JPH08501451A

JPH08501451A - 異種移植臓器移植片の事前適応化、その他を目的とする膜間転移によるタンパク質の供給法

Info

Publication number: JPH08501451A
Application number: JP6508379A
Authority: JP
Inventors: バーン、ゲイラード、ダブリュ．; クーイマン、デービッド、リー; ローガン、ジョン、スティール
Original assignee: DNX Biotherapeutics Inc
Current assignee: DNX Biotherapeutics Inc
Priority date: 1992-09-22
Filing date: 1993-09-22
Publication date: 1996-02-20
Also published as: AU5132593A; FI951325A; CA2144767A1; WO1994006903A1; AU671158B2; NO951074D0; NO951074L; FI951325A0; EP0662125A1

Abstract

(57)【要約】ＧＰＩの結合されたタンパク質が脊椎動物の運搬細胞から目標とする脊椎動物の組織に、特にインビボで移転させられる。例えば、異種移植が目的の場合、例えば遺伝子操作された赤血球のような受容体種に特異的な補体阻害因子を有する細胞を、補体阻害因子の移転が行われるまで第２の不調和な供与体種の移植可能な細胞と共にインキュベーションする。移転はインビボであるいはインビトロで生ずるが、補体阻害因子を有する細胞は、受容体種の補体阻害因子をコードする遺伝子を発現する受容体種の正常細胞か、または供与体種の遺伝子操作された細胞である。この方法はブタ臓器をヒトに異種移植するとき修飾するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】異種移植臓器移植片の事前適応化、その他を目的とする膜間転移によるタンパク質の供給法発明の背景本願は1992年9月22日付出願の米国特許出願第07/948,521号の一部継続出願である。発明の分野本発明は目標とする脊椎動物あるいは脊椎動物から単離した組織または臓器にタンパク質を供給する分野に係る。１実施例では、タンパク質が補体インヒビターとなって、異種移植臓器移植片の血管内皮に供給される。背景技術の説明細胞膜細胞膜は、細胞内のプロセスを外部から保護する壁であると同時に、その周囲にあるものと交流するためのインターフェイスでもある。膜内のタンパク質受容体が刺激に応答し、細胞の機能を活動させたり停止させ、それによってたくさんの細胞のタイプの優勢な特徴や機能を決定するという複雑な機構内にあって、特に重要なものである。細胞膜は、脂質、タンパク質および炭水化物からできている（細胞膜の液体モザイクモデルの研究に関する、Singer S．J．Nicolson G．L ．(1972)参照）。脂質は、グリセロール、ホスフェート、その他の成分を含有する親水性の頭部[heads]と、14−18炭素の２本の炭化水素鎖からなる疎水性の尾部[a tail]と、を有する分極化したリン脂質分子である。ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルコリンは、殆どの動物および植物細胞の細胞膜に見られる３つの共通したリン脂質である。これら分子の分極性[polarized nature]のゆえに、水性環境にあってこれら分子は、疎水性の尾部を二分子層の内側にし、親水性の頭部を外表面にした１つの脂質二分子層［a lipid bilayer］へと自動的に結合する。これが全ての（原）形質膜［p lasma membranes］に見られる基本的な脂質構造である。この脂質二分子層のほかにも細胞膜［cell membranes］は、細胞の内側と外側の両方に複雑なモザイク面を形成する炭水化物とタンパク質の列［an array］を有している。炭水化物成分は、糖脂質を産生する脂質の頭部および糖タンバク質と呼ばれる膜関連タンパク質の両方に共有結合的に付いている。内在性の膜タンパク質細胞膜に組み込まれているタンパク質（内在性タンパク質）は、二分子層の内側領域とタンパク質の疎水性ドメインとの疎水性相互作用によって定位置に保持されている。疎水性タンパク質トメインは通常、１９個またはそれ以上の疎水性アミノ酸からなるαへリックスを有している。内在性膜タンパク質は、イオンや代謝中間体の運搬、細胞・細胞間の相互作用、細胞・基質の付着、ホルモンとサイトカイン［cytokine］の受容、および内在的な細胞骨格エレメントとの相互作用などの細胞機能の根幹路［a wide array］を制御している。タンパク質はいくつかの方策によって細胞膜中に取り込むことができる（内在性膜タンパク質の構造に関するCapalid，Roderick A. (1982) Trends in Biolog ical Science 7:292-295参照）。ノイラミニダーゼのような球状膜タンパク質は、よく１本の長い疎水性アミノ酸配列を持っていることがあり、こうしたアミノ酸配列は、膜表面に露出する親水性の球状触媒ドメインをそのままにして、脂質二分子層に球状タンパク質を結び付ける(Fields,S.,Winter,G.,とBrownlee,G.G. (1981)Nature 290:213-217参照）。その他のトランスメンブランタンパク質は、膜の両側に突出するタンパク質の親水性の部分と共に脂質二分子層中に埋め込まれた１つ（グリコホリン）または多数（シトクロムｃオキシダーゼ）の疎水性アミノ酸配列をもつことがある。ＧＰＩで固定された膜タンパク質細胞膜にタンパク質をアンカー（固定）させるのに使われるより一般的な方法は、新しく形成されたポリペプチドに糖脂質を共有結合的に翻訳後に追加する方法である。このような脂質アンカーの最大の特徴は、グリコシルホスファチジルイノシトール［glycosyl-phosphatidyl inositol］（ＧＰＩ）が付加していることである。ひとたび付加されると、ホスファチジルイノシトール部分の炭化水素は二分子層の疎水性空間に埋め込まれる。こうしてＧＰＩ基はタンパク質を細胞膜につなぎ留め、アンカーする機能を果たす。ＧＰＩ合成および付加については Ferguson (1991)参照。ＧＰＩアンカーのあるタンパク質としては、加水分解酵素、細胞間付着分子、免疫細胞調節または補体調節に関与するタンパク質、および寄生生物に発現する多くのタンパク質などがある。これらのタンパク質のあるものについて、特に加水分解酵素および補体調節タンパク質については、その細胞機能はよく定義されていると考えられるが、その他のタンパク質については、その細胞機能はさまざまな細胞プロセスにとって明らかに重要であるにも拘わらず十分に理解されていない。これらタンパク質の機能はさまざまであるが、ＧＰＩで結合されているタンパク質にはいくつか共通の特徴がある。ＧＰＩ結合が存在することは内在性膜タンパク質に無関係な特殊な化学的可能性があることを示す。ＧＰＩアンカーは亜硝酸による脱アミノ化およびホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤ（ＰＩＰＬＤ）およびホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ−２）に感受性である。ＧＰＩ結合の存否を検出する試験には通常細菌ＰＩＰＬＣが常用される。というのはこの酵素こそ細胞の表面からＧＰＩの結合しているタンパク質の集団［population］の少なくとも一部分を取り除くことができるからである。イノシトールの環がエステル結合した脂肪酸で修飾されると、ＧＰＩアンカーはＰＩＰＬＣに感受性でなくなる。そしてこうした修飾およびその他の修飾は、ＰＩＰＬＣ抵抗性のＧＰＩタンパク質が存在することを物語る。Walter,Elizabeth I．，Roberts，William L ., Rosenberry, Terrone L., Ratno ff,William D.,とMedof,M.Edward,(1990),“Structuralbasis for variations i n the sensitivity of human decay accelerating factor to phosphatidylinos itol-specific Phospholipase C cleavage,”Journal of Immunology, 144:1030 -1036参照。ＰＩＰＬＣ加水分解へのＧＰＩ結合の感度および頻繁に観察される多数の可溶型のＧＰＩ結合したタンパク質の存在は、ＧＰＩアンカーがＧＰＩ結合した表面タンパク質の放出を制御する方法を細胞に提供しているのかもしれないということを示唆している。例えばリポタンパク質リパーゼが3T3-L1アジポサイト［adip ocytes］からＰＩＰＬＣによって放出されるが、これはそのＧＰＩアンカーを示し、またインシュリンの生理的に関連するレベルによる刺激でも放出される。Ch an, Betty Liwah, Lisanti, Michael P., Rodriguez-Boulan,Enrique, とSaltie l,Alan R.(1988), “Insulin-stimulated release of lipoprotein lipase by m etabolism of its phosphatidylinositol anchor,"Science, 241:1670-1672参照。同様の観察が、5'-ヌクレオチダーゼ、アルカリホスファターゼ及びヘパリンサルフェートプロテオグリカン［heparin sulfate proteoglycan］のようなその他のＧＰＩ結合したタンパク質についても認められている。Lisanti, Michael P ., Rodriquez-Boulan, Enrique,とSaltiel,Alan R.,(1990), “Emerging functi onal roles for the glycosy-phosphatidylinositol membrane prcotein anchor ,”Journal of Membrane Biology, 117:1-10参照。細胞に対するインシュリン効果は、（原）形質膜［plasma membrane］の内側のグリコシルホスファチジルイノシトール分子を加水分解する特異的ホスホリパーゼを活性化し、事後的に他のインシュリン感受性酵素を調節するジアシルグリセロール［diacyglycerol］およびイノシトールリン酸グリカンを放出することによって発生させられるものと考えられている。Saltiel,A.R.,Fox, J.A.,Sherl ine P.,とCuatrecasas, P., (1986),Schience, 233:967)参照。遊離のグリコシルホスファチジルイノシトールはＧＰＩアンカー中のものと構造的に類似しているが、インシュリン依存性の加水分解は細胞質中で生ずるもので、細胞外の膜タンパク質に影響することは稀であろうということに留意されなければならない。こうした表面タンパク質の放出がＧＰＩアンカーの加水分解を介して発生しているのであれば、細胞膜の面上または面内で活動する追加的なインシュリン依存のホスホリパーゼの存在を予想することになる。このような酵素は、哺乳類ＰＩＰＬＤが豊富な血清タンパク質［an abundant serum protein］として知られてはいるが、まだ確認されていない。Davitz,Michael A.,Hom,Judy,とSchenkman,Ser gio,(1989),“Purification of a glycosyl-phosphatidylinositol-specific ph ospholipase D from human plasma,”Journal of Biological Chemistry, 264:1 3760-13764参照。ＰＩＰＬＤはＧＰＩタンパク質を細胞表面から放出できないので、ＰＩＰＬＤが問題の酵素であるとは考えにくい。しかし、この酵素はＧＰＩアンカーを溶液中のタンパク質から加水分解することができるので、流れ出たタンパク質からＧＰＩアンカーを除去することに関与している可能性がある。いずれにしてもインシュリンまたはサイトカイン調節による流出を介して細胞から放出された溶解タンパク質は、インビボで起こった場合、無傷の［intact］G P Iアンカーを有するとは考えられない。脂質アンカーの結果、ＧＰＩ結合したタンパク質は、しばしば膜の面［plane ］内において促進された流動性を示す。Thy-l,DFA,アルカリホスファターゼ、その他のＧＰＩ結合タンパク質は、遊離の脂質よりは低いが、トランスメンブランタンパク質よりは高い拡散係数を有することを示している。しかしながらこれは、全てのＧＰＩ結合タンパク質について言えることではなく、一定のタンパク質は全体［population］の一部だけしか促進された流動性を示さない。しかしタンパク質によっては、膜の面内の促進された流動性は、それらタンパク質の既知の機能ないし推定の機能にぴたり一致する。例えば、ＣＤ５９とＤＡＦは双方とも補体活性化［complement activation］を調節する。ＣＤ５９はＣ９の重合に干渉して膜侵襲複合体の形成を阻止し、ＤＡＦはＣ３転換酵素［convertase］の形成を阻止して現存のＣ３転換酵素の分解を促進する。膜面内の促進された流動性は、こうした調節タンパク質が、活性な補体攻撃部位に遭遇する蓋然性を増大させる。ＧＰＩ結合のタンパク質はまた、分極した上皮細胞の頂点面に区分けされることが認められた。この区分け挙動はＧＰＩ部分によって少なくとも部分的にはシグナルされるであろう。例えば単純ヘルペス糖タンバク質Ｄは正常には分極したＭＤＣＫ細胞の基底外側［ basolateral］に発現される。ＧＰＩ付加のための信号を有しているＤＡＦのカルボキシ末端の３７個のアミノ酸が糖タンパク質Ｄの細胞質ドメインに融合されると、その結果生ずるＧＰＩ結合した融合タンパク質は、基底外側ではなく頂点面に運搬される。こうしてＧＰＩ結合の付加は最も有力な頂点への区分けシグナルとして作用するように考えられる。。Lisanti, Michael P., Caras, IngridW. , Davitz, Michael, A.,とRodriguez-Boulan,Enrique, (1989),“A glycophosph olipid membrane anchor acts as an apical targeting signal inpolarized ep ithelial cells,”Journal of Cell biology, 1- 09:2145-2156; Lisanti,Micha el P.,Le Bivic,Andre,Saltiel,Alan R.,とRodriguez-Boulan, Enrique, (1990) ,“Preferred apical distribution of glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) anchored proteins: A highly conserved feature of the polarized epithelia l cell phenotype,”JournalMembrane Biology, 113:155-167参照。ＧＰＩ結合タンパク質に共通する特徴は細胞膜中に自発的に挿入していく能力であるようである。ＧＰＩアンカーが無傷のままになるようにしてＤＡＦが細胞から単離されると、精製したタンパク質は、機能的に細胞の形質膜中に組み込まれる異種細胞に与えることができる。Medof, M.Edward, Kinoshita, Taroh,とNu ssenzweig,Victor, (1984),“Inhibition of complement activation on the su rface of cells after incorpor ation of decay-accelerating factor (DAF) into their membranes,” Journal of Experimental Medicine, 160:1558-1578参照。この膜への組込みが無傷のＧＰＩアンカーに依存するということは明らかである。というのは遺伝子組換えで作られた可溶性のＤＡＦはそれ自体膜中に挿入し得ないからである。Moran, Pau l, Beasley, Hannah, Gorrell, Aldona, Martin, Evy,Gribling, Peter, Fuchs, Henry, Gillet, Nancy, Burton, Louis E.,とCaras, Ingrid W., (1992),“Hum an recombinantsoluble decay accelerating factor inhibits complement acti vation in vitro and in vivo,”Journal of Immunology 149:1736-1743参照。同様の研究がＣＤ５９とＴｈｙ−１を使って行われた。Rollins, Scott A.,とSi ms,Peter J. (1990),“The complement-inhibitory activity of CD59 resides in its capacity to block incorporation of C9 into membrane C5c-9,"Journa l of Immunology, 144:3478-3483; Zhang,Fen,Schmidt, William G.,Hou,Yu,Wil liams,Alan F., Jacobson,Ken,(1992),“Spontaneous incorporation of the gl ycosyl-phosphatidylinositol-linked protein Thy-1 into cellmembranes,”Pr oceeding of the National Academy of Science,89:5231-5235参照。いくつかのＧＰＩ結合タンパク質は可溶性の非ＧＰＩ結合類似体を有している。ある場合には、可溶型はｍＲＮＡの異なるプロセッシングに由来するものであり、分泌タンパク質をもたらす。このほかの場合には可溶型はＰＩＰＬＣまたは膜結合タンパク質のプロテアーゼ加水分解に由来するものと考えられている。。殆どの場合、こうした可溶性タンパク質はＧＰＩアンカーをもはや有していない。我々が知っている唯一の例外は、一定の組織にＤＡＦおよびＣＤ５９を含有する可溶性ＧＰＩが存在することである。Rooney,I .A.,とMorgan,B.P., (1992),“Characterization of the membrane attach comp lex inhibitcory Protein CD59 antigen on human amniotic cells and in amni otic fluid,”Immunology, 76:541-547参照。可溶性ＧＰＩ結合型は羊水および ***のような、補体作用［complement activity］にとって高い可能性がある領域に典型的に認められ、細胞外小胞体に関連している。Rooney,Isabelle A., At kinson, John P., Krul, Elaine S., Schonfeld,Gustav,Polakoski,Kenneth,Saf fitz, Jeffrey E.,とMorgan,B.Paul,(1993)“Physiologic relevance of the me mbrane attach complex inhibitory protein CD59 in human seminal plasma: C D59 is present on extracellular organelles (postasomes), binds cell memb ranes, and inhibits complement-mediated lysis,”Journal of Experimental Medicine,177:1409-1420参照。これら脂質小胞体中のＧＰＩ結合タンパク質の起源については知られていない。例えばＧＰＩ結合タンパク質が細胞表面から流出して、次に小胞体中に組み込まれるのか、あるいは細胞から流出した小胞体が既にタンパク質を有しているものなのかどうかについては明らかでない。トランスメンブランタンパク質とは異なり、ＧＰＩ結合タンパク質は細胞質（細胞内の）ドメインを有していない。細胞質ドメインが存在しないということは、ＧＰＩ結合タンパク質というものは膜を通過するシグナル変換ができないことを示唆しているのかもしれない。しかし本件についてはそうではないようだ。細胞増殖またはサイトカイン放出により測定されたシグナルトランスダクション（変換）は多くのＧＰＩ結合タンパク質について、Ｔ細胞またはＢ細胞（Thy-1,Ly-6,RT-6,DAF,Qa-2,5'-ヌクレオチダーゼ）、単球（CD 14,LFA-3）および胸腺上皮（LFA-3）上に証明されている。詳しくはLublin, D.M .,- (1992)“Glycosyl-phosphatidylinositol anchoring of membrane proteins ,”Current Topics in Microbiology and Immunology,178:141-1162参照。このシグナル形質導入にとってＧＰＩ部分が必要とされることを示すよい証拠がある。Ｑａ−２、マウス第１類抗原、の架橋は、正常にはＴ細胞の増殖をもたらし、マウスＨ−２第１類抗原の抗体架橋は***促進的でない。正常Ｑａ−２またはＱａ−２の細胞外部分をＨ−２Ｄ^bのトランスメンブランドメインに融合することによって生成するトランスメンブラン型か、またはＨ−２Ｄ^bの細胞外ドメインをＱａ−２のＧＰＩ付着シグナルに融合することによって生成したＨ−２Ｄ^bのＧＰＩ結合型を発現する遺伝子導入（トランスジエニック）マウスが生成された。こうした動物から得たＴ細胞は、正常Ｑａ−２およびＧＰＩ結合Ｈ−２Ｄ^b− Ｑａ−２融合を架橋している抗体がＴ細胞増殖を引き出すものであることを証明する。対照的に、トランスメンブランＱａ−２−Ｈ−２Ｄ^b融合タンパク質の架橋は***促進的ではなかった。Robinson, Peter J., Millrain, Margaret, Antoniou, Jane, Simpson,Elizabeth,とMello r,Andrew L., (1989),“A glycophospholipid anchor is required for Qa-2-me diated T cell activation,”Nature,342:85-87参照。いくつかのＧＰＩアンカータンパク質がp571ck、および細胞内タンパク質キナーゼと会合する［associat e with］ことが報告されている。Sefanova, I.,Horejsi, V., Ansotegui, I.J., Knapp, W.,とStockinger,H.,(1991),“GPI-anchored cell-surface molecules complexed to protein tyrosine knases,”Science,254:1016-1019参照。キナーゼとの会合のメカニズムおよび手段については何も知られていないが、これはＧＰＩアンカーされたシグナル変換のために可能な経路を提供する。ＧＰＩの結合したタンパク質の病理学上の役割発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）は、ＧＰＩ結合タンパク質が重要な役割をするヒトの疾病である。PNHは造血幹細胞に影響する後天的な造血疾病である。これら影響を受けた幹細胞は、あらゆるＧＰＩ結合タンパク質が減少もしくは剥奪されている赤血球、単球、顆粒球、Ｂ細胞および好中球などのさまざまな血液細胞を産生する。PNHは、ＧＰＩ生合成の初期段階にみられるPIG-A遺伝子の後天的な体細胞変異によって引き起こされる。Takeda, Junji, Miyate, Toshio, K awagoe, Kazuyoshi, lida, Yoshiyasu, Endo, Yichi, Fujita, Teizo, Takahash i, Minour, Kitani, TeruoとKinoshita, Taroh, (1993),“Deficiency of the ＧＰＩ anchor caused by a somatic mutatio n of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,”Cell, 73:70 3 711参照。 PNH患者の赤血球などの血液細胞は通常と異なり、補体を介在させた細胞溶解に感受性がある。この現象は、ともに赤血球に発現するＧＰＩ結合タンパク質ＤＦＡとＣＤ５９の喪失と一致する。Okuda, Keikc, Kanamaru, Akihisa, Ueda Et suko, Kitani,Teruo, Okada, Noilo, Okada, Hidechika, Kakishita,EizoとNaga i,Kiyoyasu,(1990),“Exression of decay-accelerating factor on hematopoie tic progenitors and their progeny cells grown in cultures with fracticin ated bone marrow cells from normal individuals and patients with paro- x ysmal nocturnal hemoglobinuria,”Experimental Hematology,13:1132-1136; F letcher,A.,Bryant, J.A.,Gardner,B.,Judson, P.A., Spring, F.A., Parsons, S.F., Mallinson,G.とAnstee,D.J.,(1992),“New monoclonal antibodies in CD 59: use for the analysis of peripheral blood cells fromparoxysmal noctur nal hemoglobinuria (PNH) patient and for the quantitation of CD59 on nor mal and decay accelerating factor (DAF)-deficient erythrocytes,”Immunol ogy, 75:507-512参照。実際、これら影響を受けた赤血球にＣＤ５９を外来的に付加し組込ませることは補体に対する赤血球の抵抗力を格段に改善する。Okada, N., Harada, R., Taguchi, R.とOkada,H.(1989),“Complete deficiency of 20 kDa homologous restriction factor (HRF20) and restoration with purif ied HRF20.” Biochemical, Biophysical Research Communication,164:468-473 参照。補体による細胞溶解に対して感受性である上に、PNH患者は細菌性感染を受けやすくなっている。FcRIII(CD16)は、好中球、大顆粒リンパ球、好酸球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、およびある種のＴ細胞上に存在するＧＰＩが結合した免疫グロブリン受容体である。ＧＰＩ結合型は赤血球では１細胞につき 135,000箇所に存在し、最も広く認められる血液中のIg- レセプターの形態である。別の遺伝子でコードされたトランスメンブラン型はマクロファージおよびナチュラルキラー細胞で発現される。ＧＰＩが結合したPcRIIIは免疫複合体による好中球活動にとって優勢な受容体であるようである。Hundt,MatthiasとSchmidt, Reinhold E. (1992),“The glycophosphatidylinositol-Iinked Fc receptor II I represents the dominantreceptor structure for immuno complex activatio n of neutrophils，”European Journal of Immunology, 22:811-816参照。PNH に冒された好中球ではこのＧＰＩがアンカーしているタンパク質の発現は見られない。このことは循環している免疫複合体の存在およびPNH患者における細菌性感染に対する感受性を説明する一助となろう。Selvaraj, Periasamy, Rosses, W enda1 F., Silber, RobertとSpringer, Timothy M. (1988),“Themajor Fc rece ptor in blood has a phosphatidylinositol anchor and is deficient in paro xysmal nocturnal hemoglobinuria，”Nature, 333:565-567: Simmons,DavidとS eed, Brian, (1988), “The Fc receptor of natural killer cells is a phospholipid-link ed membrane Protein,” Nature,333:568-570参照。ある種の病理学的症状はＧＰＩタンパク質発現の変形されたパターンに関連している。さまざまな免疫不全疾病の中にはＢ細胞およびＴ細胞に発現される5'- ヌクレオチダーゼのレベルは減少している。この減少は発現レベルにおける真の減少であって、Ｂ細胞、Ｔ細胞数の減少ではないと思われる。5'-ヌクレオチダーゼはこれら細胞の成熟度を測定するための有益なマーカーたり得ると考えられる。Thompson, Linda F., Ruedi, Julie M.とLow,Martin G., (1987),“Purific ation of 5'-nucleotidase from human placenta after release from plasma m embranes by phosphatidylinositol-specific phospholipase C.,”Biochemical and Biophysical Research Communications,145:118-125; Thompson,Linda F., Ruedi, Julie M., Low,Martin G.とClement,Loran T., (1987)Journal of Immun ology,139:4042-4048参照。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質ＣＥＡは、腺癌中に最初に同定された腫瘍関連抗原である。循環ＣＥＡのレベルは、結腸癌その他の悪性腫瘍をモニターするのに広く利用されている。循環ＣＥＡは感染していない［in tact］ＧＰＩアンカーを一つも含んでいないように見える。Jean, Frederic, Ma lapert, Pascale, Rougon, GenevieveとBarbet, Jacques，(1988)，“Cell memb rane, but not circulating carcinoem bryonic antigen is linked to a phosphatidylinositol-containing hydrophob ic domain.,” Biochemical and BophysicalResearch Communication 155:794-8 00; and Takami, Noboru,Misumi, Yoshio,Kuroki,Motomu, Mtsuoka,YujiとIkeha ra,Yukio(1988),“Evidence for carboxy-terminal processing and glycolipid -anchoring of human carcinoembryonic autigen”Journal of Biological Chem istry, 263:12716-12720）参照。ＧＰＩが結合している可変表面の糖タンパク質はアフリカトリパノソーマ寄生虫の主たるコート成分で、宿主免疫系に対する主要な防衛バリヤである。トリパノソーマは多くのＶＳＧ遺伝子を含んでいる感染している間は１つのＶＳＧが非常に濃密な外殻コートとして優性に発現する。このＶＳＧに反応して宿主が抗体を装備すると、寄生虫は効果的に除去されるが、別のＶＳＧを発現しているマイナーな集合体は急速に再生産し、寄生虫の新たなピークをもたらす。この過程は継続して規則的に連続する寄生変化を現出する。同様に、マラリア原虫やリーシュマニアなどの原生動物における多くの表面タンパク質がＧＰＩ結合している。 Braun-Breton, Catherine, Rosenberry, Terrone L.とPereira da Silvia Luiz, (1988),“Induction of theproteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase C, ”Nature 332:457-459; Ferguson,Michael A.J. (1991)，“Lipid anchors on m embrane proteins,” Current Opinio n in Structural Biology, 1:522-529参照。こうした寄生虫の表面タンパク質がＧＰＩ結合する頻度は重要な機能上の役割を示唆する。アフリカトリパノソーマＶＳＧタンパク質は感染後の赤血球に検出されており、慢性感染に見られる貧血症状の度合に関係あるものと考えられる。タンパク質の膜間転移 RifkinとLandsberger(1990)は、アフリカトリパノソーマから得たＧＰＩの結合したトリパノソーマの可変表面糖タンパク質［variable surface glycoprotei n］（ＶＳＧ）をヒツジ赤血球にインビトロで膜間転移させたことにつき報告している。彼らはこの転移が２段階で行われたとしている。すなわち（１）液相中にトリパノソーマがタンパク質を流出する。（２）そのタンパク質を赤血球の膜で取り込む、である。例えば、ＧＰＩの結合したアセチルコリンエステラーゼ（ Cookら、1980）の膜間転移について、「これらの系の運動学上の研究は液相中のタンパク質の転移モデルに合致するもので、転移するのに膜の融合または衝突を必要とするモデルは除外する」とコメントしている。 Furguson(1991)はRifkinの研究は「移動が、インビボで遭遇したかもしれない血清のＧＰＩ特異的ホスホリパーゼＤの存在下で起こり得るか否かにつき証明していない」点を指摘した。したがってこの現象がインビボで起こるか否かについては不明である。もし起こるとしたら、放出はトリパノソーマの膜の通常とは異なる特徴に起因するものかもしれない。というのは、それらにおけるＧＰＩの結合したタンパク質の濃度が、脊椎動物の細胞膜に見られるものよりマグニチュードにして数オーダーも高いのである。このようにＧＰＩの結合したタンパク質が異常に豊富に存在することは、トリパノソーマ膜からこうしたタンパク質を放出することを促進しているとも考えられるのである。ヒトＤＡＦがSchistosoma mansoni住吸血虫の表面に検出され、ヒト赤血球との共同培養によって住吸血虫に移動することが証明された。Fatima,M.,Horta,M. とRamalho-Pinto,F.Juarez, (1991),“Role of human decay-accelerating fact orin the evasion of Schistosoma mansoni from the complement-mediated kil ling in vitro,”Journal of Expeimental Medicine,174:1399-1406参照。Fatim aら(1991)は次のようにコメントしている。「我々は準備した未発表のデータから、ヒト多形核細胞中に見られるように、ＤＡＦがＮ−ＨｕＥ膜から流出し、溶液中に入り、そして寄生虫の表面、おそらくは特異的タンパク質受容体分子に結合するのではないかと考えるに至った」と。住吸血虫は自分の脂質を合成することができないから、外来性の脂質やリポタンパク質を自らの膜に取り込むいくつかのメカニズムを開発してきたものと考えられる。特別のメカニズムの存在が、ＧＰＩ非結合の膜タンパク質を取り込む住吸血虫の能力から示唆される。住吸血虫はリポタンパク質を宿主細胞膜から「ちぎり取る」ほど多量に「取り込む」ことはないであろう。科学者団体のうちいくつかは、タンパク質が一時的に液相に入ることなく直接に膜と膜とが接触する結果、ＧＰＩの結合したタンパク質の膜間転移が行われるという考えを拒否したということは、上述したことから明らかである。 HourcadeらはAdv. Immunol.45:381 (1989)で補体活性化遺伝子群［the comple ment activation gene cluster］のレギュレーター［regulators］について考察している。彼らは腐敗促進因子［decay acceleration factor］（ＤＡＦ）であるＧＰＩ結合タンパク質は、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、顆粒球、血小板、内皮細胞、上皮細胞、および繊維芽細胞の膜に認められることを確認している。 Hourcadeらは、これら異なるタイプの細胞においてＤＡＦが見られることは、内皮細胞の場合も含めて、これらの細胞におけるＤＡＦの組織特異的な発現の結果である、と示唆した。これによってＨｏｕｒｃａｄｅらは、内皮細胞膜にＤＡＦが現れることが別のメカニズム、例えば赤血球からの膜間移動、に起因するのだという説に反対している。膜に関係するＧＰＩの結合したタンパク質を他の脊椎動物の細胞にインビボで転移させる赤血球能は本発明以前には確立されていなかった。ＧＰＩの結合したタンパク質の薬学的利用多くのＧＰＩ非結合タンパク質が均質に精製され、経口、非経口（血管内、筋肉内、皮下など）投与の医薬品として調剤されている。しかしＧＰＩの「尾部」がどんな表面にも非特異的に付着する傾向があるので、ＧＰＩ修飾されたタンパク質は簡単には精製されていない。 Moranらは、J.of Immunology 149:1736-1743(1992)で３つの型のＤＡＦを精製している。ＧＰＩが結合された膜のある１つの型と、ＧＰＩの結合がない可溶性の２つの型である。これらの分子の小規模精製はイオン交換と免疫親和性クロマトグラフィの両方を必要とする。ＧＰＩの結合した膜ＤＡＦの最終的溶出のためには、有機溶剤（７．５％のｎ−ブタノール）が必要だが、可溶性の型のものは必要でない。このようにＧＰＩの結合した型は精製するのがより困難であった。３つの分子はいずれも補体活性化の第１および第２経路の双方を阻止することができたが、ＧＰＩの結合した膜のＤＡＦは、細胞膜中に取り込むことができるため、無血清培地で可溶性のいずれの形のものよりも５０倍以上も効果的であった。。残念ながら膜ＤＡＦの有効性は血清の存在下では著しく低減された。この報告はＧＰＩの結合したＤＡＦ、さらにはその他のＧＰＩ結合タンパク質の、注射投与による治療法、その他血流による移動に頼った治療法における利用に水を差すものであった。さらに薬物運搬（ドラッグデリバリー）に関する従来の薬学的研究にとってより一般的な問題は、患者が治療の継続を希望するとき、その同じ薬物を反復投与するか、または徐放性の移植体のような手段を採用するかしなければならないことである。従来の方法はまた、大量投与を少数回行うのではなく、少量投与を多数回行う必要があるときには、不便であった。遺伝子療法と遺伝子導入動物別の方法として、その場で薬物を産生させるもの、すなわち薬物をコードする遺伝子を提供して患者の細胞がそれを発現するようにさせる方法がある。一般にこの技術は遺伝子療法として知られているが、２つの形をとる。１つは自然に分泌された正常の可溶性タンパク質（例、ホルモン）を運搬するもの、もう１つは膜タンパク質または細胞質タンパク質を運搬するものである。可溶性タンパク質としては、そのタンパク質が血流に到達するのであれば、どの細胞にそのタンパク質を含有させ、発現させるように操作するかは重要でない。こうして例えば、下垂体で通常生成される成長ホルモンを遺伝子操作された造血幹細胞により発現させることができ、その関連する生理学的機能を果たすことができる。これとは対照的に、膜タンパク質については、遺伝子療法はそのタンパク質の最終目的物である実際の細胞中の関連する遺伝子の発現を必要とすると考えられてきた。したがって例えば、嚢胞性繊維症治療のための嚢胞性繊維症トランスメンブラン受容体［cystic fibrosis transmembrane receptor］（ＣＦＴＲ）タンパク質の遺伝子療法的送出法は、ＣＦＴＲタンパク質の発現が望まれる肺の細胞を感染させることができるウイルスベクター（ＣＦＴＲ遺伝子を含有）、例えばアデノウイルスを患者の気道に直接導入することが必要と考えられていた。通常は、分泌していない膜に結び付いたタンパク質であるから、ＧＰＩの結合しているタンパク質は、表面上は遺伝子療法の最初の例に寄与していないようにみえる。最終目的物の細胞中で発現することが必要のように思われる。今日の分子生物学では他所から遺伝子がもたらされる細胞を正確にコントロールすること、あるいは発現される細胞のタイプを正確にコントロールすることには限界がある。遺伝子導入動物開発の分野でも同じような状況が認められる。発現されるべきタンパク質が血流中に分泌されたら、どの細胞がそれを産生するかは通常問題とならない。最終的にそれは活性部位に到達するのである。例えば成長促進遺伝子導入動物が、主としてアブノーマルな（ＰＥＰＣＫ）部位（肝臓）中にホルモンを発現させるプロモーターのある成長ホルモン遺伝子を使って開発されている。膜タンパク質をコードする導入遺伝子のある遺伝子導入動物に対してはプロモーターの選択は、これまで最終目的物において発現することができるものに限定されていた。臓器移植 1989年度では、毎40分に１個のヒト臓器が別人に移植されている。同年に16,0 00個の臓器が移植されたのである。その中には9,000個の腎臓、各々ほぼ2,000個弱の心臓と肝臓、3,000個弱の骨髄移植が含まれる。こうした移植はある種の動物から同種の別個体の動物へのもので、同種移植と呼ばれる。同種移植療法は現代医学の最も劇的な療法の１つであるが、実際行うには一定の限界がある。現在のところ最大の限界は、すべてのタイプの臓器につき提供者が極端に不足していることである。この全般的な不足は組織のタイプにつきその提供者と受容者とが合致していなければならない必要性によって複合的に増大している。1989年度には9,000人の患者が腎臓の提供を受けたが、17,000人がなおウエイティングリストに挙げられたままである。さらに1,500人の心臓受容を待ち望む者と、1,000人の肝臓受容を待ち望む者がいる。心臓病の場合には、患者は心臓移植自体の経緯の結果死亡するよりも、適切な提供者の臓器の提供を待っている間に死亡してしまう可能性の方が高い。さらに現在の移植療法には別の不利な点もある。多くの臓器提供者は彼ら自身何らかの事故の犠牲者（例えは交通事故）であるか、彼らの臓器に何らかの損傷を引き起こした病気の犠牲者なのであって、それら臓器は理想的な移植の対象とは言えない。しかも臓器の入手可能性が予測困難なため、移植手術は日常的な手術のように計画的に行うことができないことが多い。あまりにも多くの場合に、外科手術チームおよび病院の職員は臓器提供者が特定されたその瞬間に即座に対応しなければならないから、管理上の困難を引き起こしている。心臓、肝臓、および肺の移植の場合、拒絶反応が起こると、別の適切な提供者が短期間中に存在することが幸運にも分かっていない限り再移植することは通常不可能である。異種移植そこで移植において異種移植の利用可能性について検討することに努力が向けられるようになった。異種移植とは組織の異種間転移に使われる総括的用語である。治療法において組織の異種移植という用語を使うときには一定の定義がある。例えば最近ではブタ組織を大動脈弁の代用に利用したり、ブタ皮膚を激しい火傷の患者に被覆するのに利用したり、ウシ臍血管を代用血管移植として利用するなどが報告されている。しかし機能臓器全体（または臓器の大部分）を使った、より大規模な異種移植は、移植片に対する受容体の急激な免疫応答のために、一般に可能ではなかった。移植後数分ないし数時間で超拒否反応［hyperacute rejection］（ＨＡＲ）が起こり、移植片を壊滅させてしまう。ＨＡＲは典型的には広範な睾丸間浮腫および出血、組織壊死、および臓器機能の急速な減衰を伴う。ＨＡＲという用語は、ブタとヒトのように関係が遠い種間での移植について主に使われる。ＨＡを伴う異種移植は不調和［disc ordant］異種移植として知られている。一方、近い関係にある種間の異種移植はこのような激しい免疫反応（ＨＡＲ）を免れている。そこで、ヒトに近い霊長類であるチンパンジーから得た組織はＨＡＲを経ることなく機能することができ、ＨＡＲを伴わない異種移植は調和［co ncordant］異種移植と呼ばれる。長期間に亙る超拒否反応が生ずることもあるが、通常それほど急激でも激烈でもない。調和異種移植は同種移植の問題に対する解決となると考えられ得るが、実際にはそうではない。チンパンジーはヒトよりずっと小さいのでその臓器はヒトにおいて妥当な機能を提供するには十分に大きくないのが普通である。しかもチンパンジーは自然の中でゆっくりと生育するもので、拘束状態の中では貧弱にしか育たない。またチンパンジーの実験動物としての需要（特に後天性免疫不全症候群［acquired immune deficiency syndro me］(AIDS)のための研究時代である今日において）は、ここでも供給をはるかに凌いでいるのである。また、ヒトでない霊長類を異種移植の供与体として利用することに対して世論の同意を得るのは困難な状況にある。これとは逆にある種の不調和種を異種移植片の供給源（ソース）として利用できる可能性が、これら欠点の全部でないにしても多くを克服させてくれるかもしれない。例えばブタは、臓器の大きさ、ヒト臓器との生理学的類似性の点でも臓器の供給源として有望である。ブタは容易に育成できるし、家畜として農場環境で生育できる。米国だけでも年間５０万頭以上もが生育されている。短い懐胎期間（４カ月）、成熟期（６カ月）で、この同腹産種は短期間で増殖させることができ、投資効果も大きい。人類のためのブタの家畜化、利用（即ち食用）は既に何百年も以前から行われている。したがってこの実績を別の目的（即ち異種移植片のソース）に拡大することは、チンパンジーのような家畜種でない動物の利用に対する倫理的障害とならない。しかし残念ながら人類にとってブタは不調和な種なのである。したがってＨＡＲこそヒト治療にブタ臓器を使用するに当たっての主たる障害となっている（Plattら、1990参照）。補体活性化と阻害今日優勢となりつつある科学的見解によればＨＡＲはホストの補体の溶菌防衛系の活性化によって起こるとされている。補体およびその活性は今日よく知られた事柄で、Roitt, Essential Immunology（Fifth Edition, 1984）Blackwell Sc ientific Publications, Oxfordにも記載されている。補体（Ｃ’）に起因するとされる活性は全体的に活動する９つのタンパク質成分（Ｃ１Ｃ９）の作用によるもので、これら９つのうち第１のものはＣ１ｑ，Ｃ１ｒ，およびＣ１ｓと呼ばれる３つの主要なサブフラクションである。補体は第１または第２経路［the classical or alternative pathway］によって活性化できる。これら経路につき以下に説明する。第１経路でＣ１は抗体に結合する。Ｃ１ｓサブユニットはエステラーゼ活性を得てその活性化を引き起こし、膜上の部位または最初にＣ４、次にＣ２といった免疫複合物に移動する。この複合物は「Ｃ３転換酵素」活性を有し、Ｃ３を溶液中で切断し、小さなペプチドフラグメントＣ３ａと残基分子Ｃ３ｂを生成する。これらは非常にはっきりした機能を有している。。Ｃ３ａはアナフィラトキシン活性を有し、補体のカスケート的増幅においてこれ以上の役割を果たさない。Ｃ３ｂは膜結合し、抗原−抗体−Ｃ３ｂ複合物の免疫付着を引き起こすことができ、その後の食作用を準備する。第２経路ではＣ３転換酵素活性はＣ３ｂＢが担う。Ｃ３６Ｂの活性化は、特に抗体とは独立に活動する例えば内毒素のような微生物多糖類といった、外剤によってトリガーすることができる。この転換酵素はＣ３ｂ複合物の因子Ｄおよび因子Ｂの活動によって形成される。これは、Ｃ３の破壊による産物（Ｃ３ｂ）がより多数の切断酵素の形成を助けるという正の帰還ループを形成する。第１経路、第２経路の両方において、Ｃ３ｂレベルはＣ３ｂイナクチベータ（Ｉ因子）の活動によって維持される。Ｃ３ｂはＨ因子と結合して、Ｉ因子により破壊される複合物を形成し、その溶血特性および免疫付着特性を失う。第１経路、第２経路はＣ３段階後には共通になる。Ｃ５は切断されてＣ５ａ（５−Ｃ５ｂのフラグメントとなる。Ｃ５ａはアナフィラトキシン活性化を有し多型［polymorphs］の走化性を高める。Ｃ５ｂは複合物としてＣ６とＣ７と結合し、最終成分Ｃ８およびＣ９を補充する膜に耐熱性部位を形成して、膜侵襲複合［ membrane attack complex］（ＭＡＣ）体を作り出す。これは膜に挿入され、それから突出する環状構造で、電解質および水に完全に浸透性のトランスメンブランチャネルを形成する。高い内部コロイド浸透圧のために、細胞溶菌へと入るナトリウムイオンと水の実効流入［a net influx］がある。溶菌活動を減少または妨害する等の方法でカスケード的な補体活動に干渉する補体阻害（制限）因子が同定されている。これらの因子はホスト動物が免疫反応を回避する「自身」としての組織をラベルするのに利用される。これらの因子は細胞膜に結合するか、血清中にフリーに存在する。しばしばこれら因子は補体活性化の第１第２経路両方に共通の段階の１つに関与するが、ある種の因子は第１経路または第２経路のいずれかに特異的である。 PlattとBach（1991）（および参考文献）は、不調和異種移植が第１経路でホストの補体（Ｃ’）をトリガーすると信じている。ホストの血流中に循環している予備形成自然抗体［preformed natural antibodi es］（ＰＮＡ）は、特に血管内皮のルミナール表面上に供与体の臓器を認識し結合する。ＰＮＡの結合はホストのＣ’系をトリガーするようにする。この侵襲は、移植後数時間で内皮細胞の活性化、血小板および白血球の付着、血栓症および異種移植片の最終的壊死を起こす。移植された臓器の毛細管床はホストの補体活性化による侵襲に対して最も感受性の高い部位のようである。逆にWhiteらは、W091I/05855で超急性異種移植拒否反応は必ずしも抗体の介在によるものではない、つまり補体活性化の第２経路からも生起されると強調している。Whiteらが正しいとすれば、ＰＮＡの除去は必ずしも常に超急性異種移植拒否反応を防止しないということになる。補体活性化はＨＡＲで重要な働きをするということは古くから知られている（ Shilling （1976）等）。最近になって超急性拒否反応における補体の関与が、異種移植に先立つホストの補体活性の外因的阻害によるものであることが劇的に証明された。いくつかのグループがホスト内で予備形成自然抗体のレベルを激減させることによって補体に干渉する実験方法を開発している。予備形成自然抗体はホストの血液をブタ腎臓のような供与体の臓器を介して濯流させることによって、あるいは免疫グロブリン分子を除去するイムノアフィニティカラムに血液を通すことによって除去するのである（Mobergら, 1971; Fischelら，1991;Gianel loら,1991: Yeら,1991; Agishiら,1991 ）。こうした方法はそのまま直接臨床移植に転換できるものではない。あるいは大量のコブラ毒因子（McConnelとLachman, 1976）または可溶性補体レセプター（Wei sman,1990: Hebell, 1991;Pruitt,1991; Xia,1991）の投与も補体活性を減少させるのに効果的であることが証明されている。これらの方法を使って、少なくとも２つの別々のグループが、移植前におけるホストの補体の阻害が異種移植片を長時間に亙って生き延びらせることになることを証明している（Plattら, 1990; Fischelら,1991;Mobergら,1971; Lexerら,1987）。通常なら数時間のうちに拒否される異種移植片が、ホストの補体が継続して抑制されているならば、数日、数週間と維持されたのである。この外因的抑制を約２週間行うと、異種移植片に根本的な変化が生じる。この変化は適応化［accomodation］と呼ばれる。ホストによって適応化された異種移植片は、ホストの免疫グロブリン分子によってなお認識されるものではあるが、もはや超急性拒否反応は示さず、外因的な補体阻害がなくても生き残る。こうした適応化状態は、ホストの補体が抑制されている期間を臓器が最初に経過したときにのみ生ずる。例えば１個の適応化した臓器を持ったホストは、それ以上の外因的な補体阻害のない間に、移植された２番目の異種移植片を即座に拒否するが、たとえ２番目の異種移植片が１番目の臓器と同一供与体のもの、例えば２個の腎臓、であるときでも最初の適応化した異種移植片は拒否しない（Platt,私信）。適応化の基本的メカニズムは不明だが（PlattとBach,1991）、 Plattは次の考え得る３つの説を述べている。第１説は移植片の内皮細胞は、移植に伴う外傷のために補体により感受性になっているためとするものである。もし補体が阻害されていれば移植片の内皮細胞は回復して抵抗力のある状態を保持するのではないかというのである。第２説はホストの抗体レベルが徐々に常態に戻るので、補体が効力を失うように移植片の内皮細胞に発現されるエピトープが変えられるからだとするものである。第３の説は、予備形成自然抗体の枯渇後生成されるホストの抗体が、当初存在していた予備形成自然抗体のものとは特異性及び／又は親和性を異にしているためというものである。最初の２説は共に移植片の内皮細胞がそれ自体の細胞膜に変化を起こすということを示唆している。これらは共に如何にしてこのような劇的な変化が結集して生起されるのかを説明するのにむしろ曖昧と言うべきである。最後の説は本当かもしれないが、戻ってきたホストの抗体が２番目の同様な異種移植片の超急性拒否反応をトリガーするのに十分なことが明らかなのだから適応化の過程を適切に説明してはいない。これらの説に沿って、適応化した組織を分析することは、分析する移植片の内皮中のホストの補体インヒビターの存否決定ではなく、ホストの免疫グロブリンおよびホストの補体系成分の検出という方向に向けられた（Pl attら,1990: Plattら, 1991; Roseら,1991）。こうしてＣインヒビターをホストの細胞から移植片に転移させる可能性について考察が進められた。また、こうした従来の理論はどれ一つとしてＨＡＲの問題を克服する方法を直接示唆するものでもなかった。培地から補体インヒビターを取り込む内皮細胞の能力 Plattら（1990）は次のように報告している。「ヒトDAF．．．をブタ内皮細胞にインビトロで挿入した後、ヒトDAFを膜に発現しているブタ内皮細胞は、ヒトD AFを含有していないブタ内皮細胞に比較し、ヒト血清による細胞溶解からきわめて有効に保護される」と。この論述からはＤＡＦが分子生物学的な意味でブタ細胞中に発現されるのか否か、つまりブタ細胞はヒトＤＡＦ遺伝子を発現するように遺伝子的に操作されたのか否か、あるいは細胞生物学的な意味で、つまりブタ細胞が細胞膜に外因的ヒトＤＡＦを表示したのか否かは明確でない。Bachら（19 91）およびDalmassoら（1991）を読むと、後者のように考えられる。いずれにせよDalmassoら（1991）は、精製されたヒトＤＡＦおよび１０％の血清を含有する培地で培養されたブタ大動脈内皮細胞はＤＡＦを取り込み、ヒト補体（Ｃ）の細胞障害効果に縮減された感受性を示したことを証明している。ＤＡＦにはＧＰＩが結合されているので、Dalmassoらは、グリコシルホスファチジルイノシトールのセグメントに人工的に結合させたＣＲＩまたは膜補因子タンパク質［membrane cofactor protein］（ＭＣＰ）の類似体の方が、それらのＧＰＩ非結合野生型よりもＨＡＲをコントロールするのにより有効であろうと示唆している。前に指摘したように膜ＤＡＦは、血清にさらされると補体インヒビターより効果的でない。これがそうであるという理由はいくつかある。第１に血清中ではそれは可溶性リボタンパク質その他の脂質と接触するようになるから、後者はそれを捕捉しそれによってそれを隔絶する可能性がある。第２に、血清は膜ＤＡＦのＧＰＩ尾部を切断することができるホスホリパーゼを含有しているから、ＤＡＦ分子は細胞膜に融合することができない。したがってヒトＤＡＦの適切なコーティングを意図する異種移植片のすべての血管内皮細胞に送出する手段として、ブタに静脈内からヒトＤＡＦを投与することが実際的であるとは思えない。おそらくこうした理由から、Dalmassoはこの方法を提唱しないで、内皮細胞がＤＡＦを発現する遺伝子導入動物を使うことの方を要求したのであろう。 Dalmassoら（1991）は、ＧＰＩの結合したＣインヒビターを膜間タンパク質移動によって内皮細胞に供給するのに赤血球を使う可能性については何も書いていない。彼はこのインヒビターが通常の患者から取った赤血球中に存在することについて知ってはいたが。彼は正常赤血球からのＣインヒビター流出度が非常に低いことを十分に予測し得たであろうし、あるいは侵害細胞がこうしたＣインヒビターを取り込んでしまってホストの補体から無償で保護されることができることを十分に予測し得たであろう。たしかに液相中の濃度は彼の研究で使われたものよりずっと低いであろう。しかも体内ではリポタンパク質、脂質、およびホスホリパーゼの濃度は、たった１０％ＦＣＳであった彼の培地におけるよりも高いであろう。（実際、市販のＦＣＳはおそらくホスホリパーゼＤの有意レベルを含有していない）。赤血球と内皮細胞間のＤＡＦの膜間移動が可能と彼が考えたとしても明らかに、タンパク質のインビボでの膜間移動は液相中を進むものであるという従来技術の考えに鑑みるとき、彼はそれがインビボで有意であったのか否かにつき疑ったことであろう。血管内皮細胞でヒト補体インヒビターを発現する異種移植片の供給源としての遺伝子導入動物 Plattら（1990）は、ヒトＤＡＦそしておそらくはその他のヒト膜関連の補体インヒビターを発現する遺伝子導入ブタを、可能性のある供与体動物として産生することは可能かもしれないと推測している。この考えはヒトの補体インヒビターを遺伝子導入ブタの内皮細胞膜に発現させようとするPlattら（1991）にさらに発展的に詳述されている。Dalmassoらも同様に、異種移植片の内皮細胞に対応するタンパク質を高レベルで発現させるため、ブタなど遺伝子導入供与体動物にヒト膜関連Ｃインヒビター遺伝子を導入することを示唆している。ここでも中心的な考えはＣインヒビターを内皮細胞に直接発現させることであって、それらを内皮細胞膜に送出するメカニズムについては考察されていない。上記と同一の方法でWhiteらのW091/05855は、ヒト膜補因子タンパク質［membr ane cofactor protein］（ＭＣＰ）（ＣＤ４６とも呼ばれる）（例１１）またはヒト分解促進因子［decay accelerating factor］（ＤＡＦ）（例１２）をコードする導入遺伝子を有する遺伝子導入マウスを調製している。しかしこれらの遺伝子が発現されたか否か、また、発現されたのであればどの組織に発現されたのか、あるいはその遺伝子導入動物から得た移植片が不調和動物においてＨＡＲを起こしたのかどうかにつき決定していない。同様にYannutsosら（1991）もヒトＤＡＦまたはＭＣＰを発現する遺伝子導入マウスの経過につき記述している。この研究では全体的な補体インヒビターの発現が内皮細胞中で生じるように一連の広スペクトルプロモーターが使われている。こうした動物の殆どは非常に低レベルの補体インヒビター発現をしたようである。しかも彼らは内皮細胞における発現があったか否か、あるいは補体抵抗力が得られたかどうかにつき確認していない。ヒトＤＡＦの遺伝子導入動物は一部のゲノムＤＮＡフラグメントを使って作出されている。Cary,N.,Moody,J.Yannoutsos,N.,Wallwork,J.とWhite,D.,(1993), “Tissue expression of human decay accelerating factyor, a regulator ofc omplement activation expressed in mice: A potential approach to inhibiti on of hyperacute rejection.”Transplant.Proc.,25:400-401 （Feb.1993）参照。これらの動物は、造血組織には殆ど何もＤＡＦ発現をしていないようだが、広範囲に亙るＤＡＦ発現を示したと伝えられている。最も一貫して観察された発現は血管平滑筋においてであって、内皮では可変的に発現されている。引例された文献の遺伝子導入動物は、遺伝子プロモーターのさまざまな組合せをした１０年間に亙る遺伝子導入の動物実験を通して、基準的な実験設計ならびに方法として発展している。もし最終目標が特定のグループまたはタイプの細胞の表面に導入遺伝子をコードするタンパク質を存在させることであるなら、その導入遺伝子を（少なくとも）これらとまさしく同一の細胞中に直接発現させることが合理的に期待できるブロモーターにその導入遺伝子を結合することこそ直接的方法であると言えるであろう。この直接的方法は移植に適する臓器を産生するためには役にたたない。この直接的方法が、補体インヒビターを血管系［thevasculature］全体、特に毛細血管床に至るまで均一的な分布を確保するとは、広スペクトルプロモーターが、例えば内皮細胞といった全ての目標細胞中に適切に発現されないおそれがあるのであるから、考えにくい。細胞のうちのあるものが十分に補体インヒビターを発現しないときは、臓器の少なくとも一部に超急性拒否反応をもたらすおそれがあるのである。 Whiteら、またYannoutsosらなどを含むがこれに限らずこれまでの多数の遺伝子導入研究には、導入遺伝子をコードするタンパク質を特定グループまたはタイプの細胞に存在させるのに、非標準的で間接的な方法が可能で、おそらく好ましいものであることを示唆するものはない。このような間接的方法では、導入遺伝子をコードするタンパク質が存在するようになることが望まれる表面を有する細胞以外の細胞のグループまたはタイプの細胞に導入遺伝子を発現するようにプロモーターが選択されることになろう。別個の目標細胞にインビボで移転される導入遺伝子をコードするタンパク質を、このように間接的に発現させる可能性は、本願発明の以前には遺伝子導入動物で証明されたことがなかった。また、本願発明以前に、移植されるべき臓器の細胞以外の細胞に補体インヒビターを発現させることを研究することが合理的であるとは考えられていなかった。なお出願人は、ここに記載した文献のいずれも本願発明に対する従来技術または関連技術であると認めるものではなく、また、文献内容および発表日付の正確さにつき将来に異議を唱える権利を留保する。発明の概要本発明は従来技術の欠点を解消するものである。具体的な内容は、目的のタンパク質を標的とする脊椎動物に、ＧＰＩアンカーによってそのタンパク質が膜に結合した可動性の細胞を提供することによって供給することである。ＧＰＩアンカー。次に、ＧＰＩの結合したタンパク質は膜間転移によって別の細胞に供給される。適合する可動性の細胞としては、赤血球、マクロファージ及び繊維芽細胞がある。元来はＧＰＩが結合していない目的のタンパク質は、細胞が認識するＧＰＩ付着信号を供給する非自然発生的な前駆体タンパク質を発現することによって可動の細胞に付着させることができる。好ましい実施例では本発明は、超急性拒否反応（ＨＡＲ）の危険を減少させるため、赤血球などの可動細胞から得る補体抑制因子を、不調和異種移植片組織にインビボまたはインビトロで膜間転移させることに関する。これらの補体抑制因子は、膜間転移を促進する自然または「人工」のＧＰＩアンカーを有している。異種移植片の適応化［accomodation］は、受容者である動物の赤血球から得た１個または２個以上の種特異性補体インヒビター因子を、その異種移植片の血管内皮に転移［transfer］させることの結果もたらされるのである、と我々は信じている。この転移が完了しないうちは、異種移植片は外因性インヒビターの無細胞投与または宿主抗体の除去によって、ＨＡＲから保護されなければならない。ひとたび十分な量のインヒビターが転移すれば、異種移植片は宿主の補体に抵抗力を持ち異種移植片は適応する。受容者がヒトの場合は、この敷居値レベルは移植後７〜１０日で通過するとみられる。宿主の抗体レベルが正常に戻ったら、宿主赤血球から新しいＣインヒビターが継続的に供給されるので移植片は保護され続けられる。これは移植片の内皮細胞膜の正常なターンオーバー（代謝回転）によるＣインヒビターの損失を補償する。上述したような従来理論により誤導されて、補体インヒビターそのものを投与するか（これはその後の供給上の問題を引き起こす）、あるいは異種移植片自体の内皮細胞内で直接インヒビターをコードする遺伝子を発現させることによって適応化を達成しようとしたが、これらの細胞の表面にインヒビタータンパク質を僅かに発現させるにとどまったと報告されている。これに対して出願人はインビトロで赤血球膜から目標の内皮細胞膜へＣインヒビターの転移が起こることを発見し、また、この現象はインビボでも発生することを示す証拠をつかんだ。本発明は、異種移植片に対する補体抵抗力を細胞から細胞へ転移させることができる条件下で、目的とする受容者内でも機能可能な適切なる膜関連補体阻害因子を含有する細胞に接触させることによって、不調和異種移植片の移植につきものの上記問題を克服しようとするものである。このような接触がインビボで行われるときは、補体抵抗力の広範囲に亙る分配が達成できるように、好ましくは有益な細胞は赤血球のような可動な細胞であるのがよい。内皮細胞中で外来遺伝子の発現を得ることは比較的困難であるし、また内皮細胞中に導入された外来Ｃインヒビター遺伝子を直接的に発現させることにより遺伝子導入動物の血管内皮を完全にカバーすることの困難性は、こうした細胞の異質グループ中の相違によって複合される。つまり大動脈内皮細胞中で有効なプロモーターは毛細管内皮細胞中では並、そして逆に後者中で有効なプロモーターは前者中では並という関係にあるのであろう。本願に記載の間接的方法によれば、Ｃインヒビターが赤血球（又はその他の細胞）に発現され、次に膜から膜への移動によって内皮細胞へと転移させられる。このメカニズムは特に細胞が密集している毛細血管、小動脈、小静脈において有効であろう。これらこそ最初にＨＡＲに襲われる領域なのである。特に好ましい実施例では、ヒトに通常不調和な種であるヒト以外の遺伝子導入動物、例えばブタ、を調製している。その動物の赤血球は１個または２個以上のヒト特異的補体阻害因子を発現するように遺伝子操作してある。短期間経過後には、ヒトの補体抵抗力がその動物の血管化した［vascularized］組織や臓器に与えられる。これら組織や臓器が次にヒトに移植されるのであって、異種移植片の超急性拒否反応の危険はかなり低減させられている。あるいは正常の導入遺伝子提供動物以外の動物の組織と臓器を、インビボまたはインビトロで、表面に受容体特異的な補体阻害因子を持つ外因性赤血球にさらすことによって、受容体の補体系に抵抗力を与える。本発明は、不調和異種移植片に対する補体抵抗力をその異種移植片に転移させる方法、また、補体阻害因子の同定および、いつ臓器が超急性拒否反応を回避するのに十分なほど改変されたかを決定するためにする分析に関する。他の好ましい実施例においては、ＧＰＩが結合した別のタンパク質を可動細胞に供給し、目標細胞に転移させている。図面の簡単な説明図１は、ヒトＣＤ５９遺伝子、ヒトαグロビンの5'および3'隣接配列、及びヒトグロビンＬＣＲが結び付いてＬＣＲαＣＤ５９を形成することを示すフローチャートである。図２は、ＬＣＲαＤＡＦの構築方法を同様にして示すフローチャートである。図３は、プラスミドＬＣＲαＤＡＦの地図、ならびに線状化されたＳｃａＩ− ＫｐｎＩフラグメントの地図である。。図４は、ブラスミドＬＣＲαＣＤ５９の地図、ならびに線状化されたＳｃａII フラグメントの地図である。図５は、ＭＣＰ：ＤＡＦ融合物のＤＮＡならびに翻訳されたアミノ酸配列である。ＤＡＦ配列は塩基８２６から始まる。好ましい実施例の詳細な説明本発明はＧＰＩの結合したタンパク質の膜間転移に関する。ここで「膜間転移」［intermembrane transfer］という用語は、当該技術において周知ではあるが、曖昧である。第一に細胞は数個の膜を持っているから、１個の膜から別の膜へと同一細胞内でタンパク質が移動することを含むかのごとくに誤って解釈されてしまうおそれがある。しかし当該技術では、また本明細書においても、より狭義の「膜間転移」現象を指すもので、直接か間接かを問わず、ある細胞から別の細胞への転移を言う。特許請求の範囲における目的として、「膜間転移」とは細胞間における膜関連タンパク質の転移を指すものとする。膜間転移は、細胞膜と細胞膜との接触の結果などの直接的なものでもよく、また間接的でもよい。間接的な場合は、タンパク質はそれら細胞を分離している液相（例えば血液）中を移動するか、ある細胞から放出され別の細胞によって吸収される脂質小胞体［lipid vesicle］によって運搬される。中心的事項はまだ完全に解明されたわけでもなく、また出願人は以下の理論に拘束されることを望むものではないが、膜間転移は直接的であると信じている。その証拠は主に状況的なものである。つまり仮に転移が間接的とすれば、タンパク質は血清の脂質、リポタンパク質およびリパーゼにさらされてしまうであろうから、我々が成功したのは、我々の系が非常に多量のＧＰＩ結合したタンパク質を流出したために血清分子による捕捉ならびに分解があったにも拘わらず目標細胞にそれを転移させるに十分であった、ということによるよりも、直接的な膜間転移の結果こうした障害物を除去し得たことによる所が大であると思われるのである。しかし出願人の実施例８では、膜間転移のメカニズムを決定するため幾つかのプロトコルを記載している。標的動物本発明のタンパク質転移法のための標的動物は脊椎動物、つまり哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類または両生類である。哺乳類の中でも標的動物は好ましくは霊長目（ヒト、類人猿、サル）、偶蹄目（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）、齧歯目（例、ウサギ、マウス、ラット）または食肉目（例、ネコ、イヌ）にこの順序で属するものがよい。鳥類の中でも標的動物としては、ガンカモ目［anseri forms］（例、アヒル、ガチョウ、ハクチョウ）またはキジ目［galliforms］（例、ウズラ、ライチョウ、キジ、シチメンチョウ、ニワトリ）が、この順序で好ましい。魚類の中で標的動物としては、ニシン目［clupeiforms］（例、イワシ、シャド、アンチョビー、シロマス、サケ、マス）が、この順序て好ましい。「標的組織」としては、上述の運搬細胞［carrier cells］を有するＧＰＩの結合したタンパク質と接触することができる標的動物の組織または臓器ならいずれでもよい。（「標的組織」および「標的臓器」の用語は以下、互換的に用いる）。たとえ既に外植されている選択された組織または臓器だけが運搬細胞にさらされるのだとしても、動物は「標的動物」と考えることにする。血管内皮細胞が好ましい標的組織である。１実施例では、標的動物は非ヒト哺乳類で、臓器または組織をその哺乳類から得て患者たるヒトに移植される。ＧＰＩの結合したタンパク質が膜間転移により後述の可動細胞から目的とする臓器または組織の移植片（集合的に「標的組織」という）に転移させられ、この移植片がその後患者に移植される。最も普通には、このＧＰＩの結合したタンパク質は補体インヒビターである。非ヒト哺乳類を臓器移植片の供与体として特別に使用しようとすることは、受容体がその臓器または組織を受容するものである限り多くの利点がある。第１に、細心の注意をもって育成した非ヒト動物は、ヒト供与体よりも損傷されているおそれ、および病原ウイルスや腫瘍などに冒されているおそれが少ない。ヒト供与体となる者はしばしば死亡しているのであり、その死亡原因は供与体の臓器を理想的な状態から遠いものにしているおそれがあるのである。第２に、異種移植片ではヒト臓器供与体のランダムな選択に比較し、その大きさや年齢につき注意深くコントロールすることができる。第３に、受容体たるものは供与体の臓器が入手できるまで長期間待機することができない場合が多い。非ヒト哺乳類から得た臓器なら、同種のヒト臓器よりも多量に、またより恒常的に入手することができる。もしある移植片がダメなら、別の臓器を容易に得ることができる。最後に、臓器ならびに受容体は初めからＭＨＣ適合性のために既に適合している。拒否反応がそれほど心配でないのなら、注意を別の方面、例えば大きさが一致するかどうかなどに向けることができる。本発明によれば種々の不調和動物を、ヒトおよびその他の動物のための臓器および組織移植の供与体として利用することができる。どの動物を選択するかは必要とする臓器または組織、受容体の体格や性別によって異なる。受容体がヒトの場合、大きさ、類似した生理、遺伝子操作の容易さ、繁殖および便利性などの理由から、ブタが概して好ましい。これ以外の咄乳類、例えばヒツジ、ヤギ、ウシなども使うことができる。受容体がヒトでないときは、動物の選択はさまざまになり得るが、同様な選択基準によって当業者なら適当な供与体動物を選択できる。移植され得る臓器のリストは非常に長くなるが公知の外科手術技術に主として限定される。一定の組織または臓器部分も移植できる。ここに記載の特許請求の範囲のため、「臓器」という用語は臓器全体、臓器の部分、およびさまざまな組織を含む概念とする。例えば、腎臓、眼球、心臓、心臓弁、皮膚、肝臓、骨髄、腸、血管、関節ならびに関節部分、膵臓ならびに小島を有する部分、肺、気管支、脳組織、および筋肉その他の管組織などである。しかし血液または血液成分の輸血は臓器移植と考えないものとする。移植は、怪我、遺伝子的欠陥、病気、毒性反応などの結果、機能不順となった臓器を修正するために行われるものであろう。受容体は、火傷処置のため皮膚組織を使うとか、糖尿病のため膵小島を使うとか、パーキンソン病処置のため脳組織を使うとかというように、取り出された臓器を自分の持っている組織に補うため受け入れる。あるいは腎臓、心臓、肝臓、肺または関節の移植のように、受容体の不全な臓器をそっくり取り出して異種移植片と交換するということも行われる。ある種の臓器移植では、肝硬変や肝腫瘍あるいは肝感染の処置のため肝臓移植片に用いられ得るような、いずれの技術も使うことができる。運搬細胞「運搬細胞」とは、ＧＰＩが結合した目的のタンパク質を膜内に有する脊椎動物細胞で、所望の転移条件下でそのタンパク質を脊椎動物の標的組織に膜間タンパク質転移で転移させることができるものをいう。「可動細胞」とは、受動的に循環する赤血球と、自分の意志で積極的に動くことができる真に移動性のある細胞との両方を含む概念である。膜間タンパク質転移がインビボで起こるときは、運搬細胞は可動細胞である。いかなる可動細胞でも補体阻害因子発現の主要部位として用いることができ、そうした可動細胞が体内を移動するときその他の細胞にそれら因子を分配するためその可動細胞を頼りにすることができる。「赤血球」［red blood cells］とは、赤血球［erythrocytes］と網状赤血球［reticulocytes］の両方を含む概念であり、共に赤血球［red blood cells］フラクション中に存在する。赤血球は動物の血流中に循環しており、血管組織または臓器のどこにも存在する。その他の細胞、例えばマクロファージとかＴ細胞などは、こうした運動をできるばかりでなく、血流中から固体組織へ移動することもできるから、「移動遊走性細胞」［migratory cells］と呼ぶ。この用語はまた細胞外空間を動くことができる繊維芽細胞をも含む。血液中には１０⁹ＲＢＣ／ｍｌ以上の赤血球［ＲＢＣ］がある。これは赤血球以外の血液細胞よりもマグニチュードとして数オーダーも大きい。池の血液細胞はそれらの表面に、より高いレベルのＣインヒビターを有しているのであるが、ＧＰＩの結合したタンパク質（例、Ｃインヒビター）の血管内皮細胞への転移のための主要ビークルとして、上述の赤血球数は大いに有利なのである。補体インヒビターのような遺伝子産物の血管内皮細胞以外の組織への移動にとって好ましいビークルは、マクロファージ、Ｔ細胞、繊維芽細胞およびその他の「移動細胞」である。目的のタンパク質は、ＧＰＩアンカーの付いたタンパク質を供給し、ＧＰＩの結合したタンパク質がそれ自身ＧＰＩアンカーを介して適当な可動細胞の膜に付着することができるように、標的動物と両立し得る可動細胞によって標的の組織体に導入される。供給方法、一般論第１の実施例では遺伝子操作された可動細胞が標的動物に投与される。目的のタンパク質は、所望のＧＰＩアンカーを付けることによって、その有益なタンパク質に融合されたシグナル配列に応答してそれと共に、翻訳後にそのタンパク質を改変する可動細胞中に発現する。次にＧＰＩの結合したタンパク質は可動細胞の膜へと運ばれ、そこから膜と膜との接触を介して標的組織へと転移させられる。第２実施例では、標的動物はヒトではない、可動細胞の少なくとも一部が所望のＧＰＩの結合したタンパク質を産生し、それを膜へと動かすように遺伝子操作したキメラまたは遺伝子導入動物となっている。こうした動物は、その動物にとって内在性の遺伝子物質中に少なくとも１つのトランスジーン（導入遺伝子）と呼ばれる外来遺伝子を有している。第３実施例では、目的のタンパク質は既にＧＰＩアンカーが付けられて可動細胞外で産生される。次にそのタンパク質を細胞膜中に組み込める条件下で運搬細胞と共にインキュベートする。この細胞をさらに標的組織と共にインキュベートする。第４実施例では、ＧＰＩの結合したタンパク質を標的動物外で産生し、標的動物の細胞、特に可動細胞を含む細胞、によって取り込むことができるようにして標的動物に投与する。第１および第２実施例では、新しいＧＰＩの結合したタンパク質が可動細胞によって標的動物内で産生され続けるという利点がある。事前適応化のための、ＧＰＩ結合したＣインヒビターの異種移植片への供給本発明によると異種移植片は受容体が当該移植片を外来のものと即座に認識してＨＡＲを始めないように「擬装」させられる。この擬装は移植されるべき臓器または組織（移植片）を、超急性拒否反応防止のため、補体インヒビター因子を有する有効量の可動細胞その他の運搬細胞と接触［contact］させることによって行われる。この接触は、異種移植片が超急性拒否反応を予防するに十分なインヒビターを得ることができるように、長期間に亙って行われる。異種移植片には超急性拒否反応を予防するのに必要な補体インヒビターがさまざまな方法で与えられる。例えば前節で記載した一般的方法を具体的に適応させることでよい。好ましい実施例では、超急性拒否反応は可動細胞中で受容体の種特異性の補体阻害因子を発現し、次にその補体阻害因子を移植されるべき細胞に転移するように供与体動物を操作することによって回避される。定義によれば不調和動物はこの能力を欠くので、本発明は、超急性拒否反応を防ぐために必要であると信じられている１つあるいは複数の因子をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を調製することによって、この制限を乗り越えた。こうして本発明の１実施例は、第１組織で発現し、そのタンパク質生成物が可動細胞によって第２部位に送付されることができる、導入遺伝子を含んでいる。。これら第２部位では、細胞は導入遺伝子の生成物を合成する必要はなく、膜間転移でただそれを得ればいいだけである。赤血球は体内中を動き回るので、この技術は超急性拒否反応阻害因子を広範に分配できるものと期待される。別の実施例では組織または臓器は、申し出のあった受容者から得た赤血球のような細胞と接触させられることで事前に適応化される。この場合、その赤血球が少なくとも受容者と調和しているなら、その受容者本人から得られなければならない必要はない。血液型等の適合程度が大きければ大きいほどよい。赤血球は容易に大量に入手可能なので、本例ではこのソースを使う。接触工程はインビボでもインビトロでも行い得る。抵抗力の効果的な転移にとって十分な程に臓器または組織の全表面が抵抗性細胞と接触していることを確認できれば、適切な分配が得られるので、インビトロで行うときには可動細胞の使用は不要である。それでもなお赤血球を使用する方が好ましい。接触がインビボで行われるときは、可動細胞を使用することが要求される。接触前に臓器または組織をまず供与体から取り出すか、あるいは移植前に接触工程を供与体の中で行うかのいずれでもよい。インビトロでは組織または臓器の中に十分に赤血球をさらすために、組織または臓器を適切な赤血球で灌流することで接触を促進させることができる。インビボでの処置は、供与体動物の中で供与体の臓器を標的赤血球に接触させるため、適切な赤血球を供与体に転移させることで行う。より優れた効果のためには、輸血された赤血球を拒否しないように供与体は免疫抑制されているべきである。免疫抑制は、脾臓のような免疫系に関係する臓器の除去あるいは破壊、抗リンパ球抗体の供給、抗体及び／又は補体を除去するプラズマフェレシス、あるいはシクロスポリン、ステロイド、サリドマイドまたはスクシニルアセトンのような免疫抑制剤の投与などさまざまな方法で行うことができる。遺伝子導入動物および血液交換技術の組合せを使うこともできる。この場合には、１個または２個以上の異なる受容体特異的Ｃインヒビターを発現する１または２以上の遺伝子導入動物から赤血球を抜き取って、最終的に臓器の供与体になる所の同種の受容体動物中に輸血することができる。免疫抑制は不要で、特に多数のＣインヒビターが必要なときは、所望のインビビターを遺伝子導入動物の単一ライン中に入れ込むよりも簡単なことが分かるであろう。補体抵抗力の転移が遺伝子導入動物内で生じたときは、臓器および組織は超急性拒否反応阻害因子を受け取るように、操作された可動細胞と十分に接触させることになる。ほかの場合には、補体インヒビターの異種移植片への転移に必要な時間だけ接触を継続する必要があろう。この時間がいかほどかは赤血球その他の可動細胞の量、処置される臓器または組織、その他のファクターによる。ある内皮組織に対する予備的実験では、２日では不十分で６日だと十分であるようである。非常事でない大半の場合には、移植される臓器または組織のサンプルまたは関連組織を、それらが十分に適応化されているか否かについて試験することが好ましいＣサンプルを移植を受ける受容体の臓器または組織から得た血清でインキュベートし、どんな反応があるかを測定する。もし補体介在の細胞溶解あるいは細胞死が起こったら、適応化はあきらかに完了していないのである。補体結合テスト［complement fixation test］もまた有効な指標となる。ラベルされた抗（ヒト免疫グロブリン）抗体を用いてサンプルを免疫組織化学染色［immunohistoche micalstaining］することによって、サンプルへの抗体結合反応が少なくなることが観察できる。このほかにも多数の適当なイムノアッセイが可能で、臓器または組織が移植に先立って受容体に十分適応化されたか否かを判断するのに利用することができる。目的のタンパク質に関する一般論移転されるべきタンパク質は自然発生のＧＰＩの結合したタンパク質でもよいし、そのタンパク質の機能を有するフラグメントまたは類似体でもよい。自然にＧＰＩの結合したタンパク質を表５に挙げる。有益なタンパク質はまた、その最も近い自然発生の同族体［cognate］がＧＰＩを結合していないが、しかしＧＰＩアンカーを起こすように処理されるように修飾されているものでもよい。このような修飾については次節で述べる。細胞表面に発現されるか、または細胞から分泌されるすべてのタンパク質もまた、アミノ末端リーダー配列を持っていなければならない。これは発生期のポリペプチド鎖を小胞体中に向かわせる疎水性配列である。ＧＰＩ結合するように操作されたタンパク質は、もしそれが既に存在している場合を除いて、いずれもこの配列を持っていなければならない。例えば細胞内タンパク質は、シグナル配列の追加を要求するであろうが、成長ホルモンのような分泌タンパク質は既にシグナル配列を持っている。目的のタンパク質のアミノ酸配列は、「実質的に」「対応している」アミノ酸配列を有する突然変異タンパク質を得るため、例えば対応する遺伝子の部位特異性または半分ランダムな突然変異生成によって修飾することができる。配列が「実質的に対応」しているか否かをみるためには次の点につき考察しなければならない。即ち、配列が標準的アルゴリズムに従って最もよい適合状態に並ぶときの配列類似性の程度、すべての架橋（例、ジスルフィド結合）の連結パターンにみられる類似性如何、例えばＸ線回析分析または核磁気共鳴などによって示される類似する３次構造を有するタンパク質の程度、そして配列決定されたタンパク質が有する類似する生物学的活性の程度である。この文脈において、セリンプロテアーゼインヒビターの中には、同族と認められるタンパク質のファミリーがあり、その中には僅か３０％ほどしか配列類似性がない、いくペアものメンバーがいることに注意されなければならない。好ましくは成熟タンパク質の配列は、自然発生の同族体の配列と、少なくとも５０％が同一であること、より好ましくは８０％以上が同一であるのがよい。三次構造は内部の、また表面の残基を同定するのに用いることができる。一般に（受容体結合部位以外の）表面残基を突然変異されたタンパク質は、活性が残っている傾向がある。しかしCreigton Chothia,Nature, 339:14(1989)は、埋もれた残基における突然変異の許容度について述べている。三次構造はまた、フレキシブルな表面「ループ」およびトメイン間の境界を判定するのにも利用することができる。タンパク質はこうした領域において、削除や挿入に対し許容度がより高いのである。。一般に核磁気共鳴で分析しにくいタンパク質のセグメントは、運動がより自由で、したがってまた突然変異に対する許容度がより高いセグメントであることが多い。挿入および削除はアミノ末端またはカルボキシル末端か、ループ（ヘリックスとヘリックス、ヘリックスとシート、そしてシートとシートをつないでいる配列、およびドメイン間の境界にある配列）で行われるのが好ましい。末端では、内部的な挿入や削除は３個以下のアミノ酸、より好ましくは１個のアミノ酸につき行われるのがよい。突然変異は置換が好ましい。行うことができる置換の種類については、別の組織体の同族タンパク質間のアミノ酸変化の頻度についての分析によることができる。この分析に基づき、保存的な置換を下記のグループ内での交換と定義する。Ｉ．脂肪族で非分極またはごく僅か分極している小さい残基 − Ａｌａ，Ｓｅｒ，ＴＨｒ（Ｐｒｏ，Ｇｌｙ） II．負荷電残基およびそのアミド − ＡｓｎＡｓｐＧｌｕＧｌｎ III．正荷電残基 − ＨｉｓＡｒｇＬｙｓ IV．脂肪族で非分極の大きな残基 − ＭｅｔＬｅｕＩｌｅＶａｌ（Ｃｙｓ）Ｖ．芳香族の大きな残基 − ＰｈｅＴｙｒＴｒｐ３つの残基は、そのタンパク質構造［architecture］における特殊な役割があるので括弧で括ってある。Ｇｌｙだけが側鎖のない残基であるから、鎖にフレキシビリティを与えている。Ｐｒｏは鎖を窮屈に束縛する特殊な形態［geometry］をしている。Ｃｙｓはタンパク質を特殊な折り畳み状態［folding］に保持するジスルフィド結合に関与する。ｂＧＨの４つのシステインは高度に保存されているのである。専門家によっては上記のＩとIIを合併するかもしれない。Ｔｙｒはその水素結合能のためＳｅｒ，Ｔｈｒなどと一定の親族関係にあることも注意されたい。目的のタンパク質と配列および生物学的活性において類似するタンパク質の外観は許容される傾向がある結果、許容できる置換としては公知の置換も含む。例えば問題のタンパク質がスーパーオキシドディスムターゼ活性を持っている場合には、自然発生のＳＯＤと同一のタンパク質を使う代わりに、いくつかの自然発生ＳＯＤのキメラでもよい。所望活性を減少させる突然変異は勿論、ＧＰＩアンカーの付着を阻止するおそれがある突然変異は回避すべきである。活性部位の残基は、それが既知でないときは、ChungとReid (1985)によりＣ４ｂｐにつき行われたように、体系的にフラグメントノ活性を試験することによって、あるいは突然変異体を組織的に試験することにより、決定することができる。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、必須的というわけではないが、自然発生配列と同一でよい。転写効率または翻訳効率を改善したり、制限部位の導入または除去、あるいは組換え可能性を減少するように、「サイレントな」突然変異を起こさせるのもよい。また既述のように、コードされたアミノ酸配列に変化をもたらす突然変異を起こさせてもよい。補体インヒビター異種移植片の移植に当たっては、最も重要なタンパク質が「補体インヒビター」である。補体溶菌系を有する全種の中には、表１に示すように、補体を常態的に阻害する機能を有する種々の分子がある。これらの補体インヒビターは、宿主内での自家細胞溶解を制限することが必要であるようである。補体インヒビターによっては種特異性である。つまり、分解促進因子［decay accelerating factc or］（ＤＡＦ）のようなヒト補体インヒビターはヒトならびにヒトに近縁の霊長類の補体は阻害するが、マウスとかブタといったより遠い種の補体に対しては非効果的である。（At kinson、私信）。実際こうした種特異性の補体阻害の形式は異種移植片が調和的か不調和的かを決定するのに主要な貢献因子の１つと考えられる。ヒト補体インヒビター、ＤＡＦおよびＣＤ５９のうちの少なくとも２つ、あるいは３番目の、相同制限因子［homologous restriction factor］（ＨＲＦ）が、宿主細胞を補体に介在された細胞溶解から単独で保護するとすべて考えられているので、特に関心の高いものである。（Kinoshita，1991）。これらの分子は、Ｃ３およびＣ５の転換酵素（ＤＡＦ）で干渉することによって、あるいは末端の膜侵襲複合体（ＣＤ５９およびＨＲＦ）の形成を阻止することによって、補体を阻害する。しかし本発明はＤＡＦ、ＣＤ５９およびＨＲＦに限定されるものではない。これら分子はすべて赤血球ならびに内皮細胞に認められるもので、グリコシルホスファチジルイノシトール［glycosylphosphatidylinosital］（ＧＰＩ）結合を介して細胞表面にアンカーされている（Lisantiら参照）。タンパク質レベルでこれら３つの補体インヒビターはすべて、表１に見るように、広く分配されており、補体活性と接触している領域ならどこにでも一般に見ることができる。ＣＲ１，ＣＲ２，ＤＡＦ，ＭＣＰ，Ｃ４ｂｐ，およびＨに対応する補体ＤＮＡはクローニングされて配列決定されており、その結果これらのタンパク質は長さ約６０−７０個のアミノ酸のタンデム（縦列的）に反復するモチーフで（Hourca deら参照）、ショート・コンセンサス・リピート［short consensus repeats］（ＳＣＲ）と呼ばれる。いくつかの病原菌は構造的に関係あるタンパク質をコードする遺伝子を持っている。３５ｋワクシニアタンパク質は４つのＳＣＲがついたシグナル配列を有しており、アミノ酸レベルでＣ４ｂｐの半分のアミノ末端に３８％相同である。ＨＳＶの糖タンバク質Ｃ−１は典型的なＳＣＲ構造を欠くが、それでも種々のＣインヒビターに実質的に相同な短いストレッチ（区間）［stretches］を有しており、ＤＡＦ様の活性を示す。酸化防止剤移植に先立ち行われる臓器の摘出、灌流、貯蔵、再灌流の間、血管内皮は環境的ならびに代謝的に激しい変化にさらされる。こうした変化は内皮細胞の活性化および組織損傷をもたらす反応性酸素中間生成物を産生する。この再灌流損傷は、特に異種移植の場合には、移植後の好中球浸透があるために移植臓器をさらなる損傷にさらすことになる。こうした損傷を抑制する１つの方法は、ＧＰＩアンカーを有するスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはカタラーゼを内皮細胞の表面に発現させることである。というのはこれらタンパク質は両方とも酸素遊離基を排除するからである（Erzurum Serpil C., Lermarchand Patricia, R osenfeld Melissa A., Yoo Jee-HongとCrystalRonald G. (1993),“Protection of human endothelial cells from oxidant injury by adenovirus-mediated tr ansfer of the human catalase cDNA,” Nucleic Acids Rcsearch 21:1607-1612参照）。これをもたらすための好ましい方法は、これらタンパク質の長期的な構成的な［co nstitutive］発現が移植片受容体の健康にとって害となるおそれがあり、これらのタンパク質の血管内皮表面全体に亙る効果的な発現がウイルスのベクター系にとって達成困難のおそれがあるため、ＧＰＩの転移で行う方法である。細胞内酵素であるカタラーゼにとって、細胞表面における発現を目標とするために、ＧＰＩ尾を付加するためのＧＰＩアンカー配列のほかに、疎水性リーダー配列を付加することが必要であろう。次にこのタンパク質を赤血球中で発現させると、血管細胞表面に転移する。付着分子ＧＰＩ結合タンパク質について最も込み入った特徴の１つは、それらタンパク質のいくつかが付着分子として機能すると考えられることである。例えばＮ−ＣＡＭ、つまり神経細胞付着分子［a neural cell adhesion molecule］が、ＲＮＡの別のプロセッシングのためにＧＰＩ結合型およびトランスメンブラン型の両方の形で存在している。ニューロンが神経細胞以外の細胞上で培養されると、ニューロン以外の細胞に表現されたＮ−ＣＡＭの両形が軸索突起［neurite］の発達を促進させることができる。こうしたニューロンによる応答はニューロン内のトランスメンブランＮ−ＣＡＭによって仲介されるもので、古典的な第２メッセージ経路を刺激する。本例ではＧＰＩの結合したＮ−ＣＡＭが認識機能または位置識別情報を供給するように考えられ、一方、トランスメンブラン型は細胞がこの情報に活発に応答することを要求するのかもしれない。この解釈に沿って発見されることは、基質細胞（ニューロンがはい回っている細胞）と目標細胞（それに向けてニューロンが分岐しシナプスを成立させる細胞）とが、しばしばＧＰＩの結合したＮ−ＣＡＭを発現することである。例えば、その上にニューロンが成長するSchwann細胞およびニューロンがそれにシナプスを成立させる骨格筋は、ＧＰＩの結合したＮ−ＣＡＭ（Schwann細胞）を選択的に発現するか、またはシナプス形成の前にＧＰＩの結合した形（骨格筋）に切り替わる（Wals h F.S.Dohery P.(1991)“Glyosylphosphatidylinositol anchored recognition molecules that function in axoonal fasciculation,growth and guidancein t he nervous system,”Cell Biology International Reports,15:1151-1166参照）。上述したように細胞表面に対するタンパク質のＧＰＩ結合は、ある意味では薄弱である。したがってＧＰＩの結合した付着分子の発現によって細胞付着を阻害するようにこの状態を利用することも可能である。細胞表面のこうした分子は、別の細胞上にある付着分子に結び付いたとき、単純に膜から放出されるのかもしれない。このようにしてＧＰＩの結合した付着タンパク質は「滑りやすい岩」として機能するのかもしれない。例えばリンパ球の内皮細胞への炎症箇所における付着は、主としてＶＣＡＭ−１によって仲介される。この付着分子は、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αによる処理後２時間以内に内皮細胞上に発現されるトランスメンブランタンパク質で、この発現は少なくとも７２時間維持される。この分子の発現はリンパ球の付着と浸透を可能にする。ＶＣＡＭ−１のＧＰＩ結合型を表現させることによって、内皮のリンパ球浸透を遅延させるか阻止することも可能である。このＧＰＩの結合したイソフォーム［isoform］は遺伝子導入のマウスまたはブタの赤血球中に発現させることができ、そこでこれは血管内皮細胞に転移する。こうしてブタから得た臓器はヒトに移植することができ（臓器がヒト補体調節タンパク質も表現するとするならば）、ヒト内でリンパ球浸透に対する促進された抵抗力を持つであろう。多形核白血球への内皮結合の同じような阻害は、ＧＰＩの結合したＥＬＡＭ−１のイソフォームを使って達成することができる。ＵＰＡ受容体遺伝子治療の取組みに応用可能なＧＰＩ転移のもう一つの効用は、造血幹細胞の導入［introduction］および正常にＧＰＩの結合したウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター受容体の過剰な発現である。この受容体およびそのリガンド、そしてウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーターは酵素前駆体プラスミノーゲンの調節に関与するもので、こうして血栓症など、組織の再構築［re modeling］に関与する多くの生物学的過程に関係する。（McNeill Helen and Je nsen Pamela J. （1990），“A high affinity receptor for urokinase plasminogen activator on huma n keratinocytes: characterization and potential modulation during migrat ion,” Cell Regulation. 1:843-852参照）。このタンパク質の過剰な発現およびその内皮細胞への転移は、静脈炎で苦しむ患者の手足に蓄積された血栓症部位を抑制するのに有効に適応することができる。この方法は、移動のための血流を必要とするので閉塞した脈管に血流を復帰させることはできないが、部分的に閉塞した脈管中での流れを改善するものと期待できる。さらにこの方法は、病気再発からの長期的救助策となる一時的処置ともなる。静脈炎処置のための類似の遺伝子治療法は、共にＧＰＩアンカーを組み込むための修飾を必要とする内在性膜タンパク質であるトロンボモジュリン［thrombomodulin］および組織プラスミノーゲンアクティベーター受容体を使って行うことができる。（Nachman RalphL.( 1992),“Thrombosis and atherogenesis: Molecular connetions,”Blood.79:18 97-1906参照）。ＧＰＩ付着シグナル配列ＧＰＩアンカーの利益を得るために、正常にはＧＰＩが結合していないタンパク質（例、ＣＲ１，ＣＲ２，ＭＣＰ）に、自然発生の、または修飾してある既知のＧＰＩ付着シグナルを組み込むことは本発明の技術範囲内にある。ＧＰＩの結合したタンパク質に関する研究についてはCrossら，1990; Lisantiら，1990; Fe rguson, 1991; FergusonとWilliams, 1988参照。正常にはＧＰＩが結合していないタンパク質にＧＰＩアンカーが付着するように細胞を仕向けるためには、そのタンパク質（またはその問題のタンパク質の生物学的に活性なフラグメント）のカルボキシ末端に適当なシグナル配列が提供されるようにその配列を修飾することが必要である。ＧＰＩ部分［moiety］の付着は、小胞体内で起こると考えられる翻訳後修飾である。ＧＰＩ付加の結果、疎水性配列が発生期のタンパク質のカルボキシ末端から取り除かれる。この疎水性配列は必要なものではあるが、ＧＰＩ付加のシグナルに完全な十分な部分ではない。例えばカルボキシ末端１７アミノ酸のＤＡＦの疎水性ドメインは、削除されると、ＧＰＩ残基の付加を妨害するし、この同じ配列が異種タンパク質、ヒト成長ホルモンに融合されてもＧＰＩでアンカーされた融合タンパク質を生成しない。 Carasら，“Analysis of the signal for atta chment of a glycophospholipid membrane anchor”，Journal ofCell Biology ，108:1387-1396，（1989）参照。既知のＧＰＩが結合したタンパク質中で、切断および付着後の最後のアミノ酸は、代表的なものとして、Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ａｓｐ，Ａｓｎそして（おそらくそれほど好ましくないが）Ｃｙｓである。（Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｐｒｏ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｔｈｒ，ＭｅｔおよびＴｙｒはこの役割を果たさないということを信ずる理由は、Ferguson（1991）を参照）。これらは全部小さいアミノ酸で、せいぜい炭素２つの側鎖を持つ程度である。小さい付着アミノ酸には、切断された同じか別の第２のそのようなアミノ酸が続いているのが通常である。（これら２個のアミノ酸を切断／付着部位［cleavage,attachment site］（ＣＡＳ）ダブレットと共に呼ふ）。このダブレットは疎水性カルボキシ末端と一緒になってＧＰＩ付加にとって必要最小限の配列を形成するように思える。しかしＧＰＩ付加の効率に影響する多数の微妙な変形がある。ＣＡＳダブレットの疎水性ドメインに対する位置関係は重要である。５−２０アミノ酸のスぺーサ、より好ましくは７−１４のスペーサ、さらにより好ましくは８−１２アミノ酸のスペーサがよい。このスペーサ配列についてFerguson（1991）は極性アミノ酸が共通していると記しており、この知見は追認されるであろうが、ＧＰＩ付加の効率にはそれほど影響しないようである。Ｓｅｒ−Ｓｅｒ，Ｓｅｒ−Ｇｌｙ，Ｓｅｒ−ＡｌａのＣＡＳダブレットが最も有効なようである。最後に疎水性ドメインの長さもＧＰＩ付加の効率性に影響し得る。疎水性ドメインは、小胞体内で、ＧＰＩ部分が付着できるよう発生期のタンパク質が小胞体（ＥＲ）膜の通過［ transit］を遅くさせるか一時的に停止するように機能すると考えられる。ロイシンのホモポリマーを疎水性ドメインとして使うと、１４残基の尾部が最高度に有効で、１１残基の尾部が僅かにそれより少なく有効だったが、８残基の尾部はＧＰＩが付着するには十分でなかった。Coyneら，“Construction of synthetic signals for glycosyl-phosphatidylenositol anchor attachment”, Journal of Biological Chemistry，268:6689-6693（1993）参照。これは常態的に疎水性であっても、疎水性ドメインの長さが重要であることを示している。自然発生ＧＰＩアンカーシグナルの疎水性分析（表４参照）は、疎水性ドメインが最小限８個のアミノ酸からなり、より好ましくは平均最小疎水性が−１．３（典型的には、短い配列としては疎水性が高い）の、これより長い配列からなることを示す。好ましくは、疎水性ドメインは電荷のあるアミノ酸を持たないのがよい。これらは最も親水性だからである。表４のシグナル配列の１部だけしかＧＰＩ付着を必要としないかもしれない。疎水性領域の縮重があるため、また、小さなアミノ酸付着部位の組合せ可能性が多数あるゆえに、保存的な置換が許容できると考えられる。ＧＰＩ結合の付加は、すべてのタイプの細胞とは言わぬまでも、殆どの細胞で広く行われる。ＧＰＩ付加は一連の共通した、どこにでもある細胞機能を介してつくられると考えられる。したがってＧＰＩ付加に実質的に影響する種ないし細胞特異性はないものと考える。あるＧＰＩシグナル配列は、すべての種のすべての細胞タイプに効率的である。そうは言ってもＧＰＩ結合タンパク質の合成の効率性は、シグナル配列だけでなくＧＰＩ合成に必要な他の酵素の存在にも左右される（Crossの考察第17-22頁参照）。例えばAmthauerら（1993）は、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）がＧＰＩ合成に関与する代謝中間体に結び付くことを証明している。また、著者らはトランスアミダーゼ（まだ同定されていない）が小胞体中に存在することを証明している。好ましい実施例では、目的のタンパク質は、下記の分解促進因子（ＤＡＦ）由米の付着シグナル（ＤＡＦ２９）の生物学的活性に必要な部分を少なくとも有する融合物として発現される。ただし、上記配列（配列番号１３）においてＣ末端疎水性ドメインにはアンダーラインが付され、切断・付着部位は太字で示されており、ＣＡＳダブレットの最初のアミノ酸はＳまたはＧである。Lisanti,J.Cell.Sci.,99:637-640（1991）は、ｈＧＨ−ＤＡＦ２９（Ｓｅｒ，Ｇｌｙ）融合物がＧＰＩが結合した形で発現され、トランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞によって正しく配置された、と報告している。多数の付着シグナルの候補が同時に産生され、Ladner,USP5,223,409の方法で効率性を高めるためスクリーニングされた。遺伝子がコードする、正常に分泌され容易に分析できるタンパク質、例えば成長ホルモンを付着シグナルである可能性のある大きなファミリーをコードしている「さまざまな」（半ランダムな）ＤＮＡに融合する。コドンのある位置は、その遺伝子の各バージョン中の同一アミノ酸をコードするが、その他の位置は、どのＤＮＡ分子を調べたかにより、異なるアミノ酸をコードする。Ladnerはこれらに相当するアミノ酸位置を各々、「定常」残基と「可変」残基と言っている。定常残基と可変残基は所望のように散在させることができる。多数の残基に影響を与えて変化させることも可能である。例えば、このＤＮＡは次の形を取ることもできる。 α₂β_8-12γ_8-30 下付き文字は、クラスα、β、γ各々のコドン数で、αコドンはＧＡＳダブレットのアミノ酸をコードし、βコドンはスペーサのアミノ酸をコードし、γコドンは疎水性尾部のアミノ酸をコードする。理論的には、遺伝子は、所定の可変残基における「置換セット」が、遺伝子的にコードできる２０個のアミノ酸すべてを含むように合成されることができる。より典型的には、このバリエーションは制限され得る、例えば１個または２個以上のαコドンが、Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ａｓｐ，ＡｓｎおよびＣｙｓのいずれかを独立してコードするように各々ランダム化され、１個または２個以上のγ コドンが、より疎水性のアミノ酸、例えばＩｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｗ，Ｐｈｅ，Ｃｙｓ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＳｅｒおよびＴｙｒのいずれかを独立してコードするように各々ランダム化される。（これ以外の置換セットも可能である）。βコドンはそれほど重要でない。βコドンは既知のＧＰＩ結合タンパク質前駆体のスペースの後にモデルされる１配列をあらゆるタンパク質中にコードするように選択することができるし、あるいはβコドン中のバリエーションはアミノ酸よりも多数のコドン中でコードすることができ、あるいはβコドンの１個または２個以上は各々、自然発生種中によく認められるアミノ酸をコードするコドンから独立に選択することができる。融合遺伝子はＧＰＩアンカーをタンパク質に付加することができる培養可能細胞中に発現される。この細胞はまずネガティブスクリーニングにかけられる。これは、上澄液［the supernate］中に親タンパク質（例えば成長ホルモン）を（例えばラベルされた抗体を用いて）探すことである。それが発見されたら、そのタンパク質はＧＰＩアンカーを有し、膜内に保持されているのではなくむしろ分泌され、これらの細胞中に発現される候補シグナルが非効率的であることが証明される。第１回のスクリーニングを経た「非分泌」細胞は次に、ホスホリパーゼＤまたはその他のＧＰＩ結合を切断する酵素で処理する。上澄液を次にＧＨの存否をみるためスクリーニングにかける。もし存在するなら、細胞が、ＧＰＩが結合したＧＨを産生したことを示すが、ＧＨが培地中に出て行きホスホリパーゼ処理がＧＰＩを除去したことを示すことにはならない。ＧＰＩ結合型ＧＨは、ＧＨ／ＤＡＦ２９付着シグナルのキメラを細胞中に発現することによって産生されたので、ＧＨは好ましい「分析目標」である。したがってこうしたシグナルの付着はＧＨの検出に干渉しないことが知見される。トランスジェニック（遺伝子導入）動物遺伝子導入動物においては、その導入遺伝子はその動物の子孫にも伝達できるように生殖細胞も含めてその動物の細胞の全部に最終的に含まれる。キメラ動物においては、その動物に内在性の細胞の少なくともあるものはその導入遺伝子を持つが、生殖細胞の伝達は必ずしも可能ではない。「遺伝子的に操作された動物」という用語は、遺伝子導入動物およびキメラ動物の両方を含む概念である。しかし導入遺伝子の生殖細胞伝達は普通有益なのであるから、遺伝子導入動物の生産は通常好ましい。したがって以下の記載では「遺伝子導入」動物について言及するが、それらの言及は、必要な変更を加えて、その他のキメラ動物にまで適用されるものとする。導入遺伝子を動物の遺伝材料に導入する技術としては、レトロウイルス［retroviral］感染、エレクトロポレーション［electroporation］、受精卵の前核［pronuclei］中に導入遺伝子を微量注射する方法、胚の幹細胞操作など多数の技術を使うことができる（WagnerとHoppeによる米国特許第4,873,191号; PalmiterとBrinster, 1986,Ann.Rev.Genet.20:465-499; 1987年8月7日に公告されたフランス国特許出願第2593827号参照）。今日までに生産された遺伝子導入動物（すべての遺伝子導入家畜類を含む）の殆ど全部はＤＮＡの前核微量注射法によるものである。この技術は、１個の細胞で受精した卵子の前核の一つにＤＮＡ溶液を移す［delivery］技術を含んでいる。受精卵の前核はNomarski光学機械により200倍で見ることができる。ブタ、ウシおよびヒツジの卵子の場合には、その卵子はまず、前核の視覚化を困難にする細胞質脂質を沈降させるため、遠心分離しなければならない。（Swansonら、199 2）微量注射法に用いられる細胞保持／微量注射用ピペットはホウケイ酸ガラスキャピラリー（毛管）（1mm O.D.,0.78mm I.D.）から製造される。毛管はマイクロフォージで加熱されてから引き伸ばされて、微量注射、あるいは保持端が作られる。微量注射後、残りの卵子は発情期にある受容体雌中に戻される。この前核微量注射法以外にも、例えば、遺伝子的に操作したレトロウイルスを移植前の胚に感染（１個〜８個の細胞）させる方法などがある。Jaenisch,R.（1 976），“Germ line integration and Mendelian transmission of the exogeno us Moloney leukemia virus”; Ploc.Natl.Acad.Sci.USA 73:1260-1264参照。この場合には透明帯が除去され、胚が感染過程中で繊維芽細胞と共に培養される。感染した胚は透明帯に戻され、適当な受容者に移入される。遺伝子導入動物を産生するもう一つの方法は、エレクトロポレーションを行うものである。この技術では１個の細胞卵子をＤＮＡ溶液の入ったエレクトロポレーションチャンバに入れる。このチャンバ中に脈動する電界が作られＤＮＡを卵子中に移動させる。胚幹［embryonic stem］（E S）細胞ラインが、哺乳類（例、マウスおよびハムスター）の胚盤胞の内細胞塊の細胞から得られる。例えば主要な胚繊維芽細胞または胚繊維芽細胞の細胞ラインＳＴＯの支持細胞層における成長によって、ＥＳ細胞が幹細胞状に維持される。ＥＳ細胞はインビトロ哺乳類細胞培養に適した技術ならいずれによっても遺伝子的に改変することができ、その後胚盤胞中に注射される。それから生殖細胞などの動物組織の全部とは言わぬまでも殆どを分化させコロニー化［coloniz e］する。 Doetschman，“Gene Targeting in Embryonic Stem Cells”,Chap. 4,pp. 89-100，of First and Haseltine，Transgenic Animals （Butterworth-H einemann: 1988）参照。遺伝子導入動物はその細胞全部の中に導入遺伝子を持っているか、遺伝子的にモザイクであるかである。多くの研究が遺伝子導入にマウスを利用しているが、ほかの種の遺伝子導入動物、例えばウサギ、ヒツジ、ブタ（Hammerら， 1985， Nature 315:680-683）、ニワトリ（Salterら, 1987,Virology 157:236-240）、ラット（Mullinsら,1990,Nature,344:541-544）、ヤギ（Denmanら, 1991）,Bio/ Technology,9:839-843）、およびウシ（Krimpenfortら, 1991,Bio/Technology,9 :844-847）なども産生されている。遺伝子導入ブタは、適切に調製した目的のタンパク質をコードする挿入断片で、α及び／又はβグロビン遺伝子を置き換えてSwansonら（1992）に記載されている方法および材料を採用して作出することができる。適応化分析本発明の１側面は適応化過程を模倣するインビトロ分析となっている。この分析では臓器移植中にある率［ratios］を模倣して内皮細胞を1000倍のヒト赤血球と共培養する。赤血球の溶解を回避するため細胞を洗浄し、新鮮な赤血球が３日ごとに追加される。培養期間後、ヒト血清を添加して内皮細胞を補体抵抗力について試験する。この分析は３つの主要な結果を示した。第１は６日間の過程を通じて、十分な補体阻害機能がヒト赤血球から内皮へと転移され、完全に近い補体保護を示す。第２にこの補体阻害機能は種特異的である。すなわちヒト赤血球との共培養は内皮細胞をヒト血清から保護するが、ブタまたはネズミ血清からは保護しない。第３にこの分析は、少なくとも２つの既知のヒト補体インヒビター、ＤＡＦおよびＣＤ５９を、共培養した６日後に内皮細胞膜へ転移させることを証明した。補体阻害機能は単に共培養するだけでヒト細胞から異種細胞へ転移することができる。しかも種特異的な補体抵抗力の獲得は、好ましくはヒトＤＡＦおよびＣＤ５９の赤血球から内皮細胞への膜間転移を含む。補体抵抗力をインビトロで確立するのに必要な時間は異種移植片の適応化に必要な時間に類似する。したがってこの分析は自然発生過程を模倣するのである。可動細胞中におけるＧＰＩ結合タンパク質（例、Ｃインヒビター）の産生遺伝子導入動物の細胞中であるか否かに関係なく、さまざまな可動細胞中で発現するのに好ましいプロモーターを表３に示す。ＧＰＩが結合しているタンパク質（例、Ｃインヒビター）を赤血球（成熟中に核を喪失する前の）中で発現させようとする場合、その導入遺伝子を発現する動物の赤血球中で活性なプロモーターがその導入遺伝子になければならない。好ましくはそのプロモーターは、赤芽細胞中で主として発現されるものがよい。このようなプロモーターの例は、ヒト α、β、δ、υまたはζプロモーターのようなグロビンプロモーターか、またはヒト以外の種のこれらに相当するプロモーターである。αグロビンプロモーターの配列については Liebhaberら，proc. Nat.Acad.Sci.USA,77:7054-56（1980）参照。遺伝子を遺伝子導入ブタ赤血球で発現させようとする場合、ブタグロビンプロモーターが特に好ましい。しかし内在性プロモーターの使用は必要でない。また、採用されるプロモーターが自然発生配列を持っていることも必要でない。配列を、そのプロモーターの力すなわち組織特異性を促進するように突然変異させてもよい。例えば赤芽細胞特異性を与えるグロビンプロモーターの調節エレメントをなすものなど、より高いレベルの転写活性を有する別のプロモーターでハイブリッドプロモーターを構築することも可能である。転写効率および特異性はグロビンプロモーターより劣るであろうが、赤血球中でＧＰＩの結合したタンパク質（例、Ｃインヒビター）の発現を駆動させるため、グロビンプロモーターのほかに赤血球中で機能する別のプロモーターを使うことも可能である。グロビンプロモーター以外の、赤血球中でＧＰＩ結合タンパク質（例、Ｃインヒビター）を発現するのに適したプロモーターとしては、その赤血球細胞骨格のタンパク質成分をコードする遺伝子のプロモーターがある。これらには、αスペクトリン［Sahrら，“The Complete cDNA and Polypeptide Sequences ofHuman Erythroid Alpha-Spectrin,”J.Biol.Chem.265:44 34-43（1990）］、βスペクトリン［Winkelmannら,“Molecular Cloning of the cDNA for Human Erythrocyte Beta-Spectriｎ,:Blood, 72:328-34（1988）］、アンキリン［Lambertら，“cDNASequence for Human Erythrocyte Ankyrin,”Pr oc.Nat.Acad.Sci.USA,87:1730-34（1990）］およびヒト赤芽細胞陰イオン交換タンバク質［Luxら，“Cloning and Characterization of Band 3, the Human Ery throcyte Anion-Exchange Protein （AEI）”Proc.Nat.Acad.Sci.USA,86:9089-9 3（1989）］などがある。ＣＲ１は赤血球中でのみ発現されるＣインヒビターであるから、ＣＲ１プロモーターも関心のあるものである。ＣＲ１はＧＰＩの結合していないタンパク質である。これらのほかのものとしては、赤血球中で製造される酵素のプロモーター、例えばスーパーオキシドジスムターゼとかカルボニックアンヒドラーゼがある。マクロファージ中での発現に好ましいプロモーターは、ニワトリリゾチームである。ＣＤ２およびＴＣＲプロモーターはＴ細胞中での発現にとって好ましいものである。繊維芽細胞には、インターフェロンβ（繊維芽細胞インターフェロン）遺伝子またはその他の繊維芽細胞中で特に活性な遺伝子のプロモーターで転写を制御することができる。プロモーターの上記の例は本発明の範囲を限定するためのものではない。基本的な要件はＧＰＩの結合したタンパク質（例、Ｃインヒビター）の妥当量の供給を可動細胞の表面に向かわせ、異種移植片の血管内皮のような目標組織へと転移させるように、十分に高いレベルで適当な時間内に遺伝子を発現することである。しかしこの生産が遺伝子導入動物中で行われるときは、その遺伝子導入動物の生活過程の妨害をできるだけ少なくするように選択した運搬可動細胞にその発現が特異的であることが好ましい。必ずしも内皮細胞というわけではないが、赤血球（またはその他の可動細胞）中にＣインヒビターを発現させることの利点は、その結果得られる適応化された臓器または組織は、外来遺伝子を発現しないことである。外来遺伝子を発現する臓器や組織の移植を心配する声がある。これら以外の調節エレメントも、構造遺伝子の上流および下流の両者または構造遺伝子のイントロン中にあるものを含めて、導入遺伝子中に組み込むことができる。好ましくは赤血球中での発現のために、導入遺伝子はGrosveld WO89/0151 7に記載のように、優性な活性化因子（部位制御領域［locus control region］（ＬＣＲ））配列を有しているのがよい。ヒト成人βグロビン遺伝子の５’の約５０kbおよびヒトυグロビン遺伝子の５’の５kbに、いくつかのＤＮａｓｅＩ超過敏部位すなわちＬＣＲがある。これらの部位はGrosveld,WO9/01517に記載のように、制御したＤＮａｓｅＩ消化によって同定される。GrosveldはβグロビンＬＣＲの全部または一部を有するβグロビンの「ミニ遺伝子座」ベクターの構築法について記載している。実施例対照例Ａ：タンパク質の位置確認：それは膜内にあるのかタンパク質が細胞表面に表わされるか否かをみる標準的分析法は、無傷の浸透化されていない細胞を目的のタンパク質に特異的な抗体でラベルすることであろう。次にそのタンパク質特異的抗体を、第１抗体に特異的な第２の蛍光複合抗体で検出する。あるいは、この問題のタンパク質に特異的な抗体である第１抗体を、ＦＩＴＣまたはローダミンのようなフルオロクロム［fluorochrome］に直接複合してもよい。次にこの抗体が結合された細胞を蛍光顕微鏡で観察するか、蛍光活性化した細胞分画（セルソーティング）によって観察することができる。蛍光顕微鏡はMoranら（1991）によって使われた方法で、蛍光細胞分画法はCoyneら（ 1992）によって使われた方法である。免疫グロビン分子のサイズは無傷の細胞中への侵入をさせないから、そのタンパク質が細胞外表面に現れる限り、その抗体によってのみ検出することができる。対照例Ｂ：タンパク質に付いたＧＰＩアンカーの検出問題のタンパク質にＧＰＩが結合しているかどうかを判定するには少なくとも３つの方法がある。いずれの方法も単独では決定的ではないが、これら３方法すべてを使って得た結果が現在のところＧＰＩ結合の証明となっている。第１の方法は、ＧＰＩ結合しているもののホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）による加水分解に対する感受性を利用する。問題のタンパク質を発現する細胞を、熱失活させた２％ウシ胎児血清と４μｇ／mlのＰＩＰＬＣとで少量のリン酸緩衝生理食塩水中で３７℃で３０〜６０分インキュベーションする。インキュベーション後、細胞を遠心分離して取り出し、その上澄液を、問題のタンパク質が存在するかみるため、通常はＥＬＩＳＡアッセイで分析する。この方法はMoranとCara（1991）、およびCaras，WeddellおよびWilliam s（1989）でも使われた。第２の方法は、ＧＰＩアンカーのあるタンパク質を明確にラベルするためにＧＰＩ結合したものの特殊構造を利用するものである。一般にタンパク質はエタノールアミンを有していないが、この化合物はＧＰＩ結合物の決定的な成分である。細胞はトリチウム化したエタノールアミンを使って代謝的にラベルすることができるから、この放射性トレーサーをＧＰＩアンカー中に組み込む。ラベルされてしまえば、このタンパク質は洗浄剤を使って膜から抽出したり、ＰＩＰＬＣによって細胞表面から放出することができる。こうして得た溶解タンパク質を、問題のタンパク質に特異的な抗体で免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する。一般にこの方法は、ポリペプチド中に放射性トレーサーを位置付けるための³⁵Ｓラベルしたメチオニンを使った標準的なタンパク質のラベル法と平行的に行われる。メチオニンでラベルされたタンパク質を免疫沈降の対照として使うのである。この方法はCaras，WeddellおよびWilliams（1989）でも使われた。ＧＰＩ結合を証明するための第３の方法は、活性化状態中にはＧＰＩの結合しているタンパク質は細胞膜へ自発的に一体化しようとする能力があるが、これを利用するものである。この方法を行うためにＧＰＩアンカーを有する問題のタンパク質を精製する。この精製の詳しい方法は具体的なタンパク質ごとに異なるが、通常、洗剤溶解とイオン交換精製および／又はイムノアフィニティカラムからなる。場合によっては有機溶剤で調製した粗抽出物を使うこともできる。精製されたタンパク質を、問題のタンパク質を発現しない細胞と共にインキュベーションする。ＧＰＩアンカーがあるため、タンパク質は生化学的活性状態で異種細胞膜中に取り込まれる。次にタンパク質の活性を適当な分析を行って測定する。例えばMedofら（1984）はブタノール抽出、ＤＥＡＥ-Sephacelおよび高圧液体クロマトグラフィを組合せて、ヒト赤血球からＤＡＦを精製している。この精製されたタンパク質をヒツジ赤血球に加えると、そこに組み込まれ、ヒト補体からの保護を示した。ブタ内皮細胞を使った同様な実験がDalmassoら（1991）によって行われた。これらの実験もＤＡＦがヒト補体に対する保護を示すことを証明している。一般に最初の２つの方法は、比較的容易なので普通に用いられており、一緒に行われれば、有益なタンパク質がＧＰＩアンカーされていることを示す確実な証拠となる。最後の方法はタンパク質の厳格な精製が要求されるので、稀にしか行われない（タンパク質があまり精製されていないときは、不純物が観察された活性に関与していると批判され得る）。滅多に行われないとはいってもこの分析法は、特に他の２法と共に行われたときは、ＧＰＩ結合体の存在についてのきわめて高度な確証となる。ＧＰＩの結合したタンパク質が細胞間で転移可能であることを証明するには、そのタンパク質を発現する細胞をそのタンパク質を発現しない非対応細胞と共に培養することができる。ＧＰＩアンカー分析はOxford GlycoSystems Cat ♯K-200で「IDENTIFICATION of PIRLC sensitive proteins」というキット形式で入手できる。実施例１：適応化のインビボ分析細胞培養仔ウシ大動脈内皮細胞（＃CCL 209 CPAE）をAmerican Type Culture Collecti onから得た。解凍後、75mm組織培養フラスコ中に播く（プレートする）前に、細胞を10％仔ウシ血清300mg/mlL-グルタミンおよび５０μg/mlゲンタマイシンを補足したPRMI 1640中で10mlに希釈した。細胞を37℃の、５％ＣＯ₂で湿潤したインキュベータ中に置いた。６日間の成長後、トリプシン処理して細胞を２個の75mm フラスコに分けた。Ａ＋型血液を、PresisionGlide Vacutainer（Becton, Dickinson and Company 社Rutherford NJ.）の針とホルダーを使って、ヘパリンを含有している収集管（ VenoJect, Terumo Medical EIekton MD.）中に健康な成熟牡から収集した。血液を15ml Falcon 2097型の円錐形遠心分離管（Becton, Dickinson and CompanyRut herford NJ.）に移し、2100rpmでIEC HN-SII （Damon/IEC Needham MA）卓上遠心分離機にかけた。血清画分を取り、100μl ごとに分けて−８０℃で貯蔵した。赤血球を３回リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で遠心分離機を使って洗浄し、血清および補体のような血清成分を除去した。白血球の密集した軟層も除去した。洗浄後、赤血球を、補足RPMI 1640中に再懸濁し、血球計算器を使って数えた。約１×１０⁵の赤血球が２mlの補足RPMI 16 40中で懸濁され、24ウエル組織培養皿10個中で培養した。上澄液を毎日採取し、ヘモグロビンを415nmにおいて分光器で分析した。９６時間培養後に初めて、光学密度にきわめて僅かな変化が見られた。血液を成熟ブタから咽喉部穿刺で集め、直ちにヘパリン処理した。血液収集後約２４時間で、ブタ血液を前述の方法で洗浄し、前述と同様にして血清を保存した。麻酔をかけたマウスから眼球収集［ocular collection］によってマウス血液を20μlのヘパリンを含有した1.5ml管に収集した。マウス血液を前述と同様に洗浄した。マウス血清をOncogene Science （ManhassetNY.）から得て前述と同様に貯蔵した。補体の分析第１回の実験はマイトマイシンＣ（0.02μg/ml一晩インキュベーション）で処理した仔ウシ内皮細胞とヒト赤血球との共培養を含む。第２回以降の実験は未処理の仔ウシ内皮細胞に関する。培養実験は２室（チャンバ）用組織培養スライド（＃177380Nunc Naperville IL）または24ウエルのプレートのいずれかで行った。組織培養室は室温で１０分間、１％ゼラチンでプレコートされた層流組織培養フード中で行った。ジェラチン溶液を吸引器で吸い出し、使用前にスライドを空気乾燥した。約１×１０⁴の仔ウシ内皮細胞を各チャンバ内でウエルにプレートし、補足したRPMI 1640内で株化するまで２４時間インキュベーションした。新たに収集し、調製した約1000倍のヒト赤血球を各チャンバに加え、その赤血球を共培養した。７２時間ごとに赤血球を吸引器で吸い出し、新たに収集し調製した赤血球を加える前に内皮細胞をリン酸緩衝生理食塩水でほかの赤血球に触れないようにして洗浄した。内皮細胞の補体に対する感度を評価するため、赤血球をチャンバ／ウエルから吸引器で吸い出し、リン酸緩衝生理食塩水で、ほかの赤血球に触れないようにして内皮細胞を３回洗浄した。赤血球と共に培養されなかった内皮細胞を有するチャンバ／ウエルを同様にして洗浄した。その後、両方のチャンバ／ウエルの細胞を10％の正常ヒト血清を含有する補足したRPMI 1640で４時間培養した。内皮細胞による補体抵抗力の獲得内皮細胞による補体抵抗力の獲得は、ヒト赤血球を仔ウシ大動脈内皮細胞（AT CC♯CCL-209 CPAE）と共に培養することで得た。内皮細胞をチャンバ内で、ヒト赤血球の存在下あるいは非存在下で、１日、３日、６日、７日、８日および９日共培養インキュベーションした後、仔ウシ内皮細胞上にヒト血清の効果を測定した。ヒト血清中の補体成分が介在したと考えられる細胞損傷を視覚的に確認するため位相差顕微鏡で細胞を観察した。１日目および３日目には、ヒト赤血球の存在下に培養されたか否かに関係なく、ヒト血清にさらした後の内皮細胞の劇的な減少があった。両グループ中に残った細胞の実質的な全部が、正常の付着性形態［adherent morphology］と対照的に丸く膨張した。これはヒト血清中の補体成分が細胞を攻撃したので異常な形態と溶解をもたらしたことを示唆している。ヒト赤血球との共培養の６日後には、劇的に異なる結果をもたらした。前述の通りヒト血清でインキュベーションすると、対照グループは３日目に観察された細胞と類似するように見えた。無傷の［intact］細胞が全体的に激減し、残った細胞は丸くなったが非付着性であった。逆にヒト赤血球と共に培養された内皮細胞は、ヒト血清でインキュベーション後も正常で、全く、あるいは殆ど、異常が見られなかった。７日目、８日目、９日目も同様な結果であった。これは１日目および３日目に、ほぼ最適レベルの補体調節タンパク質が赤血球から内皮細胞へ転移されたことを示す。しかし６日目までには、十分な調節タンパク質（おそらく少なくともＤＡＦとＣＤ５９）が内皮細胞膜内に組み込まれ、膜をヒト補体から保護したのである。当初の心配はＧＰＩの結合したタンパク質の転移が非常に遅く非効率的ではないのかということだった。内皮細胞がタンパク質の転移よりも迅速に成長するのなら、内皮細胞はヒト補体から保護するのに十分なヒトＤＡＦ及び／又はヒトＣＤ５９を組み込むことができないかもしれない。したがって内皮細胞を、ＤＮＡに架橋して***抑制剤として作用するマイトマイシンＣで処理した。実施例２：膜タンパク質の赤血球から他の細胞への転移のインビトロ分析仔ウシ内皮細胞を前述したと同様にヒト赤血球と共培養した。培養の３日目、６日目、７日目及び８日目に、前述したと同様に赤血球を採取した。抗ヒトＤＡＦマウスＩｇＧモノクローナル抗体（Waco Pure Chemical Industries, Ltd., R ichmond VA）と、抗ヒトＣＤ５９ラットＩｇＧモノクローナル抗体（Dr. Herman Waldman寄贈品）とを、ヒトＤＡＦが仔ウシ内皮細胞へ転移したかどうか評価するため、テキサスレッドと結合したヤギ抗マウスＩｇＧと共に使った。マウス抗血液グループＡＩｇＧ（Pharmingen San Diego CA）を、その他の赤血球膜タンパク質の転移を評価するため、ＦＩＴＣと結合したラット抗マウスＩｇＧと共に使った。室温で１０分間アセトンで固定して、内皮細胞を蛍光抗体染色する準備を行った。抗体のインキュベーションを４℃で行った。内皮細胞をヒトＤＡＦ（５μg/ ml）に対する抗体と共に、５％のウシ胎児血清及び０．１％のＮａＮ₃を補足したリン酸緩衝生理食塩水中で同時に２０分間インキュベートした。細胞を抗血液グループＡ抗体と共に同様にしてインキュベートした。第２の抗体インキュベーションを、５μg/ml濃度で前述と同様にして結合した抗体を使って、暗室中で行った。第２抗体インキュベーション後、細胞を前述と同様に洗浄し、蛍光抗体を定量した。実施例３：補体抵抗力の種特異性赤血球から仔ウシ内皮細胞への補体抵抗力の転移の有無の評価は、一般的な現象であるかヒト赤血球に限られたことなので、もう一つの実験を行った。この実施例では仔ウシ内皮細胞を、２４個のウエルプレートに１ウエルプレートにつき当初１×１０⁴の細胞濃度で培養した。そしてヒト、ブタまたはマウスの赤血球を、これらの細胞と共に培養した。２日目と９日目に観察した。４個のウエルプレートを、各観察日に赤血球の各種ごとに割り当てた。４個のうち２個のウエルプレートを、その処理グループ内の赤血球と同種のものから１０％の正常または熱失活した血清にさらした。残り２個のウエルプレートの各々を、その処理グループ内で赤血球が使われなかった２種の１つから得た１０％血清にさらした。したがって各処理は、内皮細胞と共に培養された赤血球と同種のものから得た血清の効果の評価と、赤血球と共に培養されたものとは異なる種から得た血清の効果の評価とからなる。前述の例から分かるように、内皮細胞は、それが赤血球と共に２日間インキュベーション後のクロスされた種から得たものか否かに関係なく、補体攻撃から保護されない。このことは不十分なレベルの補体調節タンパク質が、赤血球から内皮細胞へと転移したことを再び示している。赤血球と共培養の９日経過後には、その内皮細胞と共培養した赤血球と同種のものから得た血清（正常のもの又は熱失活させたもの）にさらした内皮細胞は、補体による溶解から保護された。これは補体調節タンパク質が赤血球から内皮細胞へと転移したことを再び示している。しかし赤血球源となったものと異なる種から得た血清は内皮細胞を溶解した。したがって不調和異種移植では、ある一定の種の補体調節タンパク質は不調和補体の存在下で機能しないことが明らかである。またこれは、補体阻害タンパク質の赤血球から内皮細胞への転移というものは、前述したヒト赤血球と仔ウシ内皮細胞に限定されない一般的な過程であることも示している。実施例４：遺伝子のクローニングと遺伝子導入動物の調製４．１ＣＤ５９遺伝子を導入した赤血球特異的発現系の構築あるＧＰＩが結合したタンパク質の、その宿主から供与体組織への転移によるインビボ適応化は、形質転換した赤血球中にそのタンパク質を発現させることによって行われ、この赤血球は次にそのタンパク質を供与体の組織へ転移する。ヒトＣＤ５９のｃＤＮＡはDr. Herman Waldmanから提供して戴いた。表２に示したＰＣＲプライマーＣＤ５９５、及びＣＤＮ５９３は、クローニングを容易にするために末端に操作されたＮｃｏＩ部位を有するコード領域だけを含むように設計された。ヒトαグロビン遺伝子をDr.Frank Grosveldから入手して，クローニングベクターｐＳＥＬＥＣＴ−１（Promega Biotechnology Madison,WI）中にクローニングし、ｐＳＥＬＥＣＴαをつくった。多数のαグロビン遺伝子クローンが公に入手可能で、その他のどんなαグロビンプロモーターならびにターミネーターでも受容できる。調節配列の配列が公表されているので、所望なら合成することもできる。グロビンＮｃｏＩ部位のαグロビン遺伝子ヘライゲーション（連結）する前に、ＰＣＲでクローニングされたｃＤＮＡをＮｃｏＩで消化した。こうしてグロビンプロモーターは赤血球へのＣＤ５９の発現を命令することができ、グロビン遺伝子はｍＲＮＡの安定性に必要なエレメント（すなわち３’隣接ＤＮＡとポリアデニレーションシグナル）を提供することができる。このαグロビン／ＣＤ５９のキメラ遺伝子をｐＳＥＬＥＣＴαからＣｌａＩ、ＫｐｎＩ消化で取り出し、ヒトヘモグロビンの部位制御領域［locus control region］（ＬＣＲ）があるプラスミド（ｐＬＣＲ）中に挿入した（Grosveld参照）。ＬＣＲのあるプラスミドはDr.Grosveldおよび英国のMedical Research Councilから一般に入手できる。ＬＣＲはDr.Grosveld W）89/01517に記載の方法でヒト遺伝子ＤＮＡを適当にスクリーニングすれば得ることができる。ＬＣＲαＣＤ５９プラスミドをＳａｃIIで消化し、ＬＣＲαグロビン：ＣＤ５９の直鎖状フラグメントを取り出し、微量注射する前にアガルースゲルで精製した。４．２ＣＤ５９遺伝子導入動物の調製ＣインヒビターＣＤ５９遺伝子およびグロビン調節配列を持つがプラスミド特異的配列は持たない直線状フラグメントを、Wagner（Wagnerら、1981）に大略記載の方法で受精マウス胚中に微量注射した。出発［founder］マウス（Ｆ₀）は、スロットブロットハイブリダイゼーションで同定し、遺伝子導入マウスを繁殖させることができるときは常に遺伝子導入されていないマウスに育種した。遺伝子導入マウスの系統化を始めるため、Ｆ₁×Ｆ₁の交配をした。それで得た子孫をＦ₂ ．．．と名づけた。タンパク質とＲＮＡの発現パターンを、Ｆ₁、Ｆ₂またはＦ₃ 遺伝子導入マウスのいずれかを使って調べた。４．３遺伝子導入動物内でのＣＤ５９の組織分布遺伝子導入マウス内で赤血球およびリンパ球にヒトＣＤ５９のタンパク質を発現させることはＦＡＣＳ分析で評価し、組織でのタンパク質の発現を調べるためには免疫組織化学を利用した。１０個のライン（系統）の各々から得たＦ₁遺伝子導入動物を頚部脱臼させて殺した。約２mmの立方体の組織片を、心臓、膵臓、肺、腎臓および肝臓から採取した。この組織サンプルをTissue-TEK O.C.T.（Mil es Inc. Elkert IN）で被覆した約２mm立方体のコルクの上に置き、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結した。凍結後に４ミクロン厚の切片にクリオスタットで切断し、免疫組織化学分析のためにスライド上に乗せた。乗せられた切片を分析するまで−８０℃で保持した。組織を固定するため１０分間室温のアセトン中に浸漬する前に、スライドを１０分間室温にして解凍した。固定後、スライドをアセトンから取り出し空気乾燥した。組織を予め湿らすため３分ごとにＰＢＳを変えて、そのスライドをＰＢＳ中に１２分間浸漬した。ＰＢＳ中で１：２５に希釈した約２５μlの一次抗体を組織上にピぺットで乗せた。この一次抗体は、Dr. Herman Waldman （Meriら1990）から入手したラットＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体（ＹＴＨ５３．１）である。ヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂでアフィニーティー精製された、ＦＩＴＣに結合している抗体を二次抗体として使用した。各抗体とインキュベーション後、ＰＢＳを３分間ごとに変えてスライドを全部で９分間ＰＢＳ中に浸漬した。その組織内の内皮細胞（ＥＣ）に関する免疫組織化学染色の結果は、試験されたマウス中の平均で、心臓２＋、腎臓３＋、膵臓３＋、肝臓微→２＋、肺微→２＋となり、赤血球でのＣＤ５９発現のレベルに依存していた。導入遺伝子がコードするヒトＣＤ５９の赤血球特異的タンパク質の発現を調べるためＦＡＣＳで全血をを分析した。ＥＤＴＡの入った管中に眼窩骨膜［perior bital］から放血させて全血を集めた。赤血球をＰＢＳ中で洗浄し、血球計算器で数えた。約１×１０⁶の赤血球を１０μlのＰＢＳ中に再懸濁し、抗−ＣＤ５９（ＹＴＨ５３．１）または対照の非特異的ラットＩｇＧ２ｂのいずれか５μｇを加え、１時間氷上でインキュベーションした。ＰＢＳで３回赤血球を洗浄し、１００μlのＰＢＳ中で再懸濁した。紅藻素（フィコエリスリン）を接合したヤギ抗ラット１ｇＧ２ｂの１μg を加え、１時間インキュベートした。その赤血球をその後ＰＢＳで３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを補足したＰＢＳ５００μl中に保存した。分析はCou lter Elite流動細胞計測器で行った。Ｆ₁遺伝子導入マウス全部が、ヒト赤血球に検出されるレベルより平均で２倍ものレベルで、赤血球にヒトＣＤ５９を発現した。４．４遺伝子導入動物中でのＤ５９メッセンジャーＲＮＡの組織分布ヒトＬＣＲと関連するヒトαまたはβグロビン遺伝子の造血組織特異的発現については既に論述されている（Behringerら、1989）。したがってＥＣにヒトＣＤ５９抗原が存在することはタンパク質の転移に起因するのにちがいない。これを確認するため、ＲＮＡを種々の組織から得て調べた。Ｆ₁遺伝子導入マウス１匹に麻酔をかけて、固定した。腹中央部を切開して胸腔を開け心臓をさらした。大静脈を分断後、丸頭の２３ゲージ針を左心室に挿入し、肝臓と腎臓が青白くなるまで、ヘパリンナトリウム含有のＰＢＳ（約30ml）を体内に灌流させた。腎臓、心臓および肝臓のサンプルを取り出しＲＮＡをChomczynskiら（1987）の方法によって単離した。ウエル当たり３μgのトータル細胞ＲＮＡをノザーン分析した。対照の遺伝子導入されていないマウスＲＮＡは、ヒトＣＤ５９プローブにハイブリダイズしなかった。適正な大きさのハイブリダイゼーションは、遺伝子導入マウスの血液ＲＮＡからのみ検出され、腎臓、心臓あるいは肝臓のサンプルで検出されなかった。血管化された［vascularized］移植片の遺伝子導入マウスＥＣに検出されたヒトＣＤ５９抗原は、このＥＣでは合成されなかったと我々は結論した。ヒトＣＤ５９抗原は、赤血球からＥＣへと転移したのにちがいない。４．５ＣＤ５９の内皮細胞への転移ＣＤ５９がインビボで赤血球からＥＣへ転移することを証明しようとして、腎臓を遺伝子導入していないマウスから遺伝子導入マウスに移植した。この移植を完成するため腎動脈を背大動脈に、そして腎静脈を大静脈に接続した。尿管を膀胱に接続した。こうして移植された腎臓は機能する腎臓として働いた。移植後５日目に、移植された正常マウス腎臓を生検して、前述と同様に組織片を免疫組織化学法で分析した。ヒトＣＤ５９を、５日間遺伝子導入マウス血液にさらされた非遺伝子導入マウスの腎臓中に３＋の濃度でＥＣから検出した。正常マウス腎臓のＥＣに検出されたヒトＣＤ５９抗原は、遺伝子導入マウスの赤血球からのみ出たものである。この実験はヒトＣＤ５９抗原が赤血球から内皮細胞へ転移することを明確に証明している。ＣＤ５９の赤血球から内皮細胞への転移につきさらなる証拠を提供するため、 Leong法（Leongら、1992）に基づき骨髄移植実験を行った。１２匹のＣＤ５９遺伝子導入マウスを２０匹の非遺伝子導入マウスのための骨髄供与体として使った。移植前６日目と５日目に遺伝子導入供与体マウスに、０．２５mgのモノクローナル抗体ＹＴＳ１６９およびＹＴＳ１９１（Leongら、1992）の血管内注射をした。遺伝子導入供与体マウスを移植用細胞を集める前に頚部脱臼で殺した。大腿骨と脛骨を各マウスから取り出し、骨髄幹細胞を採取するため水洗した。脾臓を取り出し、単個細胞懸濁液［a single cell suspension］を調製した。全部の供与体マウスから得た幹細胞と脾臓細胞を各々の懸濁液中にプールした。移植前１４日目に受容体マウスに、０．２５mgのモノクローナル抗体ＹＴＳ１６９およびＹＴＳ１９１の血管内注射をした。その後受容体マウスに０．２５mg のＹＴＳ１６９およびＹＴＳ１９１のＩ．Ｐ．血管内注射を移植前１１日目、８日目、６日目、４日目に行った。さらにこれらマウスに飲料水に入れた５００mg /lのジメトリダゾール［dimetridazole］を移植前１０日目〜０日目まで投与し、飲料水に入れた５０mg/lのオキシテトラサイクリンを移植後０日目〜２１日目まで投与した。移植前２０時間目に、受容体マウスにジメチルミレラン［dimeth ylmyleran］（８mg/kg）をＩ．Ｐ．注射した。ジメチルミレラン（ＤＭＭ）は骨髄剥離剤［myeloablative agent］（Leongら、1992）として作用する。遺伝子導入供与体マウスから得た１×１０⁷骨髄細胞と１×１０⁷脾臓細胞を、これらマウスに血管内注射した。移植後１００日目に受容体マウスをＦＡＣＳ分析でスクリーニングし、ＣＤ５９陽性反応赤血球の存否をみた。約３０％の赤血球がＣＤ５９陽性反応を示す３匹のマウスから腎臓摘出を行った。免疫組織化学分析を行って、分析した腎臓中に３＋ＥＣ染色を検出した。頸部脱臼により１匹のマウスを殺し心臓組織の生検をしたが、これもヒトＣＤ５９につきＥＣ特異的染色を示した。上述の腎臓移植の場合に見られるように、この実験はヒトＣＤ５９抗原がさまざまな血管化した臓器中で赤血球から内皮細胞へと転移することを明確に示している。４．６転移後のＣＤ５９の機能完全性ヒトＣＤ５９が心臓の赤血球から内皮細胞へひとたび転移したその機能面での完全性を半ビボ［ex vivo］でLangendorf法により臓器灌流して評価した。遺伝子導入と非遺伝子導入各々のマウス心臓を、はじめに、安定な基礎心臓［a stab le basal heart］（ＨＲ）になるまで（平均約２０分）、酸素化したウィスコンシン大学（University of Wisconsin）（ＵＷ）培地で灌流した。ＨＲの安定後、５０％のヒト血漿または血清を補足した酸素化ＵＷ培地を使って、初期の基礎ＨＲの２５％が得られるまで（平均約３０分）臓器を灌流した。最初の基礎ＨＲが２５％に到達したら、灌流を止め、心臓の生検を前述のように免疫組織化学分析のため行った。灌流後のＥＣ上にヒト膜侵襲複合体［membrane attack comple x］（ＭＡＣ）が存在するか否かをみるため生検サンプルを分析した。ＭＡＣについての免疫組織化学染色は灌流後の非遺伝子導入ＥＣ上で３＋濃度であるのに対し、遺伝子導入ＥＣ上では限局性で微小量であった。したがって赤血球から内皮細胞へ転移したヒトＣＤ５９が機能していたのである。４．７ＤＡＦ遺伝子導入発現系の構築ヒトＤＡＦｃＤＮＡをヒト胎盤ｍＲＮＡからクローニングした。このｃＤＮＡは第１鎖ｃＤＮＡ合成反応のＰＣＲによって得た。表２に示すプライマーＤＡＦ５とＤＡＦ３は、クローニングが容易なように、端部に操作されたいくつかの制限酵素認識部位をもつｃＤＮＡのコード領域だけを含むように特別に設計された。ＤＡＦｃＤＮＡをＰＣＲでクローニングし、ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化してからｐＧｅｍ−４Ｚ（Promega Biotechnology Madison WI）に連結してｐＧｅｍ−４ＺＤＡＦを調製した。ＤＡＦクローンをＸｂａＩ、ＰｓｔＩでｐＧｅｍ −４Ｚから取り出し、ｐＳＥＬＥＣＴαにクローニングするためマングビーンヌクレアーゼで平滑化させた。ｐＳＥＬＥＣＴαをＮｃｏＩで消化し、平滑化したＤＡＦクローンと連結反応させる前にマングビーンヌクレアーゼで平滑化させた。また、αプロモーターが発現を指示するのに利用することができ、α遺伝子はｍＲＮＡ安定配列を提供することができる。微量注射に使うＬＣＲαＤＡＦ直線状フラグメントを放出させるため、ＬＣＲαＤＡＦプラスミドをＳｃａＩとＫｐｎＩで消化した。４．８ＣＤ５９／ＤＡＦ遺伝子導入共発現系の構築と用途ＬＣＲαＣＤ５９とαＤＡＦフラグメントをつくるために、上述のＬＣＲαＣＤ５９ＳａｃIIフラグメントをαＤＡＦフラグメントと共に使った。これを行うため、ピーブルースクリプト［pBluescript］（Stratagene, LaJolla, CA）をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶで切断した。ＬＣＲａＣＤ５９を前述したようにＳａｃIIフラグメントとして得て、pBluescriptの平滑化されたＥｖｏＲＶ部位中に連結反応する前に平滑化した。このpBluescripＬＣＲαＣＤ５９をＥｃｏＲＩで切断し平滑化した。ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ αＤＡＦフラグメントをpSelect αＤＡＦから取り出し、ｐBluescripＬＣＲαＣＤ５９の平滑化されたＥｃｏＲＩ部位中に連結反応させる前に平滑化した。ＬＣＲαＣＤ５９、αＤＡＦフラグメントを、完全ＳａｌＩ完全消化、ＳａｃII部分消化で取り出し、微量注射のため精製した。ＬＣＲαＣＤ５９、αＤＡＦ構築物［construct］を有する遺伝子導入マウスを同定した。ＣＤ５９とＤＡＦ両者の赤血球特異性発現を、ＦＡＣＳ分析でこれらのマウス中に同定した。ＣＤ５９とＤＡＦはまた、蛍光抗体法で遺伝子導入マウスの内皮細胞上に検出された。４．９人工的にＧＰＩを結合した融合タンパク質ＭＣＰ：ＤＡＦの遺伝子導入発現系の構築ＣＤ５９とＤＡＦと同様な可動特性を有すると考えられるＧＰＩの結合したＭＣＰをつくるため、ＭＣＰｃＤＮＡとＤＡＦｃＤＮＡの融合を行った。ＭＣＰは、本質的にＧＰＩの結合しないＣインヒビターである。これを行うため、ＰＣＲプライマーＭＣＰ５とＭＣＰ−ＳｃａＩを使って、ＭＣＰｃＤＮＡの最初の８２５塩基をクローニングした。ＰＣＲプライマーＤＡＦ−ＳｃａＩとＤＡＦ３を使ってＤＡＦの最後の２７９塩基をクローニングした。ＤＡＦＰＣＲフラグメントをＳｃａＩとＰｓｔＩで消化し、ＸｂａＩとＰｓｔＩで切断したｐＧｅｍ中に連結反応させる前に、ＭＣＰフラグメントをＳｃａＩとＸｂａＩで消化した。１１０４ＭＣＰ：ＤＡＦフラグメントをｐＧｅｍ中に単離し、正しいコドン整列となっているかを確認するため配列決定した。ｐＳｅｌｅｃｔαＭＣＰ：ＤＡＦを調製するため、ＤＡＦについて前述したように、ＭＣＰ：ＤＡＦＸｂａＩ、ＰｓｔＩフラグメントをｐＳｅｌｅｃｔαにクローニングした。４．１０ＣＤ５９／ＤＡＦ／ＭＣＰ：ＤＡＦの共発現系の構築 αＣＤ５９、αＤＡＦおよびαＭＣＰ：ＤＡＦを有するクローンをpBluescrip 中に構築した。これを行うため、pBluescripをまずＥｃｏＲＩで切断し平滑化した。αＭＣＰ：ＤＡＦをｐＳｅｌｅｃｔαＭＣＰ：ＤＡＦからＣｌａＩとＫｐｎＩとで消化して取り出し、pBluescripαＭＣＰ：ＤＡＦを作るため、平滑化した pBluescrip中に連結反応する前に平滑化した。次にpBluescripαＭＣＰ：ＤＡＦをＳａｃIIで切断し、ＳａｃII部位であったところにＥｃｏＲＩリンカーを付加して平滑化した。これをＣｌａＩで切断し、ＬＣＲαＣＤ５９、αＤＡＦ配列中に付加するためＳａｌＩで切断される前に平滑化した。上記のpBluescripαＣＤ５９、αＤＡＦをＳａｃIIで部分的に切断し、平滑化し、そしてその後ＳａｌＩで切断して、一方端が平滑化され、他方端にＳａｌＩのオーバーハングを有するＬＣＲαＣＤ５９、αＤＡＦフラグメントを、取り出した。このフラグメントを準備してあったpB luescripαＭＣＰ：ＤＡＦ中に連結反応させて、pBluescripＬＣＲαＣＤ５９、 αＤＡＦ、αＭＣＰ：ＤＡＦをつくった。１７．２５kb ＬＣＲαＣＤ５９、α ＤＡＦ、αＭＣＰ：ＤＡＦフラグメントをＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩの部分消化で取り出し、微量注射のために調製した。この構築物を有する遺伝子導入マウスと遺伝子導入ブタを産生した。４．１１ εグロビン調節ＤＮＡによるＣＤ５９遺伝子導入発現系の構築および用途内在性グロビン遺伝子の遺伝子座アレンジメントによりよく類似している構築物を設計した。Grosveldから入手したヒトεグロビン遺伝子をＫｐｎＩフラグメントとしてｐＧｅｍに連結反応させた。このｐＧｅｍεをＢｇｌIIとＢａｍＨＩで消化し、コード領域の主要部分を取り出した。ゲル精製後この消化ｐＧｅｍε を再連結して、プロモーター領域を有するがコード領域は殆どない突然変異ε遺伝子（ＥΔ）をつくった。したがってこの突然変異εは活性のあるεタンパク質を産生することができないものである。ＥΔをＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、 pBluescripのＥｃｏＲＶ部位に連結反応させる前に平滑化した。Grosveldから入手したヒトβグロビン遺伝子をＫｐｎＩ、ＭｌｕＩフラグメントとしてｐＳｅｌｅｃｔに連結させた。ヒトＤＡＦｃＤＮＡを、αグロビンについて上述したようにしてβグロビンのＮｃｏＩ部位に連結反応させた。βグロビンＤＡＦをＤｐｎＩ、ＭｌｕＩフラグメントとして取り出し、pBluescripEΔの平滑化されたＥｃｏＲＩ部位に連結反応する前に平滑化した。ＬＣＲαＣＤ５９フラグメントを、pBluescripのＥｃｏＲＶ部位に平滑末端で連結させた。このpBIuescripＬＣＲ αＣＤ５９プラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、ＥΔβＤＡＦフラグメントと平滑末端で連結する前に平滑化した。このpBluescrｉｐＬＣＲαＣＤ５９ＥΔβＤＡＦフラグメントを、マウス卵子に微量注射するために準備する前に、部分Ｓａｃ II、ＳａｌＩ消化で取り出した。ＣＤ５９およびＤＡＦを赤血球に発現し、内皮細胞へ転移する遺伝子導入マウスが産生された。実施例５：遺伝子導入臓器の患者への移植心臓移植片を必要とする患者が、実施例４の方法で調製された適切なサイズの遺伝子導入ブタに適応化される。別の臓器を必要とするその他の患者も同時に同じ遺伝子導入動物に適応化される可能性もある。このブタから得た組織サンプルを実施例３の方法で分析し、臓器が十分にヒトに適応化しているかを判定する。それからブタを殺し心臓を摘出する。心臓は患者に外科的に移植される。実施例６：インビボでの臓器および組織の修飾実施例４で得た遺伝子導入ブタを殺す前後に血液を採取する。または殺されるブタ以外の遺伝子導入ブタから血液を得る。血液凝固予防のため収集した血液にクエン酸ナトリウムまたはＥＤＴＡを添加する。正常ブタを腎臓（その他の臓器）を必要とする患者に適応させる。この正常ブタに麻酔をかけ、頚静脈にカテーテルを挿入する。ブタ血液の１リットルを各ブタから採取し、遺伝子導入ブタ血液の１リットルと交換する。処理ブタを他の動物から分離し１週間食物を供給する。７日後にブタ組織のサンプルを採取し、臓器が移植にとって十分に適応化しているかを判定するため、実施例１に従い分析する。ブタを殺し腎臓（その他の臓器）を取り出し、ヒト患者に外科的に移植する。実施例７：異種移植片のインビボでの適応化腎臓移植が必要な透析療法を受けている患者を適切なサイズのブタに適応させる。まずブタに麻酔をかけ、Ａ結合カラムおよび補体受容体結合カラムへの血清通過によると、自然に予備形成されたヒト細胞に対する抗体および補体の除去と、血漿交換との組合せで免疫抑制する。こうして得た血清につき、サンプルを取り出し、それを洗浄ヒト赤血球とインキュベーションして溶解の存否を観察して完全除去が行われたかどうかを調べる。血液１リットルをこのブタから採取し、洗浄したヒト赤血球の１リットルと交換する。ヒト赤血球を血液銀行から得て、受容体患者に交差適応しているかどうかを判断基準にして選択する。この過程を８日間毎日反復する。８日後にブタを殺し、腎臓を摘出する。移植に先立ち移植される臓器またはその動物の無関係の組織の一部につき、腎臓が超急性拒否反応の発生がない程十分に受容体宿主に適応化されているかを判定するため、実施例３の分析法で試験する。それから臓器または組織をヒト受容体に外科的に移植する。実施例８：ＧＰＩの結合しているタンパク質の細胞間転移に関する分析ＧＰＩ転移のメカニズムは明確でない。ある者は転移は、フリーなＧＰＩ結合タンパク質の自発的な放出によって起こると示唆している。もしこれが正しいのだとすれば、自発的放出の高度な反復により、血清中にあるＤＡＦ、ＣＤ５９アルカリホスファターゼや５’ヌクレオチダーゼ（すべて赤血球に発現される）のようなフリーなＧＰＩの結合したタンパク質を発見することが期待できることになる。しかし事実はそうでなく、これらタンパク質が他の膜中に効率的に吸収されるか、またはＧＰＩ放出頻度が非常に遅いか、あるいはフリーなタンパク質が血清ＰＩＰＬＤで急速に加水分解されることを事実は示唆している。この後者の可能性は、可溶性のＧＰＩタンパク質の存在を説明できる。ＧＰＩ転移のメカニズム解明は、異種移植に対する影響上重要である。移植がフリーなタンパク質経由で起こるのだとすれば、ＧＰＩ転移の効率性は、遺伝子導入動物中でも、また異種移植片を受けたヒト患者中でも、ＰＩＰＬＤインヒビターの投与によって改善することができることになる。小胞［vesicles］経由のＧＰＩ転移、すなわち「さっと動かすこと」［flipping］はこの処理から利益を受けるものではない。メカニズムの説明には以下の３つの可能性がある。（１）ＧＰＩ結合タンパク質は細胞の膜表面から自発的に放出され、そのＧＰＩ尾部のために別の細胞の膜中に取り込まれる。このメカニズムでは、転移ビークルはフリーなタンパク質である。（２）細胞が、他のタンパク質の中で、その膜中に埋め込まれたＧＰＩの結合したタンパク質を含有している脂質小水泡を産生する。このメカニズムでは、別の膜に融合することになる小胞はＧＰＩの結合したタンパク質の転移用ビークルである。このメカニズムはトランスメンブランタンパク質をＧＰＩ結合タンパク質ほど効率的に転移することができると期待される。（３）ＧＰＩ結合タンパク質の転移は細胞間の物理的な接触があって初めて起こるものである。この接触の結果、１細胞のＧＰＩ結合タンパク質が他の細胞の膜中に埋め込まれるように「さっと動かす」のである。この後者のメカニズムは、ＧＰＩ転移を開始するために細胞／細胞間の接触を必要とし、ために必ずしもその細胞表面からの自発的なＧＰＩ結合タンパク質の放出の有限率［finite rate］を必要としない、という点で最初のものとはっきり異なる。我々のインビトロ培養系は、細胞間のＧＰＩ転移を調査できる契機を提供するものである。例えばホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣがＧＰＩ結合タンパク質を細胞表面から除去させることができるということは文献で衆知のことである。逆に血清タンパク質であると考えられる（Davitzら（1989）参照）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤはＧＰＩ結合タンパク質を細胞膜から除去させることはできないが、溶液中のフリーなタンパク質のＧＰＩ結合を加水分解することはできる。したがって、これらのリパーゼはＧＰＩ転移に関する２つのどちらかのメカニズムのいずれかを選択するのに必要な道具を提供するものである。ＧＰＩ結合タンパク質を含有している小さい脂質小胞に仲介された細胞間転移は、その小胞中のＧＰＩ結合タンパク質に影響しないＰＩＰＬＤに抵抗力（耐性）があるが、その小胞からＧＰＩ結合タンパク質を移動させるＰＩＰＬＣによって阻害されるかもしれない。逆に、フリーなＧＰＩ結合タンパク質経由の転移は、ＧＰＩ結合タンパク質を細胞表面から移動させるＰＩＰＬＣ溶液中のフリーなＧＰＩ結合タンパク質を加水分解するＰＩＰＬＤの両方に感受性かもしれない。これらの酵素を我々のインビトロ共培養分析に組み込むことによって、これら二者択一のメカニズム（上記１と２）を解明することができる。細胞と細胞との接触の必要性について調査するため、培地条件が設定できるように供与体細胞の赤血球だけを単独で培養できる。こうして設定された培地を、低速度の遠心分離機にかけ全細胞を除去し、次に高速度で小胞体［vesicle］のような巨大分子成分を除去する。このように処理された条件設定された培地を次に標的細胞（例えば内皮細胞）に適用し、ＧＰＩ結合されたタンパク質の転移を本明細書に記載したようにして測定する。この条件設定培地で低速度遠心分離後に転移が起きていたら、細胞・細胞接触は必要ではなく転移はフリーなタンパク質または小胞体経由で起こり得る。高速度遠心分離後にＧＰＩ結合タンパク質の転移も起きたら、転移のメカニズムはフリーなタンパク質に起因する可能性が高い。この実験は条件設定培地をＰＩＰＬＣおよびＰＩＰＬＤ処理と組合せて行うこともできる。上記のように、ＰＩＰＬＣは小胞体経由の転移を阻害するものと考えられるし、ＰＩＰＬＤは小胞体仲介の転移に何の影響ももたないと考えられる。同様にフリータンパク質の転移はＰＩＰＬＤおよびＰＩＰＬＣの両方によって阻害される。ＧＰＩ転移は、標的細胞（内皮細胞）が供与体細胞（赤血球）から選択的な透過膜によって分離されるように改変した培養系中でも調べることができるかもしれない。この浸透膜の細孔サイズは、ＧＰＩ結合タンパク質あるいは小胞体のような巨大分子を通過させることがきるように選択することも、または細胞の２タイプ間で交換することができるような他の膜にすることもできる。膜が存在することは密接な細胞と細胞との接触に重大な制限を課すものである。この改変された培養系は、密接な細胞・細胞接触の必要性や、（分離膜が許容する）最大サイズ、また転移ビークルの化学的性質を決定するために、ＰＩＰＬＣおよびＰＩＰＬＤ酵素の処理と共に使うことができる。。おわりに具体的な実施例に関する上述の事柄は、現今の知識を適用することによって第三者でも、一般的な概念から離れることなく具体的な実施例につき種々の応用を容易に採用したり改変することができ、したがって、こうした応用や改変もここに開示された実施例と均等な技術範囲技術事項内にあると考えられるべく、本発明の一般的な性質を開示したものである。ここに採用された語句は技術説明を目的としたもので、技術限定を目的とはしていないことを理解してほしい。本願に記載の特許、特許出願、および記事など全引用は、ここに組み込むものとする。引用文献 Crossから採用のこの表は、ｃＤＮＡから予想されるカルボキシアミノ酸配列をリストしている。縦線は翻訳後ＧＰＩの切断／付着位置を示す。親水性は７am inoacid windowを使ってKyte and Doolittle,J.Mol.Biol.,157: 105-132（1982 ）法される疎水性ドメインの始まりを示す。ＤＡＦの場合に限って、この疎水性ドメインは実験してマップした。その他のドメインはＧＰＩ付着部位からの間隔（最小距離はアミノ酸８個）及び、スロープ中で最大のマイナス変化を示したアミノ酸を選択して行った配列全体の親水性プロッティングに基づき選択した。親水性値は、表５自然にＧＰＩ結合しているタンパク質加水分解酵素アルカリホスファターゼアセチルコリンエステラーゼ５’-ヌクレオチダーゼトレハラーゼアルカリホスホジエステラーゼ腎ジペプチダーゼアミノペプチダーゼＰリポタンパク質リパーゼ寄生虫タンパク質ｐ６３プロテアーゼLeishmania MerozoiteプロテアーゼPlasmodium 可変表面糖タンパク質trypanosoma 表面タンパク質Paramecium 195-kDa抗原Plasmodium Scrapieプリオンタンパク質 Tegumentタンパク質Schistosoma Ssp-r Trypanosoma 免疫学的Ｔｈｙ−１＊ＲＴ−６＊Ｑａ−２＊Ｌｙ−６＊Ｂｌａｓｔ−１ＣＤ１４＊ＦｃIII受容体＊癌関連癌胎児性抗原非特異***差反応抗原補体分解促進因子＊ＣＤ５９細胞付着ＬＦＡ−３＊神経細胞付着分子ヘパリンサルフェートプロテオグリカンＰＨ−２０モルモット*** その他 130-kDaヘパトマ糖タンパク質 34-kDa胎盤性成長因子ＧＰ−２フォレート受容体オリゴデンドロサイトミエリンタンパク質抗原１１７ジクチオステリウム 125-kDa糖タンパク質Saccharomyces 延長因子ＥＦ−１α ＊は、赤血球、マクロファージ、リンパ球および繊維芽細胞のような、移動細胞に発現したＧＰＩ結合タンパク質を示す。配列表 (1)一般情報 (i)出願人： (ii)発明の名称：異種移植臓器移植片の事前適応化、その他を目的とする膜間移動によるタンパク質の供給法 (iii)配列数：１２ (iv)連絡先： (A)宛名：ブローディ＆ネイマーク (B)番地：ノースウエスト、セブンスストリート４１９番地 (C)市：ワシントン (D)州：ディストリクトオブコロンビア (E)国：アメリカ合衆国 (F)ZIP：２０００４ (v)コンピュータ読取り可能形式 (A)媒体：フロッピーディスク (B)コンピュータ：IBM PC互換 (C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS (D)ソフトウェア：PatentIn Release#1.0,Versin#1.25 (vi)現行出願データ (A)出願番号：US 07/948,521 (B)出願日：１９９２年９月２２日 (C)分類： (viii)代理人／事務所情報 (A)名前：クーパー、アイバーピー． (B)登録番号：２８，００５ (C)整理番号：ＢＹＲＮＥ１ (ix)通信情報 (A)電話番号：２０２−６２８−５１９７ (B)テレファックス：２４８６３３ (C)テレックス：２０２−７３７−３５２８ (2)配列番号１に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：29 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号１ (2)配列番号２に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：33 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号２ (2)配列番号３に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：28 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号３ (2)配列番号４に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：27 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号４ (2)配列番号５に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：24 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号５ (2)配列番号６に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：24 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号６ (2)配列番号７に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：23 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号７ (2)配列番号８に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：23 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号８ (2)配列番号９に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：23 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号９ (2)配列番号１０に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：23 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号１０ (2)配列番号１１に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：23 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号１１ (2)配列番号１２に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：23 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号１２ (2)配列番号１３に関する情報 (i)配列の特徴 (A)長さ：29 (B)種類：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)分子タイプ：ＤＮＡ (xi)配列の説明：配列番号１３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者クーイマン、デービッド、リーアメリカ合衆国、08536 ニュージャージー州、プレインズボロ、タマロンドライブ 7806 (72)発明者ローガン、ジョン、スティールアメリカ合衆国、08691 ニュージャージー州、ロビンスビル、オールドヨークロード 347―ビー

Claims

【特許請求の範囲】１．目的のタンパク質を標的動物の組織に配分する方法であって、（ａ）この目的のタンパク質を膜に有している可動細胞を動物に供給し、このタンパク質は結合されたグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーで膜に付着されたもので、（ｂ）上記組織と接触し、上記目的のタンパク質を膜間転移によって該組織に転移させるように、上記動物内に上記細胞を循環させることを特徴とする、目的のタンパク質を標的動物の組織に配分する方法。ただし上記タンパク質は、膜間転移により上記可動細胞によって上記組織に、上記標的動物内で自然発生している程度より実質的にはるかに大量に、転移する。２．可動細胞が赤血球である請求項１に記載の方法。３．可動細胞が移動細胞である請求項１に記載の方法。４．移動細胞がマクロファージである請求項３に記載の方法。５．移動細胞が繊維芽細胞である請求項３に記載の方法。６．ＧＰＩの結合したタンパク質が可動細胞によって産生される請求項１に記載の方法。７．標的動物がその可動細胞の１個または２個以上がＧＰＩ結合タンパク質を産生するように遺伝子操作された遺伝子導入またはキメラ動物である請求項６に記載の方法。８．可動細胞が標的動物に導入されている請求項１に記載の方法。９．ＧＰＩの結合したタンパク質が可動細胞によって産生される請求項８に記載の方法。１０．ＧＰＩ結合タンパク質が、標的動物への導入前に可動細胞に付着させられる請求項８に記載の方法。１１．第１の種の動物から得た移植可能な細胞を、抵抗性細胞から得た補体抵抗性を上記移植可能な細胞に転移させるのに効率的な条件下で、不調和な第２の種の動物の補体を阻害することができる転移可能な補体阻害因子を有する前記抵抗性細胞に近接させることを特徴とする、不調和な第２の種の動物へ異種移植するため事前適応化した第１の種の細胞を得る方法。１２．供与体動物から得た臓器を、それとは不調和な第２の種の受容体動物へ移植する方法であって、（ａ）請求項１１の方法により異種移植する前に上記臓器の少なくとも血管内皮細胞を事前適応化し、（ｂ）上記事前適応化した細胞を上記受容体動物に移植する、ことを特徴とする方法。１３．上記ステップ（ａ）（ｂ）間に、上記の移植可能細胞のサンプルを、受容体動物の補体に対して活性な補体阻害因子の存否判定のために分析することを特徴とする請求項１２に記載の方法。１４．移植可能な組織を上記抵抗性細胞と共にインビトロで共培養することにより、移植可能細胞を事前適応化する請求項１２又は１３に記載の方法。１５．抵抗性細胞が赤血球である請求項１１〜１４に記載の方法。１６．抵抗性細胞が補体抵抗力の転移にとって効率的な条件下で供与体動物の体内に導入される請求項１２〜１５に記載の方法。１７．抵抗性細胞が供与体動物に輸血された血液細胞である請求項１６に記載の方法。１８．供与体動物が抵抗性細胞を拒否しないように免疫抑制されている請求項１６に記載の方法。１９．供与体動物が遺伝子導入動物で、抵抗性細胞は、補体阻害因子をコードし主として上記可動細胞で導入遺伝子を発現する上記供与体動物の可動細胞から主としてなる請求項１２に記載の方法。２０．抵抗性細胞が赤血球である請求項１９に記載の方法。２１．導入遺伝子の発現が赤血球特異的である請求項２０に記載の方法。２２．抵抗性細胞が移動（遊走性）細胞である請求項１９に記載の方法。２３．移動細胞がマクロファージである請求項２２に記載の方法。２４．移動細胞が繊維芽細胞である請求項２２に記載の方法。２５．抵抗性細胞が遺伝子導入動物から得たもので、その少なくとも一部が、転移可能な形の補体阻害因子を産生する請求項１４に記載の方法。２６．抵抗性細胞が受容体動物から得たものである請求項１４に記載の方法。２７．受容体動物がブタである請求項１２〜２６のいずれかに記載の方法。２８．供与体動物がブタである請求項１２〜２７のいずれかに記載の方法。２９．補体阻害因子が膜関連分子である請求項１１〜２８に記載の方法。３０．補体阻害因子がＧＰＩアンカーのあるタンパク質である請求項２９に記載の方法。３１．補体阻害因子が、補体阻害ドメインが本質的にＧＰＩ非結合のタンパク質のドメインに相当するキメラタンパク質である請求項３０に記載の方法。３２．補体阻害因子がＧＰＩアンカーを有するＭＣＰの類似体である請求項３１に記載の方法。３３．補体阻害因子が、ＤＡＦ，ＣＤ５９，ＭＲＦ，ＭＣＰ，因子Ｈ，Ｃ４ｂｐ，ＣＲ１，ＣＲ２，ワクシニアウイルスｇｐ３５，およびヘルペスシンプレックスウイルスｇｃ−１，ｇｃ−２からなるグループから選択される請求項１１〜２８のいずれかに記載の方法。３４．転移が、接触している細胞間の膜間転移である請求項１１に記載の方法。３５．前記条件が、少なくとも約６日間、細胞接触することである請求項１１に記載の方法。３６．前記因子が超急性拒否反応を阻害する動物であって、予定のイムノコンピテント（免疫適格）な不調和な動物に移植されるとき、超急性拒否反応により拒否されないように、請求項１１に記載の方法によって事前適応化された細胞の臓器。３７．腎臓、眼球、心臓、皮膚、肝臓、骨髄、腸、血管、関節、膵臓、肺、気管支、脳組織、腺、ホルモン生成組織、及びこれら組織の部分のグループから選択される請求項３６に記載の臓器。３８．通常不調和な、第２の種の動物の、補体系に対し有効な補体阻害因子をコードする導入遺伝子を発現する可動細胞を有する第１の種の遺伝子導入動物であって、上記可動細胞が上記補体阻害因子を、他の不可動細胞に転移させるもので、これによって上記遺伝子導入動物の臓器が第２の種の受容体動物に超急性拒否反応を示すことなく転移することができる、遺伝子導入動物。３９．導入遺伝子が可動細胞においてのみ本質的に発現される請求項３８に記載の動物。４０．可動細胞が赤血球である請求項３９に記載の動物。４１．組織が不調和動物に適応化されるか否かを判定する分析法であって、上記組織または類似に処理されたその他の組織のサンプルを得、このサンプルを上記不調和動物から得た血清に接触させてインキュベーションし、上記血清からの抗体の上記サンプルへの結合を測定する、ステップを有する分析法。４２．上記サンプルに結合する抗体が、補体固定、ラベルされた抗免疫グロブリン抗体の添加、または上記サンプル中の細胞の観察により測定される請求項３９に記載の分析法。