DE10061334A1 - Verwendung von aus embryonalen Stammzellen hergeleiteten Zellen zur Erhöhung der Transplantationstoleranz und zur Wiederherstellung zerstörten Gewebes - Google Patents
Verwendung von aus embryonalen Stammzellen hergeleiteten Zellen zur Erhöhung der Transplantationstoleranz und zur Wiederherstellung zerstörten GewebesInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Zellen aus Zelllinien, die aus frühen Embryonalstadien abgeleitet werden, zur spenderspezifischen Erhöhung der Transplantationstoleranz und zur Wiederherstellung zerstörten Gewebes. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. DOLLAR A Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine spenderspezifische Immuntoleranz zu erzeugen, um eine Abstoßung des transplantierten Gewebes durch eine Immunreaktion zu verhindern und so die Verabreichung von Immunsuppressiva einschränken zu können. DOLLAR A Für die Erzeugung einer spenderspezifischen Immuntoleranz werden embryonalen Stammzellen ähnliche Zelllinien (embryonic stem cell like cell lines, ECL) aus Blastozysten gewonnen und mit genetischem Material des Spenders, das für die MHC-Haplotypen kodiert, transfiziert. Die so erzeugten Zellen werden dem Empfänger schließlich vor der Transplantation zur Erzeugung der Immuntoleranz gegen das zu transplantierende Gewebe bzw. zur Erneuerung bereits geschädigten Gewebes verabreicht.
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Zellen aus Zelllinien, die aus frühen
Embryonalstadien abgeleitet werden, zur spenderspezifischen Erhöhung der
Transplantationstoleranz und zur Wiederherstellung zerstörten Gewebes.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
In der Transplantationsmedizin hat die Entwicklung zunehmend starker Immunosuppressiva
wie Prednison, Cyclosporin, Tacrolimus, Mycophenolatmefetil und Antilymphozyt-
Antikörper die Überlebensdauer der Patienten und die Verweildauer der Transplantate um
durchschnittlich ein Jahr erhöht. Die routinemäßige Anwendung dieser Medikamente hat die
klinische Transplantation zu einer Standardbehandlung gemacht, die für die meisten
nichtmalignen terminalen Erkrankungen des Herzens, der Nieren und der Leber gewählt wird.
Eine Verbesserung der frühen Überlebensdauer der Transplantate wurde jedoch nicht ohne
eine beachtliche infektiöse Morbidität und nichtimmune Nebeneffekte (Gaber et al.,
Transplantation 66: 29-37, 1998) erreicht. Darüber hinaus konnte eine bessere frühe
Überlebensdauer nicht in eine bessere langfristige Überlebensdauer des Transplantates
überführt werden, da die chronische Abstoßung weiterhin die Transplantate nach dem ersten
Jahr in einer Häufigkeit, die sich in den letzten 20 Jahren im wesentlichen nicht verändert hat
(Cecka and Terasaki, Clinical Transplants 1997, Los Angeles, UCLA Tissue Typing
Laboratory, 1998), funktionsunfähig gemacht hat. Außerdem zeigten sich bei längerem
Verfolgen des klinischen Verlaufs von Transplantationen (Pirsch and Friedman, J. Gen.
Intern. Med. 9: 29-37, 1994) zunehmend eine späte Morbidität und Mortalität aufgrund der
weiteren Notwendigkeit einer nichtspezifischen Immunsuppression.
Der Begriff der Immuntoleranz (nachfolgend als Toleranz bezeichnet), der allgemein mit dem
Ausbleiben einer Immunreaktion nach Verabreichung oder Aufnahme eines bestimmten
Antigens (AG) beschrieben werden kann, besitzt in der Transplantationsmedizin eine zentrale
Rolle. Vom Standpunkt des Transplantationsimmunologen kann die Toleranz als anhaltende
Persistenz eines Gewebes in Abwesenheit einer schädlichen Immunreaktion definiert werden,
die ohne andauernden therapeutischen Eingriff erreicht werden kann. In diesem
Zusammenhang ist es wichtig festzustellen, daß die Toleranz keine angeborene Eigenschaft
eines Individuums ist, sondern erworben wird (Owen, Science 102: 400-401, 1945;
Billingham et al., Nature 172: 603-606, 1953). Es ist weiterhin bekannt, daß sich der tolerante
Zustand, der bei der Geburt besteht, ständig verändert und zwar vor allem dann, wenn der
Körper im Laufe des Lebens mit neuen Antigenen konfrontiert wird. Das Immunsystem muß
z. B. in der Lage sein, bestimmte "fremde" Antigene, wie während der Pubertät und
Schwangerschaft freigesetzte physiologische Hormone, zu tolerieren (Fowlkes and Ramsdell,
Curr. Opin. Immunol. 5: 873-879, 1993). Auch die Tatsache, daß sich fötales Leben
entwickeln und in einem an major histocompatibility complex (MRC) nichtangepaßten Wirt
überleben kann, ist ein weiteres Beispiel für die Fähigkeit der Natur, nicht nur zwischen
fremd und nicht fremd, sondern auch zwischen gefährlich und ungefährlich unterscheiden zu
können (Vacchio and Jiang, Crit. Rev. Immunol. 19: 461-480, 1999).
Bei einer allogenen hämatopoetischen Stammzellentransplantation (CD34+) wird eine
erfolgreiche Transplantation in an MHC nichtangepaßten Wirten nur dann erreicht, wenn der
Empfänger sublethal myeloablatiert oder bestrahlt wird.
Um eine Abstoßung des Transplantats durch eine Immunreaktion zu verhindern, werden
gegenwärtig starke Immunsuppressiva verabreicht, die jedoch wiederum eine gesteigerte
Infektanfälligkeit hervorrufen. So können ubiquitäre Keime, die bei einem normal
funktionierenden Immunsystem keinerlei Gefahr darstellen, in einem immunsuppressiven
Zustand schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen. Bei einer Blutstammzellen
transplantation (CD34+) wird zum Beispiel eine erfolgreiche Transplantation in einen an
MHC nichtangepassten Empfänger nur dann erreicht, wenn das Knochenmark des
Empfängers vorher entfernt bzw. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen zerstört wurde.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine spenderspezifische Immuntoleranz zu
erzeugen, um eine Abstoßung des transplantierten Gewebes durch eine Immunreaktion zu
verhindern und so die Verabreichung von Immunsuppressiva einschränken zu können.
Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Für die Erzeugung einer spenderspezifischen Immuntoleranz werden embryonalen
Stammzellen ähnliche Zelllinien (embryonic stem cell like cell lines, ECL) aus Blastozysten
gewonnen und mit genetischem Material des Spenders, das für die MHC-Haplotypen kodiert,
transfiziert. Die so erzeugten Zellen werden dem Empfänger schließlich vor der
Transplantation zur Erzeugung der Immuntoleranz gegen das zu transplantierende Gewebe
bzw. zur Erneuerung bereits geschädigten Gewebes verabreicht.
Der Einsatz der Zellen aus den ECLs als "Toleranzvektoren" wird durch einen Mangel an
MHC-Antigen-Expression und die damit verbundene immunogene Inaktivität der ECL
eröffnet. Durch Untersuchungen wurde festgestellt, daß Zellen von ECLs transplantiert
werden können und langfristig überleben, wobei sie hämatopoetische Zellen unterschiedlicher
Abstammung erzeugen. Darüber hinaus haben diese aus ECL abgeleiteten hämatopoetischen
Zellen einen ständigen gemischten Chimärismus erzeugt (hämatopoetische Zellen des
Spenders und des Empfängers existieren nebeneinander im gleichen Wirt) und schaffen somit
die Basis für eine langfristige Allo-Transplantatakzeptanz. Demzufolge können sie entweder
als ideales Mittel für die Toleranzerzeugung eingesetzt werden oder alternativ in einer
Situation Anwendung finden, in der die parenchymatöse Verletzung eines bestimmten Organs
zu beheben ist.
Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert.
Für die ECL-Isolation wurden drei Rattenrassen gewählt, Wistar Kyoto (WKY), Sprague
Dawley (SD) und ACI.
Aus diesen gewonnene Blastozysten wurden auf durch Mitomyzin inaktivierte
Embryofibroblasten von Mäusen (MEF) oder Ratten (REF) als Versorger gepflanzt. Die MEF
erwiesen sich als besser und beide, MEF und REF, waren eindeutig Gelatine überlegen. Wenn
sich Auswüchse der inneren Zellmasse (ICM) nach dem Anwachsen der Blastozysten an die
Versorgerschicht bildeten, konnten sie gewöhnlich leicht in Gruppen von ES-ähnlichen
Zellklumpen (Primärklumpen) etwa 10 Tage lang erweitert werden (Primärwachstum).
Danach differenzierten sich die Zellen weitgehend in ein Gemisch verschiedener Zelltypen
und wurden bald von runden, locker angebundenen, endodermartigen Zellen überwachsen.
Nur ein kleiner Teil der Zellen aus den Primärklumpen überlebte und wurde zu einer Zelllinie
erweitert.
WKY-Blastozysten wuchsen sehr schnell an, zeigten ein starkes Primärwachstum und mehr
als 10% der Embryos erzielten ständige Zelllinien (Tabelle 1). SD-Blastozysten wuchsen mit
etwas Verzögerung an, erzielten eine moderate Anzahl von Primärklumpen und die
Effektivität der Zelllinienerzeugung war gering. ACI-Blastozysten brauchten die längste Zeit
für das Anwachsen, erzeugten eine sehr kleine Zahl von Primärklumpen und keine Zelllinie
konnte von dieser Rasse erzeugt werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die
Geschwindigkeit, mit der sich die Blastozysten an die Versorgerzellschicht binden, und die
Anzahl der Primärklumpen während des größten Primärwachstums positiv mit der Effektivität
der ECL-Ableitung verbunden (Tabelle 1) sind. Es ist interessant, daß bei den
Hybridblastozysten der WKY-Genotyp die ACI bei der Herstellung der ECLs schlägt, jedoch
nicht den SD-Genotyp (Tabelle 1).
Der Einsatz der Zellen aus den Zelllinien, die aus den embryonalen Stammzellen erzeugt
wurden, als "Toleranzvektoren" zur Herbeiführung einer spenderspezifischen Immuntoleranz
bedingt weiterhin die Expression der spenderspezifischen MHC-Antigene. Diese Eigenschaft
wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß Zellen der ECLs mit den Genen des Spenders,
die für die MHC-Antigene codieren, transfiziert werden. Dies kann durch (i) Fusion der ECL
mit einer gegebenen somatischen Zelle oder Zelllinie erfolgen, die die MHC-Gene, die von
Interesse sind, aufweist, durch (ii) Transfektion der ECL mit einem gegebenen MHC-
kodierenden Plasmid, durch (iii) Schaffung transgener Ratten mit einem MHC-kodierenden
Plasmid und die Erstellung von ECL von dieser Rasse oder durch (iv) Peptid-Beladung der
ECL mit MHC-Allopeptiden der Klasse I, die für die hochpolymorphe α1-Helix eines
spezifischen MHC-Antigens der Klasse I kodieren. Für die Verabreichung der transfizierten
Zellen stehen verschiedene Varianten, z. B. über die Portalvene, durch intraperitoneale,
subkutane oder intravenöse Injektion, zur Verfügung.
In der klinischen Praxis der Organtransplantation wird dadurch die Möglichkeit geschaffen,
die Alloreaktion der Empfänger durch die Verabreichung von ECLs, die die
spenderspezifischen MHC-Antigene exprimieren, zu modifizieren. Eine exakte
Phänotypisierung und morphologische Charakterisierung der von ECL abgeleiteten
Abkömmlinge ermöglicht, ähnliche Zellen mit Stammzellenmerkmalen im erwachsenen Wirt
zu suchen. Dies ermöglicht, zu einem besseren Verständnis der Elastizität der aus einem
erwachsenen Gewebe hergeleiteten Stammzellen zu kommen, die, alternativ zu den ECL,
die ECL-Eigenschaften teilen und in ähnlicher Form verwendet werden können.
Mausembryofibroblasten (MEF) oder Rattenembryofibroblasten (REF) werden aus 13-14-
Tage schwangeren Tieren bereitet, die mitotisch inaktiviert wurden durch 3-5 Behandlungen
mit Mitomyzin C (10 µg/ml) 2 oder 1 Stunden lang, gewaschen mit Phosphat gepufferter
Salzlösung (PBS) und in Nunc 4-Muldenschalen (well-dishes) gepflanzt. Die Blastozysten
werden mit PBS/20% FCS (fötales Kälberserum) oder einem Kulturmedium aus dem Uterus
von 4,5 Tage schwangeren Ratten gespült, auf inaktivierte Embryofibroblasten gepflanzt und
3-4 Tage in DMEM/15% FCS/2,500 µ/ml LIF ("Leukemia inhibiting factor", ESGRO, Life
Technologies) mit Zusätzen (Iannaccone et al., Dev. Biol. 1994; 163: 288-292) in einem
Medium von 6% CO2/Luft unbehandelt belassen. In dieser Zeit entwickeln sich die
Blastozysten und binden sich an den Versorger, und die ICM beginnt zu wachsen, wobei die
Effizienz vom genetischen Hintergrund abhängt. Auswüchse mit einer ES-zellenartigen
Erscheinung werden aufgenommen und in mehrere Klumpen zerbrochen durch Ansaugen in
gezogene Glaskapillaren mit einem etwas geringeren Durchmesser als die Auswüchse und auf
frische Versorgerplatten aufgebracht. Das Aufnehmen und Zerbrechen erfolgt entweder
täglich oder jeden zweiten Tag. Zerfallene Kolonien werden reihenweise zurückgesetzt, bis
man eine kleine Zahl sauberer, stabil wachsender ES-artiger Klumpen erhält. Die Population
der Klumpen wird dann auf mehrere Dutzend erweitert, in 35-mm-Schalen aufbewahrt und
leicht trypsiniert in ein Gemisch einzelner Zellen und kleiner Aggregate. Die hergestellten
Ratten-ES-Zellen wurden jeden oder jeden zweiten Tag durch Trypsinierung (0,05% Trypsin,
0,02% EDTA-4Na, 1% Hühnerserum, in Ca/Mg-freier PBS) passagiert. Die Artenidentität
der sich ergebenden Zelllinien wird durch PCR, unter Anwendung von Renin-Gen-Primern
(Brenin et al., Transplant. Proc. 1997; 29: 1761-1765), geprüft, um eine Verunreinigung durch
Maus-ES-Zellen auszuschließen.
Eine erste Reihe von Experimenten untersuchte das Schicksal einer einmaligen intraportalen
Injektion von 1,0 × 106 von WKY abgeleiteten ECL in allogene DA(RT1.av1)-Wirtsratten, die
keinerlei immunsuppressive oder myeloablative Behandlung erhalten haben. Die
Untersuchungen zeigen, daß diese Zellen langfristig (< 150 Tage) in DA-Wirtsratten
überleben können. Dabei wurde herausgefunden, daß die ECL und ihre Abkömmlinge einen
Zustand eines ständig gemischten Chimärismus (Hämatopoetische Zellen des Spenders und
des Empfängers bestehen nebeneinander im gleichen Wirt) erzeugen können. Weiterhin
wurde herausgefunden, daß sich diese Zellen in hämatopoetische Zellen differenzieren, die
MHC-Antigene der Klasse II (Ox-3) und B-Zellenabstammungsmarker (Ox-45) exprimieren.
Der monoklonale Antikörper (mAb) Ox-3 ist ein spezifscher Antikörper eines (WKY)-
MHC-Spenders der Klasse II, der sich an MHC-Epitope der Klasse II bindet, die an WKY
exprimiert werden, jedoch nicht an positive DA MHC-Zellen der Klasse II. Eine
fließzytometrische Bestimmung von doppelt gefärbten Leukozyten (WBC) ergab, daß 3 bis 5%
der WBC, die DA-Ratten entnommen wurden (100 Tage nach der ECL-Injektion), Ox-3+-
Zellen exprimierten, wobei 15-20% der Milzlymphozytenpopulation Ox-3+ enthielten.
Diese Ergebnisse weisen die Tatsache nach, daß ECL hämatopoetische Zellen erzeugen
können. Dementsprechend wurden Ox-3+-Zellen histomorphologisch (10-15%) im
interstitiellen Raum der Empfänger-(DA-)Herzen nachgewiesen, die selektiv 100 Tage nach
einer einmaligen intraportalen Injektion von 1,0 × 106 von WKY abgeleiteten ECL zerstört
wurden (siehe Abb. 1).
Der stabile chimärische Zustand dieser Tiere schafft die Grundlage für die Untersuchung des
Schicksals der WKY-Herzallotransplantats, die in DA-Ratten transplantiert wurden, sieben
Tage nach der intraportalen ECL-Injektion. Kaplan Meier Diagramme zeigen, daß die
Vorbehandlung der DA-Ratten mit 1,0 × 106 ECL intraportal und die Herztransplantation
(HTx) sieben Tage später zu einer langfristigen (< 150 Tage) abstoßungsfreien
Allotransplantatakzeptanz führten, während nichtbehandelte DA-Ratten die WKY-Allografts
akut abstießen (siehe Abb. 2). Gleichzeitig wurden die Herzallotransplantate von CAP-Ratten
von mit WKY-ECL injizierten DA-Ratten innerhalb von 12,4 ± 1,4 Tagen abgestoßen, was
die Immunkompetenz dieser Ratten beweist.
In primären in vitro Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass die zuvor beschriebenen ECL-
Zellen durch Ko-Kultivierung mit somatischen Zellen neuronalen oder entodermalen
Ursprungs, eine Differenzierung in Astrozyten respektive Kardiomyozyten und Hepatozyten
annehmen. Damit eignen sich die beschriebenen embryonalen Zelllinien auch zur Behandlung
Organ-spezifischer Erkrankungen des Zentralnervensystems (z. B. als dopaminerge Zellen zur
Behandlung des M. Parkinson, als Hepatozyten zur Behandlung der Leberzirrhose oder als
Kardiomyozyten zur Behandlung frischer Herzinfarkte). Die nunmehr anstehende Isolierung
der für diese spezifischen Differenzierungsformen notwendigen Signalproteine ist von großer
klinischer Bedeutung, da sie ein problemloses Programmieren der ECLs zur gewünschten
Zellpopulation ermöglichen konnte. Das Ziel besteht daher in der exakten Sequenzierung
dieser Funktionsproteine, um deren rekombinante Herstellung zu ermöglichen. Die große
Sequenzhomologie zwischen Ratten- und Menschprotein würde darüber hinaus auch
Aufschlüsse zur analogen Herstellung menschlicher Funktionsproteine geben. Die damit
verbundenen therapeutischen Anwendungsmöglichkeiten umfassen sowohl den voran
beschriebenen Einsatz der ECL abgeleiteten somatischen Zelllinien als auch der daraus
abgeleiteten Funktionsproteine für den zukünftigen klinischen Einsatz auf allen
Indikationsebenen des Tissue-Engineering zum Organersatz, für Gentherapie und zur
Behandlung metabolischer Erkrankungen im Bereich des ZNS, der Leber und des Herzens.
Claims (18)
1. Verfahren zur Erzeugung einer spenderspezifischen Immuntoleranz gegen transplantierte
Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß dem Empfänger vor der Transplantation Zellen
verabreicht werden, die von frühen Embryonalstadien, z. B. Blastozysten, abgeleitet
wurden ("embryonal stem cell like cell lines", ECL).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verabreichten Zellen mit
MHC-Genen und/oder Reportergenen transfiziert wurden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit den
spenderspezifischen MHC-Genen transfiziert wurden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion durch eine
Fusion der ECL mit einer somatischen Zelle oder Zelllinie erfolgt, die die
spenderspezifischen MHC-Gene aufweisen.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion mit einem
bestimmten MHC-kodierenden Plasmid erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion durch
Schaffung transgener nichtmenschlicher Säugetiere mit einem MHC-kodierenden Plasmid
und die Herstellung von ECL von diesen transgenen Tieren erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion durch Peptid-
Beladung der ECL mit MHC-Allopeptiden der Klasse I, die für die hochpolymorphe α1-
Helix eines spezifischen MHC-Antigens der Klasse I kodieren, erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die verabreichten Zellen mit
einem LacZ-Plasmid transfiziert wurden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen von
humanen Zelllinien eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen 3-7
Tage vor der Transplantation zugeführt werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen
intravenös zugeführt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen intraportal
zugeführt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen
subkutan zugeführt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen
intraperitoneal zugeführt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ECL Zellinie als
Ausgangszelle zur Differenzierung in neuronale Zellen mit spezifischer
Transmitterfunktion (z. B. Dopamin) programmiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ECL Zellinie als
Ausgangszelle zur Differenzierung in Hepatozyten zur Unterstützung der leber
spezifischen Metabolismen programmiert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ECL Zellinie als
Ausgangszelle zur Differenzierung in Kardiomyozyten zur Regeneration der
Herzmuskelfunktion programmiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die infolge der Ko-Kultivierung
gefundenen Signalproteine mit spezifischem Differenzierungspotential für neuronale
Zellen (dopamin-produzierende Zellen), Hepatozyten und Kardiomyozyten als
rekombinante Proteine hergestellt werden.
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