DE69432975T2

DE69432975T2 - Tryptase hemmer

Info

Publication number: DE69432975T2
Application number: DE69432975T
Authority: DE
Inventors: Hans Fritz; P. Christian SOMMERHOFF
Original assignee: Proteo Biotech AG
Current assignee: Proteo Biotech AG
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-25
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2014-07-26
Also published as: EP0714408B1; CA2164221A1; JPH09500532A; TW492975B; US5972698A; DE69432975D1; NO960325D0; WO1995003333A3; ATE245660T1; FI960333A; WO1995003333A2; NO960325L; FI960333A0; SG52658A1; EP0714408A1; NZ271635A; AU7532494A; AU694444B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Inhibitoren für humane Tryptase, deren Isolierung aus Blutegeln, Nukleotidsequenzen, welche für die neuen Inhibitormoleküle oder Fragmente davon kodieren, Vektoren, welche die kodierende Sequenz davon enthalten, mit solchen Vektoren transformierte Wirtszellen, die rekombinante Herstellung der Inhibitoren, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die neuen Inhibitormoleküle enthalten, und deren Verwendung für die Diagnose und Therapie.
Tryptase ist ein tetrameres Mitglied aus der Familie Trypsin-ähnlicher Serinproteinasen. Tryptase wird praktisch ausschließlich von Mastzellen exprimiert [Castells Irani, 1987] und in großen Mengen in deren Sekretgranula gespeichert, das etwa 23% des gesamten zellulären Proteins ausmacht [Schwartz Lewis Austen, 1981 ]. Nach der Aktivierung von Mastzellen wird Tryptase schnell zusammen mit anderen vorgeformten Mediatoren (z. B. Histamin, Chymase und Proteoglycane) in den extrazellulären Raurn freigesetzt [Schwartz Lewis Seldin, 1981; Caughey Lazarus, 1988]. Erhöhte Spiegel wurden gefunden

– im Plasma von Patienten mit Mastozytose, nach systemischer Anaphylaxie [Schwartz Metcalfe, 1987; Schwartz Yunginger, 1989], und während der systemischen Antwort nach einem Aspirinreiz bei Patienten mit Aspirin-sensitivem Asthma [Bosso Schwartz, 1991 ],
– in der bronchiolo-alveolären Spüllösung von Patienten mit Asthma [Broide Gleich, 1991, Bousquet Chanez, 1991; Wenzel Fowler, 1988], interstizieller Lungenerkrankung [Walls Bennett, 1991], und nach dem Antigenreiz bei allergischen Patienten [Castells, 1988; Butrus, 1990],
– im Hautbläschenfluid von Patienten mit einer atrophen und allergischen Hauterkrankung nach kutanem Antigenreiz [Shalit Schwartz, 1990; Atkins Schwartz, 1990],
– im Nasenspülfluid von Patienten mit saisonbedingter allergischer Rhinitis nach einem lokalem Antigenreiz [Juliusson Holmberg, 1991],
– im Zahnfleischtaschenfluid von Patienten mit Zahnfleischentzündung und Periodontitis [Cox Eley, 1989, J. Period. Res.; Eley Cox, 1992, J. Dent] und
– in verletzter Haut von Patienten mit Psoriasis [Harvima Naukkarinen, 1989].

In vitro-Studien haben erhebliche Beweise dafür geliefert, dass Tryptase direkt an der Pathogenese Mastzell-bezogener Störungen beteiligt ist. Tryptase wurde beispielsweise als pathogener Mediator von Asthma vorgeschlagen, da er die Kontraktionsfähigkeit der glatten Muskulatur in der Luftröhre erhöht [Sekizawa, 1989] und vasoaktive intestinale Peptide inaktiviert, wodurch seine starke bronchienerweiternde Wirkung zerstört wird [Tam Caughey, 1990; Tam Franconi, 1990; Franconi, 1989]. Ferner wurde gezeigt, dass Tryptase ein potentes Mitogen für Fibroblasten ist, was für eine Beteiligung an der Lungenfibrose bei Asthma und interstitiellen Lungenerkrankungen spricht [Ruoss Hartmann, 1991; Hartmann Ruoss, 1992]. Tryptase spielt auch eine Rolle bei der Pathogenese von Arthritis und peridontalen Erkrankungen, da sie Prostromelysin aktiviert (= MMP-3), welches wiederum Collagenase aktiviert und dadurch den Abbau von Knorpelgewebe bzw. peridontalem Bindegewebe initiiert [Gruben Marchese, 1989; Gruben Schwartz, 1990; Cox Eley, 1989; J. Period. Res.; Eley Cox, 1992, J. Dent]. Tryptase kann auch Blutgerinnungsstörungen fördern, indem sie die prokoagulierende Funktion von hochmolekularem Kininogen inaktiviert [Maier Spragg, 1983] und indem sie Fibrinogen spaltet [Schwartz Bradford Littman, 1985].
Humane Tryptase ist unter den Serinproteinasen praktisch einzigartig, da sie im Plasma und im extrazellulären Raum die volle katalytische Wirksamkeit besitzt [Schwartz Bradford, 1986; Goldstein Leong, 1992]. Tryptase wird nicht durch die natürlich vorkommenden Antiproteinasen, welche die Aktivität anderer Trypsin-ähnlicher Serinproteinasen, wie dem Mucus-Proteinaseinhibitor (=Antileukoprotease oder HUSI-I), Antithrombin-III, Alpha₁-Proteinaseinhibitor, Alpha₂-Macroglobulin oder C₁-Esteraseinhibitor, regulieren, gehemmt [Alter Kramps, 1990; Smith Hougland, 1984; Schwartz Bradford, 1986; Haevima Schechter, 1988; Cromlish Seidah, 1987]. Ferner, obwohl Tryptase seit über 10 Jahren bekannt ist, wurden Inhibitoren aus nicht-humanen Spezies oder solche, die durch Peptidsynthese oder rekombinante Technologien hergestellt werden, bislang nicht beschrieben. Somit wird Tryptase nicht durch Hirudin [Alter Kramps, 1990], Aprotinin, dem Ovomucoidinhibitor, dem Sojabohnen- und Limabohnen-Trypsininhibitor [Butterfield Weiler, 1990; Cromlish Seidah, 1987; Harvima Schechter, 1988], Ecotin [Chung Ives, 1983] und der rekombinanten Kunitz-Domäne des Beta-Amyloid-Alzheimer-Vorläuferproteins [Sinha Dovey, 1990] angegriffen.
Obwohl Tryptase durch allgemeine Inhibitoren Trypsin-ähnlicher Proteinasen, wie Düsopropyl-fluorphosphat, Phenylmethylsulfonylfluorid und Tosyl-L-Lysin-Chlormethylketon [Smith Hougland, 1984; Harvima Schechter, 1988] gehemmt wird, sind diese Verbindungen ungeeignet für in vivo- und selbst für die meisten in vitro-Verwendungen, und zwar auf Grund ihrer hohen Toxizität und/oder geringen Stabilität. Ferner sind die einzigen anderen Inhibitoren, von denen bekannt ist, dass sie Tryptase angreifen, nämlich die Peptid-Argininaldehyde Leupeptin und Antipain [Cromlish Seidah, 1987] und bestimmte Benzamidinderivate [Stürzebecher Prasa, 1992; Caughey, 1994] nur begrenzt nützlich, da sie relativ unspezifisch sind und/oder Tryptase nur mit mittleren Affinitäte n hemmen (die K_i-Werte der Komplexe liegen im mikromolaren Bereich).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen potenten und wirksame n Inhibitor für die humane Proteinase Tryptase bereitzustellen.
Wie im Folgenden ausführlicher beschrieben, kann die Aufgabe durch Bereitstellen eines Inhibitorpolypeptids, das man aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis gewinnen kann, gelöst werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen:
1: Isolierung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors durch Kationenaustauschchromatographie mittels SP-Sephadex. Dialysiertes Blutegelextrakt wurde aufgetragen und die Säule wurde gewaschen, bis die Absorption des Eluats auf die Basislinie zurückkehrte. Die Desorption wurde mit 20 mM NaP, 500 mM NaCl (pH 8,0) erreicht. Fraktionen mit inhibitorischem aktiven Material (mit einem Balken gekennzeichnet) wurden vereint.
2: Affinitätschromatographie des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors mit Anhydrotrypsin-Sepharose. Das vereinte Eluat aus der SP-Sephadex-Chromatographie wurde aufgetragen, die Säule wurde gründlich gewaschen und mit 100 mM KCl/HCl (pH 2,1) eluiert. Fraktionen mit inhibitorischem aktiven Material (mit einem Balken gekennzeichnet) wurden aufgefangen und sofort durch Zugabe von 1 M Tris neutralisiert.
3: Kationenaustauschchromatographie des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors auf einer Mono-S-FPLC-Säule. Nach der Dialyse gegen 20 mM NaP (pH 8,0) trug man das vereinte Eluat auf die Anhydrotrypsin-Affinitätschromatographiesäule auf, wusch die Säule und eluierte mit einem linearen Gradienten von 60 bis 240 mM NaCl. Die Fraktionen mit inhibitorischem aktiven Material (mit einem Balken gekennzeichnet) wurden vereint.
4: SDS-PAGE des isolierten Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors unter reduzierenden Bedingungen. Bahn 1 = dialysiertes Blutegelextrakt; Bahn 2 = Eluat aus der SP-Sephadexsäule; Bahn 3 = Eluat aus der Anhydrotrypsin-Affinitätschromatographie; Bahn 4 = Eluat aus der Mono-S-Kationenaustauschchromatographie. Die Molekulargewichtsmarker (Bahn 5), von oben nach unten aufgeführt, waren: Ovalbumin (43 kD), Carboanhydrase (29 kD), β-Lactoglobulin (18,4 kD), Lysozym (14,3 kD), Trypsininhibitor aus Rind (6200 D) und β-Kette von Insulin (3400 D).
5: Umkehrphasen-HPLC des isolierten Blutegel-stämmigen Tryptaninhibitors. Die Elutionszeit und die Absorption des Eluats bei 206 nm sind auf der Abszisse bzw. Ordinate aufgetragen. Die zwei Peaks zeigen, dass wenigstens zwei Formen vorliegen.
6: Tryptischer Verdau zweier Spezies des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors, aufgetrennt mittels Umkehrphasen-HPLC (siehe 5). Untere Aufzeichnung: HPLC-Aufzeichnung des tryptischen Verdaus des Peaks aus 5, der bei 25 Minuten eluiert. Obere Aufzeichnung: HPLC-Aufzeichnung des tryptischen Verdaus des Peaks, der bei 29 Minuten eluiert. Die Elutionsprofile unterscheiden sich nur in den Peaks, welche die Cterminalen Peptide darstellen (durch Pfeile gekennzeichnet).
7: Massenspektroskopie zweier Spezies des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors, aufgetrennt durch HPLC (siehe 5). a) Das Massenspektrum des HPLC-Peaks, der bei 25 Minuten eluiert, zeigt das Vorliegen von 2 Formen mit einer Masse von 4340 (Form A; linke Peaks) bzw. 4396 (Form B; rechte Peaks). b) Das Massenspektrum des HPLC-Peaks, der bei 29 Minuten eluiert, zeigt eine dritte Form (Form C) mit einer Masse von 4738.
8: Sequenzbestimmung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors. Die Balken zeigen überlappende Fragmente, die zum Entschlüsseln der Aminosäuresequenz verwendet wurden. Die durchgezogenen Balken zeigen die Sequenz, die man aus dem HPLC-Peak, der bei 25 Minuten eluiert, gewann (siehe 5) und der unterbrochene Balken zeigt die zusätzliche Sequenz, die aus dem HPLC-Peak, der bei 29 Minuten eluiert, stammte. N-terminal = Sequenz des nativen Inhibitors; Red/T = Sequenz nach der Reduktion und dem tryptischen Verdau; Ox/T/ChT = Sequenz nach der Oxidation und dem tryptischen/chymotryptischen Verdau.
9: Hemmung der humanen Tryptase durch den Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitor. Tryptase (0,59 nM) wurde mit ansteigenden Konzentrationen des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors (0–40 nM) 25 Minuten bei 37°C vorinkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe des Substrats Tos-Gly-Pro-Arg-pNa initiiert. Die resultierenden Gleichgewichtsgeschwindigkeiten wurden über 3,5 Minuten gemessen. Die angegebenen Werte zeigen die Quotienten aus der Geschwindigkeit in Gegenwart des Inhibitors, geteilt durch die Geschwindigkeit in Abwesenheit des Inhibitors.
10: Wirkung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors auf die Tryptaseinduzierte Spaltung von vasoaktivem intestinalen Peptid (VIP). VIP wurde mit Tryptase in Gegenwart ansteigender Konzentrationen des Blutegelstämmigen Tryptaseinhibitors inkubiert. Danach wurde die Menge gespaltenes VIP durch Umkehrphasen-HPLC quantifiziert. Die Werte sind als Quotient aus der Geschwindigkeit in Gegenwart des Inhibitors, geteilt durch die Geschwindigkeit in Abwesenheit des Inhibitors, angegeben.
11: Design, DNA- und Aminosäuresequenz der Form C des synthetischen rLDTI-Gens. (a) Design des synthetischen rLDTI-Form-C-Mastergens. Die eingeführten Restriktionsstellen sind gezeigt. (b) Nukleotid- und entsprechende Aminosäuresequenz des rLDTI-Form-C-Mastergens. Klammern und Zahlen stehen für die synthetischen Oligonukleotide, die zur Zusammenstellung des Gens verwendet wurden. (c) Modifikation des rLDTI- Form-C-Mastergens durch Kassettenmutagenese.
12: (a) Plasmidkarte von pRM 5.1.5. (b) Expressionsvektor pRM 9.1.4. Ein synthetisches Gen für die rLDTI-Form-C wurde in den gereinigten Hefe-Sekretionsvektor pVT102U/α, der mit Xbal und HindIII gespalten worden war, ligiert. Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription; ADH-p, der ADH1-Genpromotor; mat, das α-Paarungsfaktor-Leitgen; ADH-t, die 3'-Region des ADH1-Gens mit einem Transkriptionsterminationssignal; Ura-3, das Ura-Gen; amp-R, das Ampicillinresistenz-Gen; der E.coli-ori, Hefeori (2μ-ori) und die Zwischengenregion des Phagen f1 (f1-ori).
13: SDS/PAGE-Analyse des Fermentationsüberstands und der gereinigten rLDTI-Form-C. Bahn 1 = niedermolekulare Gewichtsmarker; Bahn 2 = Fermentationsüberstand des Hefestamms HOO5 nach 96 Stunden in Kultur (80 μl); Bahn 3 = gereinigte rLDTI-Form-C (2 μg).
14: HPLC-Analyse der gereinigten rLDTI-Form-C. Eine Umkehrphasen-HPLC auf einer RP-18-Säule wurde mit 7,4 nmol (35 μg) gereinigtem Inhibitor durchgeführt. Ein linearer Gradient von 0–60% (volumenbezogen) Acetonitril, gebildet aus 0,1% (volumenbezogen) Trifluoressigsäure in Acetonitril und 0,1% (volumenbezogen) Trifluoressigsäure, wurde verwendet. Die Fließrate wurde auf 1,0 ml/min eingestellt und die Absorbtion des Eluats wurde bei 206 nm überwacht.
15: Plasmidkarte des Expressionsvektors pRM 3.1.10
16: Plasmidkarte des Expressionsvektors pRM 4.1.4
17: Plasmidkarte des Expressionsvektors pRM 11.1.4.
Eine erste erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft gereinigte Inhibitormoleküle der humanen Tryptase, die durch folgende Aminosäuresequenz (Position 1: N-terminale Aminosäure Lys) gekennzeichnet sind:
worin X = N (SEQ ID NO: 1), Gly (SEQ ID NO: 2) oder Gly-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 3).
Die neuen Inhibitoren sind Polypeptide, die man aus Blutegelextrakten gewinnen kann, beispielsweise aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis. Die Erfindung betrifft auch funktionale Äquivalente der Inhibitormoleküle, welche Tryptaseinhibitoraktivität besitzen, sowie pharmazeutisch verträgliche Salze der Inhibitoren.
Die erfindungsgemäßen Inhibitormoleküle sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, humane Tryptase mit einem K_i-Wert im Bereich von etwa 0,1 bis 10 nM zu hemmen, wobei sie die an der humanen Blutgerinnungskaskade beteiligten Proteasen im Wesentlichen unbeeinflusst lassen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch genetische Varianten, Allele oder funktionale Äquivalente der oben genannten Sequenz, bei denen ein oder mehrere Aminosäuren substituiert (konservativ oder nicht-konservativ) oder entfernt wurden oder an die ein oder mehrere Aminosäuren angefügt wurden, ohne die Tryptaseinhibitoraktivität zu beeinflussen. Konservative Substitutionen umfassen beispielsweise Substitutionen innerhalb nachstehender Aminosäuregruppen (Ein-Buchstaben-Kode): G,A; V,I,L; D,E; N,Q; K,R; und S,Y,N. Die Aminosäureaddition oder -entfernung erfolgt vorzugsweise am N- und/oder C-terminalen Ende der oben genannten Sequenz. Die funktionalen Äquivalente mit geänderter und/oder verbesserter Spezifität und/oder inhibitorischer Wirksamkeit können leicht vom Fachmann hergestellt werden, wobei übliche Peptidsyntheseverfahren oder Verfahren verwendet werden, die in der Molekularbiologie allgemein bekannt sind, wie beispielsweise die ortsspezifische Mutagenese oder die unspezifische Mutagenese (z. B. mit einem Phagen-Display-System).
Funktionale Äquivalente des erfindungsgemäßen Inhibitors sind beispielsweise solche mit der Aminosäuresequenz
worin
der N-terminale Rest R¹ für Ala- oder Cys-Ala- steht;
der C-terminate Rest R² für -Arg oder -Arg-Cys steht; und
Z für eine beliebige, vorzugsweise natürlicherweise vorkommende Aminosäure steht.
Ferner wird der Fachmann ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung fähig sein, Fragmente der natürlichen Formen des Inhibitors herzustellen, die noch die gewünschte Tryptaseinhibierungsaktivität besitzen.
Die natürlich vorkommenden Formen der beanspruchten Inhibitormoleküle können entweder aus Blutegeln, vorzugsweise aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis hergestellt werden oder man kann sie durch Peptidsynthese oder rekombinante DNA-Technologien gewinnen.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wurde ein synthetisches Gen, welches für die C-Form (SEQ ID NO: 3) des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors (LDTI-C) kodiert, entworfen, kloniert und in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Das kodierende Fragment wurde mit Hilfe von 6 Oligonukleotiden zusammengestellt; es enthält Linkersequenzen, Stop-Kodons und ausgewählte Erkennungsstellen für weitere Modifikationen, beispielsweise durch Kassettenmutagenese. Eine starke Expression der rekombinanten C-Form des Inhibitors (rLDTI-C) wurde mit Hilfe des Saccharomyces cerevesiae-Sekretionsvektors pVT102U/alpha und -Stamms S-78 gefunden. Das sekretierte Material wurde mittels Zentrifugation und Querstromfiltration isoliert und weiter durch Kationenaustauschchromatographie gereinigt; es besitzt eine inhibitorische Aktivität und ist etwa 85% rein. Die Aminosäuresequenzierung zeigte, dass rLDTI-C im Wesentlichen richtig an der Schnittstelle zwischen dem Alpha-Paarungsfaktor-Leitpeptid und den ersten Aminosäuren von LDTI-C prozessiert ist; nur geringe Mengen der trunkierten Form wurden nachgewiesen. Das entfernte UV-CD-Spektrum des rekombinanten Moleküls ist typisch für ein gefaltetes Protein mit Sekundärstrukturelementen. Die Molekülmasse des HPLC-gereinigten Materials beträgt 4738 ± 4 Da, was mittels Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektroskopie bestimmt wurde. Die rLDTI-C zeigt Gleichgewichtsdissozationskonstanten mit Rindertrypsin und humaner Tryptase, die mit den natürlichen fast identisch sind. Die erwarteten Expressionsprodukte, die in dem Expressionsvektor kodiert sind, wurden auch in vitro identifiziert, wobei man ein S30-Transkriptions-Translations-System verwendete.
Die in dieser Erfindung beschriebenen Proteine sind die ersten Verbindungen, die als wirksame Tryptaseinhibitoren bekannt sind. Die Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitoren vermindern somit die katalytische Aktivität von Tryptase; der K_i-Wert des Enzym-Inhibitor-Komplexes liegt im nanomolaren Bereich. Ferner beinflussen die Inhibitoren nicht nur die Tryptase-induzierte Spaltung des Peptid-Nitroanilid-Substrats, das als Werkzeug verwendet wird, um die Aktivität der Proteinase in vitro zu bestimmen. Sie betreffen auch die Spaltung des vasoaktiven intestinalen Peptids (VIP) und die von Kininogen, Vertretern von Peptiden und Proteinen, die als biologisch relevante Substrate von Tryptase gelten. Ferner vermindern die Inhibitoren wirksam das Tryptase-induzierte Wachstum von humanen Keratinozyten – ein Beispiel für die direkte zelluläre Wirkung von Tryptase – ohne sichtbare zytotoxische oder andere Nebenwirkungen hervorzurufen.
Abgesehen davon, dass sie eine hohe Affinität für Tryptase besitzen, sind die Blutegelstämmigen Tryptaseinhibitoren hoch spezifisch. Mit Ausnahme der Bauchspeicheldrüsen-Proteinasen Trypsin und Chymotrypsin werden andere Serinproteinasen nicht oder nur unwesentlich gehemmt; die K_i-Werte der Enzym-Inhibitor-Komplexe sind wenigstens 200-fach höher als bei dem Komplex mit Trypase. Ihre Spezifität wird durch die fehlende Wirkung auf die Blutgerinnung ex vivo gezeigt, was bestätigt, dass die an der Gerinnungskaskade beteiligten Proteinasen nicht beeinträchtigt werden.
Die erfindungsgemäßen Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitoren ermöglichen somit erstmals die Hemmung von Tryptase mit hoher Affinität und Spezifität. Folglich bieten die Inhibitoren die Aussicht, dass man pathophysiologische Ereignisse, bei denen Proteine und Peptide gespalten werden, und/oder die Aktivierung von Zellen durch Tryptase wirksam blockieren kann.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Inhibitoren als Sonden bei der Diagnose sowie als Wirkstoffe bei der Therapie von Tryptase- und Mastzellen-bezogener Erkrankungen einzusetzen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen, beispielsweise DNA- und RNA-Sequenzen, welche für ein Polypeptid mit Tryptaseinhibitoraktivität oder für Fragmente davon kodieren. Vorzugsweise werden Polynukleotidmoleküle mit folgender allgemeiner Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 4) bereitgestellt:
worin R für A oder G steht; M für A oder C steht; W für A oder T steht; S für C oder G steht; Y für C oder T steht; N für A, C oder T steht; N für ein beliebiges Nukleotid steht und X für -OH (SEQ ID NO: 4), GGN (SEQ ID NO: 5) oder GGN ATH YTN AAY (SEQ ID NO: 6) steht. Die Erfindung betrifft auch die komplementären Stränge davon und die DNA-Sequenzen, welche, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, an oben genannte DNA-Sequenz hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen den Nukleotidresten 1 bis 149 oder weiter bevorzugt 7 bis 144 gemäß SEQ ID NO: 7 entspricht; oder ein Fragment davon, welches wenigstens 15 bis 21 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 7 enthält. Zur Erfindung gehören auch komplementäre Polynukleotide, welche eine Polynukleotidsequenz enthalten, die im Wesentlichen den Nukleotidresten 1 bis 149 oder vorzugsweise 10 bis 147 gemäß SEQ ID NO: 8 entspricht; oder Fragmente davon, welche wenigstens 15 bis 21 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 8 enthalten. Diese Fragmente sind vorzugsweise Tryptaseinhibitor-spezifische oder funktionale Derivate dieser Nukleotidsequenzen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Oligonukleotid, welches, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, an eine Nukleotidsequenz hybridisiert, die für ein Polypeptid mit Tryptaseinhibitoraktivität kodiert. Dieses Oligonukleotid umfasst eine Nukleotidsequenz, welche im Wesentlichen komplementär zu der Nukleotidsequenz der Reste 22 bis 87 gemäß SEQ ID NO: 7 ist.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Polynukleotide, welche für ein Polypeptid mit Tryptaseinhibitoraktivität kodieren, wobei die Polynukleotide durch Hybridisierung, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einem wie oben definierten Oligonukleotid erhältlich sind; sowie Polypeptide, welche von diesen Polynukleotiden kodiert werden: Geeignete stringente Bedingungen können leicht vom Fachmann ermittelt werden.
Auch zur Erfindung gehören die Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:9 und funktionale Äquivalente davon.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Vektormoleküle zur Transformation von eukaryontischen und prokaryontischen Wirten, welche ein wie oben beschriebenes DNA-Molekül enthalten. Der Vektor kann beispielsweise ein Virus oder ein Plasmid sein, der oder das die für den Inhibitor kodierende DNA-Sequenz im funktionalen Bezug zu geeigneten regulatorischen transkriptionalen und translationalen Sequenzen, die auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, enthält. Die kodierende Sequenz kann auch an geeignete autonom replizierende Sequenzen (ARS) gebunden sein. Geeignete Wirtszellen können mit einem Vektor, welcher die kodierende Sequenz für den Tryptaseinhibitor enthält, transformiert werden, und der von den Wirtszellen hergestellte Inhibitor kann exprimiert und in geeigneter Weise aus der Zellkultur isoliert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Polypeptidexpressionskassette mit einem Promotor, der operativ mit einer DNA-Sequenz, welche für das Polypeptid kodiert, und einer DNA-Sequenz, welche Transkriptionsterminationssignale enthält, verbunden ist. In Wirten, welche die Fähigkeit besitzen, exprimierte Polypeptide zu sekretieren,umfasst die Expressionskassette vorzugsweise einen Promotor, der operativ an eine erste DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert und im passenden Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, verbunden ist, sowie eine DNA-Sequenz, die Transkriptionsterminationssignale enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden der Promotor, die Signalsequenz und der Terminator von dem Hefe-Expressionssystem erkannt.
Promotoren, die sich für die Expression in einem bestimmten Wirt eignen, sind allgemein bekannt. Beispiele sind der Promotor des TRP1-Gens, des ADHI- oder ADHII-Gens, des Saure Phosphatase-(PHO5)-Gens, des CUP1-Gens, des Isozytochrom-C-Gens oder ein Promotor für Gene, die für glycolytische Enzyme kodieren, wie TDH3, Glyceraldehyd-3-Phosphatasedehydrogenase (GAPDH), einer gekürzten Version von GAPDH (GAPFL), 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase, Invertase, und für Glucokinase-Gene, oder es kann ein Promotor der Hefe-Paarungs-Pheromon-Gene, die für den aoder α-Faktor kodieren, verwendet werden. Bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten z.B. Promotoren mit transkriptionaler Kontrolle, die man durch Verändern der Wachstumsbedingungen an- und abschalten kann, z. B. der Promotor des PHO5-oder des CUP1-Gens. Den PHO5-Promotor kann man beispielsweise nach Wunsch unterdrücken oder die Unterdrückung wieder aufheben, und zwar alleine indem man die Konzentration an anorganischem Phosphat im Medium erhöht oder erniedrigt, und der CUP1-Promotor kann durch die Zugabe von Cu²⁺-Ionen ins Medium, z. B. in Form eines Kupfersalzes, angeschaltet werden. Besonders bevorzugt sind der GAPDH- und der Hefe-CUP1-Promotor.
Die für ein Signalpeptid ("Signalsequenz"), z. B. ein Hefe-Signalpeptid, kodierende DNA-Sequenz stammt vorzugsweise von einem Gen, z. B. einem Hefe-Gen, das für ein Polypeptid kodiert, welches gewöhnlich sekretiert wird. Hefe-Signalsequenzen sind beispielsweise die Signal- und Präpro-Sequenzen das Gen für Hefe-Invertase (SUC2), den α-Faktor, die Pheromonpeptidase (KEX1), das "Killer-Toxin" und die unterdrückbare saure Phospatase (PHO5), und die Glucoamylasesignalsequenz aus Aspergillus awamori. Weitere Sequenzen, wie Pro- oder Spacer-Sequenzen, welche spezifische Prozessierungssignale tragen können, können auch in die Konstrukte eingefügt werden, um die genaue Prozessierung der Vorläufermoleküle zu unterstützen. Die Prozessierungssignale enthalten beispielsweise einen Lys-Arg-Rest, der von einer Hefe-Endopeptidase, die in den Golgi-Membranen lokalisiert ist, erkannt wird. Bevorzugte erfindungsgemäße Signalsequenzen sind diejenigen des Hefe-PHO5-Gens, des α-Faktor- und des Hefe-Invertase-Gens (SUC2).
Eine DNA-Sequenz mit Transkriptionsterminationssignalen, z. B. Hefe-Transkriptionsterminationssignalen, ist vorzugsweise die 3'-flankierende Sequenz eines Gens, z. B. eines Hefe-Gens, welche die passenden Signale für die Transkriptionstermination und die Polyadenylierung enthält. Die bevorzugte flankierende Sequenz ist die des Hefe-PHO5- und des α-Faktor-Gens.
Die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende DNA kann aus einer Genbank des natürlichen Wirts (des medizinischen Blutegels Hirudo medicinalis) durch allgemein bekannte Verfahren isoliert werden oder kann durch PCR synthetisiert werden, wobei man beispielsweise die vom Wirt bevorzugten Kodons verwendet.
Der Promotor, die für das Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz, die für das Polypeptid kodierende DNA-Sequenz und die DNA-Sequenz mit den Transkriptionsterminationssignalen sind operativ miteinander verknüpft, d.h. sind in einer solchen Weise nebeneinander angeordnet, dass sie ihre normalen Funktionen behalten. Die Anordnung ist derart, dass der Promotor die richtige Expression des Signalsequenz-Polypeptid-Genkomplexes bewirkt und die Transkriptionsterminationssignale zum richtigen Abbruch der Transkription und Polyadenylierung führen. Die Signalsequenz ist im passenden Leserahmen an das Polypeptidgen geknüpft, und zwar in einer solchen Weise, dass das letzte Kodon der Signalsequenz direkt mit dem ersten Kodon des Polypeptidgens verbunden ist. Der Hefe-Promotor ist vorzugsweise an die Signalsequenz gebunden, und zwar zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem natürlicherweise an das Promotorgen gebundene ATG. Die Signalsequenz hat ihr eigenes ATG zur Translationsinitüerung. Die Schnittstelle dieser Sequenzen kann beispielsweise durch synthetische Oligonukleotidlinker, die die Erkennungssequenz einer Endonuklease tragen, gebildet werden. Beispiele verwandter Expressionskassetten sind beispielsweise in der EP-A-341215 beschrieben.
Bevorzugte Expressionskassetten umfassen den CUP1- oder den GAPDH-Promotor, den α-Faktor oder die Hefe-Invertase-Leitsequenz, das Tryptaseinhibitorgen und den α-Faktor-Terminator.
Eine besonders bevorzugte Expressionskassette umfasst ein rekombinantes DNA-Molekül, wie in Beispiel 9 beschrieben, oder ein funktionales Fragment oder Derivat davon.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein rekombinantes Plasmid, welches eine wie oben beschriebene Polypeptidexpressionskassette enthält.
Neben der Polypeptidexpressionskassette können die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide ein DNA-Segment, das von den Replikationsursprung enthaltender 2-Micron- DNA abstammt oder, falls ein 2-Micron-DNA-freier Hefestamm verwendet wird, die gesamte 2-Micron-DNA enthalten. Der letztere Plasmidtyp ist bevorzugt. Die erfindungsgemäßen Plasmide können beispielsweise die komplette 2-Micron-DNA in nichtunterbrochener Form enthalten, d. h. die 2-Micron-DNA wird einmal mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten und die linearisierte DNA wird vor dem erneuten Ringschluss mit den anderen Komponenten des Vektors verbunden. Die Restriktionsstelle wird so ausgewählt, dass die normale Funktion der REP1-, REP2- und FLP-Gene sowie die der ORI-, STB-, IR1- und IR2-Stellen der 2-Micron-DNA, ebenso wie die kleinen "FLP-Erkennungsziel-" (FRT) Stellen, die im Mittelbereich jedes invertierten Repeats (IR), an dem die FLP-Rekombinase angreift, vorliegen, erhalten bleibt. Gegebenenfalls wird die Restriktionsstelle so ausgewählt, dass das D-Gen der 2-Micron-DNA ebenfalls intakt bleibt. Geeignete Restriktionsstellen sind beispielsweise die einzigartige Pstl-Stelle, die im D-Gen lokalisiert ist, und die einzigartigen Hpal- und SnaBI-Stellen, die alle außerhalb dieser Gene und Stellen lokalisiert sind. Es ist jedoch gleichermaßen möglich, die Expressionskassette und weitere Komponenten (siehe unten) in verschiedene (wie beispielsweise zwei) Restriktionsstellen, insbesondere die oben genannten, der 2-Micron-DNA einzufügen.
Die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide umfassen vorzugsweise ein oder mehrere, insbesondere ein oder zwei selektive genetische Marken, z. B. einen Macker für Hefe und einen Macker und (außer bei symmetrischen 2-Micron-ähnlichen Hybridvektoren) einen Replikationsursprung für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli.
Als selektiver Genmaarker kann jeder Genmarker verwendet werden, der die Selektion von Transformanten anhand der phenotypischen Expression des Markergens erleichtert. Geeignete Marken sind beispielsweise diejenigen, die Antibiotikaresistenzen exprimieren, oder, im Fall von autotrophen Hefemutanten, Gene, welche Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene übertragen beispielsweise eine Resistenz gegen die Antibiotika G418, Hygromycin oder Bleomycin oder führen zu einer Prototrophie in einem auxotrophen Hefemutanten, beispielsweise das URA3-, LEU2-, LYS2-, HIS3- oder TRP1-Gen.
Da die Amplifikation der Expressionsplasmide praktischerweise in einem Prokaryonten, wie E. coli, erfolgt, sollte man vorzugsweise einen prokaryontischen, z. B. von E. coli stammenden Genmarker und einen prokaryontischen, z. B. von E. coli stammenden Replikationsursprung einfügen. Diese können aus den entsprechenden prokaryontischen Plasmiden, beispielsweise E. coli-Plasmiden, wie dem pBR322- oder einem pUC- Plasmid, beispielsweise pUC18 oder pUC19, gewonnen werden, die beide prokaryontische, z. B. von E. coli stammende Replikationsursprünge und genetische Macker, die Antibiotikaresistenzen, wie gegen Ampicillin, verleihen, enthalten.
Ein geeigneter Vektor zur Transformation von Hefezellen ist das Plasmid pRM 9.1.4, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9271.
Weitere bevorzugte Vektormoleküle sind:
pRM11.1.4, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9272;
pRM5.1.5, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9270;
pRM4.1.4, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9269; und
pRM3.1.10, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9268.
Der Vektor kann auch unter pHE175, pHE175R, pHE177 und pHE177R, wie in nachstehendem experimentellen Teil beschrieben, ausgewählt sein.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Tryptaseinhibitors, umfassend die Schritte

a) Gewinnen eines Blutegelextrakts, vorzugsweise aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis, und
b) Reinigen des Extrakts durch Dialyse und Säulenchromatographie.

Das Rohextrakt wird vorzugsweise gegen einen Puffer mit geringer Ionenstärke dialysiert. Anschließend wird das dialysierte Extrakt durch Kationenaustauschchromatographie, biospezifische Chromatographie, beispielsweise Anhydrotrypsin-Sepharose-Affinitätschromatographie, und einen weiteren Kationenaustauchchromatographie-Schritt gereinigt. Weitere experimentelle Einzelheiten sind in nachstehendem experimentellen Teil gezeigt. Modifikationen des beanspruchten Verfahrens kann der Fachmann einfach durchführen und diese gehören auch zu vorliegender Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung rekombinanter Tryptaseinhibitoren sowie rekombinante Tryptaseinhibitoren, die durch diese Verfahren erhältlich sind. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren, wobei man

a) einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt mit einem wie oben definierten Vektor transformiert;
b) die Expression der für den Tryptaseinhibitor kodierenden Sequenz induziert;
c) das Expressionsprodukt gewinnt; und gegebenenfalls
d) von dem erhaltenen Produkt Peptidfragmente entfernt, welche für die Tryptaseinhibitor-Aktivität nicht erforderlich sind, und/oder das Produkt gegebenenfalls renaturiert.

Die kodierende Sequenz kann auch mit Hilfe eines geeigneten Transkriptions-Translations-Systems exprimiert werden, beispielsweise des S30-Transkriptions-Translations-Systems.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft prokaryontische und eukaryontische Wirte, die mit einem für einen Tryptaseinhibitor kodierenden Vektor transformiert sind, sowie Varianten und Mutanten davon.
Geeignete Wirte sind prokaryontischen und eukaryontischen Ursprungs. Beispiele sind Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Insektenzellen. Bevorzugte Wirte sind Bakterien- und Pilzzellen, wie die von E. coli oder Pilzen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa.
Bevorzugte Hefestämme sind die oben genannten, z. B. Stämme von S. cerevisiae, die von dem endogenen 2-Micron-Plasmid ("cir⁰-Stämme") befreit wurden und insbesondere Stämme, denen ein oder mehrere Hefeproteasen fehlen; und oder, falls der CUP1-Promotor verwendet wird, Hefestämme, die 1–2 zusätzliche Kopien des chromosomalen CUP1-Gens enthalten.
Eine große Vielfalt Proteinasen, wie die genannten, wurden in dem Hefestamm Saccharomyces cerevisiae charakterisiert [Achstetter et al., (1985)]. Mutanten, denen die Aktivität der meisten dieser Proteasen fehlen, wurden isoliert und biochemisch untersucht. Die Auswirkungen des Fehlens bestimmter Proteasen wurde untersucht und einige Eigenschaften zeigten sich als nützlich zur Herstellung heterogener Proteine. Die Proteasen, die in den erfindungsgemäßen Hefestämmen fehlen, erfüllen keine unverzichtbaren Funktionen im zellulären Metabolismus; Mutationen, welche die Aktivität dieser Proteine vollkommen zerstören, sind nicht lethal. Dem Hefestamm fehlen beispielsweise ein oder mehrere Proteasen, die unter den Carboxypeptidasen yscα, yscB, yscA, yscY und yscS ausgewählt sind. Verfahren zur Herstellung solcher Hefestämme sind beispielsweise in der EP-A-40170 und der EP-A-341215 beschrieben.
Die Transformation des Wirts mit den erfindungsgemäßen Hybridplasmiden kann gemäß allgemein bekannten Verfahren erfolgen.
Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft einen eurkaryontischen Wirt, der von S. cerevisiae S-78, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer 9273, abstammt, und Varianten und Mutanten davon, die fähig sind, ein Tryptase-inhibierendes Molekül herzustellen.
Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Tryptase-hemmende Menge eines wie oben definierten Polypeptids enthalten, das aus Blutegelextrakten hergestellt wird oder beispielsweise durch Expression eines rekombinanten für den Typtaseinhibitor kodierenden Gens hergestellt wird, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Diese Zusammensetzungen können insbesondere für die hier genannten Indikationen verwendet werden, wenn man sie, z. B. parenteral (wie intravenös, intrakutan, intramuskulär oder subkutan), oral, mittels Inhalation oder topisch verabreicht. Die Dosierung hängt im Wesentlichen von dem spezifischen Verabreichungsweg und dem Zweck der Behandlung oder Prophylaxe ab. Die Menge der Einzeldosierung und der Verabreichungsplan sollte am besten für den Einzelfall individuell bestimmt werden. Verfahren, mit denen man die relevanten Faktoren bestimmen kann, sind dem Fachmann bekannt. Normalerweise, im Fall der Injektion, liegt die therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen im Dosierungsbereich von etwa 0,005 bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht. Der Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,05 mg/kg Körpergewicht ist bevorzugt.
Die Verabreichung erfolgt durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion. Folglich enthalten die pharmazeutischen Präparate zur parenteralen Verabreichung, je nach Verabreichungsweg, etwa 0,5 bis etwa 10 mg der erfindungsgemäßen Verbindung pro Einzeldosierung. Neben dem Wirkstoff enthalten diese pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise einen Puffer, z. B. einen Phosphatpuffer, der den pH-Wert zwischen etwa 3,5 und 7 hält, und, ferner, Natriumchlorid, Mannitol oder Sorbitol, um die Isotonizität anzugleichen. Sie können in gefriergetrockneter oder gelöster Form vorliegen, wobei die Lösungen vorzugsweise ein antibakterielles Konservierungsmittel enthalten sollten, z. B. 0,2 bis 0,3% 4-Hydroxybenzoesäuremethylester oder -ethylester.
Ein Präparat zur topischen Anwendung kann in Form einer wässrigen Lösung, Lotion oder eines wässrigen Gels sein, einer öligen Lösung oder Suspension oder einer fettigen oder insbesondere einer Emulsionstinktur. Ein Präparat in Form einer wässrigen Lösung lässt sich herstellen, indem man beispielsweise die erfindungsgemäße Substanz oder ein therapeutisch nützliches Salz davon in einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 6,5 löst und, falls gewünscht, ein oder mehrere weitere Substanzen hinzugibt. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 0,08 bis 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0 mg in etwa 10 ml einer Lösung oder 10 g eines Gels.
Eine ölige Form zur Verwendung für die topische Verabreichung lässt sich gewinnen, indem man beispielsweise die erfindungsgemäße Substanz oder ein therapeutisch nützliches Salz davon in einem Öl suspendiert, gegebenenfalls unter Zugabe von Quellmitteln, wie Aluminiumstearat, und/oder oberflächenaktiven Mitteln (oberflächenentspannendes Agens), deren HLB-Wert (hydrophil-lipophiles Gleichgewicht) unter 10 liegt, wie Fettsäuremonoester mehrwertiger Alkohole, z. B. Glycerolmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitan-monostearat oder Sorbitanmonooleat. Eine fettige Tinktur kann hergestellt werden, indem man beispielsweise die erfindungsgemäße Substanz oder die Salze in einer streichbaren fettigen Grundmasse suspendiert, wobei gegebenenfalls ein oberflächenwirksames Agens mit einem HLB-Wert unter 10 zugegeben wird. Eine Emulsionstinktur lässt sich durch Triturieren einer wässrigen Lösung der erfindungsgemäßen Substanz oder der Salze davon in einer weichen, streichbaren, fettigen Grundmasse herstellen, wobei ein oberflächenaktives Agens, dessen HLB-Wert unter 10 liegt, zugegeben wird. All diese topischen Anwendungsformen können auch ein Konservierungsmittel enthalten. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 0,08 bis etwa 1,5 mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,9 mg in etwa 10 g der Matrix.
Die Erfindung betrifft auch die bioanalytische Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Salze zur analytischen Bestimmung von Trypase und Präparate, die dazu verwendet werden können und die erfindungsgemäßen Substanzen enthalten, z. B. Feststoffmischungen und alle oben genannten Lösungen, insbesondere wässrige Lösungen. Neben einer spezifischen Menge oder Konzentration der erfindungsgemäßen Substanzen (auch in Form eines Salzes) können diese auch inerte Hilfsstoffe, z. B. die oben mit Bezug auf die Injektionspräparate beschriebenen Stoffe, welche beispielsweise eine stabilisierende und/oder konservierende Funktion haben, enthalten.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Verwendung eines Tryptaseinhibitors zur Diagnose von funktionaler Tryptase und Mastzell-bezogenen Erkrankungen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen für die Behandlung von Asthma, intestinalen Lungenerkrankungen, Arthritis, Zahnfleischentzündung, allergischen Erkrankungen, Blutgerinnungsstörungen, Hauterkrankungen und Psoriasis.
Experimenteller Teil
1. MATERIAL

a) Blutegelextrakte: Extrakte aus dem medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis waren ein Geschenk von Plantorgan, Deutschland. Die Blutegelextrakte können auch gemäß der Offenbarung der EP-A-0 207 956 und der darin zitierten Referenzen hergestellt werden.
b) Enzyme und Substrate: Proteasen wurden wie folgt bezogen: Rindertrypsin, Kallikrein aus der Bauspeicheldrüse vom Schwein und Elastase aus der Bauspeicheldrüse vorn Schwein (Sigma; Deisenhofen, Deutschland); humaner Faktor Xa (Boehringer Mannheim; Mannheim, Deutschland); humane Neutrophilelastase, humanes Thrombin, humane Urokinase und Chymotrypsin aus dem Rind (Medor; Herrsching, Deutschland); humane Plasmin und humanes Plasma-Kallikrein (Kabi; Essen, Deutschland); humanes Cathepsin G (Calbiochem; Bad Soden, Deutschland).

Tryptase wurde bis zur sichtbaren Homogenität nach einer Modifikation der beschriebenen Verfahren [Smith Hougland, 1984; Schwartz Lewis Austen, 1981; Harvima Schechter, 1988] aus humanem Lungengewebe gereinigt.
Nachstehende Substrate wurden gekauft: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (Novabiochem; Bad Soden, Deutschland); Suc-Ala-Ala-Ala-pNA (Bachem; Heidelberg, Deutschland); D-Pro-Phe-Arg-pNA und D-Val-Leu-Arg-pNA (Kabi; Essen, Deutschland); Suc-Val-Pro-PhepNA und Pyr-Gly-Arg-pNA (Medor; Herrsching, Deutschland); MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-ValpNA (Sigma; München, Deutschland). Tos-Gly-Pro-Arg-pNA stammten von Boehringer Mannheim, Medor und Sigma. (Tos = Tosyl; Suc = Succinyl; pNA = p-Nitroanilid).
Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) wurde von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland) gekauft und Rinderlungen-Heparin von Sigma. Bdellin-B war ein Geschenk von E. Fink (Klinische Chemie und Klinische Biochemie, Chirurgische Klinik, LMU; München, Deutschland).

c) Säulenmaterial: SP-Sephadex®, Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose® 4B und Mono-S®-HR-5/5 stammten von Pharmacia (Freiburg, Deutschland).

Anhydrotrypsin wurde aus Trypsin hergestellt, nach einer Modifikation des von Ako [Ako Foster Ryan, 1972] beschriebenen Verfahrens einer Affinitätsreinigung unterworfen und auf Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose 4B nach den Richtlinien von Pharmacia immobilisiert.

d) Zellkultur: Medium, fötales Kälberserum und Antibiotika stammten von Biochrom (Berlin, Deutschland). Die humane Keratinozyten-Zelllinie HaCaT [Boukamp Petrussevska, 1988] stammte von N. Fusenig, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ; Heidelberg, Deutschland). [Mefhyl-³H]thymidin wurde von Amersham Buchler (Braunschweig, Deutschland) bezogen.

2. VERFAHREN
2.1. Reinigung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors

a) Chromatographie auf SP-Sephadex®: Blutegelextrakt (~3,5 g) wurde in entionisiertern Wasser (77 ml) gelöst und gegen 20 mM NaP (pH 8,0) über Nacht bei 4°C dialysiert. Das dialysierte Material wurde auf eine SP-Sephadex®-Säule (1,6 × 20 cm), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min gewaschen, bis die optische Dichte (280 nm) des Ausflusses die Grundlinie erreichte, und mit 20 mM NaP, 500 mM NaCl (pH 8,0) eluiert. Fraktionen mit inhibitorischem aktiven Material wurden aufgefangen und vereint.
b) Affinitätschromatoaraphie auf Anhydrotrygsin-Sepharose®: Das vereinte Material aus der Kationenaustauschchromatographie (≈20 ml) wurde auf eine Anhydrotrypsin-Sepharose-Säule (1,6 × 3,6 cm), welche mit 20 mM NaP (pH 8,0) äquilibriert worden war, aufgetragen. Etwa 90% des inhibitorischen aktiven Materials wurde gebunden; das restliche Material im Durchfluss wurde für eine weiter Chromatographie aufgefangen. Nach gründlichem Waschen der Säule (~10 Säulenvolumen) startete man die Elution durch Zugabe von 100 mM KCl/HCl (pH 2,1) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min. Fraktionen wurden aufgefangen und direkt durch Zugabe von 1 M Tris neutralisiert. Das vereinte Eluat wurde gegen 20 mM NaP (pH 8,0) über Nacht bei 4°C dialysiert.
c) Chromatographie auf Mono-S®: Das dialysierte Eluat aus der Affinitätschromatographie wurde an eine Mono-S-Kationenaustauschsäule (0,5 × 5 cm), welche mit 20 mM NaP (pH 8,0) äquilibriert worden war, gebunden. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer (~20 ml) gewaschen und mit einem Gradienten von 60 bis 240 mM NaCl in 50 Säulenvolumen mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Fraktionen, welche inhibitorisches aktives Material enthielten, wurden vereint (≈5 ml), in Aliquots geteilt und bei –20°C gelagert.

2.2. Analytische Standardverfahren

a) Proteinassay: Die Proteinkonzentrationen wurden nach dem Bicinchoninsäureverfahren [Smith Krohn, 1985] mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.
b) Elektrophorese: Die elektrophoretische Analyse von reduziertem und denaturiertem Protein erfolgte auf 10 bis 20%-igen SDS-Polyacrylamid-Gradientengelen, wie vorn Laemmli [Laemmli, 1970] beschrieben. Die Proteine wurden mittels Silberfärbung nachgewiesen [Heukeshoven, 1985].
c HPLC: Proben (~1 nmol) wurde auf eine Lichrospher-RP-8-Umkehrphasensäule (120 × 4 mm; Merck) geladen und mit einem linearen Gradienten von 0% bis 30 Acetonitril in 0,1% TFA mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert.
d) Sequenzanalyse: Reduktion und S-β-Pyridylethylierung: Die S-β-Pyridylethylierung erfolgte im Wesentlichen wie von Friedman et al. [Friedman Krull, 1970] beschrieben. Der Inhibitor (1-2 nmol) wurde in 100 μl Puffer (6 M Guanidinium-HCl, 0,25 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 5 (v/v) β-Mercaptoethanol; pH 8,5) gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 5 μl 4-Vinylpyridin und 90-minütiger Inkubation stoppt man die Reaktion durch Ansäuern mit Ameisensäure. Der S-Pyridin-ethylierte Inhibitor wurde durch Umkehrphasenchromatographie auf einer Aquapore-RP-300-Säule (2,1 × 30 mm; Applied Biosystems, Pfungstadt, Deutschland) entsalzt.

Oxidation des Inhibitors: Eine Mischung aus Ameisensäure (45 μl) und Wasserstoffperoxid (30 %; 5 μl) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert. Danach wurde der Inhibtor (1–2 nmol) in dieser Mischung gelöst. Nach 1 Stunde Inkubation bei 4°C stoppte man die Reaktion, indem man sie mit 1 ml entionisiertem Wasser verdünnte und lyophilisierte.
Fraktionierung: Der Inhibitor (1 nmol) wurde mit Trypsin und/oder Chymotrypsin (beide von Sequenzierungsgüte; Boehringer Mannheim) in 100 μl 1 M Ammoniumhydrogencarbonatpuffer (pH 8,0) 14 Stunden bei 37°C inkubiert. Es wurde ein Enzym/Inhibitor-Verhältnis von 1 : 40 verwendet. Die Reaktion wurde durch Ansäuern mit Ameisensäure beendet und Fragmente wurden mittels HPLC aufgetrennt.
Aminosäuresequenzanalyse: Die automatisierte Aminosäuresequenzierung erfolgte mit einem Gasphasen-Sequenzanalysegerät 473A (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland).

e) Sequenzvergleich: Die MIPSX-Datenbank (Martinsrieder Institut für Proteinsequenzen am Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Deutschland) wurde mit dem schnellen Proteinsuchalgorithmus FASTP nach Lipman & Pearson [Lipman Pearson, 1985] durchsucht. Alignments wurden mit Hilfe von CLUSTAL optimiert [Higgins Sharp, 1988].
f) Aminosäureanalyse: Proben von oxidiertem Inhibitor wurden unter Vakuum in 5,7 M Salzsäure bei 110°C 20 Stunden hydrolysiert und mit einem Biotronik-LC-5000-Hochleistungs-Analysesystem (Puchheim, Deutschland) analysiert.
g) Bestimmung der Molekülmasse: Die Molekülmasse des HPLC-gereinigten Inhibitors (50 uM) wurde mit einem Tandem-Quadrupole-Apparat API-III (Sciex, Thornhill, Ontario, Kanada) bestimmt. Das Gerät wurde mit den Ammoniumadductionen von Polypropylenglycol geeicht.
h) Inhibitorische Aktivität: Während des Reinigungsverfahrens überwachte man den Inhibitor, indem man seine Wirkung auf die amidolytische Aktivität von Tryptase bestimmte. Dazu wurden Proben mit Tryptase (0,59 nM) in 50 mM Tris/HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 50 μg/ml Rinderlungen-Heparin und 0,1% (w/v) Rinderserumalbumin 25 Minuten bei 37°C inkubiert. Der Assay wurde durch Zugeben des Substrats Tos-Gly-Pro-Arg-pNa in einer Endkonzentration von 0,1 mM gestartet. Das freigesetzte Nitroanilin wurde spektrometrisch bei 405 nm 3,5 Minuten mit einem UVIKON-930-Photometer (Kontron; Eching, Deutschland) überwacht.

Eine inhibitorische Einheit (IU) wurde als die Menge Inhibitor definiert, welche die Substrathydrolyse um 30% vermindert.

i) Titration des Inhibitors: Die Konzentration des inhibitorisch aktiven Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors wurde durch Titration mit Trypsin bestimmt. Dazu wurde Rinderpankreas-Trypsin durch „active-site"-Titration mit p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoat genormt [Chase Shaw, 1970]. Die Konzentration des aktiven Inhibitors wurde unter der Annahme berechnet, dass Inhibitor und Trypsin in einer 1 : 1-Wechselwirkung stehen.
k) Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten: Um die Spezifität des Inhibitors zu bestimmen, wurde seine Wirkung auf die amidolytische Aktivität verschiedener Serinproteinasen bestimmt (siehe Tab. 5). Dazu wurden Proteinasen mit dem Inhibitor (0,2 uM) 15 und 30 Minuten unter den Tab. 5 angegebenen Bedingungen inkubiert. Die verbleibende Enzymaktivität wurde nach Zugabe eines geeigneten Substrats gemessen.

Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_i) für die Komplexe aus dem Inhibitor und den einzelnen Proteasen wurden im Wesentlichen wie von Bieth [Bieth, 1980] beschrieben, bestimmt. Kurz beschrieben wurden ansteigende Konzentrationen des Inhibitors mit einer gleichbleibenden Konzentration des Enzyms inkubiert; die Zeit, die jeweils benötigt wurde, bis sich das Gleichgewicht des Enzym-Inhibitor-Komplexes eingestellt hatte, bestimmte man für jede Protease in Vorversuchen. Dann wurde Substrat zugegeben und die restliche Enzymaktivität wurde gemessen. Die K_i-Werte wurden durch Angleichen der Gleichgewichtsgeschwindigkeiten an die Gleichung für enge bindende Inhibitoren [Morrison, 1969] mit Hilfe einer nicht-linearen Regressionsanalyse berechnet.

l) Gerinnungsassay: Die Prothrombinzeit gemäß Quick und die partielle Thromboplastinzeit wurden mit einem Amelung-KC-10-Coagulometer (Lemgo, Deutschland) und den Reagenzien-Zusammenstellungen der Behringwerke AG (Marburg, Deutschland) gemäß den Herstellerangaben gemessen.
m) Spaltung des vasoaktiven intestinalen Peptids (VIP) Tryptase (4,8 nM) wurde 25 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors in 100 mM Tris (pH 7,4), 140 mM NaCl, 50 μg/ml Heparin vorinkubiert. Vasoaktives intestinales Peptid (VIP; 24 uM Endkonzentration) wurde dann zugegeben. Nach weiteren 1 bis 10 Minuten Inkubation stoppte man die Reaktion durch Ansäuern mit Essigsäure. Das restliche VIP und die erzeugten Fragmente wurden mittels HPLC quantifiziert.
n) Wachstum humaner Keratinozyten: Für Wachstumsstudien der humanen Keratinozyten-Zelllinie HaCaT verwendete man eine spontan transformierte Zelllinie, welche die Eigenschaften differenzierter Keratinozyten behalten hatte [Boukamp Petrussevska, 1988]. HaCaT-Zellen wurden auf 24-Well-Gewebekulturplatten (Falcon; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) mit einer Dichte von 10⁴ Zellen/cm² in einem Medium, welches 90% Dulbecco's modifiziertes Eagles' Medium, 10% fötales Kälberserum und 50 μg/ml Gentamicin enthielt, ausplattiert. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen zweimal mit serumfreien Dulbecco's modifiziertem Eagles' Medium gewaschen, und frisches, serumfreies Medium, welches nur 7,8 μg/ml Heparin enthielt, oder Medium, welches die Agonisten und/oder den Inhibitor enthielt, wurde zugegeben. Nach 48 Stunden wusch man die Zellen noch zwei Mal und gab frisches, serumfreies Medium, welches 1 μCi/ml ³H-Thymidin enthielt, zu.

Nach weiteren 2 Stunden wusch man die Zellen dreimal mit eiskaltem Dulbecco's PBS und das aufgenommene ³H-Thymidin wurde mit 10%-iger Trichloressigsäure präzipitiert. Nach der Solubilisierung des Präzipitats in 0,1 N NaOH, 1% SDS wurde die aufgenommene Radioaktivität mittels Flüssigkeitsszintillationszählung (beta-Zähler Modell LS 1800, Beckman Instruments, München, Deutschland) bestimmt. Für Wachstumsstudien können auch andere Keratinozyten-Zelllinien verwendet werden.
Beispiel 1: Isolierung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors
3,5 g lyophilisiertes Blutegelextrakt wurde in Wasser gelöst, gegen 20 mM NaP (pH 8,0) dialysiert und auf eine SP-Sephadex©-Kationenaustauschsäule (siehe Verfahrensabschnitt) aufgetragen. Die meisten Proteine (≈98%) und die Trypsin-inhibitorische Aktivität befand sich im Durchlauf, wohingegen der Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor an die Säule gebunden war. Nach der Elution der Säule mit 500 mM NaCl Fig. 1) trennte man den Inhibitor von nicht-Trypsin-hemmenden Proteinen, und zwar mit einer anschließenden Affinitätschromatographie auf Anhydrotrypsin-Sepharose Fig. 2). Die Endreinigung wurde mittels Mono-S®-Kationenaustauschchromatographie (3) erreicht. Die Daten des Isolierungsverfahrens sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Reinigung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors
3,5 g lyophilisiertes Blutegelextrakt wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Eine inhibitorische Einheit (IU) wurde als die Menge Inhibitor definiert, welche die amidolytische Aktivität von Tryptase um 30% vermindert (siehe Verfahren).
Der isolierte Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor war gemäß SDS-PAGE und Nterminaler Sequenzanalyse homogen (4 und 8). Zwei Spezies wurden jedoch mittels Umkehrphasen-HPLC getrennt (5). Die anschließende Aminosäuresequenzierung nach dem tryptischen Verdau, die Aminosäureanalyse und die Massenspektroskopie (Tab. 2, 6 und 7) zeigten, dass die zwei Spezies drei Formen enthielten, die sich nur in ihrer C-terminalen Sequenz unterscheiden. Demnach unterscheiden sich die Formen B (43 Aminosäuren) und C (46 Aminosäuren) von der kürzesten Form A (42 Aminosäuren) durch die C-terminale Verlängerung um -GLY bzw. -GLY-ILE-LEU-ASN; die aus den drei Formen gewonnenen Ergebnisse sind in Tab. 3 gegenübergestellt.
Tabelle 2: Aminosäureanalyse der zwei Spezies des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors, aufgetr ennt mittels HPLC (siehe Fig. 5).
Tabelle 3: Zusammenfassung der Charakterisierung der drei Formen des Blutegelstämmigen Tryptaseinhibitors
Die 35 N-terminalen Aminosäurereste des Blutegel-stämmigen Inhibitors wurden durch Sequenzieren des nativen Inhibitors bestimmt. Die Primärstruktur wurde vervollständigt und mit Hilfe überlappender Peptide, die nach der Modifikation erzeugt wurden, und dem tryptischen und/oder chymotryptischen Verdau bestätigt (8).
Sequenzvergleiche zeigen, dass der Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor ein untypischer Serinproteinase-Inhibitor des Kazal-Typs ist. Der höchste Ähnlichkeitsgrad wurde zu Bdellin-B [Fink Rehm, 1986] gefunden;. in dem bei beiden Inhibitoren übereinstimmenden Sequenzbereich (Aminosäuren 1 bis 40) waren 19 von 40 (47,5%) der Aminosäuren identisch (Tab. 4). Trotz der hohen Sequenzidentität des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors zeigt Bdellin-B, ein Inhibitor, der ebenfalls aus dem medizinischen Blutegel stammt, keine Wirkung auf Tryptase (unveröffentlichte Beobachtungen).
Tabelle 4: Vergleich der Aminosäuresequenzen des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors mit Bdellin B-3 [Fink Rehm, 1986].
Beispiel 2 : Spezifität des Blutegel-stämmigen Inhibitors
Der Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor hemmt humane Tryptase in einer konzentrationsabhängigen Weise. Mit dem Tripeptid-Nitroanilid Tos-Gly-Pro-Arg-pNa als Substrat wurde eine maximale Hemmung von 50% beobachtet (9). Der Inhibitor blockiert daher, wahrscheinlich durch sterische Behinderung, nur zwei der vier katalytischen Untereinheiten des Tryptasetetramers, wodurch die zwei anderen Untereinheiten weiterhin Zugang zu dem kleinen Substrat haben. Die Wechselwirkung des Inhibitors mit den ersten zwei Tryptaseuntereinheiten lässt sich mathematisch als eng-bindende Inhibierung mit einem K von ~1,4 nM für den Komplex beschreiben. Der Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor ist hochspezifisch und hemmt nur Trypsin und Chymotrypsin mit Affinitäten, die denen für Tryptase ähneln (Tab. 5). Im Gegensatz dazu sind die K_i-Werte für Komplexe mit anderen Proteinasen wenigstens 200-fach höher.
Beispiel 3: Biologische Charakterisierung
Um zu bestimmen, ob der Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor die Spaltung eines biologisch relevanten Substrats durch Tryptase beeinflusst, wurde seine Wirkung auf den 5 Abbau des vasoaktiven intestinalen Peptids (VIP) gemessen. Bei einer Konzentration von 4 × 10^–7 M verringerte der Inhibitor den Abbau von VIP um 66% 10). Der Inhibitor blockiert damit nicht nur die Tryptase-induzierte Spaltung des Peptid-Nitroanilid-Substrats Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (siehe Beispiel 2), sondern auch die eines biologisch relevanten Substrats.
Tryptase spaltet nicht nur lösliche Proteine, sondern zeigt auch eine direkte Wechselwirkung mit Zellen, die zelluläre Funktionen aktivieren, wie das Wachstum von Fibroblasten und Keratinozyten. Um zu bestimmen, ob der Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor diese zellulären Wirkungen von Tryptase hemmt, wurde seine Wirkung auf das 15 Tryptase-induzierte Wachstum von kultivierten humanen Keratinozyten untersucht. In Abwesenheit des Inhibitors stimulierte Tryptase (10^–9 M) das Wachstum von Keratinozyten deutlich; sie erhöhte deren ³H-Tymidin-Einbau um 182 ± 6% gegenüber der Kontrolle. Der Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor beeinflusste das Basislinienwachstum nicht wesentlich, was für das Fehlen zytotoxischer Wirkungen spricht Tab. 6 .
Tabelle 6: Wirkung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors auf die Proliferation der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT.
Der Inhibitor verringerte das Tryptase-induzierte (10^–9 M) Zellwachstum stark, und zwar ohne eine wesentliche Wirkung auf die Proliferation unter Basislinienbedingungen. Der Inhibitor blockierte damit die biologische Wirkung von Tryptase fast vollständig, ohne zytotoxische Nebenwirkungen.
Der Inhibitor reduzierte die Tryptase-induzierte Proliferation jedoch entscheidend, wobei die ³H-Tymidin-Aufnahme auf 115 ± 5% und 120 ± 2% der Kontrolle verringert wurde, und zwar bei einer Konzentration von 10^–7 M bzw. 10^–8 M. Da diese ³N-Tymidin-Aufnahme ähnlich zu der ist, die von 10^–11 M Tryptase verursacht wird (118 ± 4%), sprechen die Daten dafür, dass der Inhibitor die zelluläre Wirkung von Tryptase um etwa 99% hemmt.
Letztlich wurde der Einfluss des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors auf die Prothrombinzeit (gemäß Quick) und die partielle Thromboplastinzeit gemessen, um zu bestimmen, ob er die Blutgerinnung stört. Bei einer Konzentration von 10^–7 M zeigte der Inhibitor auf keinen der Parameter eine signifikante Wirkung (Tab. 7). Der Blutegestämmige Tryptaseinhibitor hemmt somit keine der an der Blutgerinnungskaskade beteiligten Proteasen in signifikanter Weise.
Tabelle 7: Wirkung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors auf die Blutgerinnung
Der Inhibitor (100 nM) beeinflusste weder die Prothrombinzeit nach Quick noch die partielle Thromboplastinzeit, was dafür spricht, dass die an der Blutgerinnungskaskade beteiligten Enzyme nicht gehemmt werden.
Beispiel 4: Pharmazeutisches Präparat, welches den Tryptaseinhibitor zur parenteralen Verabreichung enthält.
Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Lösung dialysierte man gegen eine 0,9 %-ige NaCl-Lösung. Die Konzentration der Lösung wurde dann durch Aufkonzentrieren oder Verdünnen mit der gleichen NaCl-Lösung auf 1 mg/ml oder 10 mg/ml eingestellt. Diese Lösungen wurden durch Ultrafiltration (Membranen mit 0,22-μm-Poren) sterilisiert.
Die sterilisierten Lösungen können zur intravenösen Verabreichung verwendet werden.
Beispiel 5: Herstellung eines rekombinanten Tryptaseinhibitors
5.1. Material
Die Chemikalien stammten von Sigma, St. Louis, USA; Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland; Serva, Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland; Biomol, Hamburg, Bundesrepublik Deutschland; Roth, Karlruhe, Bundesrepublik Deutschland; Braun, Melsungen, Bundesrepublik Deutschland; Dianova, Hamburg, Bundesrepublik Deutschland; Promega, Madison, USA. Restriktionsendonukleasen und DNA-modifizierende Enzyme wurden von Boehringer Mannheim, Bundesrepublik Deutschland; New England Biolabs, Beverly, USA und Pharmacia-Biotech, Freiburg, Bundesrepublik Deutschland, gekauft. Adenosin-5'-α-[³⁵S]-thiotriphosphat stammte von Amersham Buchler, Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland.
Bacto-Trypton, Bacto-Pepton, Bacto-Hefe-Stickstoffbasis (ohne Aminosäuren, w/o), Bacto-Hefeextrakt und Bacto-Agar stammten von Difco, Augsburg, Bundesrepublik Deutschland. Als Kulturmedium verwendete man 2xYT [Sambrook et al., 1989]; YPD (10 g Bacto-Hefeextrakt, 20 g Bacto-Pepton, 20 g Glucose, pH 6,0); YED (20 g Bacto-Hefeextrakt, 20 g Glucose, 6,7 g NaHP₂O₄, pH 6,0) und SD+ (6,7 g Bacto-Stickstoffbasis (w/o), 20 g Glucose, 6,7 g NaHP₂O₄, 19 mg L-Leucin, pH 6,0).
Oligonukleotide wurden von MWG-Biotech, München, Bundesrepublik Deutschland gekauft oder von Dr. S. Modrow, München, Bundesrepublik Deutschland synthetisiert.
Vektoren und Stämme: Der E. coli-pUC-Klonierungsvektor stammte von der Pharmacia Biotech Europa GmbH, Freiburg. Der E. coli-S. cerevisiae-Shuttle und der Expressionsvektor pVT102U/α sowie der Hefestamm S-78 wurden freundlicherweise von T. Vernet, Montreal, Kanada und C.-W. Chi und Y.-S. Zhang, beide Shangai, China [Lit. Vernet et al., Chen et al.] zur Verfügung gestellt. E. coli-TG 1 ((lac-pro), supE, thi, hsdD5/F'traD36, proA⁺B⁺, IacI^q, IacZM15) stammten von Amersham-Buchler, Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland; E.coli-JM105 (thi, rspL, endA, sbcB15, hspR4, (lac-proAB)-F'traAAB-proAB, IacI^q, IacZM15) sowie E. coli-HB101 (F^–, pro^–, leu^–, thi^– IacY, Sm^r, endol^–, recA^–, r_k ^–, m_k ^–) stammten von der deutschen Stammsammlung Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland.
Die Standardverfahren des molekularen Klonierens wurden gemäß Sambrook et al. [Sambrook et al., 1989] und M.-D. Rose et al. [Rose et al., 1990] durchgeführt.
5.2. Standard-Analyseverfahren
a) SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierun (IEF)
SDS-PAGEn der Proteine erfolgten mit 15–25%-igen Polyacrylamidgelen nach dem Verfahren von Laemmli [Laemmli, 1970]. Die Gele wurden entweder selbst hergestellt und in einem herkömmlichen Apparat laufen gelassen oder es wurde das PhastSystem (Pharmacia, Sollentuna, Schweden) verwendet. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte ebenfalls mit Hilfe des PhastSystems, wobei das isoelektrische Fokussierungs-Kalibrierungskit, pH 3–10, verwendet wurde.
b) HPLC-Analyse, Aminosäuresequenzierunq
Üblicherweise untersuchte man 2–3 nmol Protein durch Umkehrphasen-HPLC wie zuvor ausgeführt [Auerswald et al., 1991 ]. Die N-Termini wurden mit einem Gasphasen-Sequenzanalysegerät 473A (Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Bundesrepublik Deutschland) gemäß Herstellerangaben sequenziert.
c) Bestimmung der Proteinkonzentration
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendete man den Pierce-BCA*-Protein-Assay mit BSA als Eichprotein [Smith et al., 1985]. Der A_280nm-Wert (1%) wurde für rekombinantes LDTI-C berechnet, wobei man die A₂₈₀-Werte für aromatische Reste und Cystine nach Mach et al. [1992] verwendete: A₂₈₀(1%) = 3,46 und für Proteingemische A₂₈₀(1%) = 1.
d) Trypsin-Inhibierungsassay
Die Konzentration des inhibitorisch aktiven Materials und der spezifischen inhibitorischen Aktivität von rLDTI-C wurden indirekt durch Messen der verbleibenden Trypsinaktivität bestimmt, wobei nachstehende, von Chase und Shaw, 1970 beschriebene Bedingungen verwendet wurden. Testpuffer: 0,05 M Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 600 pM Trypsin; 100 uM Tos-Gly-Pro-Arg-p-NA.
e) Bestimmung der K_i-Werte
Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_i) für die Komplexe aus rLDTI-C mit Trypsin und Tryptase wurden im Wesentlichen wie zuvor beschrieben [Bieth, 1990] bestimmt.
5.3. Konstruktion des synthetischen LDTI-C-Gens
Ein synthetisches Gen, welches für ein rekombinantes Homolog der C-Form von LDTI kodiert, wurde entworfen und wie in 11 dargestellt konstruiert. Die DNA-Sequenz wurde auf Basis der Aminosäuresequenz des natürlichen Tryptaseinhibitors mit Hilfe der GCG-Sequenzanalysesoftware ausgewählt [UWGCG, Devereux et al., 1984], und zwar mit der E. coli- und S. cerevisiae-Kodonverwendung für stark exprimierte Gene [Bennetzen und Hall, 1982].
Die 5'-OH-Enden der internen Oligonukleotide wurden vor der Hybridisierung mit Hilfe der T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Alle sechs Oligonukleotide, jeweils 200 pmol, wurden 5 Minuten auf 95°C erwärmt. Die Hybridisierung erfolgte beim Abkühlen auf Raumtemperatur innerhalb von 8 Stunden. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolpräzipitation ligierte man interne Nicks mit der T4-Ligase (Boehringer), und zwar nach den Herstellerangaben. Das Material wurde mittels Gelelektrophorese auf einem niederschmelzehden Agarosegel (5%) aufgetrennt und ein 149-bp-langes Fragment wurde mit Hilfe des MERMAID-Isolationskits von Dianova, Hamburg, gereinigt.
5.4. Konstruktion des Klonierungsvektors pRM3.1.10.
Das gemäß 5.3. gewonnenen DNA-Fragment wurde in den Vektor pUC18, der mit EcoRl/HindIII geschnitten worden war, ligiert (Molverhältnis von Vektor : Fragment, 1 : 20). Kompetente E. coli-TG1-Zellen wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert und rekombinante Klone wurden ausgewählt. Die DNA-Sequenzierung wurden mit dem M13/pUC-(–40)-Sequenzierungsprimer, einem 17-mer, und dem reversen Sequenzierungsprimer (–48), einem 24-mer, durchgeführt. Der Vektor pRM3.1.10 (15), welcher die entworfenen Sequenzen von rLDTI-C enthielt, wurde für weitere Versuche verwendet.
5.5. In vitro-Herstellung und zytoplasmatische Expression in E. coli

a) Das synthetische LDTI-C-Gen und der Expressionsvektor pASK-40 [Skerra et al., 1991] wurden jeweils mit EcoRI und HindIII gespalten, gereinigt und ligiert. Modifiziertes pASK-40 wurde als pRM4.1.4 bezeichnet (16). Die pRM4.1.4-DNA wurde durch ein E. coli-S-30-gekoppeltes in vitro-Transkriptions-Translations-System von Promega mit S-35-Cystein nach den Herstellerangaben untersucht. Die in vitro-Transkription-Translation des Vektors pRM4.1.4 mit einem gewerblich erhältlichen S-30-E. coli-Lysat zeigte zwei radioaktiv markierte Haupt-Proteinbanden mit einem erkennbaren Molekulargewicht von 7 kDa und 5 kDa (Daten nicht gezeigt). Die andere nachgewiesene starke Bande schien (3-Lactamase zu sein (sichtbares Molekulargewicht 31 kDa). Die 7-kDa-Proteinbande wird als nicht-gespaltene Fusionsprotein interpretiert, welches die ompA-Signalsequenz und LDTI-C enthält (theoretisches Molekulargewicht von 7038 Da), wohingegen die 5-kDa-Proteinbande (mit dem theoretischen Molekulargewicht von 5015 Da) das gespaltene und erwartete [ANS] LDTI-C zu sein scheint, und zwar um drei Aminosäure-Teste verlängert.
b) Für die zytoplasmatische Expression wurde das synthetische LDTI-C-Gen nach einer Auffüll-Reaktion in pGEX-3X (Pharmacia) geschnitten worden war, ligiert. Der resultierende Vektor wurde pRM11.1.4 genannt (17) und der gewonnene Wirtsstamm war E. coli-1314. Zytoplasmatische Glutation-S-Transferase-LDTI-C-Fusionsproteine wurden als unlösliche, in E. coli-1314 eingeschlossene Körper gefunden (HB-101 mit pRM11.1.4, Daten nicht gezeigt).

5.6. Konstruktion des Expressionsvektors pRM9.1.4
Für die Expressionsversuche mit Hefe wurde das modifizierte α-Paarungs-Sekretions-System pVT102U/α [Vernet et al., 1987] ausgewählt, in dem der Trichosanthes-Trypsininhibitor, ein kleiner Serinproteinaseinhibitor der Squash-Familie, erfolgreich exprimiert wird [Chen et al., 1992]. In diesem System war der rekombinante Inhibitor richtig gefaltet, von der Signalsequenz abgespalten, vor einem proteolytischen Abbau geschützt und konnte in zwei oder drei Schritten aus der Hefe-Fermentationsbrühe gereinigt werden.
Um den Shuttle-Vektor pVT102U/α zu verwenden, musste das rLDTI-C-Gen zunächst modifiziert werden. Das LDTI-C-Gen (11) wurde mutiert, indem man die EcoRI/Sphl-Kassette gegen eine Xbal/Sphl-Linker-Kassette austauschte. Die Sequenz dieses Xbal/Sphl-Linkers ist CTAGATAAAAGAAAGAAGGTTTGCGCATGV. Sie kodiert für das C-terminale Ende (11 c) der Signalsequenz vom alpha-Paarungs-Typ, das eine Spaltungsstelle für die KEX2-Signalpeptidase (Lys Arg) sowie den N-Terminus von LDTI enthält. Das modifizierte LDTI-C-Gen wurde über drei Fragmentligationen mit der XbaI/Sphl-Linker-Kassette, dem Sphl/HindIII-LDTI-C-Fragement und dem Xbal/HindIIIgespaltenen pUC18-Vektor (Molverhältnis 10 : 5 : 1) zusammengefügt. Nach der Transformation von E. coli-TG1 wurden rekombinante Klone durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung mit dem M13/pUC (–40) Primer (Biolabs) und dem M13/pUC/-48 reversen Primer (Biolabs) (CGCAGTAGCGGTAAACG) gescreent. Der neue Vektor pRM5.1.5 (12a) trug die erwartete Sequenz und das Xbal/HindIII-Fragment, wobei das rLDTI-C-Gen in den mit Xbal/HindIII-gespaltenen pVT102U/α ligiert wurde. Der resultierende Expressionsvektor pRM9.1.4 (12b) wurde isoliert und verwendet, um den S. cerevisiae-Stamm S-78 nach dem Verfahren von Becker und Guarante [Becker und Guarante, 1991) zu transformieren.
5.7. Expression in Saccharomvces cerevisiae
Analytische rLDTI-C-Expressionsversuche mit dem Hefestamm HOO5 (S-78 mit pRM9.1.4) wurden in Fernbach-Flaschen durchgeführt (180–220 Upm, 28°C; 3 Tage Vorkultur mit 100 ml SD(+)-Medium und 4 Tage Hauptkulturen mit 900 ml frischem YED-Medium). Die Zelldichte (OD₇₀₀) wurde täglich bestimmt, der pN-Wert wurde mit 1 M NaOH auf 6,0 eingestellt, 10 ml Hefeextrakt-Stammlösung, 50%, und 30 ml 50% (w/v) Glucose wurden zugegeben und die Hemmung von Trypsin wurde gemessen.
Nach der Transformation kompetenter S-78-Stämme mit pRM9.1.4 ermittelte man die Expression von rLDTI. Die Nährlösung der kultivierten rekombinanten Hefezellen zeigte eine bemerkenswerte Trypsinhemmung. Der konzentrierte Überstand ergab ein Proteinmuster, wobei die stärkste Bande bei einem sichtbaren Molekulargewicht von 5000 Da nach SDS-PAGE migrierte (siehe 13, Bahn 2).
Das rekombinante Material wurde präparativ aus der Kulturbrühe von S. cerevisiae isoliert, welche 96 Stunden in 1-Liter-Schüttelflaschen inkubiert worden waren. Nach dieser Zeit erreichte die Wachstumskurve der Hefezellen einen OD₇₀₀ von 22,0. Die inhibitiorische Aktivität auf Trypsin wurde nach 2 Tagen beobachtet und stieg parallel zur Biomasse an.
Die Hefebrühe wurde nach 96 Stunden in Kultur geerntet (6000 g, 20 min, 4°C) und der Überstand wurde filtriert, zunächst durch eine 0,16-μm-Membran und dann durch eine Querstrommembran mit einer Ausschlussgrenze bei 3 kDa (Filtron Omega Minisette, Filtron, Karlstein, Bundesrepublik Deutschland). Der Puffer wurde durch Diafiltration gegen 20 mM NaHP₂O₄, pH 8,2, ausgetauscht. Das Material wurde durch Kationenaustauschchromatographie gereinigt (Fractogel EMD SO₃ ^– 650 (S) Säule 150–10; Merck), Fließgeschwindigkeit 3 ml/min, Elutionspuffer: 20 mM NaHP₂O₄, pH 8,2, 500 mM NaCl.
Die Daten einer als Beispiel dienenden Reinigung sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8: Ergebnisse einer typischen Reinigung von rLDTI, Form C, aus dem Überstand einer Saccharomyces cereviseae-Kultur
Aus einem Liter Fermentationsbrühe wurden 3 mg rLDTI-C gewonnen. Die SDS-PAGE dieses Materials zeigte eine homogene, jedoch relativ breite Bande, die bei einem erkennbaren Molekulargewicht von 5000 Da (13, Bahn 3) migrierte. Etwa 85% des rLDTI-C eluierten in Form eines spitzer Peaks bei 28% Acetonitril auf einer RP18-HPLC. Die Aminosäuresequenzierung von Peak 1 (14) zeigte den erwarteten N-Terminus KKVCACPK. Kleine Heterogenitäten wurden jedoch nach der RP-HPLC beobachtet und ein anderer N-Terminus wurde identifiziert (Peak 2), welcher mit 11 zusätzlichen Aminosäuren am C-terminalen Teil des alpha-Faktor-Signalpeptids begann (14).
Die zeigt, dass die endogene KEX-2-Protease aus Hefe mit einer hohen Genauigkeit nach LysArg, der Erkennungsstelle der Signalpeptidase KEX2, spaltet, noch vor den zwei N-terminalen Aminosäureresten LysLys von LDTI. Die isoelektrische Fokussierung mit dem PhastSystem zeigte, dass der isoelektrische Punkt von rLDTI über pH 10 lag.
Die ermittelten Inhibitionskonstanten der Komplexe Tryptase-LDTI-C und Trypsin-LDTI-C sind ähnlich zu denen mit natürlichem LDTI. Die gemessene spezifische Trypsininhibitorische Aktivität von 60% ist vergleichbar mit der anderer rekombinanter Inhibitoren.
rLDTI-C hemmt humane Tryptase in einer ähnlichen Weise wie der natürlich vorkommende Blutegel-stämmige Tryptaseinhibitor: mit dem Tripeptid-Nitroanilid Tos-Gly-Pro-Arg-pNa als Substrat wurde eine maximale Hemmung von ~50% beobachtet und es wurde ein K_i Wert von 1,9 nM für den Komplex zwischen Tryptase und rLDTI-C berechnet.
Beispiel 6: Konstruktion von pFBY166
pFBY166 ist ein von pUC18 abstammendes Plasmid, welches ein 1085-bp-BamHl-Fragment enthält. Dieses Fragment enthält den an das ATG der α-Faktor-Leitsequenz gebundenen CUP1-Promotor, ein Stuffer-Fragment und den α-Faktor-Terminator. Die genaue Weise, wie man die Fusionen durchführt, ermöglichen, dass man einen ORF (offenen Leserahmen) einfügt, welcher Fragmente entweder am ATG, indem man die EcoRI-Stelle verwendet, nach der Signalsequenz, indem man eine PstI-Stelle verwendet, oder nach der α-Faktor-Leitsequenz durch Einfügen hinter der BgIII-Stelle, enthält. Der zu exprimierende ORF sollte idealerweise eine Sall-Stelle am 3'-Ende haben, um die Fusion an den Terminator, vor dem sich eine Sall-Stelle befindet, zu erleichtern, und sollte keine BamHI-Stellen in der Sequenz aufweisen, da die Spaltung dieses Plasmids an den zwei BamHI-Stellen die gesamte Expressionskassette ausschneidet, so dass er leicht in einen Hefe-Shuttle-Vektor kloniert werden kann.
pFBY166 enthält ein 425-bp-BamHl/EcoRl-Fragment des CUP1-Promotors, welches den Nukleotiden 1080 bis 1505 der Hinterlegungsnummer K02204 der EMBL-GENBANK entspricht. Der CUP1-Promotor ermöglicht die Expression in einer Kupfer-gesteuerten Weise.
Das ATG wird als Teil der α-1-Faktor-Pheromon-Signalsequenz und Leitsequenz, Nukleotide 293 bis 527 der EMBL-GENBANK-Hinterlegungsnummer X01581, bereitgestellt und daran schließt sich die Sequenz AGATCTTGC an, welche eine BgIII-Stelle, die einzigartig in pFBY139 vorkommt, genau vor der normalen Position der LysArg-KEX2-Spaltungsstelle anordnet. Falls man nur die Fusion an eine Signalsequenz benötigt, kann dies durch die einzigartige Pstl-Stelle erfolgen, die in der für die Signalsequenz kodierenden Region vorliegt. Auf die BgIII-Stelle folgt eine Sequenz, die keine Bedeutung hat, da sie normalerweise entfernt wird, wenn man den einzuführenden ORF in das Plasmid kloniert, und zwar entweder zwischen die EcoRI-, PstI- oder die BgIII-Stelle und die Sall-Stelle, welche das Ende des Stuffer-Fragments und den Anfang der α-1-Faktor-Pheromon-Terminator-Sequenzen, Nukleotide 825 bis 1100 der EMBL-GENBANK-Hinterlegungsnummer X01581, markiert. Daran schließt sich direkt die Sequenz AATTCGGATCC an, welche für die BamHI-Stelle, die dieses Ende der Expressionskassette begrenzt, kodiert.
Dieses Plasmid kann mit Hilfe von Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Fragmenten aus genomischer Hefe-DNA konstruiert werden.
Alle in der PCR-Reaktion verwendeten Oligonukleotide wurden mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert. Die PCR-Reaktionen wurden in einer PCR-Einheit von Perkin Elmer unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
20 mM der in Frage stehenden Oligonukleotide wurden in 0,1 ml Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂) mit 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 0,2 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP inkubiert. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen inkubiert: jeweils 30 s bei 92°C, 1 min bei 42°C und 1 min bei 72°C.
Das Fragment mit dem Großteil der α-Faktor-Signal- und Leitsequenzen wurde aus genomischer Hefe-DNA mit Hilfe der PCR-Fragmente 1 (SEQ ID NO: 10) und 2 (SEQ ID NO: 11) hergestellt.
Das Fragment mit dem α-Faktor-Terminator wurde aus genomischer Hefe-DNA mit Hilfe der PCR-Fragmente 3 (SEQ ID NO: 12) und 4 (SEQ ID NO: 13) erzeugt:
Das Fragment mit dem CUP1-Promotor wurde aus genomischer Hefe-DNA mit den PCR-Fragmenten 5 (SEQ ID NO: 14) und 6 (SEQ ID NO: 15) hergestellt:
und die Fragmente wurden anschließend mit BamHI und EcoRI geschnitten.
Das Fragment mit dem Großteil der α-Faktor-Signal- und Leitsequenzen und das Fragment mit dem α-Faktor-Terminator wurden gemischt und erneut in einer PCR-Reaktion mit dem Oligonukleotid 1 und dem Oligonukleotid 3 amplifiziert und EcoRI und mit BamHI geschnitten. Das zuletzt amplifizierte Fragment und das Fragment mit dem CUP1-Promotor wurden in den mit BamHI geschnittenen und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelten pTZ18R kloniert, so dass pFBY139 entstand.
Beispiel 7: Konstruktion von pHE174: Expression des Tryptaseinhibitors unter der Kontrolle des regulierten CUPI-Promotors
Ein für den Tryptaseinhibitor kodierendes synthetisches Gen wurde in einer bevorzugten Hefe-Kodon-Verwendung aus drei synthetischen Oligonukleotiden in einer PCR-Reaktion zusammengefügt. Ferner verlängerte man das Gen an seinem 5'-Ende, um eine praktische Fusion im Leserahmen an die α-Faktor-Leitsequenz im Plasmid pFBY-166 bereitzustellen.
Folgende drei Oligonukleotide wurden mit Hilfe eines automatischen DNA-Synthesegeräts hergestellt:
Aus diesen drei Oligonukleotiden wurden ein 170-bp-Fragment in nachstehend beschriebener Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit der PCR-Einheit von Perkin Elmer und unter folgenden Bedingungen zusammengefügt:
20 mM der Oligonukleotide 1 und 3 und 20 nM des Oligonukleotids 2 wurden in 0,1 ml Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂) mit 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 0,2 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 Zyklen inkubiert: jeweils 30 s bei 92°C, 1 min bei 42°C und 1 min bei 72°C.
Das 170-bp-PCR-Fragment wurde auf einem 2%-igem Agarosegel isoliert, mit BgIII und SaII geschnitten und in den mit BgIII und SaII geschnittenen pFBY-166 (siehe oben) ligiert. E. coli-HB101 wurde mit dem erhaltenen Plasmid pHE174 transformiert.
Der transformierte E. coli-Stamm wurde als E. coli/pHE174 bezeichnet.
Die richtige Fusion des PCR-Fragments an die α-Faktor-Leitsequenz und die richtige Sequenz des Tryptaseinhibitor-ORFs wurde mittels Sequenzierung bestätigt.
Beispiel 8: Konstruktion von pHE-175 und -175R. 2-Micron-Vektoren mit der Tryptaseinhibitor-Expressionskassette
Für die Expression in Hefe wurde pDP34 als Vektor verwendet. pDP34 (EP-A-340 170, 3) ist eine Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor mit dem Ampicillinresistenz-Marker für E. coli und den URA3- und dLEU2-Hefe-selektiven Markern. Er enthält die komplette 2-Micron-Sequenz in der A-Form und ist kompetent für REP1, REP2 und FLP.
Das Plasmid pDP34 wurde mit BamHI verdaut und die klebrigen Enden wurden durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase entphosphoryliert. pHE174 wurde mit BamHI verdaut und das 1119-bp-Fragment, welches die vollständige Tryptaseinhibitor-Expressionskassette enthielt, wurde in das mit BamHI geschnittene pDP34 ligiert. E. coli-HB-101 wurde mit den erhaltenen Plasmiden pHE-175 und -175R transformiert. Die Orientierung des Inserts wurde durch einen Verdau mit SaII überprüft. pHE-175 enthielt die Tryptaseinhibitor-Expressionskassette in Uhrzeiger-Orientierung mit Bezug dLEU2; pHE-175R enthielt sie in Orientierung gegen den Uhrzeigersinn mit Bezug auf den dLEU2-Marker.
Beispiel 9: Konstruktion von pHE-176; der Tryptaseinhibitor-ORF. fusioniert an die Invertase-Signalsequenz (SUC2)
Um ein alternatives Sekretionssystem bereitzustellen, fusionierte man den Tryptaseinhibitor-ORF an die Signalsequenz des Hefe-Invertasegens SUC2.
Folgende 2 Oligonukleotide wurden hergestellt:
pHE-174 wurde als Templat-DNA für eine wie in Beispiel 7 beschriebene Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. 20 ng des Templats pHE-174 wurden mit 20 mM der Oligonukleotideprimer unter den in Beispiel 7 beschriebenen Versuchsbedingungen inkubiert.
Das amplifizierte 214-bp-PCR-Fragment wurde über ein 2%-iges Agarosegel isoliert, mit EcoRI und SaII geschnitten und in den mit EcoRI und SaII geschnittenen Vektor pFBY-166 ligiert.
E. coli-HB-101 wurde mit dem erhaltenen Plasmid pHE-176 transformiert. Die richtige Sequenz der SUC2-Signalsequenz-Tryptaseinhibitor-Fusion wurde mittels Sequenzierung bestätigt.
Beispiel 10: Konstruktion von pHE-177 und pHE-177R. 2-Micron-Vektoren mit der Trygtaseinhibitor-Expressionskassette mit der SUC2-Sianalseauenz
In Analogie zu Beispiel 8 wurde das 918-bp-BamHI-Fragment, welches die Tryptaseinhibitor-Expressionskassette enthielt, mittels BamHI-Verdau aus pHE-176 ausgeschnitten und in den mit BamHI geschnittenen pDP34 eingefügt. E. coli-HB-101 wurde mit den erhaltenen Plasmiden pHE-177 und pHE-177R transformiert. Die Orientierung des Inserts wurde durch Verdau mit SaII überprüft. pHE-177 enthielt die Tryptaseinhibitor-Expressionskassette in Uhrzeiger-Orientierung, bezogen auf dLEU2; pHE-177R enthielt sie in Orientierung entgegen dem Uhrzeigersinn.
Beispiel 11: Konstruktion des Saccharomvces cerevisiae-Stamms TR-1456
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm TR1456 wurde wie in der EP-A-341 215 beschrieben konstruiert. Ausgehend von dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm H449 (DSM-4413, MATa, leu23, 112, ura3, prb1 [cir°]) entfernte man in zwei aufeinanderfolgenden Versuchsreihen die zwei Carboxypeptidasen yscα und yscY aus dem Stamm H449, indem man die dafür kodierenden Gene KEX1 bzw. PRC1 zerstörte. Als erstes wurde das für ysca kodierende Gen, KEX1, zerstört.
Hierzu transformierte man den Stamm H449 mit einem DNA-Fragment, welches für das KEX1-Gen, mit dem gesamten URA3-Gen in der Mitte der kodierenden KEX1-Region, kodierte. Uracil-prototrophe Transformanten wurden ausgewählt und auf das Fehlen der ysca-Aktivität untersucht. Als nächstes zerstörte man das URA3-Gen, welches in den KEX-1-Lokus eingefügt worden war, durch Transformation mit einem Plasmid, welches eine zerstörte Version des Gens, URA3Δ5 enthielt (siehe EP-A-341215). Uracil auxotrophe Transformanten wurden ausgewählt und im nächsten Schritt zerstörte man deren endogenes, für die Carboxypeptidase yscY kodierendes PRC1-Gen. Der Versuch wurde in analoger Weise wie für die Zerstörung von KEX1 beschrieben durchgeführt. Das schließlich erhaltene isogene Derivat des Stamms H449 wird als TR1456 bezeichnet und hat folgenden Genotyp:
TR1456 = MATa, leut2-3, 112, ura3, prb1, kex1::ura3, prcl::ura3, [cir°]
Beispiel 12: Transformation des Stamms TR-1456 mit den Plasmiden pHE-175. -175R. -177 und -177R
Die Plasmide pHE-175, -175R, -177 und -177R wurden in die Wirtsstämme H449 bzw. TR1456 eingefügt, wobei das von Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978), 75, 1929) beschriebene Transformationsprotokoll verwendet wurde. Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in der EP-A-341 215 beschrieben. Transformierte Hefezellen wurden auf Hefe-Minimalmedium, welches mit Leucin angereichert war und kein Uracil enthielt, selektiert. Einzlne transformierte Hefeklone wurden isoliert und wie folgt bezeichnet:
Saccharomyces cerevisiae TR1456/pHE-175
Saccharomyces cerevisiae TR1456/pHE-175R
Saccharomyces cerevisiae TR1456/pHE-177
Saccharomyces cerevisiae TR1456/pHE-177R
Saccharomyces cerevisiae H449/pHE-175
Saccharomyces cerevisiae H449/pHE-175R
Saccharomyces cerevisiae H449/pHE-177
Saccharomyces cerevisiae H449/pHE-177R
Beispiel 13: Sekretion des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors durch TR1456. transformiert mit dem Plasmid pHE-177
Saccharomyces cerevisiae-TR1456/pHE-177-Zellen wurden nacheinander in zwei Vorkulturen mit jeweils 20 ml aufgezogen. Das synthetische Medium bestand aus:

6,7 g/I Difco-Hefe-Stickstoffbasis (ohne Aminosäuren)

10 g/I L-Asparagin

1 g/I L-Histidin

20 g/I Glucose

0,02 g/I L-Leucin
Der pH-Wert des Mediums wurde auf 5,8 eingestellt. Die erste Vorkultur wurde 16 Stunden bei 28°C und 180 Upm aufgezogen. Die zweite Vorkultur wurde mit 2% (v/v) der ersten Vorkultur beimpft und 24 Stunden bei 28°C und 180 Upm inkubiert.

Das Medium der Hauptkultur bestand aus:

5 g/I	Pepton
10 g/I	Hefeextrakt
20 g/I	Glucose
40 g/I	Sucrose
3 g/I	Ammoniumsulfat
2 g/I	Kaliumdihydrogenphophat
0,5 g/I	Magnesiumsufat-heptahydrat
0,1 g/I	Natriumchlorid
0,1 g/I	Calciumchlorid
10^–5 g/I	Biotin

Die Hauptkultur (100 ml Medium) wurde mit etwa 106 Zellen/ml beimpft und 72 Stunden bei 28°C und 180 Upm inkubiert.
Unmittelbar nach dem Beimpfen gab man steriles Kupfersulfat in einer Konzentration von 1 mM in die Kultur.
Nach der Fermentation wurden Aliquots aus der Kultur entnommen, die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und der Kulturüberstand wurde auf die Aktivität des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors untersucht, indem man den Inhibitor wie unter 2.2. i) beschrieben mit Trypsin titrierte.
Beispiel 14: Untersuchung des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors aus Fermentationskulturen des Saccharomyces cerevisiae-Stamms TR1456/pHE177 mittels Umkehrphasen-HPLC
Proben der Kulturüberstände des Stamms TR1456/pHE177 wurden unter folgenden Bedingungen einer HPLC-Analyse unterworfen:
Es wurde eine Merck-Lichrospher-1000-RP-8-Säule (4 × 250 mm, 10 μm) verwendet. Die mobile Phase A bestand aus Wasser (Nanopur®, Barnstead) mit 0,1% (v/v) Trifluor essigsäure. Die mobile Phase B wurde aus 20% Wasser (Nanopur®, Barnstead) und 80% Acetonitril (HPLC-Güte, Fluka), welches 0,09% (v/v) Trifluoressigsäure enthielt, hergestellt.
Die chromatographischen Auftrennungen erfolgten mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min, wobei nachstehender Gradient verwendet wurde (Tab. 9). Die Eluate wurden bei einer Absorption von 214 nm überwacht.
Tabelle 9:
Ein Hauptpeak mit einer Retentionszeit von 19,05 min wurde auf dem Chromatogramm beobachtet, welches bei Stämmen auftritt, die das Inhibitor-Expressionsplasmid enthalten, nicht jedoch bei nicht-transformierten Stämmen. Die weitere Untersuchung ergab, dass dieser Peak eine Spezies des Blutegel-stämmigen Tryptaseinhibitors mit einem sichtbaren Molekulargewicht von 4738,8 enthielt, was mittels Massenspektroskopie nachgewiesen wurde. Dieser Wert stimmt gut mit dem errechneten Molekulargewicht von 4738 überein, was auf das Full-Length-Inhibitormolekül mit sowohl dem richtigen N-Terminus als auch dem richtigen C-Terminus hinweist.
Das chemische Molekulargewicht des Inhibitors wurde mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-lonisierungs-Massenspektrometrie (MALDI-MS) bestimmt, wobei man eine selbstgebaute Vorrichtung verwendete (Boernsen et al., Chimica (1990) 44, 412-416).
In Verbindung mit vorliegender Erfindung wurden folgen Mikroorganismen am 29. Juni, 1994 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt:
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein gereinigter humaner Tryptaseinhibitor, der im Wesentlichen durch die Aminosäuresequenz
charakterisiert ist, worin der C-terminate Rest X für H (SEQ ID NO: 1), -Gly (SEQ ID NO: 2) oder-Gly-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 3) steht; oder die funktionalen Äquivalente davon, in welchen eine oder mehrere Aminosäuren in der obigen Sequenz substituiert oder deletiert sind, oder an welche eine oder mehrere Aminosäuren addiert sind, ohne die Tryptaseinhibitor-Aktivität substantiell zu beeinflussen.
Tryptaseinhibitor nach Anspruch 1, der bei einer Konzentration von 100 nM die Prothrombinzeit nach Quick und die partielle Thromboplastinzeit nicht beeinflusst.
Tryptaseinhibitor nach Anspruch 1 oder 2, charakterisiert durch eine Inhibition von menschlicher Tryptase mit einem K_i-Wert im Bereich von 0,1 to 10 nM.
Funktionales Äquivalent des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Aminosäuresequenz
worin der N-terminale Rest R¹ für Ala- or Cys-Ala- steht; der C-terminale Rest R² für -Arg or -Arg-Cys steht; und Z für eine beliebige Aminosäure steht.
Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, erhältlich durch Peptidsynthese oder rekombinante DNA-Technologie.
Polynukleotid, welches für ein Polypeptid mit Tryptaseinhibitor-Aktivität gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert; oder das komplementäre Polynukleotid davon.
Polynukleotid nach Anspruch 6, umfassend die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:4):
worin R für A oder G steht; M für A oder C steht; W für A oder T steht; S für C oder G steht; Y für C oder T steht; H für A, C, oder T steht; N für ein beliebiges Nukleotid steht und X für 3'-OH (SEQ ID NO: 4) GGN (SEQ ID NO: 5) oder GGN ATH YTN AAY (SEQ ID NO: 6) steht oder der komplementäre Strang davon; und die Nukleotidsequenzen welche mit der oben erwähnten DNA-Sequenz hybridisieren.
Polynukleotid nach Anspruch 7, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche im Wesentlichen den Nukleotidresten 1 to 149, oder vorzugsweise 7 bis 144 gemäß SEQ ID NO: 7 entspricht; oder ein Fragment davon.
Polynukleotid nach Anspruch 7, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche im Wesentlichen den Nukleotidresten 1 to 149, oder vorzugsweise 7 bis 147 gemäß SEQ ID NO: 8 entspricht; oder ein Fragment davon.
Oligonukleotid, welches mit einer Nukleotidsequenz hybridisiert, die für ein Polypeptid mit Tryptaseinhibitor-Aktivität nach Anspruch 1 kodiert.
Oligonukleotid nach Anspruch 10, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche im Wesentlichen komplementär mit der Nukleotidsequenz gemäß den Resten 22 bis 87 von SEQ ID NO: 5 ist.
Polynukleotid, welches für ein Polypeptid mit Tryptaseinhibitor-Aktivität kodiert und erhältlich ist durch Hybridisierung mit einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 10 und 11.
Polypeptid-Expressionskassette, umfassend einen Promotor, operativ verknüpft mit einer für ein Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und 12, und mit einer DNA-Sequenz, enthaltend Transkriptions-Terminationssignale.
Expressionskassette nach Anspruch 13, umfassend einen Promotor in operativer Verknüpfung mit einer ersten DNA-Sequenz, welche für ein Signalpeptid kodiert, die in passendem Leserahmen mit einer zweiten, für ein Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und 12 verknüpft ist, und eine DNA-Sequenz, enthaltend Transkriptions-Terminationssignale.
Expressionskassette nach Anspruch 14, worin der Promotor ausgewählt ist unter CUPIp und GAPDHp.
Expressionskassette nach Anspruch 13 oder 14, worin die Signalsequenz ausgewählt ist unter dem α-Faktor-Leader, PHO5 und SUC2.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 13 bis 16, worin der Terminator ausgewählt ist unter dem α-Faktor-Terminator und dem PHO5-Terminator.
Expressionskassette nach Anspruch 17, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 9 oder ein funktionales Äquivalent davon.
Polypeptid, welches von einem Polynukleotid nach Anspruch 12 kodiert wird.
Vektor für die Transformation von eukaryotischen oder prokaryotischen Wirten, umfassend ein Polynukleotide nach einem der Ansprüche 6 bis 9 oder 12.
Vektor für die Transformation von eukaryotischen oder prokaryotischen Wirten, umfassend eine Expressionskassette gemäß der Definition in einem der Ansprüche 13 bis 18.
Vektor nach Anspruch 20 oder 21, nämlich ein 2-Micron-basierender Hefe-Vektor.
Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 22, ausgewählt unter a) pRM9.1.4, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9271; b) pRM11.1.4, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9272; c) pRM5.1.5, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9270; d) pRM4.1.4, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9269; und e) pRM3.1.10, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 9268.
Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 22, ausgewählt unter pHE175, pHE175R, pHE177, und pHE177R.
Verfahren zur Herstellung eines Inhibitors der humanen Tryptase nach Anspruch 1 durch a) Herstellung eines Blutegelextraktes und b) Reinigung des Extraktes durch Dialyse and Säulenchromatographie.
Verfahren nach Anspruch 25, worin a) der Extrakt gegen einen geeigneten Puffer dialysiert wird; und b) der dialysierte Extrakt durch Kationenaustauschchromatographie, biospezifischer Affinitätschromatographie und einen weiteren Kationenaustauschchromatographie-Schritt gereinigt wird.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Tryptaseinhibitors, wobei man a) einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 24 transformiert; b) die Expression der Tryptaseinhibitor-kodierenden Sequenz induziert; c) das Expressionsprodukt gewinnt; und gegebenenfalls d) von dem erhaltenen Produkt Peptidfragmente entfernt, welche für die Tryptaseinhibitor-Aktivität nicht erforderlich sind und/oder das Produkt gegebenenfalls renaturiert.
Tryptaseinhibitor nach Anspruch 1, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 25, 26 oder 27.
Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine Tryptase-inhibierende Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 19 und 28, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Verwendung eines Tryptaseinhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 19 und 28 bei der Diagnose funktionaler Erkrankungen.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 to 5, 19 und 28 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von Erkrankungen mit Beteiligung von Mastzellen.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 19 und 28 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von Asthma, intestinaler Lungenerkrankung, Arthritis, periodontaler Erkrankung, allergischen Erkrankungen, Hautkrankheiten, Psoriasis oder Blutgerinnungserkrankungen.
Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, transformiert mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 24, und Varianten und Mutanten davon.
Wirt nach Anspruch 33, ausgewählt unter Saccharomyces cerevisiae oder E. coli.
Eukaryotischer Wirt nach Anspruch 34, hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnummer DSM 9273, und Varianten und Mutanten davon, welche zur Produktion eines Tryptase-inhibierenden Polypeptids befähigt sind.
Wirt nach Anspruch 34, ausgewählt unter Saccharomyces cerevisiae TR 1456/pHE 175 Saccharomyces cerevisiae TR 1456/pHE 175R Saccharomyces cerevisiae TR 1456/pHE 177 Saccharomyces cerevisiae TR 1456/pHE 177R Saccharomyces cerevisiae H449/pHE 175 Saccharomyces cerevisiae H449/pHE 175R Saccharomyces cerevisiae H449/pHE 177 Saccharomyces cerevisiae H449/pHE 177R, und Varianten und Mutanten davon, welche zur Produktion eines Tryptaseinhibierenden Polypeptids befähigt sind. 58/mm