DE10059595A1

DE10059595A1 - Proteine und den Proteinen zugrundeliegende DNA-Sequenzen mit Funktion bei Entzündungsereignissen

Info

Publication number: DE10059595A1
Application number: DE10059595A
Authority: DE
Inventors: Juerg Tschopp; Fabio Martinon
Original assignee: Apotech Research and Development Ltd
Current assignee: Topotarget Switzerland SA
Priority date: 2000-11-15
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2002-09-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für mindestens eine PYD-Domäne codieren, Expressionsvektoren, die derartige DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die mit derartigen Expressionsvektoren transformiert sind, aufgereinigte Genprodukte der vorgenannten DNA-Sequenzen, Antikörper gegen die vorgenannten Genprodukte, sowie Verfahren zur Isolierung und/oder zur Expression der vorgenannten Genprodukte. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorgenannten DNA-Sequenzen oder von deren Genprodukten zur Behandlung von Entzündungsereignissen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für mindestens eine PYD-Domäne codieren, Expressionsvektoren, die derartige DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die mit derartigen Expressionsvektoren transformiert sind, aufgereinigte Genprodukte der vorgenannten DNA-Sequenzen, Antikörper gegen die vorgenannten Genprodukte, Verfahren zur Isolierung und/oder zur Expression der vorgenannten Genprodukte und die Verwendung der DNA-Sequenzen oder der Genprodukte zur Behandlung von Entzündungsereignissen.

Proteine weisen einen modularen Aufbau auf, wobei die einzelnen Abschnitte von Proteinen strukturell und ggf. funktionell selbständig sind. Diese Abschnitte werden Do mänen genannt. Proteine mit modularem Aufbau treten bei spielsweise bei Proteinen der apoptotischen Signaltrans duktionskette auf (Aravind et al. (1999) TIBS, 24, 47-53; Hofmann (1999) Cell. Mol. Life. Sci., 55, 1113-28). Für die Klasse der apoptotischen Signaltransduktionsproteine wären drei Familien von Domänen zu nennen, nämlich die Familie der Todesdomänen (DD), die Familie der Todesef fektordomänen (DED) und die Familie der Caspase- Rekrutierungsdomäne (CARD), die alle entfernt miteinander verwandt sind und auch alle einer Superfamilie angehören, die typischerweise in ihrer 3-dimensionalen Struktur ein Bündel von sechs Helices ("six helix bundle") bildet. Zu jenen Proteinen, die eine Todesdomäne, Todeseffektordomä ne und/oder eine CARD-Domäne aufweisen, gehören bei spielsweise die Proteine FLIP, CARDIAK-RIP2, ARC, Bcl10, DEDD, wie in den Veröffentlichungen von Irmler et al., 1997, Nature, 388, 190-195; Koseki et al. 1998, Proct. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5156-60; McCarthy et al. 1998, J. Biol. Chem. 273, 16968-16975; Stegh, et al., 1998, EM- BO J., 17, 5974-86; Thome et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 9962-8 gezeigt. Während also zahlreiche Proteine, die Domänen der strukturellen Superfamilie (Bündel aus sechs Helices) aufweisen, in intrazelluläre Signaltrans duktionsprozesse verwickelt sind, insbesondere aufgrund ihrer Fähigkeit zur Assoziierung mit vor- bzw. in der Si gnaltransduktion nachgeschalteten Proteinen, sind die an der Entzündungsreaktion beteiligten Proteine, ebenso wie die Form der Signalübertragung bei inflammatorischen Re aktionen weitgehend unbekannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einerseits, solche Proteine (mit ihren Aminosäuresequenzen) und ggf. den zugrundeliegenden DNA-Sequenzen zu identifizieren, die an der Entzündungsreaktion beteiligt sind, oder aus anderem Zusammenhang bekannten Proteinen eine Funktion in der Entzündungsreaktionskaskade zuzuweisen und anderer seits, durch Bestimmung der Signaltransduktionsmechanis men, Stoffe zur Behandlung inflammatorischer Reaktionen zur Verfügung zu stellen.

Zur Lösung dieser Aufgabe haben die Erfinder zunächst festgestellt, daß PYD-Domänen eine entscheidende Rolle bei der intrazellulären Weitergabe eines inflammatori schen Signals spielen. Erfindungsgemäß wurde festge stellt, daß die Domäne PYD ebenfalls die Struktur des Bündels aus 6 Helices aufweist und daß sie in ihrem In teraktionspotential mit den insoweit strukturell verwand ten Domänen DED, DD oder CARD vergleichbar ist. Damit wird erfindungsgemäß eine vierte Familie von "Sechs- Helix-Bündel"-Domänen (hier als Domäne "PYD" bezeichnet), die als Bestandteil von nativen Proteinen auftritt, zur Verfügung gestellt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher DNA- Sequenzen, die für ein Protein mit mindestens einer PYD- Domäne codieren, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele. Insbesondere sind alle DNA-Sequenzen mit umfaßt, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren, einschließlich der jeweils im Doppelstrang komplementären Sequenzen (Anspruch 1). In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche erfin dungsgemäßen DNA-Sequenzen offenbart, für die sich ein Signifikanzniveau von p < 10^-2 ergibt, wenn die PYD-Domäne einer Ziel-DNA-Sequenz (also einer potentiell erfindungs gemäßen DNA-Sequenz) mit einem Suchprofil nach Fig. 3 verglichen wird (Anspruch 2). In Hinblick auf die diesbe zügliche experimentelle Vorgehensweise wird auf die Ver öffentlichung von Bucher et al. (1996, Computer Chem., 20, 3-24) und auf die entsprechenden Erläuterungen in der offengelegten deutschen Patentanmeldung DE 197 13 393.2- 41 verwiesen, die beide insoweit Bestandteil der Offenba rung der vorliegenden Anmeldung sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA- Sequenzen offenbart, deren Genprodukt eine der Aminosäu resequenzen (für eine PYD-Domäne), wie in Fig. 6 wieder gegeben, einschließlich aller funktionshomologen Deriva te, Allele oder Fragmente, enthält. Auch mit diesen er findungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA- Sequenzen (einschließlich der Sequenzen des komplementä ren DNA-Stranges) sind mitoffenbart (Anspruch 3).

Bevorzugt sind weiterhin DNA-Sequenzen, die eine der in Fig. 1 angegebenen (c)DNA-Sequenzen enthalten (Anspruch 4). Im Zuge der erfindungsgemäßen Feststellungen wurde nämlich herausgefunden, daß erfindungsgemäße DNA- Sequenzen für zahlreiche Proteine (Aminosäuresequenzen) mit einer PYD-Domäne codieren, die insbesondere auch am ggf. pathophysiologischen Inflammationsgeschehen betei ligt sind. Diese DNA-Sequenzen (einschließlich der ent sprechenden Aminosäuresequenzen) sind in Fig. 1 darge stellt. Hierzu gehören, wie in Fig. 1 jeweils mit Codie rungsnummer dargestellt, die Proteine Pyrin (siehe ent sprechende Protein- bzw. cDNA-Sequenzen gemäß Fig. 1, Co dierungsnummer 1.2), Pycard (Protein und cDNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.3), Pyc (Proteinsequenz und cDNA- Sequenz, Codierungsnummer 1.1), NALP1 (Proteinsequenz und cDNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.4), NALP2 ((alter Name Py7) mit Protein- und einer DNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.5), NALP3 ((alter Name PY5) mit Proteinsequenz und DNA- Sequenz, Codierungsnummer 1.6), NALP4 ((alter Name PY6) mit Proteinsequenz und DNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.7), NALP5 ((alter Name Py8) mit Proteinsequenz und DNA- Sequenz, Codierungsnummer 1.8), NALP6 ((alter Name PY9) mit Proteinsequenz und DNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.9), PY10 (mit Protein- und DNA-Sequenz, Codierungsnum mer 1.10), NALP7 ((alter Name Py11) mit Proteinsequenz und cDNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.11), NALP8 ((alter Name Py12) mit Proteinsequenz und DNA-Sequenz, Codie rungsnummer 1.12), NALP9 ((alter Name Py13) mit Protein sequenz und cDNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.13), NALP10 ((alter Name Py14) mit Protein- und DNA-Sequenz, Codie rungsnummer 1.14), NALP11 ((alter Name Py15) mit Protein- und cDNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.15), Py16 ((von der Maus)., mit Proteinsequenz und DNA-Sequenz, Codierungsnum mer 1.16), NALP13 ((alter Name Py17), mit Protein- und CDNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.17), NALP14 ((alter Name Py18), von der Maus, mit Protein- und cDNA-Sequenz, Co dierungsnummer 1.18), NALP15 ((alter Name Py19) mit Pro tein- und partieller DNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.19), NALP12 ((alter Name Py20), von der Maus, mit Proteinse quenz und cDNA-Sequenz, Codierungsnummer 1.20). Die vor genannten Sequenzen sind sämtlich in Fig. 1 aufgetragen und dort unter den vorgenannten Bezeichnungen bzw. den Codierungsnummern auffindbar. Die zusammengehörigen, d. h. unter einer Codierungsnummer zusammengefaßten DNA- und Proteinsequenzen sind jeweils durch gepunktete Linien im Fettdruck von der nächsten Einheit getrennt. Fig. 1 um faßt 22 durchnumerierte Seiten. Damit handelt es sich bei einem weiteren bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung um DNA-Sequenzen, die für eines der in Fig. 1 dargestellten Genprodukte (d. h. für eine der in Fig. 1 enthaltenen Aminosäuresequenzen) codieren oder DNA- Sequenzen, die zumindest in einem Abschnitt der Gesamtse quenz für eine der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurese quenzen codieren (Anspruch 5).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße DNA- Sequenz, bspw. wie zuvor offenbart oder gemäß Ansprüchen 1 bis 5 beansprucht, enthalten (Anspruch 6). Derartige erfindungsgemäße Expressionsvektoren (bspw. Plasmide) enthalten neben mindestens einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz typischerweise auch Promotor-Bereiche und Termi nator-Bereiche, ggf. auch Marker-Gene (bspw. Antibiotika- Resistenz-Gene) und/oder Signalsequenzen zum Transport des translatierten Proteins.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressions vektor transformiert wurden (Anspruch 7). Als geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Exprimierung der erfin dungsgemäßen DNA-Sequenzen kommen Prokaryotenhefen oder hö here eukaryotische Zellen in Frage. Bei Prokaryoten sind Gram-negative oder Gram-positive Organismen ausdrücklich eingeschlossen. Zu nennen ist hier E. coli oder Bazillen. Als bevorzugte Wirtszellen zur Klonierung der erfindungsge mäßen DNA-Sequenzen werden die Stämme E. coli 294, E. coli B und E. coli X1776 sowie E. coli W3110 offenbart. Bei den Ba zillen stehen Bazillus subtilis, Salmonella typhimurium oder ähnliche. Wie oben bereits erwähnt, enthalten die Ex pressionsvektoren typischerweise eine Signalsequenz zum Transport des Proteins in das Kulturmedium, so werden pro karyotische Zellen eingesetzt werden. Neben Prokaryoten kommen auch eukaryotische Mikroben als Wirtszellen, die mit dem Expressionsvektor transfiziert worden sind, in Frage. So etwa können filamentöse Pilze oder Hefen als geeignete Wirtszellen für die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codie rende Vektoren eingesetzt werden. Zu nennen ist vor allem Saccharomycis cirevesiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1997)).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Ex pression von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hintergrund einer möglicherweise erforderlichen Glyko silierung der codierten Proteine. Diese Funktion kann in höheren Eukaryotenzellen - im Vergleich zu Prokaryotenzel len - in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle verfüg bar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen, Ratten, Hamstern oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zel linien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzäh lung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryo nennierenzellinie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1997)), BHK (Babyhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Cervexkarzinomzellen) und weitere Zellinien.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind mit Expressions vektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aufwei sen, vorzugsweise Zellen des Säugetierimmunsystems, vor al lem des humanen Immunsystems, transfiziert (Anspruch 8).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Genprodukte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Anspruch 9). Unter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfin dung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufge reinigter Form (Anspruch 10). Diese Proteine weisen erfin dungsgemäß mindestens eine PYD-Domäne auf und regulieren oder transportieren insbesondere inflammatorische Signale.

Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es eine der in Fig. 7 angegebenen Aminosäuresequenzen (für eine PYD-Domäne), einschließlich aller funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate enthält. Zu den erfin dungsgemäßen Proteinen gehören aber auch all jene Proteine, die sich von erfindungsgemäßen DNA-Derivaten, DNA- Fragmenten oder DNA-Allelen ableiten.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine che misch modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N-Terminus vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Aminogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder Acetylgruppen und ähnliches. Auch be liebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungs gemäße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z. B. in Form einzelner Aminosäuren oder in Form von Pepti den oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N- und/oder C-Terminus fusioniert sein. Insbesonde re sind hier sogenannte Signal- oder "Leader"-Sequenzen am N-Terminus der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz vorlie gen, die das Peptid cotranslational oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) führen. Am N- oder am C- Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstabencode der Amino säuren lautet: DYKDDDDK. Diese Sequenz hat stark antigene Eigenschaften und erlaubt somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reinigung des rekombinanten Proteins. Monoklo nale Antikörper, die das Flag-Peptid binden, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Divisi on, New Haven, Connecticut erhältlich. Die erfindungsgemä ßen DNA-Sequenzen können auch in zahlreichen Exons, die durch Introns voneinander getrennt sind, auf dem Strang des Erbinformationsmoleküls abgelegt sein. Damit gehören auch alle denkbaren SPLICE-Varianten (auf mRNA-Ebene) als Genprodukte zum erfindungsgemäßen Gegenstand. Auch die von diesen verschiedenen SPLICE-Varianten codierten Proteine unterfallen dieser Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der ein Epitop auf einem erfindungsgemä ßen Genprodukt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Pro tein, erkennt (Anspruch 12). Der Begriff "Antikörper" um faßt i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper (Anspruch 13), chimärische Antikörper, anti-idiotypische Antikörper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch "Label" markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von er findungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können er findungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auf treten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfin dungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionspro teinen werden typischerweise durch die Methoden enzymati scher Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fach mann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um hete rogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen im munisiert worden sind. Ein monoklonaler Antikörper ent hält eine im wesentlichen homogene Population von Anti körpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop- Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhal ten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495- 397, (1975); US-Patent 4,376,110; Ausübel et al., Harlow und Lane "Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988)). Die in den vorgenannten Lite raturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorlie genden Erfindung einbezogen. Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehö ren: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen. Ein Hybridom-Zellklon, der er findungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Her stellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimärische Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile ent halten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ab leiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulin aufweisen). Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der An wendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. ergeben murine monoklona le Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikörper vor zugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643- 646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A- 171496; Morrion et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439- 3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antikörper: A Laboratory Ma nual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezo gen.

Ganz besonders bevorzugt wird ein solcher erfindungsgemä ßer Antikörper gegen einen Sequenzabschnitt auf der PYD- Domäne als Epitop gerichtet sein (Anspruch 14).

Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen An tikörpers assoziiert ist, erkennt. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z. B. ei nes Mäusestamms) als Ausgangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti- idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt wer den. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Deter minanten des immunisierenden Antikörpers durch die Pro duktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemä ßer anti-idiotischer Antikörper), erkennen (U.S. 4,699,880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer An tikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. anti-anti- idiotypischen Antikörpers zu führen. Der anti-anti- idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, bezüglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originären monoklonalen Antikörper sein, der die anti-idiotypische Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines monoklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone, die Antikörper von identischer Spezifität expri mieren, identifiziert werden.

Monoklonale Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Pro teine, Analoge, Fragmente oder Derivate dieser erfin dungsgemäßen Proteine gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisier ten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti-idiotypische monoklonale An tikörper sekretieren, zu produzieren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikörper auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole limpet hemocya nin") und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann an ti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungseigen schaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein Epitop des erfindungsgemäßen Proteins oder eines Fragments oder Derivats von demselben sind. Die anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen, z. B. Fab und F(ab')₂. Fab und F(ab')₂-Fragmente entbehren eines Fc- Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhan den, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufwei sen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab und F(ab_')₂ Frag mente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei der Detektion und Quantifizierung von erfindungsgemäßen Proteinen ein gesetzt werden können. Solche Fragmente werden typischer weise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab- Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab_')₂, Fragmenten) verwendet werden.

Erfindungsgemäße Antikörper, einschließlich der Fragmente von diesen Antikörpern, können zur quantitativen oder qualitativen Detektion von erfindungsgemäßem Protein in einer Probe eingesetzt werden oder auch zur Detektion von Zellen, die erfindungsgemäße Proteine exprimieren und ggf. sekretieren. Die Detektion kann mit Hilfe von Im munofluoreszenz-Verfahren erreicht werden, die Fluores zenz-markierte Antikörper in Kombination mit Lichtmikro skopie, Flußzytometrie oder fluorometrischer Detektion durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Antikörper (oder Fragmente dieser Anti körper) eignen sich für histologische Untersuchungen, wie z. B. im Rahmen der Immunofluoreszenz oder Immunoelektro mikroskopie, für die in situ Detektion eines erfindungs gemäßen Proteins. Die in situ Detektion kann dadurch er folgen, daß eine histologische Probe von einem Patienten genommen wird und markierte erfindungsgemäße Antikörper zu einer solchen Probe hinzugegeben werden. Der Antikör per (oder ein Fragment dieses Antikörpers) wird in mar kierter Form auf die biologische Probe aufgetragen. Auf diese Weise ist es nicht nur möglich, die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Protein in der Probe zu bestimmen, son dern auch die Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins in dem untersuchten Gewebe. Bei der biologischen Probe kann es sich um eine biologische Flüssigkeit, ein Gewebe extrakt, geerntete Zellen, wie z. B. Immunzellen oder Herzmuskel- oder Leberzellen, oder allgemein um Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind, handeln. Die Detektion des markierten Antikörpers kann je nach Art der Markierung durch im Stand der Technik bekannte Ver fahren (z. B. durch Fluoreszenzverfahren) erfolgen. Die biologische Probe kann aber auch auf einem Festphasenträ ger, wie z. B. Nitrocellulose oder ein anderes Trägerma terial, aufgetragen werden, so daß die Zellen, Zellteile oder löslichen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit einem geeigneten Puffer ein- oder mehrfach gewaschen werden, wobei nachfolgend mit einem detektier bar markierten Antikörper nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nichtgebundenen Antikörper zu beseitigen. Die Menge an gebun dener Markierung auf dem Festphasenträger kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.

Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Po lypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amylasen, natür liche oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen Charakters sein, um die Bedingungen nach Maß gabe der vorliegenden Erfindung zu erfüllen. Das Träger material kann beliebige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"), oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol-Kügelchen als Träger bevorzugt sind.

Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf ver schiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Anti körper an ein Enzym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Immunoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung ent steht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie oder andere opti sche Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat- Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid Isomerase, Hefe-alkohol-Dehydrogenase, alpha- Glycerophosphat-dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phsophatase, Asparigi nase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase handeln. Die De tektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spe zifisch für das für die Markierung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z. B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umgesetzten Substrats im Ver gleich zu Kontrollstandards erfolgen.

Weiterhin kann die Detektion durch andere Immunoassays sichergestellt werden, z. B. durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radioimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Bioche mistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Hol land Publishing Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillati onszählern oder durch Autoradigraphie detektiert und quantifiziert werden.

Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Mar kierung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluorescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phy cocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluoresca min. Auch fluoreszensemittierende Metalle, wie z. B. ¹⁵²E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können ein gesetzt werden. Diese Metalle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B. Diethylentriaminpentaessig säure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit Hilfe von Che milumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenz-markierten Antikörpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer che mischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für der artige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniu mester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Glei chermaßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Che milumineszenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumi neszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispiels weise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in Betracht kommen.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "twosite" oder "sandwich" Assay, zur Anwendung gelangen. Ty pische immunometrische Assay-Systeme schließen sog. "Vorwärts"-Assays ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Antikörper an ein Festphasensystem ge bunden sind und daß der Antikörper mit der Probe, die un tersucht wird, auf diese Weise in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes aus der Probe isoliert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, einschließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin mit ei ner Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Detektionsantikörper enthält. Der markierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten An tikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen An tigen zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu beseitigen.

In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog. "sandwich"-Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein einziger Inkubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebundene Antikörper und der markierte Antikör per beide gleichzeitig auf die zu testende Probe aufge bracht werden. Nach Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen, um Rückstände der flüssigen Probe und der nicht-assoziierten markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so bestimmt, wie bei den konventionellen "Vorwärts"-Sandwich-Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hinzugefügt, ge folgt von der Beimischung von nicht-markiertem Antikör per, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf ei ner geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inku bationsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von mar kiertem Antikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger reagiert hat, wird dann, so wie oben be schrieben, durchgeführt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Ver fahren zur Isolierung von Genprodukten mit mindestens einer PYD-Domäne, wobei die Wirtszellen mit einem erfindungsgemä ßen Expressionsvektor transformiert und dann unter geeigne ten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert wer den, so daß das Genprodukt schließlich aus der Kultur auf gereinigt werden kann (Anspruch 15). Das Protein der erfin dungsgemäßen DNA-Sequenz kann dabei, abhängig von dem Ex pressionssystem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellex trakten isoliert werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, daß die jeweiligen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufreinigung des von einer erfindungs gemäßen DNA codierten, rekombinanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, abhängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme eingesetzt werden, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins führen. Das Kulturmedium muß in die sem Fall durch kommerziell erhältliche Proteinkonzentra tionsfilter, z. B. Amicon oder Millipore Pelicon, aufkon zentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z. B. ein Gelfiltrationsschritt. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix mit DEAE aufweist.

A1 s Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung be kannten Materialien, z. B. Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaus tauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Proteins können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed- Phase"-Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genpro dukts können auch transformierte Hefezellen eingesetzt wer den. In diesem Fall kann das translatierte Protein se kretiert werden, so daß die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes rekombinantes Protein aus einer Hefe wirtszelle kann durch Methoden erhalten werden, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato. 296: 171 (1994)) offenbart sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Ver fahren zur Expression von Genprodukten mit mindestens einer PYD-domäne, wobei Wirtszellen mit einem Expressionsvektor, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält, transfor miert werden (Anspruch 17). Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz beruhen, dient nicht dazu, das entsprechende Gen produkt zu konzentrieren und aufzureinigen, sondern viel mehr dazu, den Zellstoffwechsel durch das Einführen der er findungsgemäßen DNA-Sequenzen über die Expression des dazu gehörigen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesonde re an die Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren transformierten Wirtszellen zum Zwecke der Ausschaltung der inflammatorischen Reaktion zu denken. Durch die Verwendung eines sogenannten konstitutiven Promotors können in diesen Zellen gleichbleibende Konzentrationen von auf erfindungs gemäßen Sequenzen beruhenden Proteinen exprimiert werden. Auf diese Weise wird dauerhaft die Auslösung der Inflamma tion unterbunden.

Die entsprechenenden Zellinien werden dadurch gegenüber ei ner Vielzahl von inflammatorischen Stimulanzien resistent. Diese modifizierten Zellen können auch gegebenenfalls wie der in den Säuger- oder humanen Organismus rücküberführt werden. Auf diese Weise wird durch in vitro mit den erfin dungsgemäßen Expressionsvektoren manipulierter Zellen und die anschließende Übertragung (Transplantation) in den Or ganismus ein gentherapeutischer Einsatz der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen möglich. Dabei werden Expressionsvektoren mit den erfindungsgemäßen Sequenzen vorzugsweise in solche Zellen transfiziert, die im Organismus einer Fehlsteuerung der Inflammation anheimfallen (bspw. Hepatocyten bei chro nischer Leberentzündung). Insbesondere werden in einem sol chen gentherapeutischen Ansatz erfindungsgemäße Sequenzen eingesetzt, die das inflammatorischen blockieren, bspw. Fragmente, die das inflammatorische Signalnicht weitertra gen und damit die Signaltransduktion unterbrechen.

Mit dem vorliegenden Erfindungsgedanken geht aber auch ein gentherapeutisches Verfahren, das in vivo durchgeführt wer den kann, einher. Zu diesem Zwecke werden Vektoren einge setzt (z. B. Liposomen, Adenoviren, Retroviren oder ähnliche oder auch nackte DNA), die die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen gezielt in die gewünschten Zielzellen des Orga nismus insertieren. Bei den Zielzellen handelt es sich ty pischerweise um Zellen, deren Inflammationsregulation ge stört ist, insbesondere um Zellen, die pathologisch eine verstärkte Disposition zur Entzündungsreaktion zeigen (bspw. bei chronischer Leberentzündung). In diesem Zusam menhang können Fragmente einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz zum Einsatz kommen, die inhibitorische Wirkung ent falten, bspw. DNA-Sequenzen, die im wesentlichen nur die PYD-Domäne enthalten und damit nur noch eine Assziierungs funktion wahrnehmen können, nicht aber weitergehend biolo gische Signale (zur Inflammation) weitergeben können - also keine weitere biologische Funktionalität aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz (Allele, Derivate, Fragmente) oder eines erfindungsgemä ßen Genprodukts zur Behandlung von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter intrazellulärer Signaltransduktion beru hen (Anspruch 17). Die vorgenannte erfindungsgemäße Ver wendung von DNA-Sequenzen schließt auch die Verwendung von oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionsvek toren ein, die eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz, bspw. eine in Fig. 1 offenbarte Nukleotidsequenz oder ein funktionelles Derivat oder Allel einer solchen Sequenz (oder auch ein infunktionelles Derivat einer solchen Se quenz) aufweisen, mit dem Ziel, die fehlgeleitete intra zelluläre Signaltransduktion zu korrigieren. Die Verwen dung kann nach gentherapeutischen Verfahren über Injekti on von nackter erfindungsgemäßer DNA oder dem Protein oder über Genfähren, insbesondere virale oder liposomale Vektoren, erfolgen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher sowohl die Verwendung derartiger erfindungsge mäßer Expressionsvektoren sowie die erfindungsgemäße Ver wendung von Zellen (d. h. die Verwendung zur Auslösung (oder zur Blockade) des Inflammationsgeschehens), die mit erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transfiziert sind.

Bevorzugt ist dabei die Verwendung einer erfindungsgemä ßen DNA-Sequenz oder eines erfindungsgemäßen Genprodukts, wenn es sich bei der Erkrankung um eine solche mit einer überschießenden Entzündungsreaktion handelt (Anspruch 18). Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung einer solchen DNA-Sequenz oder eines solchen Genprodukts zur Behandlung (zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be handlung) von Psoriasis, Artheriosklerose, bakteriellen oder viralen Infektionserkrankungen, insbesondere bakte rieller oder viraler Meningitis oder bakterieller Pneumo nie, multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, Asthma, Sarkoidose, glomerulärer Nephritis oder Osteoarthritis (Anspruch 19). Dies kann bspw. durch Fragmente erreicht werden, die die Signaltransduktion blockieren, bspw. um Sequenzen, die nur für die PYD-Domäne (oder Teile hier von) codieren bzw. nur diese enthalten.

Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfin dung wird eine Verbindung zur Verfügung gestellt, die da durch gekennzeichnet, daß sie die Funktion der erfin dungsgemäßen Genprodukte (Proteine) als intrazelluläres Signalmolekül einer inflammatorischen Signalkaskade zur Auslösung von Entzündungsreaktionen inhibiert. Insbeson dere blockieren erfindungsgemäße Verbindungen die spezifische Interaktion von PYD-Domänen zur intrazellulären Signalweiterleitung (Anspruch 20). Bevorzugt handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen chemischen Verbindung, die die erfindungsgemäße PYD-Funktion (bspw. bei Inflam mation oder Apoptose) blockiert, um ein Oligopeptid, das chemisch modifiziert (bspw. zur erleichterten Passage durch die Zellmembran, insbesondere durch endständige (vor allem N-terminale) Sequenzbereiche) sein kann oder nicht-modifiziert sein kann. Insbesondere kann es sich um einen an der PYD-Assoziierung beteiligten nativen Se quenzbereich eines erfindungsgemäßen Proteins handeln. Damit kann bspw. ein erfindungsgemäße inhibitorisches Mo lekül, vorzugsweise ein Tetra- bis Dodekamer, eine dem nativen Substrat entsprechende Aminosäuresequenz enthal ten oder aus einer nativen Substratsequenz bestehen, wo bei das vorzugsweise Tetra- bis Dodekamer typischerweise auch einen Sequenzabschnitt aus einer PYD-Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins aufweist. Ggf. kann ein derar tiges Oligopeptid auch dadurch chemisch modifiziert sein, daß die amidartige Bindung zwischen den einzelnen Ami nosäuren durch eine gegen proteolytischen Abbau resisten te alternative chemische Gruppe (bspw. Schwefel- oder Phosphorbrücken) ersetzt wird.

Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung ist vorzugs weise eine organisch-chemische Verbindung mit einem Mole kulargewicht von < 5000, insbesondere < 3000, vor allem < 1500 und ist typischerweise physiologisch gut verträg lich (Anspruch 21). Ggf. wird sie Bestandteil einer Zu sammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff so wie vorzugsweise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders ber vorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemä ßes Protein, insbesondere and die Domäne PYD eines erfin dungsgemäßen Proteins, mindestens 10⁷ mol^-1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaf fen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportpro teine (Anspruch 22).

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen die PYD-Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch genthe rapeutische in vivo Verfahren in Wirtszellen einge schleust wird und dort als "intrabody" nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige erfindungsgemäße "Intrabodies" sind die Zellen vor einer inflammatorischen Reaktion geschützt. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patien ten eine pathophysiologisch übersteigertes inflammatori sches Verhalten zeigen, also bspw. bei Hepatocyten (Leberentzündung), Keratinozyten, Bindegewebszellen, Im munzellen oder Muskelzellen. Entsprechend sind auch der artig mit erfindungsgemäßen "Intrabodies" gentherapeu tisch modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung mit der Funk tion der Blockade der bspw. inflammatorischen Funktion von erfindungsgemäßen physiologischen Proteinen (s. Fig. 1) kann als Arzneimittel Verwendung finden. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße chemische Verbindung (zur Her stellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Erkran kungen, für die zumindest tw. eine pathologische hyperin flammatorische Reaktion kausal oder symptomatisch ist, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor der zellulären Funktion eines erfindungsgemäßen Proteins, al so bspw. der inflammatorischen Reaktion, insbesondere ein Inhibitor der Assoziierung von PYD-Domänen, zur Inflamma tionsinhibition ganz besonders bei der Behandlung der folgenden Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arznei mittels zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden: Autoimmunerkrankungen, Psoriasis, Arthe riosklerose, bakterielle oder virale Infektionserkrankun gen, insbesondere bakterielle oder virale Meningitis oder bakterielle Pneumonie, multiple Sklerose, rheumatoide Ar thritis, Asthma, Sarkoidose, glomeruläre Nephritis oder Osteoarthritis, Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson (Anspruch 23).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren ("Screening-Methoden") zur Identifizierung von Verbindungen mit inhibitorischen Eigenschaften in Hin blick auf die Auslösung oder Weiterleitung von Signalen, die mit inflammatorischen Reaktionen in Zusammenhang ste hen, insbesondere von Verbindungen die die Interaktion von Proteinen der inflammatorischen Signalkaskade, insbe sondere von physiologisch miteinander reagierenden PYD- Domänen (gleicher oder verschiedener Proteine) blockie ren. Erfindungsgemäße Verfahren sehen vor, daß (a) Zel len, vor allem Hepatocyten, insbesondere T-Lymphozyten, so modifiziert werden, daß sie eine inflammatorische Re aktion zeigen, (b) diese gemäß (a) modifizierten Zellen in einer Zellkultur bereitgestellt werden, (c) Testsub stanzen zur Zellkultur zugegeben werden, (d) die das Aus maß der inflammatorischen Reaktion der Zellen in der Zellkultur bestimmt wird. Hierzu werden nach dem erfin dungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der Testsub stanz angesetzt, um im Falle einer die Inflammation inhi bierenden Wirkung der Testsubstanz deren ID₅₀-Wert bestim men zu können.

Ein erfindungsgemäßes "Screening"-Verfahren kann auch mit Hilfe von sogenannten "Proteomics"-Techniken durchgeführt werden. Hierzu werden zur Bestimmung eines Standards ty pische Unterschiede im Expressionsmuster von Zellen mit inflammatorischer Reaktion und Kontrollzellen experimen tell erhoben. Methodisch wird für ein derartiges Verfah ren typischerweise die 2D-Gelelektrophorese eingesetzt.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:

Fig. 1 stellt DNA-Sequenzen (einschließlich der entspre chenden Aminosäuresequenzen) dar, die an der inflammato rischen Signalkaskade beteiligt sind.

Fig. 2 zeigt eine Zusammenfassung der vorgenannten Se quenzen in tabellarischer Form, geordnet nach den in Fig. 1 bereits verwendeten Bezeichnungen, wobei etwaige EST- Klone, die Herkunft der Sequenz, die Lokalisierung auf einem Chromosom sowie eine Zusammenfassung der in den je weiligen Sequenzen enthaltenen Domänen (z. B. die PYD- Domäne, SPRY-Domäne, CARD-Domäne, NACHT-Domäne, die LRR- Domäne) angegeben sind. Unter (A), (B) und (C) sind die Sequenzen humanen Ursprungs zusammengefaßt, (D) enthält dagegen murine Sequenzen.

Fig. 3 zeigt das generalisierte "PYD"-Suchprofil, das eingesetzt wurde, um weitere PYD-Proteine in bspw. EST- Datenbanken aufzufinden. Hierbei wird auf die Veröffent lichung von Bucher et al. (1996, Computer Chem., 20, 3- 24) und auf die entsprechenden Erläuterungen in der of fengelegten deutschen Patentanmeldung DE 197 13 393.2-41 verwiesen, die beide insoweit Bestandteil der vorliegen den Anmeldung sind. Hierdurch wurden zwei weitere PYD- enthaltende Proteine identifiziert, nämlich NALP1 und NALP2 (die Bezeichnung NALP setzt sich aus den einzelnen in beiden Proteinen auftretenden charakteristischen Domä nen zusammen: Domäne NACHT, LRR und PYD). Beide Proteine spielen eine entscheidende Rolle als Signaltransduktions proteine für inflammatorische Signale. Des weiteren kommt auch deren Funktion und damit Verwendung im Zusammenhang mit der apoptotisches Signalproteintransduktion in Be tracht.

Im Ergebnis zeigt Fig. 4, daß Pycard mit Hilfe seiner PYD-Domäne homodimerisiert und mit der PYD-Domäne von NALP1 interagiert. In der mittleren Darstellung wurden Zellextrakte, lysiert 24 Stunden nach der Transfektion, herangezogen und die anti-Flag-Immunopräzipitate auf die Anwesenheit von VSV-Pycard untersucht. In der unteren Darstellung wurden die verschiedenen Flag-markierten Kon strukte (nämlich Pycard-PYD (also PYD von Pycard)), RAIDD, Apaf1-CARD (CARD von Apaf1, NALP1-PYD (PYD von NALP1), NALP1-CARD (CARD von NALP1) und ein Scheinvektor, in Hinblick auf ihre jeweilige Anwesenheit im Immunoprä zipitat durch anti-Flag-Antikörper untersucht.

Fig. 5 zeigt im Teil A eine Ausrichtung von PYD-Domänen aus verschiedenen Proteinen ("alignment" vom N-Terminus zum C-Terminus). Die jeweiligen Sequenzpositionen mit ei ner mindestens 50%igen Identität bzw. mit zumindest ähn lichen Aminosäuren sind schwarz bzw. mit grauem Hinter grund unterlegt. Die Abkürzungen stehen für HS: homo sa piens und DR: Danio rerio (Zebrafisch). Die jeweiligen Zugangsnummern bei der Datenbank "Gen Bank" (EMBL) sind die folgenden: AF310103 für humanes Pycard, AF310104 für murines Pycard, 015553 für Pyrin, AF310105 für NALP1, AF310106 für NALP2, AAF66964 für das Protein CASPY vom Zebrafisch, AAF66956 für das Protein Pycard vom Zebra fisch.

Fig. 5B stellt in schematischer Weise die Domän-Struktur von Proteinen mit einer PYD-Domäne (Pyrin-Domäne) dar. Die Namensgebung für die einzelnen Homologiedomänen ist zu entnehmen der Figurenlegende in Anlage A12 unter Fig. 5.

Fig. 5C stellt die Aminosäuresequenz von NALP1 dar. Die verschiedenen Schattierungen entsprechen den für Fig. 5B gewählten domänenspezifischen Schattierungen: dunkelgrau er Hintergrund: PYD-Domäne, eingerahmter heller Hinter grund NACHT-Domäne, hellgrauer Hintergrund: LRR-Domäne und dunkler Hintergrund: CARD-Domäne.

Fig. 6 stellt eine Ausrichtung ("alignment") von reprä sentativen Pyrin-Domänen (PYD-Domäne) Todeseffektordomäne (DED) und Caspase-Rekrutierungsdomän (CARD) und Todesdo mäne (DD) dar. Die Ähnlichkeit der verschiedenen Domänen wird durch korrespondierende Aminosäuren, die schattiert dargestellt sind, deutlich. Auch auf dem Niveau der Se kundärstruktur gibt es erhebliche Ähnlichkeiten, wie durch die Sekundärstruktur-Vorhersage (hier für jeweils 6 α-Helices) deutlich wird.

Fig. 7 stellt eine Ausrichtung (vom N- zum C-Terminus, "alignment") von Aminosäuresequenzen der PYD-Domänen der folgenden Proteine dar: Pyrin, vom Menschen (hs), von der Maus (mm) und rn, Pycard vom Menschen und von der Maus menschliches Pyc, menschliches NALP1, menschliches NALP2, menschliches NALP3, menschliches NALP4, menschliches NALP5, menschliches NALP6, menschliches NALP7, menschli ches NALP8, menschliches NALP9, menschliches NALP10, menschliches NALP11, murines NALP12, menschliches NALP13, murines NALP14, menschliches NALP15, menschliches PY10, murines PY16, CASPY1 vom Zebrafisch, CASPY2 vom Zebra fisch, Pycard vom Zebrafisch. In der letzten Zeile ist eine Hervorhebung der in einer Consensus-Sequenz auftre tenden Sequenzposition markiert.

Fig. 8 stellt einen Stammbaum der identifizierten PYD- Domänen enthaltenden Proteine dar, wobei die Nähe des Verwandschaftsgrades in diesem Stammbaum berücksichtigt ist. Damit zeigt der Stammbaum die vermeintliche Diver genz von durch genomischen evolutionär bedingten Dupli zierungen erhaltenen Stammbaums.

Die beigefügte Anlage A1 bis A13 ist Bestandteil der vor liegenden Offenbarung.

Ausführungsbeispiel

Um zu überprüfen, ob die PYD-Domänen - wie auch die Domä nen DD, DED, CARD - die Eigenschaft haben, nur mit Mit gliedern innerhalb der eigenen Familie von "6-Helix- Bündel-Proteinen" zu interagieren, wurden Expressionsvek toren für PYD-Proteine hergestellt und mit Coimmunopräzi pitations-Experimenten ihre Eignung zur Interaktion mit anderen Proteinen überprüft. Hierzu wurden Pycard- Konstrukte durch PCR-Techniken aus den folgenden IMAGE- EST-Klonen amplifiziert: AA528254(965955) und AI148558(1714818). Pycard wurde mit den folgenden Primern amplifiziert: JT1509 5'-ATGGGGCGCGCGCGCGAC-3' und JT1512 5'-TCAGCTCCGCTCCAGG-3'. Die PYD-Domäne von Pycard wurde mit JT1509 und JT1510 5'CGACTGAGGAGGGGCC-3' amplifiziert.

NALP1-Konstrukte wurden mit PCR-Methoden amplifiziert, indem die KIAA0926-EST-Klone aus dem Kazusa-DNA-Research Institut als "Template" verwendet wurden. NALP1-PYD wurde mit JT1497 5'-ATGGCTGGCGGAGCCTGGGGCCGCCTGGCCTGTTACTTG-3' und JT1525 5'-GATCCAGGGCATTAGCAC-3' amplifiziert. NALP1- CARD wurde mit JT1500 5'-GTTGATACTTCAGCTGCTGAGTGGCAGGAG- 3' und JT1527 5'-GATGAGACTCTGGTGTGG-3' amplifiziert.

Die amplifizierten Fragmente wurden in PCR-Zero-Blunt (von Invitrogen) ligiert und in der EcoR1-Schnittstelle von VSV oder Flag, die die PCR-3 (von Invitrogen) abge leiteten Vektoren enthalten, subkloniert, wie bei Thome et al. (1999, J. Biol. Chem., 274, 9962-8) beschrieben. Die anderen eingesetzten Konstrukte wurden bereits vorher bei Thome et al. (1999 J. Biol. Chem., 274, 9962-8) be schrieben und sind in Hinblick auf die Darstellung der experimentellen Ausführung Bestandteil der vorliegenden Offenbarung. Die Veröffentlichung von Burns et al. (1998, J. Biol. Chem., 273, 12203-12209) beschreibt die Durch führung der Immunopräzipitation. Sie ist gleichfalls Be standteil der vorliegenden Offenbarung und läßt sich zu sammengefaßt so darstellen:
293T-Zellen, die in DMEM-Medium kultiviert wurden, das mit 10%igen fötalem Kälberserum Glutamin ergänzt wurde, wurden mit einer Dichte von 1-3 × 10⁶ Zellen pro 10 cm- Platte angesetzt und mit 3 µg des jeweiligen Konstrukts am nächten Tag durch die Calciumphosphat- Präzipitationsmethode transfiziert. Die Zellen wurden ge sammelt und in Lyse-Puffer 24 bis 26 Stunden nach der Transfektion lysiert (der Lysepuffer enthält 0,2% NP40, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 30 mM Tris, pH 7,4). Die Zell- Lysate wurden für mindestens drei Stunden auf Sepharose 6B (von Pharmacia) vor der Präzipitierung mit einer glei chen Menge von Proteinen bei 4°C für 4 Stunden mit 3 µl einer Flag-Agarose (von Kodak International Biotechnolo gy) von 3 µl von Sepharose 6B Kügelchen vorgereinigt. Das Harz wurde sechsmal in Lysepuffer gewaschen und nach der letzten Wäsche wurde gebundenes Protein durch Kochen im Probenpuffer eluiert, separiert durch SDS-PAGE und auf Nitrocellulose transferiert (von Hybond ECL, Pharmacia), um nachfolgend das Western-Blotting durchführen zu kön nen. Die anti-VSV und anti-Flag-Antikörper stammen von Sigma. Ein HRP-konjugierter Antikörper wurde eingesetzt, der spezifisch die schweren Ketten von murinem IgG1 (von Southern Biotechnology Associates) detektierte.

Wie in Fig. 4 als Ergebnis des vorliegenden Ausführungs beispiels gezeigt, konnte eine spezifische Bindung von Pycard mit dem PYD-Domän von Pycard und NALP dann detek tiert, werden, wenn eine Coexpression mit VSV-markiertem Pycard, Flag-markierten Konstrukten, die entweder die PYD-Domäne von Pycard oder die PYD-Domäne von NALP1 ent halten coexprimiert wurden. Dagegen wurden keine Interak tion der PYD-Domäne von Pycard mit anderen PYD-Domänen oder mit Todesdomänen, CARD-Domänen oder Todeseffektordo mänen (letzteres ist in Fig. 4 nicht dargestellt) festgestellt. Daher interagiert eine PYD-Domäne spezi fisch mit PYD-Domänen über eine Protein-Protein- Wechselwirkung. Im Ergebnis zeigt Fig. 4 also, daß Pycard mit Hilfe seiner PYD-Domäne homodimerisiert und mit der PYD-Domäne von NALP1 interagiert.

Deutsche Übersetzung der Figuren A1-A13 A1

In pro-apoptotischen Signaltransduktionskaskaden wird die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Initiatoreinheiten, wie z. B. dem Todesrezeptor Fas, den verschiedenen Adaptorproteinen und den Caspasen in erster Linie durch drei strukturell verwandte Protein- Protein-Domänen, nämlich der Todesdomäne (DD), Todeseffektordomäne (DED) und der Caspaserekrutierungsdomäne (CARD), vermittelt. Im vorliegenden Fall wird der Nachweis erbracht, dass eine vierte verwandte Domäne, die Pyrindomäne (PYD) genannt, existiert. Die PYD wird in Pyrin, einem Protein, das bei Patienten mit familiärem Mittelmeerfieber mutiert ist, bei Pycard, einem Regulator der Etoposid-vermittelten Apoptose, bei einer Caspase vom Zebrafisch und in zwei neuen Proteinen (NALP1, NALP2), die strukturell mit dem Apoptose- Regulationsprotein Card4/Nod1 verwandt sind, beobachtet. Für die PYD-Domäne von Pycard wurde nachgewiesen, dass sie homodimerisiert und mit PYD von NALP1 interagiert. Die Identifizierung der PYD-Familienmitglieder kann hierbei zur kurzfristigen Charakterisierung von pro-apoptotischen und/oder pro-inflammatorischen Signaltransduktionswegen beitragen.

Einführung

Die Apoptose oder der programmierte Zelltod ist ein wesentlicher Vorgang bei Tieren und Pflanzen, insbesondere für die Beseitigung von unerwünschten Zellen in einer geordneten Art und Weise. Während der letzten Jahre ist ein erheblicher Fortschritt bei der Identifizierung und Charakterisierung der modularen Natur von Molekülen, die für die Regulation und Exekution der Apoptose verantwortlich sind, erzielt worden (Aravind et al., 1999, Hofmann, 1999). Von besonderer Bedeutung ist hierbei, dass drei Familien von Homologiedomänen, die Todesdomäne (DD), die Todeseffektordomäne (DED) und die Caspaserekrutierungsdomäne (CARD) existieren, die entfernt miteinander verwandt sind, und eine Superfamilie von "Sechs-Helix-bundle"-Proteininteraktionsdomänen bilden. Bei diesen Domänen ist insbesondere wichtig, dass sie hochspezifische Wechselwirkung mit Mitgliedern der gleichen Subfamilie ausüben und in den meisten Fällen auch eine Rolle beim Signaltransduktionsprozess, der zur Apoptose und/oder Entzündung führt, spielen. Im Besonderen ist zu beachten, dass die "Adaptorebene" von Proteinen, die nämlich die Todesrezeptorsignale zu den Caspasen transportieren, stark mit Proteinen besetzt ist, die Kombinationen von Domänen von DD/DED/CARD aufweisen. Aufgrund der großen Bedeutung und der Vorhersagbarkeit ihrer Funktion sind mehrere systematische Suchen nach neuen Proteinen, die diese Domänen enthalten, erfolgreich durchgeführt worden. Hierdurch wurde die Entdeckung von Proteinen wie FLIP, CARDIAK/RIP2, ARC, Bcl10, DEDD (Irmler et al., 1997; Koseki et al., 1998; McCarthy et al., 1998; Stegh et al., 1998, Thome et al., 1999) möglich. Im folgenden berichten wir von der Entdeckung einer neuen Domänenart, die im folgenden PYD (Pyrindomäne) genannt wird. Diese kann als vierte Subfamilie innerhalb der "Sechs-Helix-"bundle"-Interaktionsdomänen" bezeichnet werden, nämlich aufgrund von Sequenzhomologien, Strukturvorhersage und Interaktionseigenschaften.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Idenfizierung einer neuen Domäne: Die Pyrin-Domäne

Im Zuge der Analyse der Sequenz des kürzlich identifizierten Proteins Pycard mit einer CARD-Domäne (PYD und CARD enthaltendes Protein), das auch als ASC ("Apoptose assoziiertes Speckle-ähnliches Protein") bekannt ist, wurde realisiert, dass die zweite strukturelle Domäne, die am N-Terminus von Pycard (Pyrindomäne, PYD) auftritt, eine schwache, aber signifikante Sequenzhomologie zu einer Vielzahl anderer Proteine (Fig. 1A) aufweist. Pycard ist ein 22-kDa-Protein, das Aggregate bildet, sobald die Apoptose durch gewisse Antitumorsubstanzen induziert wird (Masumoto et al., 1999).

Darüber hinaus ist festzustellen, dass bei Zellen, die dazu gezwungen wurden, reduzierte Mengen von Pycard zu exprimieren, die Etoposid-vermittelte Apoptose gleichfalls signifikant unterdrückt ist. Unter Verwendung von PYD von Pycard ergab eine einfache BLAST-Suche, dass zwei zusätzliche PYD-enthaltende Proteine in der Sequenzdatenbank enthalten sind, nämlich Pyrin und Caspy. Pyrin wurde anfänglich als Produkt des MEFV (Mittelmeerfieber)- Gens identifiziert, das bei Patienten mit familiärem Mittelmeerfieber mutiert ist (FrenchFMFConsortium, 1997; InternationalFMFConsortium, 1997), ein erbliches periodisches Fiebersyndrom, das durch episodisches Fieber und serosale und synoviale Entzündung charakterisiert ist. Der Erkenntnisstand im Hinblick auf Pyrin basiert im wesentlichen auf seiner Domänenstruktur, die, zusätzlich zur PYD-Domäne, auch einen B- Box-Zinkfinger und eine "Spry"-Domäne aufweist (Fig. 1B). Es wurde daher vorgeschlagen, dass Pyriri ein Mitglied der RoRet-Genfamilie der nukleären Transkriptionsfaktoren ist, was Anlaß zur Spekulation gab, dass das Protein als ein transkriptionaler Inflammationsregulator (Centola st al., 1998) fungiert. Neuere Ergebnisse legen jedoch nahe, dass Pyrin in Zytoplasma lokalisiert ist und keine nachweisbare transkriptionale Aktivität aufweist (Chen et al., 2000; Tidow et al., 2000). Daher ist die genaue Funktion von Pyrin bei inflammatorischen Krankheiten immer noch ungeklärt.

Auf der Basis der PYD-Sequenz dieser beiden Proteine wurde ein allgemeines PYD-Profil erstellt (Bucher et al., 1996) und in den nachfolgenden Suchschritten in der EST-Datenbank eingesetzt. Zwei zusätzliche PYD-enthaltende Proteine NALP1 und NALP2 (NACHT; LRR und PYD-enthaltende Proteine) wurden identifiziert. Die Sequenzanalyse ergab, dass die NALPs eine PYD-, NACHT- und LRR-modulare Organisation aufweisen (Fig. 1A, B). Die NACHT- und LRR-Domänenarchitektur wird bei Proteinen aufgefunden, die an der Infiammation oder Apoptose beteiligt sind, insbesondere bei CARD4/Nod1 (Fig. 1B), ein NF-kB-induzierendes Molekül (Bertin et al., 1999; Inohara et al., 1999), einem neuronalen Apoptose-Inhibitor-Protein, NAIP, und dem MHC Klasse II-Transkriptionsaktivator, CIITA (Koonin und Aravind, 2000). Interessanterweise ist die Domäne PYD von NALP2 durch CARD bei CARD4/Nod1 ausgetauscht, während die strukturelle Gesamtorganisation konserviert ist, was eine ähnliche Funktionalität vermuten lässt (Fig. 1B). CASPY ist ein PYD- und Caspasedomäne enthaltendes Protein, das anfänglich mit einer Datenbanksuche nach Zebrafisch-Homologen von Apoptoseregulatoren von Säugern (Inohara und Nunez, 2000) identifiziert wurde. Diese Caspase ist am stärksten homolog zur Caspase-13, die beim Menschen CARD anstelle von PYD enthält. Beachtenswert ist, dass die gleiche Untersuchung ein Pycard-verwandtes Protein bei Zebrafischen identifiziert hat, was eine hohe evolutionäre Konservierung dieser Proteine indiziert (Fig. 1A).

Die Pyrin-Domäne ist verwandt mit der DD-Familie

Auf der Basis von Sequenzvergleichen wurde vorgeschlagen, dass die Domänen DD, DED und CARD strukturell verwandte Protein-Proteininteraktionsmodule darstellen (Hofmann et al., 1997). Alle drei Domänenarten haben eine ähnliche Größe und die Sekundärstruktur analyse ergab eine ähnliche Anordnung der sechs a-Helices. Alle drei Domänen teilen also die Eigenschaft, Homo- oder Heterodimere bilden zu können, und sind außerdem hochkonserviert (Hofmann et al., 1997). Die Strukturvorhersage wurde später durch NMR- Analyse der DDs, DEDs und CARD5 (Chou et al., 1998; Eberstadt et al. 1998; Huang et al., 1996; Zhou et al., 1999) bestätigt, da die strukturelle Topologie dieser Domänen sich als sehr ähnlich erwies, insbesondere im Hinblick auf den strukturellen Kern, der durch die Helices a2 bis a5 gebildet wird (Fig. 2). Einschließlich der PYD-enthaltenden Sequenzen in einem allgemeinen "Alignment" gegenüber DED, CARD und DD, wurde erfindungsgemäß die PYD-Domäne als ein potentielles viertes Glied der "DD-gefalteten" Superfamilie identifiziert (Fig. 2).

Trotz der Ählichkeit ihrer Faltung ist bekannt, dass DD, DED und CARD ausschließlich, mit Mitgliedern der eigenen Subfamilie interagieren, so dass keine Promiskuität zwischen den Domänen festgestellt werden konnte. Um zu überprüfen, ob die PYDs die gleichen Eigenschaften aufweisen, wurden Expressionsvektoren für die PYD-Proteine erzeugt, und in Ko-Immunopräzipitationsexperimenten auf ihre Eigenschaft, mit anderen Proteinen zu interagieren, getestet. Wie in Fig. 3 dargestellt, wurde eine spezifische Bindung von Pycard mit den PYDs von Pycard und NALP1 detektiert, wenn eine Koexpression mit einem VSV- markierten Pycard, Flag-markierten Konstrukten enthaltend die PYD von Pycard oder die PYD von NALP1 ausgeführt wurde. Keine Interaktionen der PYD von Pycard mit anderen PYDs oder mit DDs, CARDs oder DEDs (Fig. 3) wurden nachgewiesen. Daher ist die PYD- Domäne eine Protein-Protein-Interaktionsdomäne, die spezifisch mit PYD-Domänen interagiert.

Pycard mit seiner PYD-CARD zweigeteilten Domänenorganisation erinnert an das DD und DED enthaltende Molekül FADD oder das DD und CARD enthaltende Protein RAIDD. Für beide Proteine ist bekannt, dass sie ein DD enthaltendes Protein mit einem eine DED- oder CARD-Domäne enthaltenden Protein adaptieren. Beispielsweise erfordert die DD von Fas FADD, um an die DED von Caspase-8 zu binden. Unsere Resultate lassen vermuten, dass Pycard ein neues Adaptormolekül darstellt, das NALP1 an ein noch unbekanntes und zu definierendes CARD enthaltendes Protein koppelt. Tatsächlich zeigen erste Resultate, dass die CARD von Caspase-5 die Zielstruktur von Pycard-CARD ist. Die physiologische Rolle dieser Interaktion wird zur Zeit noch untersucht.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass wir PYD als ein neues Protein-Protein- Interaktionsmodul identifiziert haben, das alle Kriterien eines Mitglieds der DD- Faltungsfamilie erfüllt. Vergleichbar zur beschränkten Interaktions-Fähigkeit, die für andere Mitglieder gilt, interagieren PYDs nur mit PYDs und nicht mit Mitgliedern der drei anderen Subfamilien. Darüber hinaus werden PYDs im Zusammenhang mit Proteinen, die an der Apoptose und der Inflammation beteiligt sind, gefunden, was am besten durch die Caspase Caspy belegt ist. Regelmäßig treten PYDs zusammen mit CARDs, wie z. B. bei NALP1 und Pycard, auf. Die Identifizierung der neuen, PYD-enthaltenden Proteine ermöglicht daher wahrscheinlich die Charakterisierung von neuen pro-apoptotischen oder pro inflammatorischen Signaltransduktionswegen, wie es auch der Fall war nach der Identifizierung der DD von Fas vor einigen Jahren (Itoh und Nagata, 1993). Wir glauben, dass die Charakterisierung von NALP1 und dem Pycard-Komplex bereits der erste Schritt in diese Richtung ist, was schließlich zu einem besseren Verständnis der molekularen Ursachen von inflammatorischen Krankheiten führen wird.

METHODEN Sequenz- und Strukturanalyse

Die Blast- und Profile-Algorithmen wurden verwendet (Bucher et al., 1996), die auf dem ISREC-Server (www.isrec.isb-sib.ch) verfügbar sind. Die Sekundärstruktur wurde nach den Algorithmen von Rost und Sander (1993) vorhergesagt.

Klonierung, Expression und Immunopräzipitation

Pycard-Konstrukte wurden durch PCR aus den folgenden IMAGE EST-Klonen amplifiziert:
AA528254 (965955) und AI148558 (1714818). Pycard wurde amplifiziert mit den folgenden Primern: JT1509 5'-ATGGGGCGCGCGCGCGAC-3' und JT1512 5'- TCAGCTCCGCTCCAGG-3'. Die PYD-Domäne von Pycard wurde amplifiziert mit JT1509 und JT1510 5'-CGACTGAGGAGGGGCC-3'.

NALP1-Konstrukte wurden amplifiziert durch PCR unter Verwendung des KIAA0926 EST- Klons aus dem Kazusa DNA Forschungsinstitut als "Template". NALP1-PYD wurde amplifiziert mit JT1497 S'- ATGGCTGGCGGAGCCTGGGGCCGCCTGGCCTGTTACTTG-3' und JT1525 5'- GATCCAGGGCATTAGCAC-3', NALP1-CARD wurde amplifiziert mit JT1500 5'- GTTGATACTTCAGCTGCTGAGTGGCAGGAG-3' und JT1527 5'- GATGAGACTCTGGTGTGG-3'.

Amplifizierte Schnitt-Fragmente wurden in PCR-Zero-Blunt (Invitrogen) ligiert und anschließend in die EcoR1-Schnittstelle von VSV oder Flag-enthaltenden PCR-3 (Invitrogen) abgeleiteten Vektoren (Thome et al., 1999) subkloniert. Andere Konstrukte, die verwendet wurden, entsprachen jenen, die bereits zuvor beschrieben worden sind (Thome et al., 1999) subkloniert.

Die Immunopräzipitierung wurde, wie zuvor beschrieben (Burns et al., 1998), durchgeführt. Kurz zusammengefasst, 293 T-Zellen wurden in DMEM-Medium, das mit 10%igem fötalen Kälberserumglutamin angereichert war, kultiviert, in einem Bereich von 1-3 × 10⁶ Zellen pro 10 cm-Platte ausgesetzt und mit 3 µg der indizierten Konstrukte am nächsten Tag durch die Kalziumphosphat-Präzipitationsmethode tranfiziert. Die Zellen wurden geerntet und in Lysepuffer lysiert (0,2% NP40, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7,4) 24-26 Stunden nach der Transfektion. Die Zell-Lysate wurden für mindestens 3 Stunden auf Sepharose 6B (Pharmacia) vorgereinigt, und zwar vor der Fällung von einer gleichen Menge von Proteinen bei 4°C für vier Stunden mit 3 µl von Flag-Agarose (Kodak International Biotechnology) und 3 µl von Sepharose 6B-Perlen. Das Resin wurde 6× in Lysepuffer gewaschen und nach dem letzten Waschschritt wurden die gebundenen Proteine durch Kochen in Probenpuffer eluiert, durch SDS-Page separiert und auf Nitrocellulose (Hybond ECL, Pharmacia) für das nachfolgende Western-Blotting transferiert. Sowohl Anti-VSV- und Anti-Flag-Antikörper wurden von Sigma gekauft. Ein HRP-konjugierter Antikörper, der spezifisch die schwere Kette von IgG1 der Maus (Southern Biotechnology Associates) detektieren konnte, wurde eingesetzt.

Bekanntmachungen

Wir danken Kim Burns für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

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FIGURLEGENDEN

Fig. 4 (A) Multiple Ausrichtung (Alignment) der Pyrin-Domäne. Position mit mehr als 50% identischen oder ähnlichen Aminosäuren sind auf schwarzem bzw. grauem Hintergrund dargestellt. Die Speziesabkürzung ist wie folgt: HS, Homo sapiens und DR, Danio rerio. Genebank/EMBL Zugangsnummern sind: AF310103 für humanes Pycard, AF310104 für murines Pycard, 015553 für Pyrin, AF310105 für NALP1; AF310106 für NALP2, AAF66964 für Zebrafisch CASPY, AAF66956 für Zebrafisch Pycard. (B) Domänenstruktur der Proteine, die eine Pyrin-Domäne enthalten. Homologie-Domänen werden wie folgt benannt: PYD für Pyrin-Domäne, CARD für Caspase Recruitment Domain; NACHT für NAIP, CIITA, HET-E und TP1-Domäne; LRR für Leucine-Rich Repeats, SPRY für Domäne beim SPla und Ryanodine-Rezeptor. B für B-Box. (C) Aminosäuresequenz von NALP 1. Die verschiedenen Schattierungen der Boxen entsprechen den Domänen wie in Fig. 1B (4B) gezeigt.

Fig. 5 Ausrichtung der repräsentativen Pyrin-Domänen (PYD), Todeseffektordomänen (DED), Caspaserekrutierungsdomänen (CARD) und Todesdomänen (DD); diese zeigt die Ähnlichkeit dieser Interaktionsdomänen. α-Linien indizieren die vorhergesagten α-Helices für PYD (Rost und Sander, 1993) und die indizierten α-Helices bei den DD-, CARD-, bzw. DED-Lösungsstrukturen (Eberstadt et al., 1998; Huang et al., 1996; Zhou et al., 1999)

Fig. 6 Pycard homodimerisiert mit Hilfe seiner PYD und interagiert mit PYD von NALP1. Flag-markierte Konstrukte enthalten: PYD von Pycard (Pycard-PYD), RAIDD, CARD von Apaf-1 (Apaf1-CARD), PYD von NALPI(NALP1-PYD), CARD von NALPI (NALP1- CARD) und ein leerer Vektor (Mock-Vektor) wurden in 293 T-Zellen mit einem VSV- markierten Pycard-Konstrukt-kotransfiziert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach Transfektion lysiert und die Anti-Flag-Immunopräzipitate wurden im Hinblick auf die Gegenwart von einem VSV-Pycard analysiert. Die Expression der verschiedenen Konstrukte wurde in den Zell-Lysaten (untere Darstellung) analysiert.

Claims

1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Protein mit mindestens einer PYD-Domäne codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein Signifikanzniveau von p < 10^-2 ergibt, wenn die PYD-Domäne der DNA-Sequenz mit einem Such profil nach Fig. 3 verglichen wird.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß deren Genprodukt eine der Aminosäure sequenzen (für eine PYD-Domäne), wie in Fig. 6 wie dergegeben, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente, enthält.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in Fig. 1 angegebenen (c)DNA-Sequenzen enthält.

5. DNA-Sequenz nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß deren Genprodukt eine der in Fig. 1 angegebenen Aminosäuresequenzen ent hält.

6. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit ei nem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert ist.

8. Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugetierzelle, insbesondere eine huma ne Zelle, ist.

9. Aufgereinigtes Genprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprü che 1 bis 5 codiert wird.

10. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid ist.

11. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es eine der in Fig. 7 angegebenen Aminosäuresequenzen (für eine PYD- Domäne), einschließlich aller funktionshomologen Al lele, Fragmente oder Derivate enthält.

12. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epi top auf einem Genprodukt nach einem der Ansprüche 9 bis 11 erkennt.

13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

14. Antikörper nach einem der Ansprüche 12 oder 13, da durch gekennzeichnet, daß er gegen einen Sequenzab schnitt auf der PYD-Domäne als Epitop gerichtet ist.

15. Verfahren zur Isolierung von Genprodukten mit minde stens einer PYD-Domäne, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtszellen nach Anspruch 7 oder 8 unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden und das Genprodukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt wird.

16. Verfahren zur Expression von Genprodukten mit minde stens einer PYD-Domäne, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtszellen mit einem Expressionsvektor nach An spruch 6 transformiert werden.

17. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprü che 1 bis 5 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Behandlung von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter intrazellulärer Signaltrans duktion beruhen.

18. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Erkrankung um eine solche mit einer überschießenden Entzündungsreaktion handelt.

19. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Erkrankung um Psoriasis, Arthe riosklerose, bakterielle oder virale Infektionser krankungen, insbesondere bakterielle oder virale Meningitis oder bakterielle Pneumonie, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Asthma, Sarkoidose, glomeruläre Nephritis oder Osteoarthritis handelt.

20. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die spe zifische Interaktion von PYD-Domänen zur intrazellu lären Signalweiterleitung blockiert.

21. Verbindung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine organisch-chemische Verbindung mit ei nem Molekulargewicht von vorzugsweise < 3000 ist.

22. Verbindung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Zellmembran durch Diffusion oder über membranöse Transportproteine passiert.

23. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 20 oder 21 zur Behandlung von (bzw. zur Herstellung eines Ar neimittels zur Behandlung von) Psoriasis, Artherios klerose, bakterielle oder virale Infektionserkran kungen, insbesondere bakterielle oder virale Menin gitis oder bakterielle Pneumonie, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Asthma, Sarkoidose, glomeru läre Nephritis oder Osteoarthritis.