale Antikörpers darstellen oder mit dieser verbunden sein. Diese Region
könnte die spezifische Bindung an Zelloberflächenstrukturen bewirken.
Die Aufnahme in die Zelle könnte aber auch durch Liposomentransporter (Rao M
und Alving CR, 2000, Adv Drug Delv Res 30: 171-188) bewirkt werden. Hierbei
wäre das Fusionsprotein z. B. in Liposomen eingeschlossen. Die Bindungsdomäne
wäre so gestaltet, daß das Fusionsprotein besonders geeignet für den Einschluß in
ein Liposom wäre. Das Liposom würde mit der Zellmembran fusionieren und so
die Aufnahme des Fusionsproteins in die Zelle bewirken. Dem Fachmann sind
geeignete Lipide bekannt, die zur Bildung von Protein-Liposomen-Komplexen
verwendet werden können.
Eine weitere Möglichkeit wäre eine Aufnahme des Fusionsproteins durch einen
viralen Transporter. Ein Beispiel für ein virales Transportprotein ist - wie bereits
erwähnt - VP22 (O'Hare P und Elliot G, 1997, Cell 88: 223-233; Phelan A; Elliott
G; O'Hare P, 1998, Nat Biotechnol 16: 440-443).
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der Transporter von einem binären
bakteriellen Toxin. Beispiele für binäre Toxine sind das Anthrax-Toxin oder das
Toxin aus Clostridium perfringens iota. Das Clostridium perfringens iota Toxin ist
ein Mitglied der Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine.
Besonders bevorzugt stammt der Transporter von dem C2-Toxin von Clostridium
botulinum. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei
dem Transporterprotein um C2II-Domäne des C2-Toxins von Clostridium
botulinum.
Unter neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen des peripheren und
zentralen Nervensystems werden beispielsweise Morbus Alzheimer, Morbus
Parkinson, Multiple Sklerose und ähnliche Erkrankungen, die mit einem
Nervenfaserverlust und Entmarkung einhergehen, sowie Amyotrophe Lateral
Sklerose und andere Motoneuonenerkrankungen, Ischämie, Schlaganfall,
Epilepsie, Morbus Huntington, AIDS Demenz Komplex und Prionen-
Erkrankungen verstanden.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Figuren und Ausführungsbeispielen
näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.
Fig. 1: Schematische Darstellung des besonders bevorzugten Systems enthaltend
ein Fusions- und ein Transporterprotein.
Das Fusionsprotein besteht aus der Modulationsdomäne, die von der C3- Transferase aus C. limosum abgeleitet ist, und der Bindungsdomäne, die von dem N-terminalen Ende des C2I-Untereinheit des C2-Toxins aus C. botulinum stammt. Die C2II-Untereinheit des C2-Toxins aus C. botulinum stellt den Transporter dar.
Das Fusionsprotein besteht aus der Modulationsdomäne, die von der C3- Transferase aus C. limosum abgeleitet ist, und der Bindungsdomäne, die von dem N-terminalen Ende des C2I-Untereinheit des C2-Toxins aus C. botulinum stammt. Die C2II-Untereinheit des C2-Toxins aus C. botulinum stellt den Transporter dar.
Fig. 2: Verbesserung der motorischen Funktionen nach C3-C2IN-Gabe.
Die Wiederherstellung der motorischen Funktionen unterschiedlich behandelter Tiere wurde in Abhängigkeit von der Genesungsdauer bestimmt. Die mit C3- C2IN in Gegenwart von C2II behandelten Ratten zeigten gegenüber den Kontrolltieren und Tieren, die lediglich mit C2II behandelt wurden, eine deutlich höhere motorische Genesung. Nach 28 Tagen erreichten die C3-C2JN behandelten Tiere auf der BBB-Skala einen Wert von 11,50 (±1,15) im Gegensatz zu den Kontrolltieren und die C2II behandelten Tieren, mit denen Werte von 4,00 (±0,90) und 2,71 (±1,09) erzielt wurden.
Die Wiederherstellung der motorischen Funktionen unterschiedlich behandelter Tiere wurde in Abhängigkeit von der Genesungsdauer bestimmt. Die mit C3- C2IN in Gegenwart von C2II behandelten Ratten zeigten gegenüber den Kontrolltieren und Tieren, die lediglich mit C2II behandelt wurden, eine deutlich höhere motorische Genesung. Nach 28 Tagen erreichten die C3-C2JN behandelten Tiere auf der BBB-Skala einen Wert von 11,50 (±1,15) im Gegensatz zu den Kontrolltieren und die C2II behandelten Tieren, mit denen Werte von 4,00 (±0,90) und 2,71 (±1,09) erzielt wurden.
Die Konstruktion, Expression, Reinigung und Charakterisierung der Proteine
erfolgte wie in DE 197 35 105 A1 Beispiele 1 bis 5 beschrieben.
8-12 Wochen alte, männliche Lewis-Ratten (220-280 g, Charles River,
Sulfeld, GER) wurden zufällig auf zwei Gruppen verteilt und das Rückenmark
mindestens zur Hälfte durchtrennt. Nach 21 Tagen wurde eine Gruppe mit 10 µg
C3-C2IN und eine zweite Gruppe nur mit 10 µg C2II perfundiert. Die
Kontrolltiere erhielten entweder 10 µl C2 alleine (ohne C3-Komponente) oder
eine Transektion ohne Injektion. Alle Tiere wurden unter kontrollierten Licht- und
Temperaturbedingungen gehalten und mit Futter und Wasser zur freien
Verfügung ausgestattet. Die Ratten wurden entsprechend den "International
Health Guidelines" so wie einem von der Universität Tübingen überprüften
Protokoll gehalten.
Die Ratten wurden durch intraperitoniale Injektion von
Ketanest (Ketaminhydrochlorid, Parke Davis: 100 mg/kg) und Rompun
(Xylazinhydrochlorid, Bayer: 10 mg/kg) betäubt. Um eine Austrocknung der
Augen während der Anästhesie zu erreichen, wurden beide Augen mit Oculotect
Gel (Retinolpalmitat, CIBA Vision, Novartis, GER) bedeckt. Nach Erreichen
einer ausreichenden Anästhesie wurde die Haut über der Wirbelsäule geöffnet, die
den Wirbeln anheftenden Muskeln gelöst und zur Freilegung des Rückenmarks
eine Bi-Laminektomie auf Höhe des thorakalen Segments TH8 durchgeführt.
Nach Öffnung der Dura (äußerste, fibröse Hülle des Rückenmarks) wurde der
dorsale Rückenmarksstrang mit einer feinen Iridektomie-Schere durchtrennt, um
eine 2/3 Überhemisektion durchzuführen. Die durchtrennten neuralen Strukturen
waren sowohl motorischen (gekreuzter Teil der Pyramidenbahn, Teile der
extrapyramidalen Bahn) als auch sensorischen (dorsales Rückenmark) Ursprungs.
Die Wunde wurde mit steriler Salzlösung gespült und verschlossen. Alle Tiere
wurden unter Infrarotlicht gewärmt, bis sie das Bewußtsein wiedererlangten.
Alle Ratten erhielten eine
postoperative Schmerztherapie durch eine einzelne intraperitoniale Injektion von
Rimadyl 2 mg/kg (Carproven, Pfizer, GER) und wurden einer manuellen
Blasenentleerung (3 × täglich) unterzogen, bis die spontane Blasenfunktion
wiederhergestellt war (gewöhnlich innerhalb von 10-14 Tagen). Vor dem
Wiedereintritt der spontanen Blasenfunktion wurden die Ratten 2-3 × täglich
gebadet, um Urin-bedingte Wunden zu verhindern. Die Tiere wurden regelmäßig
gewogen und bei einem Gewichtsverlust 20% oder mehr getötet. Für
immunhistologische Untersuchungen wurden Ratten getötet und intrakardial mit
Fixativ (4% Formalin in 0,1 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,5), das 20.000 IU/l
Heparin enthielt, perfudiert. Rückenmark und Gehirn wurden entfernt und über
Nacht bei 4°C nachfixiert. Das fixierte Gewebe wurde in Paraffin eingebettet,
Serienschnitte angefertigt und diese auf Silan-beschichteten Objektträgern
überführt.
Nach Fixierung mit Formalin und Einbettung in Paraffin
wurden rehydrierte 2 µm-Stücke 7 Mal für 5 Minuten in Citratpuffer (2,1 g/l
Natriumcitrat, pH 6) gekocht und mit 10% normalem Schweineserum (Biochrom,
Berlin, GER) inkubiert, um die nicht-spezifische Bindung von Immunglobulinen
zu unterdrücken. Zur Identifizierung bestimmter Zelltypen wurden Antikörper
gegen zellspezifische Antigene benutzt. Dies waren beispielsweise GFAP (Glial
Fibrillary Acidic Protein, Boehringer Mannheim, GER, 1 : 100) für Astrozyten,
MBP (Myelin Basic Protein, Dako, Glostrup, DEN, 1 : 200) für Oligodendrozyten
oder Neurofilament (Dako, Glostrup, DEN, 1 : 200) für Neurone. Mikroglia bzw.
Makrophagen wurden mit monoklonalen Antikörpern gegen ED1 (Serotec,
Oxford, GB, 1 : 100), OX-42 (Serotex, Oxford, BG, 1 : 100) oder ED2 (Serotec,
Oxford, BG, 1 : 200) unter Verwendung des ABC-Verfahrens (avidin-biotin
complex) in Kombination mit alkalinen Phosphatasen-Konjugaten markiert.
Zusätzlich wurden monoklonale Antikörper gegen OX-22 (Serotec, Oxford, GB,
1 : 100) zur Identifikation von B-Lymphozyten und W3/13 (Serotec, Oxford, GB,
1 : 100) zur Identifikation von T-Lymphozyten verwendet. OX-6 (Serotec, Oxford,
GB, 1 : 100) wurde eingesetzt, um MHC-II-Moleküle zur Charakterisierung der
funktionellen Immunkompetenz zu identifizieren. Die Antikörper wurden in den
oben angegebenen Lösungen mit 1% TRIS-gepuffertem bovinem Serumalbumin
(BSA/TBS) auf die Objektträger gegeben. Die Bindung wurde durch Zugabe
eines Biotin-gekoppelten zweiten Antikörper (1 : 400; 30 min.) und eines
alkalischen Phosphatase-konjugierten ABC-Komplexes (1 : 400 in BSA/TBS; 30 min.)
sichtbar gemacht.
Die seriellen Gewebsschnitte,
die zur Immunhistochemie verwendet wurden, wurden mit Luxol Fast-Blue auf
Myelin gefärbt. Ausgehend vom Läsionszentrum wurden rostral und kaudal in
verschiedenen Abständen (0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3,0 cm) die Gebiete des Gewebes
identifiziert, die offensichtlich beschädigt waren oder einen Mangel an Myelin
aufwiesen. Die Kerne wurden mit Kresylviolett (0,1%) angefärbt, um intakte und
beschädigte Gebiete der grauen Substanz unterscheiden zu können. Die Schnitte
zeigten, daß die mit C3-C2IN in Gegenwart von C2II behandelten Ratten weniger
Sekundärschäden aufwiesen. Die Lakunenformation und Höhlenbildung war an
den so behandelten Tieren gegenüber den Kontrolltieren deutlich reduziert.
Gleichzeitig konnten mehr Zellen, weniger Aussparungen und eine erhöhte
Neuronensprossung nachgewiesen werden.
Um exakt definierte Mengen (10 × 1 µl, 10 µg)
von C3-C2IN Toxin in den rostalen Stumpf des durchtrennten Rückenmarks
injizieren zu können, wurden Mikrokapillaren sowie ein stereotaktischer Apparat
benutzt. Um das Rückenmark weiterhin zu stabilisieren, wurde eine Vorrichtung
zur Anhebung der Ratte gebaut, die eine Ausdehnung der Atembewegung auf die
Wirbelsäule blockierte.
30 µl (30 µg, 15 µl pro Seite biotinyliertem
Biodextran (BDA, 10.000 kDa) wurden mittels Hamilton-Spritze in die
motorischen Cortex-Gebiete injiziert. Nach Injektion wurde die Wunde
gewaschen und verschlossen. Diese Methode dient der Darstellung von
regenerierten axonalen Fasern des Corticospinaltrackts (CST). Das biotinylierte
Biodextran wird von den motorischen Kortex-Gebieten in das Rückenmark
transportiert. Alle Fasern, die unterhalb der Läsionsstelle biotinyliertes Biodextran
enthalten, müssen folglich neu gewachsen sein. Die mit C3-C2IN in Gegenwart
von C2II behandelten Ratten zeigten im Vergleich zu den Kontrolltieren ein
deutlich erhöhtes Nervenfaserwachstum. Hierbei war sowohl die Anzahl der
Fasern als auch die Länge der neugewachsenen Fasern deutlich erhöht. Die neu
gewachsenen Fasern waren GAP43+ (Nachweis mittels polyklonaler Antikörper)
womit sie als neuronale, aussprossende Fasern identifiziert wurden.
Die Tiere wurden über einen
Zeitraum von 1-21 Tagen nach dem Verletzungsereignis in Hinblick auf die
Funktionswiederkehr beobachtet und unter Verwendung des "Combined Sensory-
Motor Gale-Score" (Gale K, Kerasidis H, Wrathhall JR, 1985, Spinal cord
contusion in the rat: behavioural analysis of functional neurologic impairment.
Exp Neurol 88: 123-134) unter Einbeziehung der schiefen Ebene (Rivlin AS,
Tator CH, 1977, Objective clinical assessment of motor function after
experimental spinal cord injury in the rat. J Neurosurg 47: 577-581) und dem
"Motor Openfield BBB-Score (Basso D; Beatti MS, Breshnahan JC, 1996, Graded
histological and locomotor outcomes after spinal cprd contsuion using the NYU
wight-drop device versus transection. Exp Neurol 139: 244-256) beurteilt.
In zwei unabhängigen Experimenten zeigten Ratten, welche C3-C2IN erhalten
hatten eine signifikante (p < 0,0001) Verbesserung der sensorischen und
motorischen Funktion im Vergleich zu Ratten, die lediglich aktives oder inaktives
C2-Transporterprotein erhalten hatten oder Ratten, die der Kontrollgruppe
angehörten. Die Verbesserung der sensorischen und motorischen Funktion trat
bereits nach dem dritten Tag ein und erreichte ein Maximum 21 Tage nach dem
Verletzungsereignis. Vor der Applikation wurde die biologische und funktionelle
Aktivität der C3-C2IN-Konstrukte in In-vitro-Versuchen zum Kollaps des
Wachstumskegels überprüft. Es wurden Untersuchungen zur motorischen
Funktion wie Zehspreizung, Ausrichtung, Aufrichtung, schiefe Ebene und zur
sensorischen Funktion wie die Rückzugsreflexe der Hintergliedmaßen als Antwort
auf Zug, Schmerz (manuell und Hitze) und Druck sowie Schwimmtests
durchgeführt. Ein dritter Versuch wurde als doppelblinde Versuchsanordnung
durchgeführt und lieferte identische Ergebnisse.
In einem vierten Experiment wurde die Relevanz der C2-Transporter-
Komponente für die funktionelle Wiederkehr analysiert. Die Mikroinjektion von
C3-C2IN und inaktivierter C2-Komponente resultierte nicht in einer signifikanten
Wiederkehr der Funktion. Diese Ergebnisse belegen, daß das aktive Transporter-
Protein C2 zur Regeneration notwendig ist.
Die Verbesserung der motorischen Funktionen von C3-C2IN-behandelten
Tieren wurde durch das Erscheinen einer funktionaler Haltung der
Hintergliedmaßen (gewöhnlich eine Beugung in der Hüfte, dann den Knien und
zuletzt eine Dorsiflektion in den Knöcheln), die ein Maximum (Mittelwert ±
SEM) von 12,2 Punkten (± 0,84) in der BBB-Wertung (0-21 Punkte)
einschließlich einer Gewichtsunterstützung der Hintergliedmaßen erreichte (Fig.
2). In den meisten Fällen (< 80%) trat die Genesung symmetrisch ein. Die
Kontrolltiere erreichten ein Maximum von 4,1 Punkten (± 0,5) in der BBB-
Wertung und zeigten keine fortschreitende Verbesserung während des
untersuchten Zeitraums. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen anderer
Gruppen (Basso et al., 1996; supra). Am 10. Tag nach der Durchtrennung zeigten
die C3-C2IN-Tiere eine Verbesserung von bis zu 8-9 Punkten ("sweeping") im
Vergleich zu dem ersten Untersuchungszeitpunkt, wogegen die Kontrolltiere unter
3 Punkten lagen. Ausschließlich im ersten Experiment beobachteten wir eine
Verbesserung nach 21 Tagen bis zu 8 Punkten (±0,58) auch in den Tieren, die nur
C2 erhielten. Im zweiten Experiment konnten wir den Effekt einer alleinigen C2-
Gabe bis jetzt nicht bestätigen. Bis zum heutigen Tag war eine signifikante
motorische Genesung einschließlich einer Gewichtsunterstützung der
Hinterextremitäten auf Ratten beschränkt, die C3-C2IN-Konstrukte erhielten.
Keine signifikante motorische Genesung trat bei den Tieren ein, die mit C3-C2IN
mit einer inaktiven C2-Transporter-Komponente, nur mit C2-Transporter-
Komponente oder ohne Zugabe von irgendwelchen Komponenten (Kontrolltiere)
blieben.
Die sensorische Genesung wurde mittels einer senso-motorischen Gale-Wertung
quantifiziert. 21 Tage nach Injektion zeigten C3-C2IN behandelte Ratten ein
vollständiges Zurückziehen der Hinterextremitäten als Antwort auf alle getesteten
Stimuli (Berührung, Mechano-Rezeption, Temperatur) in einer Weise, die
vergleichbar ist mit unbehandelten Ratten. C3-C2IN-Tiere erreichten bis zu 95%
Genesung in dieser kombinierten Wertung, wogegen C2-Tiere oder Kontrolltiere
weniger als 50% Genesung erreichten. Weiterhin wurde ein richtig ausgeprägter
Tastsinn in C3-C2IN-Tieren beobachtet, der essentiell für ein spezifisches
Ausrichten der Hinterextremitäten ist.
Morphologische Veränderungen charakterisiert durch (i) reduzierte
Narbenbildung und (ii) reduzierte sekundäre Schadensphänomene wie
Hohlraumbildung, wurden in C3-C2IN behandelten Tieren beobachtet. Die
Gewebsneubildung wurde durch immunhistochemische Methoden (spezifische
Antikörper, Nukleinfärbung) beschrieben und das die Läsionsstelle überbrückende
Gewebe als Gewebe neuronalen Ursprungs (Neurophilament) identifiziert.
Eine durchgeführte Retranssektion oberhalb der ersten Läsionsstelle (Gh7) führte
bei den Tieren, die eine über 95%ige Regeneration zeigten, führte erneut zur
Lähmung der Hinterläufe. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Regeneration
tatsächlich von corticospinalen Fasern oberhalb der ersten Läsionsstelle, die die
Läsion überbrückten, bewirkt wurde.
Claims (14)
1. Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Fusions
protein und mindestens einen Transporter zur In-vivo-Stimulation des Nerven
wachstums, der In-vivo-Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder In-
vivo-Reduktion eines Sekundärschadens,
wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und mindestens eine Modulationsdomäne zur Änderung der Aktivität von kleinen GTP-bindenden Proteinen enthält,
und der Transporter die Aufnahme des Fusionsproteins in eine Zelle vermittelt.
wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und mindestens eine Modulationsdomäne zur Änderung der Aktivität von kleinen GTP-bindenden Proteinen enthält,
und der Transporter die Aufnahme des Fusionsproteins in eine Zelle vermittelt.
2. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Transporter an eine Struktur an der Zelloberfläche,
insbesondere einen Rezeptor oder ein Oberflächenprotein, bindet.
3. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß der Transporter ein viraler, liposomaler, ein proteinerger
oder peptiderger Transporter ist.
4. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-3, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Transporter von einem binären bakteriellen Toxin,
insbesondere von dem C2-Toxin aus Clostridium botulinum, stammt.
5. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Modulationsdomäne das kleine GTP-bindenden Proteine,
insbesondere Rho A-C, inaktiviert.
6. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-5, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Modulationsdomäne, vorzugsweise durch kovalente Modifi
kation, am meisten bevorzugt durch ADP-Ribosylierung oder Glykosylierung,
das kleine GTP-bindenden Proteine inaktiviert.
7. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Modulationsdomäne das kleine GTP-bindenden Proteine,
insbesondere Cdc42 und Rac, aktiviert.
8. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-7, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Modulationsdomäne von einem Toxin abgeleitet ist.
9. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Toxin ein bakterielles Toxin ist, wobei das Bakterium
insbesondere aus der Gruppe der Gattungen Clostridium, Staphylococcus,
Bacillus, Pseudomonas, Salmonella oder Yersinia ausgewählt ist.
10. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch
gekennzeichnet, daß das Toxin das C3-Exoenzym aus Clostridium limosum
oder eine verwandte Transferase ist.
11. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-10, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Bindungsdomäne ganz oder teilweise ein binäres bakterielles
Toxin, vorzugsweise das C2-Toxin aus Clostridium botulinum, besonders
bevorzugt die C2IN-Domäne enthält.
12. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-11 zur Behandlung
von Neuronenschäden.
13. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-11 zur Behandlung
von Verletzungen des Gehirns und des Rückenmarks.
14. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-11 zur Behandlung
von neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen des zentralen und
peripheren Nervensystems.
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AU2002217149A AU2002217149A1 (en) | 2000-12-22 | 2001-12-20 | Use of a composition for the stimulation of nerve growth, the inhibition of scar tissue formation, the reduction of secondary damage and/or the accumulation of macrophages |
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EP01272037A EP1345619A2 (de) | 2000-12-22 | 2001-12-20 | Verwendung einer zusammensetzung zur stimulation des nervenwachstums, zur inhibition der narbengewebsbildung, zur reduktion eines sekundärschadens und/oder zur akkumulation von makrophagen |
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2001
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